CN110283296B - 双功能聚氨酯及其制备方法与应用 - Google Patents

双功能聚氨酯及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种双功能聚氨酯及其制备方法与应用，属于生物医用材料技术领域。解决了现有血管材料无法消除血管植入部位氧化应激的技术问题。本发明的双功能聚氨酯，为含有川芎嗪‑硝酮基团的聚氨酯，所述川芎嗪‑硝酮基团的结构式如式Ⅰ所示。该双功能聚氨酯通过将具有抗氧化和促内皮细胞粘附双功能的川芎嗪‑硝酮基团引入聚氨酯分子链(末端)，赋予聚氨酯抗氧化和促内皮细胞粘附双重功能，使其不仅能有效促进内皮细胞的粘附与增殖，还能在氧化应激环境下，保护内皮细胞的正常功能。
Figure DDA0002100942360000011

Description

双功能聚氨酯及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种双功能聚氨酯及其制备方法与应用，属于生物医用材料技术领域。
技术背景
近年来，人工血管和支架被广泛用于心血管疾病的治疗。然而，临床研究表明，由于目前血管材料/支架血液相容性较差，植入体内后易发生栓塞和再狭窄，从而影响其长期应用结果。由于血管内皮作为天然的抗凝血表面，对于血管的抗凝血具有至关重要的作用。因此，大量研究致力于促进血管材料的快速内皮化。
现有技术中，促进血管材料快速内皮化的方法主要有四种：人工血管体外内皮化，调控人工血管表面形貌，表面接枝或负载生物活性分子(包括生长因子、抗体、活性蛋白质、天然高分子等)以及基因工程。这些方法在一定程度上都能促进内皮细胞的粘附与增殖，从而促进血管材料的内皮化。然而，上述方法仅仅关注了植入材料本身的性能，而忽略了植入环境对于血管材料内皮化的潜在危害。
研究表明，病灶部位血管处于较高氧化应激(oxidative stress)的环境中。氧化应激是由体内活性氧(ROS)过量产生，超出了机体的抗氧化防御系统所引起。氧化应激是导致心血管疾病(特别是动脉粥样硬化)的一大危险因素，处于氧化应激环境中，将会造成内皮细胞功能紊乱，NO产生减少以及炎症反应，对血管内皮化极为不利。因此，设计血管材料时，不仅要考虑材料本身对内皮细胞的粘附，还应考虑血管植入部位氧化应激环境的影响。
发明内容
本发明的目的在于解决现有血管材料无法消除血管植入部位氧化应激的技术问题，提供一种双功能聚氨酯及其制备方法与应用。
本发明解决上述技术问题采取的技术方案如下。
本发明提供一种双功能聚氨酯，该双功能聚氨酯为含有川芎嗪-硝酮基团(TBN)的聚氨酯，所述川芎嗪-硝酮基团的结构式如式Ⅰ所示；
Figure GDA0002475011320000021
优选的，所述双功能聚氨酯为川芎嗪-硝酮基团封端的聚氨酯。
更优选的，所述双功能聚氨酯的结构式如式Ⅱ所示：
Figure GDA0002475011320000022
本发明还提供上述双功能聚氨酯的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、向反应器中加入多元醇和干燥的溶剂，脱水，在惰性气氛保护下，加入异氰酸酯，60-80℃反应2-3h，得到聚氨酯预聚体；
步骤二、向聚氨酯预聚体中加入小分子多元醇，60-80℃反应3-6h，得到分子链末端为NCO基团的聚氨酯；
步骤三、向分子链末端为NCO基团的聚氨酯中加入川芎嗪-硝酮封端剂(TBN-OH)，60-80℃反应6-12h，经沉淀、洗涤、干燥，得到双功能聚氨酯(PU-TBN)；
所述川芎嗪-硝酮封端剂的结构式如式Ⅲ所示：
Figure GDA0002475011320000023
优选的，所述多元醇为聚己内酯多元醇，所述异氰酸酯为六亚甲基二异氰酸酯(HDI)，所述小分子多元醇为1,4-丁二醇，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜，所述惰性气氛为氮气。
优选的，所述步骤一中多元醇与异氰酸酯的摩尔比为1:3，步骤二中所加小分子多元醇与步骤一中所加多元醇的摩尔比为1:1.9，步骤三中所加川芎嗪-硝酮封端剂与步骤二中所加小分子多元醇的摩尔比为0.2:1.9。
优选的，所述川芎嗪-硝酮封端剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、按照摩尔比1:(5-10)向反应器中加入川芎嗪和二氧化硒，惰性气体保护下，加入溶剂，110-120℃下回流反应12-18h，经过过滤，萃取，旋蒸，柱分离后得到第一中间体(TMP-2CHO)；
步骤二、将第一中间体溶解于甲醇和THF的混合溶剂中，0-10℃下，边反应边加硼氢化钠的甲醇溶液，直至原料点消失，经旋蒸，柱分离后得到第二中间体(HO-TMP-CHO)；
步骤三、将第二中间体、N-叔丁基-羟胺盐酸盐和四氢吡咯催化剂溶解于乙醇中，20-30℃下反应0.5-1h，得到川芎嗪-硝酮封端剂；
所述第二中间体和N-叔丁基-羟胺盐酸盐等摩尔。
更优选的，所述步骤一中，溶剂为二氧六环；所述步骤二中，混合溶剂中甲醇和THF体积比为4:3，0-10℃下反应3-5h；所述步骤三中，四氢吡咯的添加量为1.1-1.2eq。
本发明还提供上述双功能聚氨酯在制备人工血管材料或人工支架材料中的应用。
优选的，所述人工血管材料为双功能聚氨酯薄膜，制备方法包括以下步骤：
步骤一、将双功能聚氨酯溶解于溶剂中，搅拌至完全溶解，得到聚氨酯溶液；
步骤二、将聚氨酯溶液滴涂至干净的玻璃片上，室温挥发溶剂，高温退火，得到双功能聚氨酯薄膜。
更优选的，所述溶剂为六氟异丙醇或N,N-二甲基甲酰胺；所述高温退火的温度为100℃，高温退火的时间为1-2h。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、本发明提供的双功能聚氨酯采用聚氨酯作为主体材料，聚氨酯是目前最符合人工血管顺应性要求的高分子材料，本发明利用聚氨酯优异的力学性能，结构可设计性，可加工性以及良好的生物相容性，使其更好地用于生物医用材料；
本发明提供的双功能聚氨酯通过将具有抗氧化和促内皮细胞粘附双功能的川芎嗪-硝酮封端剂引入聚氨酯分子链(末端)，赋予聚氨酯抗氧化和促内皮细胞粘附双重功能，使其不仅能有效促进内皮细胞的粘附与增殖，还能在氧化应激环境下，保护内皮细胞的正常功能，该材料在氧化应激环境下促内皮化示意图如图1所示；
本发明提供的双功能聚氨酯当采用聚己内酯多元醇作为聚氨酯的软段时，还赋予材料一定的生物可降解性。
2、本发明提供的双功能聚氨酯能够应用在制备人工血管材料或人工支架材料中，与现有人工血管材料内皮化技术相比，本发明将抗氧化与促内皮细胞粘附双功能引入聚合物分子链中，能够有效缓解血管植入部位氧化应激的影响，对于人工血管在氧化应激环境下的快速内皮化具有重要意义。
附图说明
图1中为PU薄膜和PU-TBN薄膜在氧化应激状态下促进内皮细胞粘附与增殖的示意图。
图2中，(a)为对比例1的PU和实施例1的PU-TBN合成路线，(b)为对比例1的PU和实施例1的PU-TBN的核磁氢谱表征结果。
图3中，(a)为实施例1中TBN-OH的合成路线，(b)、(c)、(d)分别为实施例1中TMP-2CHO、HO-TMP-CHO和TBN-OH的核磁氢谱表征结果。
图4中，(a)为PU薄膜、PU-TBN-50薄膜和PU-TBN薄膜对NIH3T3细胞毒性测试结果，(b)为PU薄膜、PU-TBN-50薄膜和PU-TBN薄膜对HUVECs细胞毒性测试结果。
图5中，(a)为HUVECs在PU薄膜、PU-TBN-50薄膜和PU-TBN薄膜上培养的荧光图片，(b)为Image J软件统计出的PU薄膜、PU-TBN-50薄膜和PU-TBN薄膜的细胞密度，(c)为ImageJ软件统计出的PU薄膜、PU-TBN-50薄膜和PU-TBN薄膜的细胞覆盖率。
图6中，(a)和(b)分别为TBN-OH对ABTS和DPPH自由基的清除活性结果。
图7中，(a)和(b)分别为PU薄膜、PU-TBN-50薄膜和PU-TBN薄膜对DPPH和ABTS自由基的清除活性结果。
图8为在H2O2诱导的氧化应激环境下，HUVECs在PU薄膜上的培养结果，(a)为荧光图片，(b)为细胞密度，(c)为归一化覆盖率。
图9为在H2O2诱导的氧化应激环境下，HUVECs在PU-TBN-50薄膜上的培养结果，(a)为荧光图片，(b)为细胞密度，(c)为归一化覆盖率。
图10为在H2O2诱导的氧化应激环境下，HUVECs在PU-TBN薄膜上的培养结果，(a)为荧光图片，(b)为细胞密度，(c)为归一化覆盖率。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合具体实施方式对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明专利要求的限制。
本发明的双功能聚氨酯，为含有川芎嗪-硝酮基团(TBN)的聚氨酯，川芎嗪-硝酮基团的结构式如式Ⅰ所示；
Figure GDA0002475011320000051
上述技术方案中，双功能聚氨酯优选为川芎嗪-硝酮基团封端的聚氨酯，更优选结构式如式Ⅱ所示的聚氨酯：
Figure GDA0002475011320000052
本发明的双功能聚氨酯的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、向反应器中加入多元醇和干燥的溶剂，脱水，在惰性气氛保护下，加入异氰酸酯，60-80℃反应2-3h，得到聚氨酯预聚体；
步骤二、向聚氨酯预聚体中加入小分子多元醇，60-80℃反应3-6h，得到分子链末端为NCO基团的聚氨酯；
步骤三、向分子链末端为NCO基团的聚氨酯中加入川芎嗪-硝酮封端剂，60-80℃反应6-12h，沉淀于乙醚中，乙醚冲洗多次，收集白色沉淀，真空干燥至恒重，得到双功能聚氨酯；
所述川芎嗪-硝酮封端剂的结构式如式Ⅲ所示：
Figure GDA0002475011320000061
上述技术方案中，多元醇、异氰酸酯、小分子多元醇均无特殊限制，现有技术中能够获得分子链末端为NCO基团的聚氨酯的多元醇、异氰酸酯、小分子多元醇皆可实现，是本领域技术人员的公知常识，配比关系本领域技术人员也可根据常识确定。本发明优选多元醇为聚己内酯多元醇，异氰酸酯为六亚甲基二异氰酸酯，小分子多元醇为1,4-丁二醇，步骤一中多元醇与异氰酸酯的摩尔比为1:3，步骤二中所加小分子多元醇与步骤一中所加多元醇的摩尔比为1:1.9，步骤三中所加川芎嗪-硝酮封端剂与步骤二中所加小分子多元醇的摩尔比为0.2:1.9。溶剂没有特殊限制，能够起到溶解作用即可，优选为N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。惰性气氛优选为氮气。小分子多元醇和川芎嗪-硝酮封端剂的加入方式一般采用溶于溶剂(如N,N-二甲基甲酰胺)中，再逐滴滴加，这也是本领域技术人员常用的加入反应物的方式。
上述技术方案中，步骤一加入异氰酸酯的同时可以添加催化剂，催化剂为聚氨酯预聚体制备过程中的常用催化剂即可，如辛酸亚锡；催化剂的添加量也为聚氨酯预聚体制备过程中的常用剂量，一般为多元醇质量的0.1-0.2％。
上述技术方案中，在川芎嗪-硝酮封端剂结构确定的情况下，本领域技术人员可以根据现有技术考虑其合成，本发明提供一种川芎嗪-硝酮封端剂的制备方法，包括以下步骤，但不限于此：
步骤一、按照摩尔比1:(5-10)向反应器中加入川芎嗪和二氧化硒，惰性气体保护下，加入溶剂(优选二氧六环)，110-120℃下回流反应12-18h，经过过滤，萃取，旋蒸，柱分离后得到第一中间体；
步骤二、将第一中间体溶解于甲醇和THF(优选体积比为4:3)的混合溶剂中，0-10℃下，边反应边加硼氢化钠的甲醇溶液(少量多次)，直至原料点消失(反应物底物消失)，不再加硼氢化钠的甲醇溶液，该反应过程一般需3-5h，经旋蒸，柱分离后得到第二中间体；
步骤三、将第二中间体、N-叔丁基-羟胺盐酸盐和四氢吡咯催化剂溶解于乙醇中，溶解顺序无限制，20-30℃下反应0.5-1h，得到川芎嗪-硝酮封端剂；其中，第二中间体和N-叔丁基-羟胺盐酸盐等摩尔；四氢吡咯催化剂稍过量(优选为1.1-1.2eq)。
本发明的双功能聚氨酯能够应用于制备人工血管材料或人工支架材料。当应用于制备人工血管材料时，人工血管材料可为双功能聚氨酯薄膜，该薄膜的制备方法可以包括以下步骤，但不限于此：
步骤一、将双功能聚氨酯溶解于溶剂中，搅拌至完全溶解(温度根据溶剂的不同而不同，如采用六氟异丙醇，可在20-30℃溶解，如采用N,N-二甲基甲酰胺，需在50-80℃溶解)，得到聚氨酯溶液，浓度没有特殊限制，优选为10wt％；
步骤二、将聚氨酯溶液滴涂至干净的玻璃片上，室温挥发溶剂，高温退火，得到双功能聚氨酯薄膜。
上述技术方案中，溶剂没有特殊限制，优选为六氟异丙醇或N,N-二甲基甲酰胺；高温退火的温度为100℃，高温退火的时间为1h。
以下结合实施例和对比例进一步说明本发明。
对比例1
如图2中(a)所示，聚氨酯的合成：
步骤一、将聚己内酯多元醇(16g，分子量2000道尔顿)溶解于200mL干燥的DMF中，加热至70℃，在惰性气体保护下，逐滴加入4.0g六亚甲基二异氰酸酯以及0.02g辛酸亚锡，70℃下搅拌3h，得到第一中间体。
步骤二、往第一中间体中滴加1.44g 1,4-丁二醇的10mL干燥DMF溶液，加入完毕后，70℃下搅拌12h，然后将反应液沉淀于1L乙醚中，乙醚冲洗2-3次，收集橘黄色沉淀，真空干燥至恒重，得到聚氨酯，记作PU。
实施例1
如图2中(a)所示，双功能聚氨酯的合成：
步骤一、将聚己内酯多元醇(10g，分子量2000道尔顿)溶解于200mL干燥的DMF中，加热至70℃，在惰性气体保护下，逐滴加入2.52g六亚甲基二异氰酸酯以及0.02g辛酸亚锡，70℃下搅拌3h，得到第一中间体。
步骤二、往第一中间体中滴加0.86g 1,4-丁二醇的10mL干燥DMF溶液，加入完毕后，70℃下搅拌3h。
步骤三、继续滴加10mL TBN-OH(0.47g)的DMF溶液，并于70℃下继续反应12h，然后将反应液沉淀于1L乙醚中，乙醚冲洗2-3次，收集白色沉淀，真空干燥至恒重，得到双功能聚氨酯，记作PU-TBN。
对对比例1制备的PU和实施例1制备的PU-TBN聚氨酯进行核磁氢谱的检测，结果如图2中(b)所示。从图2(b)可以看出，PU的核磁氢谱(400MHz,1H)数据：3.98ppm(-CH2O-)，2.96ppm(-NHCH2-)，2.27ppm(-CH2COO-)，1.54-1.27ppm(-CH2-CH2-CH2-)；PU-TBN的核磁氢谱(400MHz,1H)数据：4.35ppm(-NHCOO-CH2-TBN)，3.98ppm(-CH2O-)，2.96ppm(-NHCH2-)，2.27ppm(-CH2COO-)，1.54-1.27ppm(-CH2-CH2-CH2-)；核磁结果证明了式Ⅱ结构双功能聚氨酯的成功合成。
实施例1中采用的TBN-OH封端剂通过实验室合成，合成过程为：
步骤一、将川芎嗪(11.0g)与二氧化硒(44.84g)溶解于300mL二氧六环溶剂中，氮气保护下，在110℃下回流过夜。过滤后，将滤液旋干，加水和乙酸乙酯萃取，富集有机相，旋干溶剂，过硅胶柱分离产物(乙酸乙酯：石油醚＝1:3)，得到第一中间体(TMP-2CHO)。
步骤二、将第一中间体(5.0g)溶解于100mL甲醇/THF(v/v，4:3)的混合溶剂中，在冰水浴下，NaBH4(0.6g)分批加入到反应液中，反应3h后，旋蒸除去溶剂，硅胶柱分离产物(乙酸乙酯：石油醚＝1：1)，得到第二中间体(HO-TMP-CHO)。
步骤三、将第二中间体(1.66g)、N-叔丁基-羟胺盐酸盐(1.25g)和四氢吡咯(0.84g)溶解于50ml无水乙醇中，室温下反应30min。旋干溶剂，采用氧化铝柱分离产物(乙酸乙酯：甲醇＝50:1)，得到封端剂TBN-OH。
TBN-OH的合成路线如图3中(a)所示，TMP-2CHO、HO-TMP-CHO和TBN-OH的核磁氢谱分别如图3中(b)、(c)、(d)所示。从图3可以看出，实施例1合成了TBN-OH封端剂。
对实施例1得到的双功能聚氨酯的性能进行表征。
1、制备薄膜
步骤一、将对比例1的PU和实施例1的PU-TBN分别按质量比100/0、50/50和0/100混合，溶解于DMF中，80℃下搅拌至完全溶解，配成浓度为10wt％的聚合物溶液。
步骤二、将上述聚合物溶液分别滴涂在干净的玻璃片上，80℃下挥发溶剂2h，在100℃下退火1h，得到薄膜，分别标记为PU薄膜，PU-TBN-50薄膜和PU-TBN薄膜。
2、细胞毒性测试
采用MTT法检测PU薄膜、PU-TBN-50薄膜和PU-TBN薄膜浸提液对小鼠成纤维细胞(NIH3T3)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的相容性测试，每个样品制备1d和3d的浸提液用于实验细胞培养。
步骤一、制备薄膜浸提液。将薄膜灭菌后浸没于1mL高糖培养基DMEM中，浸提浓度为6cm2/mL，在37℃培养箱中分别浸提1d和3d。取出715μL浸提液，加入80μL胎牛血清和8μLL-谷氨酰胺，制备薄膜浸提液。
步骤二、细胞铺板。将NIH3T3和HUVECs计数，并以每孔10000个细胞的密度接种于96孔板中，在生物培养箱中孵育24h。
步骤三、换液。培养24h后，将培养液小心吸弃，加入100μL薄膜浸提液继续培养20h。
步骤四、MTT检测细胞活力。浸提液培养20h后，每孔加入25μL MTT试剂，继续孵育4h。吸弃培养基，加入150μL DMSO，用酶标仪检测492nm处的吸光度，计算细胞活力。DMSO作为对照，每个样品设6个复孔。
结果如图4所示。与阴性对照(正常培养基培养)相比，所有薄膜浸提液对NIH3T3和HUVECs均没有细胞毒性，表现出了细胞活力的增加。其中，PU-TBN薄膜浸提液能够提升HUVECs的细胞活力，经3d的浸提液培养后，细胞活力提升28％。说明，PU-TBN薄膜浸提液能够刺激HUVECs的增殖。
3、HUVECs粘附与增殖
步骤一、材料准备。薄膜(1cmⅹ1cm)经紫外灭菌6h后，用75％酒精灭菌10min，再经无菌PBS漂洗，晾干后，置于24孔板中。为了防止薄膜在细胞培养时浮起，用无菌的聚四氟空心圆柱模具(内径8mm，外径12mm，高15mm)压住。
步骤二、细胞接种。采用计数板，将HUVECs计数后，按照10000个/孔密度接种于薄膜上，所加培养液体积为500μL。分别在生物培养箱中培养4h、1d和2d。
步骤三、荧光染色与拍照。将培养液吸弃，用无菌PBS溶液小心漂洗薄膜2次，加入300μL 6μM Calcein-AM/PBS溶液，并在培养箱中孵育10-30min。将薄膜在PBS中漂洗2次后，在荧光倒置显微镜下观察并拍照。每个样品设三个复孔。
结果如图5所示，(a)为HUVECs在PU薄膜、PU-TBN-50薄膜和PU-TBN薄膜上培养的荧光图片，(b)为Image J软件统计出的PU薄膜、PU-TBN-50薄膜和PU-TBN薄膜的细胞密度，(c)为Image J软件统计出的PU薄膜、PU-TBN-50薄膜和PU-TBN薄膜的细胞覆盖率。4h粘附结果表明，HUVECs在三种薄膜上的粘附结果差异不大，PU-TBN薄膜粘附的细胞数目稍多于PU薄膜，且细胞在三种薄膜上均呈现收缩的圆形形态。随着培养时间的延长，薄膜上粘附的细胞均表现出了增殖行为。然而，HUVECs在PU薄膜上增长缓慢，在PU-TBN薄膜上的增殖行为更明显。在培养两天后，PU薄膜上细胞密度仅从78个/mm2增加到188个/mm2，而PU-TBN薄膜上细胞密度从100个/mm2增加到385个/mm2，细胞覆盖率结果与细胞密度结果一致。体外内皮细胞粘附实验结果表明，TBN基团的引入能够明显的促进内皮细胞的粘附与增殖。
4、抗氧化实验
4.1TBN-OH抗氧化实验
通过测试TBN-OH对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基的清除活性，检测TBN-OH的抗氧化活性。
4.1.1DPPH清除实验
步骤一、配制工作液。将4.0μg DPPH溶解于1mL甲醇中，得到10mM DPPH/甲醇溶液，用甲醇稀释100倍得到100μM DPPH的工作液。
步骤二，将DPPH工作液与1M TBN-OH/PBS溶液按照99：1(v/v)混合，得到终浓度为10mM TBN、100μM DPPH的反应液。取100μL反应液置于96孔板中，每隔5min检测537nm处的吸光值。不加TBN-OH的DPPH溶液和10mM L-抗坏血酸(维生素C，AA)作为对照，每个样品设6个复孔。
4.1.2ABTS自由基清除实验
步骤一、配制ABTS工作液。将7mM ABTS与2.45mM过硫酸钾的PBS溶液在室温下避光反应16h，经0.45μm过滤器过滤后，稀释10倍制得ABTS工作液。
步骤二、将ABTS工作液与1M TBN-OH/PBS溶液按照99：1(v/v)混合，得到终浓度为10mM TBN的反应溶液。取100μL反应液置于96孔板中，每隔5min检测734nm处的吸光值。不加TBN-OH的ABTS溶液和10mM L-抗坏血酸(维生素C，AA)作为对照，每个样品设6个复孔。
TBN-OH对ABTS和DPPH自由基的清除活性结果如图6中(a)和(b)所示。作为阳性对照，AA对DPPH和ABTS同时表现出了即时的清除能力，而TBN-OH则表现出了平缓地清除活性。在60min内，TBN-OH能够分别清除72.27％和92.15％的DPPH和ABTS自由基。说明TBN-OH具有优异地自由基清除能力。
4.2PU-TBN薄膜抗氧化实验
步骤一、样品制备。用Φ8的打孔器从厚约200μm的PU薄膜、PU-TBN-50薄膜和PU-TBN薄膜上制备圆形样品，经甲醇/水(50/50，v/v)溶液清洗表面后，备用。
步骤二、DPPH测试。将样品置于48孔板中，每孔分别加入200μL DPPH工作液，室温避光反应60min后，用酶标仪检测537nm处吸光值。未加薄膜溶液与10mM AA/DPPH溶液作为对照实验，每个样品设3个复孔。
步骤三、ABTS测试。将样品置于48孔板中，每孔分别加入200μL ABTS工作液，室温避光反应60min后，用酶标仪检测734nm处吸光值。未加薄膜溶液与10mM AA/DPPH溶液作为对照实验，每个样品设3个复孔。
薄膜对DPPH和ABTS自由基的清除活性结果如图7中(a)和(b)所示。由结果可知，随着聚氨酯薄膜中TBN基团含量的提高，其对DPPH和ABTS自由基的清除活性增强。其中PU-TBN薄膜在60min内能够分别清除61.23％和98.83％DPPH和ABTS自由基，表现出了优异地抗氧化活性。
5、H2O2诱导内皮细胞损伤实验
步骤一、材料准备。薄膜(1cmⅹ1cm)经紫外灭菌6h后，用75％酒精灭菌10min，再经无菌PBS漂洗，晾干后，置于24孔板中。为了防止薄膜在细胞培养时浮起，用无菌的聚四氟空心圆柱模具(内径8mm，外径12mm，高15mm)压住。
步骤二、细胞接种。采用计数板，将HUVECs计数后，按照10000个/孔密度接种于薄膜上，加入培养液体积为500μL。正常培养液培养作为对照试验，往培养液中分别加入2mM和20mM H2O2作为实验组。分别在生物培养箱中培养4h、1d和2d。
步骤三、荧光染色与拍照。将培养液吸弃，用无菌PBS溶液小心漂洗薄膜2次，加入300μL 6μM Calcein-AM/PBS溶液，并在培养箱中孵育10-30min。将薄膜在PBS中漂洗2次后，在荧光倒置显微镜下观察并拍照。每个样品设三个复孔。
H2O2诱导地氧化应激环境下，HUVECs在PU薄膜、PU-TBN-50薄膜和PU-TBN薄膜上的培养结果分别如图8、图9、图10所示，其中，(a)均为荧光图片，(b)均为细胞密度，(c)均为归一化覆盖率。由结果可知，无氧化应激状态下，所有薄膜均表现出了促HUVECs增殖的行为。而在氧化应激环境下，PU薄膜不利于HUVECs的粘附与增殖，随着培养时间延长，细胞密度和归一化覆盖率降低，且细胞始终处于收缩的圆形形态。而HUVECs在PU-TBN薄膜上的培养则几乎不会受到氧化应激环境的影响，表现出了明显的增殖行为，随着时间的延长，细胞形态逐渐伸展，几乎融合成单细胞层。结果表明，TBN的引入能够有效保护内皮细胞免受H2O2诱导的氧化损伤。同时表明赋予材料促内皮细胞粘附与抗氧化双功能的必要性及其对于体内复杂环境下植入血管快速内皮化的重要意义。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.双功能聚氨酯，其特征在于，该双功能聚氨酯为含有川芎嗪-硝酮基团的聚氨酯，所述川芎嗪-硝酮基团的结构式如式Ⅰ所示；
Figure FDA0002475011310000011
该双功能聚氨酯的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、向反应器中加入多元醇和干燥的溶剂，脱水，在惰性气氛保护下，加入异氰酸酯，60-80℃反应2-3h，得到聚氨酯预聚体；
步骤二、向聚氨酯预聚体中加入小分子多元醇，60-80℃反应3-6h，得到分子链末端为NCO基团的聚氨酯；
步骤三、向分子链末端为NCO基团的聚氨酯中加入川芎嗪-硝酮封端剂，60-80℃反应6-12h，经沉淀、洗涤、干燥，得到双功能聚氨酯；
所述川芎嗪-硝酮封端剂的结构式如式Ⅲ所示：
Figure FDA0002475011310000012
2.根据权利要求1所述的双功能聚氨酯，其特征在于，该双功能聚氨酯为川芎嗪-硝酮基团封端的聚氨酯。
3.根据权利要求2所述的双功能聚氨酯，其特征在于，所述双功能聚氨酯的结构式如式Ⅱ所示：
Figure FDA0002475011310000013
4.权利要求1-3任何一项所述的双功能聚氨酯的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、向反应器中加入多元醇和干燥的溶剂，脱水，在惰性气氛保护下，加入异氰酸酯，60-80℃反应2-3h，得到聚氨酯预聚体；
步骤二、向聚氨酯预聚体中加入小分子多元醇，60-80℃反应3-6h，得到分子链末端为NCO基团的聚氨酯；
步骤三、向分子链末端为NCO基团的聚氨酯中加入川芎嗪-硝酮封端剂，60-80℃反应6-12h，经沉淀、洗涤、干燥，得到双功能聚氨酯；
所述川芎嗪-硝酮封端剂的结构式如式Ⅲ所示：
Figure FDA0002475011310000021
5.根据权利要求4所述的双功能聚氨酯的制备方法，其特征在于，
所述多元醇为聚己内酯多元醇，所述异氰酸酯为六亚甲基二异氰酸酯，所述小分子多元醇为1,4-丁二醇，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜，所述惰性气氛为氮气；
所述步骤一中多元醇与异氰酸酯的摩尔比为1:3，步骤二中所加小分子多元醇与步骤一中所加多元醇的摩尔比为1:1.9，步骤三中所加川芎嗪-硝酮封端剂与步骤二中所加小分子多元醇的摩尔比为0.2:1.9。
6.根据权利要求4所述的双功能聚氨酯的制备方法，其特征在于，所述川芎嗪-硝酮封端剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、按照摩尔比1:(5-10)向反应器中加入川芎嗪和二氧化硒，惰性气体保护下，加入溶剂，110-120℃下回流反应12-18h，经过过滤，萃取，旋蒸，柱分离后得到第一中间体；
步骤二、将第一中间体溶解于甲醇和THF的混合溶剂中，0-10℃下，边反应边加硼氢化钠的甲醇溶液，直至原料点消失，经旋蒸，柱分离后得到第二中间体；
步骤三、将第二中间体、N-叔丁基-羟胺盐酸盐和四氢吡咯催化剂溶解于乙醇中，20-30℃下反应0.5-1h，得到川芎嗪-硝酮封端剂；
所述第二中间体和N-叔丁基-羟胺盐酸盐等摩尔。
7.根据权利要求6所述的双功能聚氨酯的制备方法，其特征在于，所述川芎嗪-硝酮封端剂的制备方法的步骤一中，溶剂为二氧六环；所述川芎嗪-硝酮封端剂的制备方法的步骤二中，混合溶剂中甲醇和THF体积比为4:3，0-10℃下反应3-5h；所述川芎嗪-硝酮封端剂的制备方法的步骤三中，四氢吡咯的添加量为1.1-1.2eq。
8.权利要求1-3任何一项所述的双功能聚氨酯在制备人工血管材料或人工支架材料中的应用。
9.权利要求8所述的双功能聚氨酯在制备人工血管材料中的应用，其特征在于，所述人工血管材料为双功能聚氨酯薄膜，制备方法包括以下步骤：
步骤一、将双功能聚氨酯溶解于溶剂中，搅拌至完全溶解，得到聚氨酯溶液；
步骤二、将聚氨酯溶液滴涂至干净的玻璃片上，室温挥发溶剂，高温退火，得到双功能聚氨酯薄膜。
10.权利要求9所述的双功能聚氨酯在制备人工血管材料中的应用，其特征在于，所述溶剂为六氟异丙醇或N,N-二甲基甲酰胺；所述高温退火的温度为100℃，高温退火的时间为1-2h；聚合物溶液的浓度为10wt％。
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