CN110279847A - Fgf21在制备促进超长随意皮瓣存活的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了FGF21在制备促进超长随意皮瓣存活的药物中的应用。FGF21的具体应用采用皮下注射的方式。按每1毫克FGF21溶于1毫升的生理盐水，配置成1mg/ml溶液。使用方式为每天按300μg/kg的剂量进行皮下注射，皮瓣I区、II区及III区分别为100微克，术后7天为一疗程。通过大量的动物实验得出结论，使用FGF21可以使得缺血随意皮瓣的存活面积比明显提高，能很好地促进缺血随意皮瓣的存活。

Description

FGF21在制备促进超长随意皮瓣存活的药物中的应用

技术领域

本发明涉及FGF21的新用途，具体涉及FGF21在制备促进超长随意皮瓣存活的药物中的应用。

背景技术

近年来，随着工业、交通以及建筑等行业的迅猛发展，大面积的损伤和组织缺损的病人愈发常见，这类型病人在清创后，往往会出现皮肤软组织缺损，无法进行直接缝合，需要皮瓣覆盖。而随意皮瓣因其应用灵活，取用方便，恢复良好等优点而广泛应用于临床。然而在随意皮瓣的长宽比超过1.5：1的时候，其远端血液供应不良使其出现不同程度的坏死。这无疑对随意皮瓣在临床上的应用带来很大的限制，因此如何增加随意皮瓣的存活，减少皮瓣坏死，成了一个重要的课题。经过研究后，促进随意皮瓣微血管的形成，增加皮瓣的血液灌注，改善组织水肿，缓解氧化应激水平等是促进随意皮瓣的存活有效治疗靶点。

成纤维细胞生长因子21即FGF21，属于成纤维细胞生长因子（FGF）家族的成员之一，具有激素类因子的作用特性，在机体中直接参与调节物质和能量代谢。有研究发现FGF21可以调节内分泌，刺激新生血管的形成，还有研究发现FGF21可抑制氧化应激来降低心肌细胞的凋亡。但目前并没有关于FGF21能对随意皮瓣存活产生影响的相关报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了FGF21在制备促进超长随意皮瓣存活的药物中的应用。FGF21的具体应用采用皮下注射的方式。按每1毫克FGF21溶于1毫升的生理盐水，配置成1mg/ml溶液。使用方式为每天按300μg /kg的剂量进行皮下注射，皮瓣I区、II区及III区分别为100微克，术后7天为一疗程。

通过大量的动物实验得出结论，使用FGF21可以使得缺血随意皮瓣的存活面积比明显提高，能很好地促进缺血随意皮瓣的存活。

附图说明

图1为FGF21组和生理盐水组术后3天的大鼠背部皮瓣情况对比图；

图2为FGF21组和生理盐水组术后7天的大鼠背部皮瓣情况对比图；

图3为FGF21组和生理盐水组术后7天的大鼠背部皮瓣存活面积柱状对比图；

图4为FGF21组与生理盐水组术后7天的皮瓣组织水肿情况对比图；

图5为FGF21组与生理盐水组术后7天的皮瓣组织水肿情况柱状对比图；

图6为FGF21组与生理盐水组术后7天的皮瓣血流灌注量对比图；

图7为FGF21组与生理盐水组术后7天的皮瓣血流灌注量柱状对比图；

图8为FGF21组与生理盐水组的皮瓣HE染色情况对比图；

图9为FGF21组与生理盐水组的皮瓣微血管数量柱状对比图；

图10为FGF21组与生理盐水组的皮瓣VEGF表达量对比图；

图11为FGF21组与生理盐水组的皮瓣VEGF表达量柱状对比图；

图12为FGF21组与生理盐水组的皮瓣SOD1含量对比图；

图13为FGF21组与生理盐水组的皮瓣SOD1含量柱状对比图；

图14为FGF21组与生理盐水组的皮瓣eNOS含量对比图；

图15为FGF21组与生理盐水组的皮瓣eNOS含量柱状对比图；

图16为FGF21组与生理盐水组的皮瓣HO1含量对比图；

图17为FGF21组与生理盐水组的皮瓣HO1含量柱状对比图。

具体实施方式

FGF21可以明显提高缺血随意皮瓣的存活性。在促进缺血随意皮瓣存活的过程中采用皮下注射的方式。按每1毫克FGF21溶于1毫升的生理盐水，配置成1mg/ml溶液。使用方式为每天按300 微克每千克大鼠的剂量进行皮下注射，皮瓣I区、II区及III区分别为100微克，术后7天为一疗程。以下为FGF21在促进缺血随意皮瓣存活的作用评价：

1、缺血随意皮瓣模型建立

选用健康的雄性SD大鼠60只，由温州医科大学实验动物中心提供，清洁级，SYXK [Zhe]2015–0019，体重250-300g。将大鼠按照随机数字表法分为两组，对照组30只、FGF21组30只。采用改良的McFarlane皮瓣制作方法，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，将动物俯卧位固定，脱毛，碘伏消毒，铺巾，以大鼠尾部两髂嵴连线为蒂，在背部正中设计一宽3cm、长9cm矩形随意型皮瓣，设计线切开皮肤，皮下组织，达深筋膜浅层，保留真皮下毛细血管网，于深筋膜浅层表面分离皮下组织，遇到知名血管即以4-0号丝线结扎。皮瓣完全掀起后，彻底止血，立即用4-0医用慕丝缝线间断缝合。切口周围碘伏消毒，皮瓣从远端到蒂平均分为三个区：I区、II区及III区。

FGF21实验组：每天皮下注射100 ug/kg的FGF21；生理盐水对照组：每天相同剂量生理盐水皮下注射。在皮瓣模型术后，连续注射7天，为减少手术操作带来的误差，所有手术由1人完成。

2、观察指标

2.1 皮瓣存活面积比的检测

皮瓣存活面积比的检测：给药7天后，用过量麻醉处死动物，从皮瓣II区采集样本（0.5cm×0.5 cm）。用透明纸准确测量皮瓣存活及坏死面积，并剪成存活或死亡两部分，分别以电子秤称重。按以下公式评估皮瓣的存活面积百分比：存活面积百分比=存活面积×100%÷总面积。皮瓣坏死标准：皮瓣颜色发黑，组织回缩、弹性差，质地坚硬，切割组织不出血。病理表现为组织崩解、细胞核消失、炎症细胞广泛浸润、有局灶出血。

每天观察和记录皮瓣，可以发现，缺血坏死首先发生在皮瓣的I区，皮肤开始看起来肿胀、发紫，逐渐变干、僵硬、发黑，没有毛发生长。坏死区从I区向蒂部扩展。术后第7天，坏死区与存活区的界限清晰稳定，说明坏死区伤口没有增加。经过定量分析，结果显示：FGF21组的皮瓣存活面积比明显大于对照组皮瓣存活面积比，如图1-3所示。

2.2组织水肿评估

用组织含水量评价皮瓣组织水肿。手术后第7天采集的六个样本在50°C的高压锅中脱水，每天称重，然后重量保持2天以上不变。组织含水量计算为：皮瓣组织含水量百分比=（总组织重量-干组织重量）÷总组织重量×100%。经过定量分析，结果显示：FGF21组组织的含水量对比于对照组组织含水量明显下降，如图4-5所示。

2.3激光多普勒血流成像

激光多普勒血流仪是利用激光多普勒原理，监测动物或人体组织微循环血流灌注量的一种设备。术后第7天麻醉大鼠并取俯卧位放置，用激光多普勒仪对皮瓣进行扫描，用灌注单位(PU)作为血流强度指标进行量化。每只大鼠重复扫描3次，取平均值进行分析。

术后第7天，激光多普勒血流仪检测显示：FGF21组皮瓣的血流信号明显强于对照组，FGF21皮瓣的血流灌注信号为（538.17 ± 31.14 PU )，对照组皮瓣血流灌注信号为(411.17 ± 30.70 PU), 两组中皮瓣的血流灌注信号比较，如图6-7所示。

2.4 HE染色

皮瓣手术后收集6例组织标本进行组织病理学分析。将标本固定于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，切成4um厚的组织切片，进行H&E染色。在200×放大倍数的光镜下观察组织切片，评估皮瓣的组织学改变，包括组织水胀、肉芽组织生长、微循环重建。为评价微循环水平，用单位面积血管横截面数(/mm2)计算皮瓣组织平均血管密度。

FGF21组见成纤维细胞增生，肉芽组织较薄，组织水肿较少，炎症细胞浸润少。生理盐水组成纤维细胞增生较少，组织水肿明显，炎症细胞浸润严重（见图4）。微血管计数，FGF21组在皮瓣区血管密度明显大于对照组在皮瓣区，FGF21皮瓣的血管密度为（322.82 ±29.18/mm2 ），对照组皮瓣的血管密度为（171.32 ± 19.43/mm2），两组中区血管密度比较，如图8-9所示。

2.5 免疫组织化学

通过检测血管内皮生长因子（VEGF）在实验组和对照组的表达及分布情况，可以知道FGF21对皮瓣的促存活作用是否与内源性血管新生有关。将组织切片用二甲苯分离，分级乙醇浴洗净后用3%(v/v)H2O2封闭，随后置于柠檬酸钠缓冲液在95℃环境下放置20 min，用10%(w/v)牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液10 min。最后，在4℃的温度下用抗体孵育组织切片，再用HRP结合二次抗体孵育，树脂封片。随机选择3组切片的6个染色均匀区域，使用DP2-TWAN图像采集系统在200倍的光镜下对染色切片进行可视化成像，利用Image-Pro Plus 评价VEGF表达指标。

免疫组化染色显示：VEGF在两组血管内皮细胞及组织间质细胞内均有表达，而FGF21组的VEGF在随机大鼠皮瓣模型中的表达明显高于生理盐水对照组，如图10-11所示

2.6 免疫印迹

通过蛋白印迹，我们可以了解氧化应激方面FGF21是否有效。术后第7天，取皮瓣II区6个皮肤样品（0.5cm×0.5cm），去除肉膜层，称质量，稀释，冰水浴中制成体积分数10％组织匀浆液，离心后取上清液，再用BCA试剂盒测量各组样品总蛋白浓度。随后将蛋白样品与5倍SDS-PAGE蛋白上样缓冲液均匀混合，热水浴加热使蛋白变性。经SDS-PAGE行凝胶电泳，转PVDF膜，加入封闭液,封闭2h。然后予以SOD1, eNOS及HO1相关一抗，在4℃下缓慢摇动孵育过夜，洗膜后，二抗室温孵育2h，洗膜，置于暗室曝光、显影，使用Image J软件分析显影条带，以目的蛋白与GAPDH条带灰度值比值作为目的蛋白的相对表达量。

两组SOD，eNOS以及HO1相应蛋白表达量比较，FGF21组的SOD、eNOS和HO1的值均明显大于对照组，如图12-17所示。

通过上述对照实验可以得出以下结论：

1、FGF21可以促进缺血随意皮瓣的存活；

2、FGF21促进皮瓣存活的机理可能是通过促进血管内皮生长因子（VEGF）的表达来促进新生血管的增生，从而增加相应血流量；

3、FGF21促进皮瓣存活的机理可能与抑制氧化应激有关。

Claims (1)

1.FGF21在制备促进超长随意皮瓣存活的药物中的应用。