CN110283927A - 基于高分辨率熔解曲线鉴别五种毛孢子菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于高分辨率熔解曲线鉴别五种毛孢子菌的方法，所述五种毛孢子菌为阿萨希毛孢子菌、皮瘤毛孢子菌、真皮毛孢子菌、Trichosporon montevideense和Trichosporon dohaense，所述方法使用一对能同时鉴别上述五种毛孢子菌的特异性引物对，以待测样品DNA为模板，建立高分辨率熔解曲线反应体系，采用高分辨率熔解曲线反应程序，同时连续检测荧光强度，以荧光信号对温度的一阶负导数为纵坐标，温度为横坐标，得到熔解曲线图。本发明方法无需进行后续PCR产物电泳检测与测序，简化操作流程，提高检测效率，并有较高的灵敏度和特异性。

Description

基于高分辨率熔解曲线鉴别五种毛孢子菌的方法

技术领域

本发明涉及高分辨率熔解曲线分析方法的应用，具体指一种基于高分辨率熔解曲线鉴别五种毛孢子菌的方法，所述的五种毛孢子菌分别是阿萨希毛孢子菌(Trichosporonasahii)，皮瘤毛孢子菌(Trichosporon inkin)，真皮毛孢子菌(Trichosporon dermatis)，Trichosporon montevideense和Trichosporon dohaense。

背景技术

毛孢子菌(Trichosporon spp.)又称丝孢酵母，属于真菌界，担子菌门，广泛分布于自然界，主要是热带和温带地区，可在土壤、水及动物粪便中找到，也可寄居在人类的皮肤、呼吸道及胃肠道中，是皮肤黏膜的常见定植菌。毛孢子菌属于一种机会性致病真菌，在人免疫系统功能正常时，通常不致病，一旦免疫功能低下，即会导致各种机会性感染。近年来，毛孢子菌感染已成为除念珠菌外致人类播撒性感染的第二大酵母菌感染，这主要与恶性肿瘤的发病率升高，器官移植的广泛开展，免疫抑制疗法、广谱抗生素、侵入性医疗操作的大量应用以及临床检测及诊断水平的提高等因素有关。

毛孢子菌的种类众多，常见的致病菌株主要有阿萨希毛孢子菌(T.asahii)，粘质毛孢子菌(T.mucoides)，星形毛孢子菌(T.asteroids)，皮瘤毛孢子菌(T.inkin)，皮肤毛孢子菌(T.cutaneum)及卵形毛孢子菌(T.ovoides)，还包括一些少见菌种，如真皮毛孢子菌(T.dermatis)，T.montevideense，T.japonicum等。这些致病菌株即可引起浅部感染，如毛发、指甲、皮肤的白毛结节病，还易导致免疫缺陷患者系统性或播撒性感染，特别是血液恶性肿瘤患者的发病率较高。播撒性毛孢子菌感染的致死率高，常伴有急性进行性呼吸衰竭、肾衰竭、播撒性血管内凝血等症状，预后较差。据报道，不同的毛孢子菌所致的感染类型存在差异，如皮瘤毛孢子菌主要引起毛结节病和侵袭性感染，阿萨希毛孢子菌和Trichosporonmontevideense主要可引起深部真菌感染和夏季型超敏性肺炎，真皮毛孢子菌可引起真菌血症或系统性真菌感染。

真菌核糖体基因转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)，又叫内转录间隔区，是位于真菌核糖体DNA(rDNA)上18S和28S基因之间的区域片段。rDNA在种内由于基因的流动而经常表现出很高的同源性，在种间则保持着各种程度的变异。变异的多少能够反映生物进化上属内种间亲缘关系的远近。ITS1和ITS2作为非编码区，承受的进化选择压力较小，其保守性基本上表现为种内相对一致，种间差异比较明显。这种特点使ITS适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。

毛孢子菌的鉴定以往主要是通过形态学及营养生理学，观察其菌落外观形态和镜下形态作出初步判读，然后进一步作API 20C AUX鉴定，但方法较为局限，难以鉴定到种，且耗时费力。除形态学培养鉴定外，通过引物对rDNA ITS和ITS2进行PCR扩增后测序，将测序结果在NCBI进行基本局部比对，根据比对结果判断菌种。但该方法对PCR扩增片段的产量和纯度要求较高，需要借助专门的基因测序分析系统完成，耗时长，成本较高。此外，还有基于rDNA-ITS片段的PCR-RFLP技术，虽然可快速、准确鉴定，但由于毛孢子菌rDNA-ITS片段的种间差异较小，对于毛孢子菌的种间鉴定准确性亦有较大影响。而毛孢子菌感染对免疫功能低下的病人有严重的生命威胁，因此，需要一种简单快速且准确度高的方法对毛孢子菌进行鉴别。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种基于高分辨率熔解曲线鉴别五种毛孢子菌的方法。所述五种毛孢子菌为阿萨希毛孢子菌、皮瘤毛孢子菌、真皮毛孢子菌、Trichosporon montevideense和Trichosporon dohaense。本发明方法操作简单，具有灵敏度高、特异性好、成本低、快速、高通量检测等优点，PCR扩增后无需进行电泳，实现闭管操作，防止交叉污染。

为了实现上述目的，本发明提供一种基于高分辨率熔解曲线鉴别五种毛孢子菌的方法，所述五种毛孢子菌为阿萨希毛孢子菌、皮瘤毛孢子菌、真皮毛孢子菌、Trichosporonmontevideense和Trichosporon dohaense，所述基于高分辨率熔解曲线鉴别五种毛孢子菌的方法使用一对能同时鉴别五种毛孢子菌的特异性引物对，所述特异性引物对的序列如下：

上游引物5’-CACTTACACCTGTGAACTGT-3’

下游引物5’-AGCCAAGAGATCCGTTGTTG-3’。

作为优选方案，上述基于高分辨率熔解曲线鉴别五种毛孢子菌的方法具体步骤如下：

1)、提取待测样品DNA；

2)、利用上述特异性引物对，以步骤1)的待测样品DNA为模板，建立高分辨率熔解曲线反应体系：

2×Mix Taqman PCR Master 15μL，

上游引物5’-CACTTACACCTGTGAACTGT-3’0.9μL，

下游引物5’-AGCCAAGAGATCCGTTGTTG-3’0.9μL，

Rox Reference DyeⅡ(100×)0.3μL，

Evagreen，20×in Water 1.5μL，

待测样品DNA模板2μL，

灭菌纯水9.4μL；

3)、高分辨率熔解曲线反应程序：

3.1)、PCR反应阶段：

将上述步骤2)建立的高分辨率熔解曲线反应体系使用实时荧光定量PCR反应程序进行PCR扩增，扩增条件为：预变性95℃10min；95℃15s，60℃25s，72℃25s，共35个循环；其中，以1.6℃/s速率升降温；

3.2)、高分辨率熔解曲线反应阶段：

上述步骤3.1)结束后直接运行高分辨率熔解曲线反应阶段程序，此阶段反应程序条件为：95℃10s，然后以1.6℃/s速率降温至60℃1min，再以0.025℃/s速率升温至95℃15s，继续以1.6℃/s速率降温60℃15s；

其中，在所述步骤3)中，同时连续检测荧光强度；以步骤3.2)中荧光信号对温度的一阶负导数为纵坐标，温度为横坐标，得到熔解曲线图。

进一步地，上述一种基于高分辨率熔解曲线鉴别五种毛孢子菌的方法的判断原则是，在所述步骤3.2)得到的熔解曲线图中，每一种特异性扩增产物Tm值的熔解曲线代表一种特定的毛孢子菌：

在75.4-78.0℃范围内荧光信号迅速降低为Trichosporon montevideense检出，所述Trichosporon montevideense扩增产物的Tm值为77.20℃；

在76.1-78.5℃范围内荧光信号迅速降低为真皮毛孢子菌(T.dermatis)检出，所述真皮毛孢子菌扩增产物的Tm值为77.73℃；

在76.5-78.6℃范围内荧光信号迅速降低为Trichosporon dohaense检出，所述Trichosporon dohaense扩增产物的Tm值为77.93℃；

在76.7-79.0℃范围内荧光信号迅速降低为阿萨希毛孢子菌(T.asahii)检出，所述阿萨希毛孢子菌扩增产物Tm的值为78.29℃；

在77.5-80.2℃范围内荧光信号迅速降低为皮瘤毛孢子菌(T.inkin)检出，所述皮瘤毛孢子菌扩增产物的Tm值为79.38℃。

本发明方法通过研究阿萨希毛孢子菌(T.asahii)，皮瘤毛孢子菌(T.inkin)，真皮毛孢子菌(T.dermatis)，Trichosporon montevideense和Trichosporon dohaense这五种毛孢子菌的基因组序列，在ITS序列中寻找差异性靶序列，在考虑序列GC含量的同时依据以下公式计算引物Tm值，选取靶序列片段和长度合成引物，经反复试验得到一对能够同时区分上述五种毛孢子菌的最佳引物，使用该对引物通过高分辨率熔解曲线(HRM)分析技术能够特异地鉴别上述五种毛孢子菌。

高分辨率熔解曲线(High resolution melting,HRM)分析技术，其原理是通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR产物的结合情况，DNA片段单个碱基的差异都会使熔解温度(以下简称Tm)发生变化，从而使DNA片段在升温解链过程中形成不同的熔解曲线，进而区分不同菌种。HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，与其他遗传分型技术相比，具有操作简单、灵敏度高、特异性好、成本低、快速、高通量检测等优点，且结果准确，实现了真正的闭管操作。

本发明方法应用高分辨率熔解曲线分析技术，通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR产物的结合情况，ITS基因序列差异会使双链DNA的Tm值发生变化，从而双链DNA在升温过程中先后解链，形成不同的熔解曲线形状。荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度和时间曲线上就能判断是否存在有差异的ITS基因片段，且ITS基因序列的差异会影响熔解曲线的峰形，能有效区分不同菌种的ITS基因。

本发明方法经验证具有较高的灵敏度和特异性，对上述五种毛孢子菌检测下限为80-100拷贝，且标准峰形区分明显，能有效区分前述五种不同毛孢子菌的ITS序列。

本发明方法与现有技术方法相比具有以下有益效果：

本发明方法基于高分辨率熔解曲线分析技术，采用全密闭反应管检测与结果分析，无需进行后续PCR产物电泳检测与分析，简化操作流程、降低实验检测成本，提高检测效率、避免样品和环境的交叉污染，采用所设计的特异性引物，具有良好的特异性，保证该方法能够特异性鉴别阿萨希毛孢子菌(T.asahii)，皮瘤毛孢子菌(T.inkin)，真皮毛孢子菌(T.dermatis)，Trichosporon montevideense和Trichosporon dohaense，避免了假阳性；本发明方法与其他鉴别上述五种真菌的方法相比，操作简单，具有灵敏度高、特异性好、成本低、快速、高通量检测等优点，PCR扩增后无需进行电泳，实现闭管操作，防止交叉污染。本发明方法可用于临床诊断、环境卫生监测、食品安全等方面对上述五种真菌的鉴别，从而为毛孢子菌的感染治疗、环境卫生和食品安全的监测提供确实可靠的依据。

附图说明

图1为本发明鉴别五种毛孢子菌的高分辨率熔解曲线图谱；

图中熔解曲线在75.4-78.0℃范围内荧光信号迅速降低为Trichosporonmontevideense检出；熔解曲线在76.1-78.5℃范围内荧光信号迅速降低为真皮毛孢子菌检出；熔解曲线在76.5-78.6℃范围内荧光信号迅速降低为Trichosporondohaense检出；熔解曲线在76.7-79.0℃范围内荧光信号迅速降低为阿萨希毛孢子菌检出；熔解曲线在77.5-80.2℃范围内荧光信号迅速降低为皮瘤毛孢子菌检出。

图2为本发明方法灵敏度验证结果图；

以10倍系列稀释阿萨希毛孢子菌、皮瘤毛孢子菌、真皮毛孢子菌、Trichosporonmontevideense、Trichosporon dohaense的DNA为模板进行检测，10倍系列稀释的该五种毛孢子菌DNA模板的检测下限为80-100拷贝。

图3为本发明方法特异性验证结果图。

阿萨希毛孢子菌、皮瘤毛孢子菌、真皮毛孢子菌、Trichosporon montevideense和Trichosporon dohaense五种毛孢子菌均出现扩增且出现相应的熔解曲线，非毛孢子菌株则未出现扩增。

具体实施方式

以下通过实施例结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等。

【实施例1】基于高分辨率熔解曲线鉴别五种毛孢子菌的方法

(一)基于高分辨率熔解曲线鉴别五种毛孢子菌的方法步骤如下：

1.经仔细研究阿萨希毛孢子菌(T.asahii)，皮瘤毛孢子菌(T.inkin)，真皮毛孢子菌(T.dermatis)，Trichosporon montevideense和Trichosporon dohaense这五种毛孢子菌的基因组序列，在ITS序列中寻找差异性靶序列，通过精心设计和筛选，设计一对特异性引物，该引物的设计无法通过计算机软件自动得出，需要依据丰富的经验选取靶序列片段和长度，在考虑序列GC含量的同时依据以下公式计算引物Tm值，选取靶序列片段和长度合成引物，经反复试验得到一对能够同时区分上述五种毛孢子菌的最佳引物，使用该对引物通过HRM技术能够特异地鉴别上述五种毛孢子菌。

所述特异性引物对核苷酸序列如下：

上游引物(F)5’-CACTTACACCTGTGAACTGT-3’

下游引物(R)5’-AGCCAAGAGATCCGTTGTTG-3’

2.提取上述五种毛孢子菌样本的基因组DNA：

取适量上述五种毛孢子菌于装有600ul裂解液的2ml离心管中，95℃加热10min，冷却至室温后12000rpm离心10min，取上清即得到待测DNA。电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测。

3.利用上述特异性引物对，以步骤2的五种毛孢子菌的DNA为模板，建立高分辨率熔解曲线反应体系：

2×Mix Taqman PCR Master 15μL，

上游引物5’-CACTTACACCTGTGAACTGT-3’0.9μL，

下游引物5’-AGCCAAGAGATCCGTTGTTG-3’0.9μL，

Rox Reference DyeⅡ(100×)0.3μL，

Evagreen，20×in Water 1.5μL，

待测样品DNA模板2μL，

灭菌纯水9.4μL；

4.在ABI QuantStudio 6flex荧光定量PCR仪上进行反应，反应程序条件设定如下表1：

表1

其中，在高分辨率熔解曲线(HRM)反应阶段中升降温速率设为，95℃10s后以1.6℃/s速率降温至60℃1min，再以0.025℃/s速率升温至95℃15s，最后以1.6℃/s速率降温60℃15s；

5.利用QuantStudio^TM Real-Time PCR Software软件进行结果分析

在上述步骤4中，同时连续检测荧光强度；以高分辨率熔解曲线反应阶段中的荧光信号对温度的一阶负导数为纵坐标，温度为横坐标，得到熔解曲线图，通过不同曲线的形状变化展现不同毛孢子菌的ITS序列差异，每一种特异性扩增产物Tm值的熔解曲线代表一种特定的毛孢子菌：

如图1所示，熔解曲线在75.4-78.0℃范围内荧光信号迅速降低为Trichosporonmontevideense检出，所述Trichosporon montevideense扩增产物的Tm值为77.20℃；熔解曲线在76.1-78.5℃范围内荧光信号迅速降低为真皮毛孢子菌检出，所述真皮毛孢子菌扩增产物的Tm值为77.73℃；熔解曲线在76.5-78.6℃范围内荧光信号迅速降低为Trichosporon dohaense检出，所述Trichosporondohaense扩增产物的Tm值为77.93℃；熔解曲线在76.7-79.0℃范围内荧光信号迅速降低为阿萨希毛孢子菌检出，所述阿萨希毛孢子菌扩增产物的Tm值为78.29℃；熔解曲线在77.5-80.2℃范围内荧光信号迅速降低为皮瘤毛孢子菌检出，所述皮瘤毛孢子菌扩增产物的Tm值为79.38℃。

以此熔解曲线图作为鉴别上述五种毛孢子菌的标准曲线图。

(二)基于高分辨率熔解曲线鉴别五种毛孢子菌的方法的灵敏度验证

以10倍系列稀释的五种毛孢子菌(阿萨希毛孢子菌(T.asahii)，皮瘤毛孢子菌(T.inkin)，真皮毛孢子菌(T.dermatis)，Trichosporon montevideense和Trichosporondohaense)的DNA为模板，采用上述基于高分辨率熔解曲线鉴别五种毛孢子菌的方法进行检测。

结果表明，如图2所示，该方法对五种毛孢子菌DNA模板的检测下限80-100拷贝，具有很高的灵敏度。

(三)基于高分辨率熔解曲线鉴别五种毛孢子菌的方法的特异性验证

1.待测真菌：Trichosporon asahii,Trichosporon inkin,Trichosporondermatis,Trichosporon montevideense,Aspergillus versicolor,Talaromycesfuniculosus,Alternaria alternata,Cladosporium sphaerospermum,Trichophytoninterdigitale,Aspergillus sydowii,Aspergillus flavus,Candida parapsilosis,Microsporum canis,Candida tropicalis,Kodamaea ohmeri,Trichophyton rubrum,Fusarium solani,Cladosporium halotolerans,Curvularia lunata,Hortaeawerneckii,Candida albicans,Talaromyces pinophilus,Trichophyton violaceum。

2.采用PCR测序法，对上述多种待测真菌进行鉴定：使用J.B.Stielow等(StielowJB,Levesque CA,Seifert KA,et al.One fungus,which genes？Development andassessment of universal primers for potential secondary fungal DNAbarcodes.Persoonia.2015；35:242–63.)中所采用引物对(ITS15’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)对待测真菌菌株的ITS区域准确扩增，得到PCR产物后进行测序，将测序结果在NCBI中进行比对，鉴定其种类，此鉴定结果作为标准结果。

3.采用本发明基于高分辨率熔解曲线鉴别五种毛孢子菌的方法对上述多种待测真菌进行鉴定，并将该鉴定结果与步骤2采用PCR测序法鉴定的标准结果进行比对，结果见下表2:

表2

结果结论：(1)采用本发明方法的鉴别结果如图3所示，阿萨希毛孢子菌(T.asahii)，皮瘤毛孢子菌(T.inkin)，真皮毛孢子菌(T.dermatis)，Trichosporonmontevideense和Trichosporon dohaense五种毛孢子菌均出现扩增且出现相应的熔解曲线，其余非毛孢子菌株则未出现扩增；(2)与传统PCR测序法鉴定结果进行比较，如上表2所示，本发明方法鉴别出的五种毛孢子菌结果均与PCR测序法鉴定结果一致；而非毛孢子菌均未扩增。结果表明本发明方法能特异、有效地用于上述五种毛孢子菌的区分鉴定。

【实施例2】基于高分辨率熔解曲线鉴别五种毛孢子菌的方法的应用

1.选取来自海南省5个县市医院60个浅部真菌感染患者样本，使用含0.5％氯霉素的马铃薯葡萄糖琼脂基(PDA)，在28℃恒温条件下进行分离培养作为待测真菌样本。

2.提取上述分离培养后的待测真菌样本的基因组DNA，采用基于高分辨率熔解曲线鉴别五种毛孢子菌的方法，对待测样本进行鉴别，并利用QuantStudio^TMReal-Time PCRSoftware软件进行结果分析，通过与实施例1的标准曲线进行比较，确定鉴别结果。

3.鉴别结果：阳性结果有12个，样本编号及鉴别结果名称见下表3，其余48个样本未扩增：

表3

样本编号	鉴定阳性结果
		01	标准曲线相比较，鉴定为皮瘤毛孢子菌
04	标准曲线相比较，鉴定为阿萨希毛孢子菌
		06	标准曲线相比较，鉴定为阿萨希毛孢子菌
09	标准曲线相比较，鉴定为皮瘤毛孢子菌
		11	标准曲线相比较，鉴定为阿萨希毛孢子菌
14	标准曲线相比较，鉴定为阿萨希毛孢子菌
		16	标准曲线相比较，鉴定为阿萨希毛孢子菌
20	标准曲线相比较，鉴定为阿萨希毛孢子菌
		21	标准曲线相比较，鉴定为真皮毛孢子菌
24	标准曲线相比较，鉴定为阿萨希毛孢子菌
		27	标准曲线相比较，鉴定为Trichosporon dohaense
30	标准曲线相比较，鉴定为真皮毛孢子菌

结果结论：同时对于上述样本采用PCR测序方法来验证，结果显示两种方法鉴别出的五种毛孢子菌结果一致。因此，本发明方法准确性好、特异性高、无假阴性或无假阳性。

序列表

<110> 武汉科技大学

<120> 基于高分辨率熔解曲线鉴别五种毛孢子菌的方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cacttacacc tgtgaactgt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agccaagaga tccgttgttg 20

<210> 3

<211> 512

<212> DNA

<213> 真皮毛孢子菌(Trichosporon dermatis)

<400> 3

ggggacttag tgattgctct ttgagcgtta actatatcca tctacacctg tgaactgttg 60

attgacttcg gtcaattact tttacaaaca ttgtgtaatg aacgtcatgt tattataaca 120

aaaataactt tcaacaacgg atctcttggc tctcgcatcg atgaagaacg cagcgaaatg 180

cgataagtaa tgtgaattgc agaattcagt gaatcatcga atctttgaac gcaacttgcg 240

ctctctggta ttccggagag catgcctgtt tgagtatcat gaaatctcaa ccattagggt 300

ttcttaatgg cttggatttg ggcgctgcca cttgcctggc tcgccttaaa agagttagcg 360

tattaacttg tcgatctggc gtaataagtt tcgctggtgt agacttgaga agtgcgcttc 420

taatcgtctt cggacaattc ttgaactctg gtctcaaatc aggtaggact acccgctgaa 480

cttaagcata tcaataagcc ggaggaaata gg 512

<210> 4

<211> 524

<212> DNA

<213> 阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii)

<400> 4

ggaacattag tgattgcctt tataggctta taactatatc cacttacacc tgtgaactgt 60

tctactactt gacgcaagtc gagtattttt acaaacaatg tgtaatgaac gtcgttttat 120

tataacaaaa taaaactttc aacaacggat ctcttggctc tcgcatcgat gaagaacgca 180

gcgaattgcg ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc 240

agcttgcgct ctctggtatt ccggagagca tgcctgtttc agtgtcatga aatctcaacc 300

actagggttt cctaatggat tggatttggg cgtctgcgat ttctgatcgc tcgccttaaa 360

agagttagca agtttgacat taatgtccgg tgtaataagt ttcactgggt ccattgtgtt 420

gaagcgtgct tctaatcgtc cgcaaggaca attactttga ctctggcctg aaatcaggta 480

ggactacccg ctgaacttaa gcatatcaat aggccggagg aaaa 524

<210> 5

<211> 525

<212> DNA

<213> Trichosporon dohaense

<400> 5

ggaaaattag tgattgcctt tataggctta aaactatatc cacttacacc tgtgaactgt 60

tctgttacct gatgcaaatc aggtattttt acaaacaatg tgtaatgaac gtcgttttat 120

tataacaaaa taaaactttc aacaacggat ctcttggctc tcgcatcgat gaagaacgca 180

gcgaattgcg ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc 240

agcttgcgct ctctggtatt ccggagagca tgcctgtttc agtgtcatga aatctcaacc 300

actagggttt cctaatggat tggatttggg cgtctgcgat tgtctaatcg ctcgccttaa 360

aagagttagc aagtttgaca ttaatgtctg gtgtaataag tttcactggg tccattgtgt 420

tgaagcgtgc ttctaatcgt ccgcaaggac aattactttg actctggcct gaaatcaggt 480

aggactaccc gctgaactta agcatatcaa taagccggag gaaca 525

<210> 6

<211> 517

<212> DNA

<213> Trichosporon montevideense

<400> 6

tgaaattagt gattgcctta ttggcttaac tatatccatc tacacctgtg aactgtttga 60

ttgaatcttc ggattcgatt ttatacaaac attgtgtaat gaacgtcatt atattataac 120

aaaaaaaaac tttcaacaac ggatctcttg gctctcgcat cgatgaagaa cgcagcgaaa 180

tgcgataagt aatgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga acgcaacttg 240

cgctctctgg tattccggag agcatgcctg tttgagtgtc atgaaatctc aaccattagg 300

gtttcttaat ggcttggatt tggaggtttg ccagtctgac tggctcctct taaaagagtt 360

agcaagttga actattgcta tctggcgtaa taagtttcgc tggaatggta ttgtgaagcg 420

tgcttctaat cgtcttcgga caattttttg actctggcct caaatcaggt aggactaccc 480

gctgaactta agcatatcaa aaggccggag gaatgat 517

<210> 7

<211> 522

<212> DNA

<213> 皮瘤毛孢子菌(Trichosporon inkin)

<400> 7

gaaaaattag tgattgcctt tacaggctta actatatcca cttacacctg tgaactgttc 60

taccacttga cgcaagtcga gtgcttttac aaacaatgtg taatgaacgt cgttttatta 120

taacaaaata aaactttcaa caacggatct cttggctctc gcatcgatga agaacgcagc 180

gaattgcgat aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcag 240

cttgcgctct ctggtattcc ggagagcatg cctgtttcag tgtcatgaaa tctcaaccac 300

tagggtttcc taatggattg gatttgggcg tcttgcgatc tctgatcgct cgccttaaaa 360

gagttagcaa gtttgacatt catgtctggt gtaataagtt tcactgggtc catggtgttg 420

aagcgtgctt ctaatcgtcc gcaaggacaa ttactttgac tctggcctga aatcaggtag 480

gactacccgc tgaacttaag catatcaata agcggaggaa aa 522

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (3)

1.一种基于高分辨率熔解曲线鉴别五种毛孢子菌的方法，其特征在于：所述五种毛孢子菌为阿萨希毛孢子菌、皮瘤毛孢子菌、真皮毛孢子菌、Trichosporon montevideense和Trichosporon dohaense，所述基于高分辨率熔解曲线鉴别五种毛孢子菌的方法使用一对能同时鉴别五种毛孢子菌的特异性引物对，所述特异性引物对的序列如下：

上游引物5’-CACTTACACCTGTGAACTGT-3’

下游引物5’-AGCCAAGAGATCCGTTGTTG-3’。

2.如权利要求1所述的基于高分辨率熔解曲线鉴别五种毛孢子菌的方法，其特征在于：所述方法具体步骤如下：

1)、提取待测样品DNA；

2)、利用所述特异性引物对，以步骤1)的待测样品DNA为模板，建立高分辨率熔解曲线反应体系：

2×Mix Taqman PCR Master 15μL，

上游引物5’-CACTTACACCTGTGAACTGT-3’0.9μL，

下游引物5’-AGCCAAGAGATCCGTTGTTG-3’0.9μL，

Rox Reference DyeⅡ(100×)0.3μL，

Evagreen，20×in Water 1.5μL，

待测样品DNA模板2μL，

灭菌纯水9.4μL；

3)、高分辨率熔解曲线反应程序：

3.1)、PCR反应阶段：

将上述步骤2)建立的高分辨率熔解曲线反应体系使用实时荧光定量PCR反应程序进行PCR扩增，扩增条件为：预变性95℃10min；95℃15s，60℃25s，72℃25s，共35个循环；其中，以1.6℃/s速率升降温；

3.2)、高分辨率熔解曲线反应阶段：

上述步骤3.1)反应程序结束后直接运行高分辨率熔解曲线反应阶段程序，此阶段反应程序条件为：95℃10s，然后以1.6℃/s速率降温至60℃1min，再以0.025℃/s速率升温至95℃15s，继续以1.6℃/s速率降温60℃15s；

其中，在所述步骤3)中，同时连续检测荧光强度；以步骤3.2)中的荧光信号对温度的一阶负导数为纵坐标，温度为横坐标，得到熔解曲线图。

3.如权利要求2所述的基于高分辨率熔解曲线鉴别五种毛孢子菌的方法，其特征在于：所述方法鉴别结果的判断原则是，在所述步骤3.2)得到的熔解曲线图中，每一种特异性扩增产物Tm值的熔解曲线代表一种特定的毛孢子菌：

熔解曲线在75.4-78.0℃范围内荧光信号迅速降低的为Trichosporon montevideense检出，所述Trichosporon montevideense扩增产物的Tm值为77.20℃；

熔解曲线在76.1-78.5℃范围内荧光信号迅速降低的为真皮毛孢子菌检出，所述真皮毛孢子菌扩增产物的Tm值为77.73℃；

熔解曲线在76.5-78.6℃范围内荧光信号迅速降低的为Trichosporon dohaense检出，所述Trichosporon dohaense扩增产物的Tm值为77.93℃；

熔解曲线在76.7-79.0℃范围内荧光信号迅速降低的为阿萨希毛孢子菌检出，所述阿萨希毛孢子菌扩增产物的Tm值为78.29℃；

熔解曲线在77.5-80.2℃范围内荧光信号迅速降低的为皮瘤毛孢子菌检出，所述皮瘤毛孢子菌扩增产物的Tm值为79.38℃。