CN110283760A - 一种鳗鲡源脆弱拟杆菌的发酵培养方法 - Google Patents

一种鳗鲡源脆弱拟杆菌的发酵培养方法 Download PDF

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吴少坤
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Abstract

本发明提供一种鳗鲡源脆弱拟杆菌的发酵培养方法，步骤如下：取鳗鲡源脆弱拟杆菌接种于装有种子活化培养基的厌氧管中，25‑38℃下静态厌氧活化培养24小时；将活化培养后的菌液，接入含有增殖培养基厌氧管中，接种量为2％，25‑38℃下再增殖培养9‑14小时，得到增殖培养菌液；将增殖培养菌液以2‑6％接种量接种于含有发酵培养基的三角瓶中，三角瓶中溶液pH为7‑9，将三角瓶置于25‑37℃恒温培养箱中静置培养。本发明获得的脆弱拟杆菌浓度大、活菌量高，同时操作过程简单，还能够减少培养过程中对脆弱拟杆菌造成的污染，并且节约时间和减少培养基的浪费。

Description

一种鳗鲡源脆弱拟杆菌的发酵培养方法
【技术领域】
本发明涉及微生物发酵培养领域，具体涉及一种鳗鲡源脆弱拟杆菌的发酵培养方法。
【背景技术】
欧洲鳗鲡原产于大西洋，栖息河川、河口、潟湖，喜钻洞潜居，以虾、蟹、贝、海虫维生的肉食者。1993年，中国大陆引进20吨欧洲鳗苗试养。我国是世界上最大的鳗鲡生产国，早在2003年，鳗鲡的年产量就已高达17.817万吨，位居世界首位，因此鳗鲡养殖业在整个水产行业里占有举足轻重的地位。
脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)作为拟杆菌属的模式种(分产肠毒素型和非产肠毒素型)，正常定植于哺乳动物的肠道中。随着对其研究的不断深入，学者们渐渐发现脆弱拟杆菌并非仅仅只是一种条件致病菌，也是一种益生菌，在对免疫调节和糖代谢方面起到了至关重要的作用(特别是来自欧洲鳗鲡的脆弱拟杆菌)。
现有获得大量的脆弱拟杆菌的方法如下：
将置于-80℃保藏的脆弱拟杆菌复苏纯化后，用接种环挑取单菌落于BPRMB(脆弱拟杆菌活化培养基，购自青岛海博生物技术有限公司)肉汤中，170r/min、28℃恒温震荡培养24h。将培养好的菌液5000rpm，离心10min，弃上清，用无菌PBS重悬洗涤沉淀3次。
即现有技术要获得大量的脆弱拟杆菌是采用离心浓缩的方法。采用离心浓缩方法获得大量的脆弱拟杆菌需培养大量的菌液，之后重复多次的离心。在经过离心后，脆弱拟杆菌会老化，造成活菌量低。在整个操作过程中费时耗力，而且过程耗费大量的培养基，一定程度上也造成浪费和费用高的问题。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题，在于提供一种鳗鲡源脆弱拟杆菌的发酵培养方法，该方法获得的脆弱拟杆菌浓度大、活菌量高，同时操作过程简单，还能够减少培养过程中对脆弱拟杆菌造成的污染，并且节约时间和减少培养基的浪费。
本发明是这样实现的：
一种鳗鲡源脆弱拟杆菌的发酵培养方法，步骤如下：1)脆弱拟杆菌活化：
取鳗鲡源脆弱拟杆菌接种于装有种子活化培养基的厌氧管中，25-38℃下静态厌氧活化活化培养24小时；所述活化培养基选用脆弱拟杆菌活化培养基肉汤；
2)增殖培养：
将活化培养后的菌液，接入含有增殖培养基厌氧管中，接种量为2％，25-38℃下再增殖培养9-14小时，得到增殖培养菌液；
其中脆弱拟杆菌增殖培养基配方如下：葡萄糖10g/L，胰蛋白胨10g/L，蛋白胨10g/L，大豆蛋白胨5.0g/L，酵母浸粉3.0g/L，NaCl 3.0g/L，K2HPO4 2.5g/L，硫代乙醇酸钠0.30g/L，半胱氨酸盐酸盐0.30g/L，pH 7.0；
3)发酵培养：
将增殖培养菌液以2-6％接种量接种于含有发酵培养基的三角瓶中，三角瓶中溶液pH为7-9，将三角瓶置于28-37℃恒温培养箱中静置培养；
其中发酵培养基配方如下：可溶性淀粉20g/L、酵母浸粉40g/L、FeSO4 12g/L、NaCl3g/L、K2HPO4 2.5g/L、MgSO4 0.24g/L、CaCO31g/L，余量为水。
进一步地，所述步骤2)中，增殖培养时间为9小时。
进一步地，所述步骤3)中，发酵培养的接种量为4％，pH值为7.0，发酵培养温度为34℃。
本发明具有如下优点：
本发明将脆弱拟杆菌活化后的种子液接种于发酵培养基中，采用发酵的方法获得大量脆弱拟杆菌，脆弱拟杆菌菌体浓度达到最大值为5.56×108个/mL，且活菌含量高达活菌含量为5.0×108CFU/mL；因此，本发明克服了现有技术需经过多次重复离心浓缩的方法获得大量脆弱拟杆菌，导致菌液老化的活菌数量低的问题。另外，本发明采用发酵培养获得脆弱拟杆菌的过程简单，能够减少培养过程中对脆弱拟杆菌造成的污染，并且节约时间和减少培养基的浪费。
【具体实施方式】
本发明涉及一种鳗鲡源脆弱拟杆菌的发酵培养方法，步骤如下：1)脆弱拟杆菌活化：
取鳗鲡源脆弱拟杆菌接种于装有种子活化培养基的厌氧管中，25-38℃下静态厌氧活化活化培养24小时；所述活化培养基选用脆弱拟杆菌活化培养基肉汤；
2)增殖培养：
将活化培养后的菌液，接入含有增殖培养基厌氧管中，接种量为2％，25-38℃下在增殖培养9-14小时，得到增殖培养菌液；
其中脆弱拟杆菌增殖培养基配方如下：葡萄糖10g/L，胰蛋白胨10g/L，蛋白胨10g/L，大豆蛋白胨5.0g/L，酵母浸粉3.0g/L，NaCl 3.0g/L，K2HPO4 2.5g/L，硫代乙醇酸钠0.30g/L，半胱氨酸盐酸盐0.30g/L，pH 7.0；
3)发酵培养：
将增殖培养菌液以2-6％接种量接种于含有发酵培养基的三角瓶中，三角瓶中溶液pH为7-9，将三角瓶置于25-37℃恒温培养箱中静置培养；
其中发酵培养基配方如下：可溶性淀粉20g/L、酵母浸粉40g/L、FeSO4 12g/L、NaCl3g/L、K2HPO4 2.5g/L、MgSO4 0.24g/L、CaCO31g/L，余量为水。
较优的，所述步骤2)中，增殖培养时间为9小时；所述步骤3)中，发酵培养的接种量为4％，pH值为7.0，发酵培养温度为34℃。
以下结合具体实施例对本发明做进一步地说明。
实施例1、
1、鳗鲡源脆弱拟杆菌的分离鉴定：
(1)肠道样品的制备：自保温箱中取出新鲜鳗鲡(取自厦门集美大学水产学院海水养殖场)，以一定剂量的MS-222麻醉鳗鲡后，用75％酒精擦拭鱼体体表并将其放置于超净工作台上。用无菌解剖剪自鳗鲡鱼体肛门处剪至鳗鲡嘴部剖取鳗鲡肠道于干净的解剖盘中，去除肠道外围的脂肪及血液，以无菌剪剪开肠道，使用无菌解剖刀轻轻刮取肠道中内含物(包括肠道黏膜和肠道内容物)，放到无菌离心管中，用灭菌的PBS缓冲液冲洗肠道内壁并将冲洗液与刮取的内含物混合，充分涡旋振荡。从上述肠道样品混合液中吸取0.1mL于无菌离心管中，冷藏待后续细菌分离实验。
(2)培养基的制备：BBE(类杆菌-胆汁-七叶苷琼脂，购自青岛海博生物技术有限公司)加水溶解后，培养液底部通氮气10min除氧，移走氮气管后迅速封好锡箔纸，高温灭菌后制备平板。
(3)肠道脆弱拟杆菌的分离：将冷藏的肠道样品混合液用灭菌除氧的生理盐水稀释至合适浓度，取稀释液0.1mL涂布于BBE平板内，倒置于厌氧培养袋中，37℃培养48h。待菌体长出后，挑取不同形态的菌株，通过反复划线法分离纯化三次得到已纯化的单菌落。挑取纯化后的单菌落于含有1mL 20％甘油保种液的冻存管，分存6管于-80℃超低温冰箱保藏。
(4)细菌种属鉴定：参照天根公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取上述菌株的基因组DNA，以其为模板，利用细菌16S rDNA通用引物(购自厦门铂瑞生物科技有限公司)对上述菌株DNA进行PCR扩增。用1％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测质量后送厦门铂瑞生物科技有限公司测序。测序结果于NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中进行序列比对，鉴定菌种。
(5)测序鉴定结果：该菌株的16S rDNA序列长度为1000bp，将测序结果与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比对，结果表明，该该菌株的序列与登录号为mm的脆弱拟杆菌的16S rDNA序列同源性最高，相似性为99％，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定菌属于拟杆菌属(Bacteroides)，为脆弱拟杆菌菌(Bacteroidesfragilis)。
2、鳗鲡源脆弱拟杆菌的发酵培养方法，步骤如下：
1)脆弱拟杆菌活化：活化培养基选用脆弱拟杆菌活化培养基肉汤(上海邦景实业有限公司)。称取本品29.4g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，分装，121℃高压灭菌15分钟，备用。
取-20℃甘油管保藏的欧洲鳗鲡源脆弱拟杆菌菌种200μL接种于装有9mL种子活化培养基的厌氧管中，37℃条件下静态厌氧活化培养24h。
2)增殖培养：
将保存于-20℃甘油管保藏的菌液活化培养24h后，接入含有增殖培养基的18×180mm厌氧管中，每支装液量10mL，接种量2％(200μL)，放入37℃培养9h；
其中脆弱拟杆菌增殖培养基配方如下：葡萄糖10g/L，胰蛋白胨10g/L，蛋白胨10g/L，大豆蛋白胨5.0g/L，酵母浸粉3.0g/L，NaCl 3.0g/L，K2HPO4 2.5g/L，硫代乙醇酸钠0.30g/L，半胱氨酸盐酸盐0.30g/L，pH 7.0；121℃灭菌20min。
3)发酵培养：
在增殖培养基的厌氧管中(每支装液量10mL)增殖9h后，以4％接种量(体积比)接种于250mL三角瓶中，三角瓶装液量100mL，pH为7.0；将三角瓶置于34℃恒温培养箱中静置培养；
其中发酵培养基配方如下：可溶性淀粉20g/L、酵母浸粉40g/L、FeSO4 12g/L、NaCl3g/L、K2HPO4 2.5g/L、MgSO4 0.24g/L、CaCO31g/L，余量为水；
恒温静置培养24h后用血球计数板测定菌体浓度，脆弱拟杆菌菌体浓度达到最大值为5.56×108个/mL。取10mL发酵后的脆弱拟杆菌菌液，设置3个重复，采用平板菌落计数后确认发酵培养中脆弱拟杆菌活菌含量为5.0×108CFU/mL。
实施例2
2、鳗鲡源脆弱拟杆菌的发酵培养方法，步骤如下：
步骤2)中，增殖培养时间为12小时；
步骤3)中，以2％接种量(体积比)接种于250mL三角瓶中，三角瓶装液量100mL，pH为8.0；将三角瓶置于28℃恒温培养箱中静置培养；
其余步骤同实施例1；
恒温静置培养24h后用血球计数板测定菌体浓度，脆弱拟杆菌菌体浓度达到最大值为5.1×108个/mL。取10mL发酵后的脆弱拟杆菌菌液，设置3个重复，采用平板菌落计数后确认发酵培养中脆弱拟杆菌活菌含量为4.51×108CFU/mL。
实施例3
2、鳗鲡源脆弱拟杆菌的发酵培养方法，步骤如下：
步骤2)中，增殖培养时间为14小时；
步骤3)中，以6％接种量(体积比)接种于250mL三角瓶中，三角瓶装液量100mL，pH为9.0；将三角瓶置于37℃恒温培养箱中静置培养；
其余步骤同实施例1；
恒温静置培养24h后用血球计数板测定菌体浓度，脆弱拟杆菌菌体浓度达到最大值为4.3×108个/mL。取10mL发酵后的脆弱拟杆菌菌液，设置3个重复，采用平板菌落计数后确认发酵培养中脆弱拟杆菌活菌含量为3.4×108CFU/mL。
本发明将脆弱拟杆菌活化后的种子液接种于发酵培养基中，采用发酵的方法获得大量脆弱拟杆菌，脆弱拟杆菌菌体浓度达到最大值为5.56×108个/mL，且活菌含量高达活菌含量为5.0×108CFU/mL；因此，本发明克服了现有技术需经过多次重复离心浓缩的方法获得大量脆弱拟杆菌，导致菌液老化的活菌数量低的问题。另外，本发明采用发酵培养获得脆弱拟杆菌的过程简单，能够减少培养过程中对脆弱拟杆菌造成的污染，并且节约时间和减少培养基的浪费。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

Claims (3)

1.一种鳗鲡源脆弱拟杆菌的发酵培养方法，其特征在于：步骤如下：
1)脆弱拟杆菌活化：
取鳗鲡源脆弱拟杆菌接种于装有种子活化培养基的厌氧管中，25-38℃下静态厌氧活化活化培养24小时；所述活化培养基选用脆弱拟杆菌活化培养基肉汤；
2)增殖培养：
将活化培养后的菌液，接入含有增殖培养基厌氧管中，接种量为2％，25-38℃下再增殖培养9-14小时，得到增殖培养菌液；
其中脆弱拟杆菌增殖培养基配方如下：葡萄糖10g/L，胰蛋白胨10g/L，蛋白胨10g/L，大豆蛋白胨5.0g/L，酵母浸粉3.0g/L，NaCl 3.0g/L，K2HPO4 2.5g/L，硫代乙醇酸钠0.30g/L，半胱氨酸盐酸盐0.30g/L，pH 7.0；
3)发酵培养：
将增殖培养菌液以2-6％接种量接种于含有发酵培养基的三角瓶中，三角瓶中溶液pH为7-9，将三角瓶置于25-37℃恒温培养箱中静置培养；
其中发酵培养基配方如下：可溶性淀粉20g/L、酵母浸粉40g/L、FeSO4 12g/L、NaCl 3g/L、K2HPO4 2.5g/L、MgSO4 0.24g/L、CaCO31g/L，余量为水。
2.根据权利要求1所述的一种鳗鲡源脆弱拟杆菌的发酵培养方法，其特征在于：所述步骤2)中，增殖培养时间为9小时。
3.根据权利要求1所述的一种鳗鲡源脆弱拟杆菌的发酵培养方法，其特征在于：所述步骤3)中，发酵培养的接种量为4％，pH值为7.0，发酵培养温度为34℃。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113481120A (zh) * 2021-06-29 2021-10-08 广州知易生物科技有限公司 培养基及其制备方法、用其培养脆弱拟杆菌的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1056314A (zh) * 1990-05-03 1991-11-20 张李阶 一株有益菌株及其应用
CN105274019A (zh) * 2014-07-08 2016-01-27 王军 一种脆弱拟杆菌的液固结合发酵工艺
WO2019030446A1 (fr) * 2017-08-08 2019-02-14 Fondation Mediterranee Infection Milieu de culture polyvalent pour bactéries anaérobies en aérobie

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1056314A (zh) * 1990-05-03 1991-11-20 张李阶 一株有益菌株及其应用
CN105274019A (zh) * 2014-07-08 2016-01-27 王军 一种脆弱拟杆菌的液固结合发酵工艺
WO2019030446A1 (fr) * 2017-08-08 2019-02-14 Fondation Mediterranee Infection Milieu de culture polyvalent pour bactéries anaérobies en aérobie

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113481120A (zh) * 2021-06-29 2021-10-08 广州知易生物科技有限公司 培养基及其制备方法、用其培养脆弱拟杆菌的方法
WO2023273019A1 (zh) * 2021-06-29 2023-01-05 广州知易生物科技有限公司 培养基及其制备方法、用其培养脆弱拟杆菌的方法
CN113481120B (zh) * 2021-06-29 2023-03-21 广州知易生物科技有限公司 培养基及其制备方法、用其培养脆弱拟杆菌的方法

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