CN110276546A - 一种用于快速测定鲍耐低氧能力的方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于快速测定鲍耐低氧能力的方法。对样品进行严格驯化；取驯化后的鲍鱼样品用于后续评测，在PowerLab仪器所附带的LabChat软件中设置相关参数，在鲍心脏上方的壳上，固定红外传感器，获得稳定易读的心电图；将粘有传感器的鲍放置于装有海水容器中，通过水浴使测定过程中容器内的水温恒定，以恒定速率充入氮气与空气的混合气体，使样品所处水体的溶解氧水平下降，直至水中溶氧不足1.00mg/L；利用软件实时记录鲍的心率变化情况，溶氧水平则利用溶氧仪进行记录，以溶氧值为X轴，统计所得鲍心率值为Y轴，绘制散点图，进行回归分析和曲线拟合，获得相应曲线方程并联立，计算出交点的横坐标值，即为所需的BPDO值。
Description
技术领域
本发明涉及水产生物技术领域中针对鲍对低溶氧耐受性的评测技术，尤其是涉及能够区分不同种或不同群体鲍对低氧耐受能力的一种用于快速测定鲍耐低氧能力的方法。
背景技术
鲍位列海产八珍之首，自古以来就深受中国食客喜爱，也因此创造了巨大经济效益和社会效益。截至2016年，我国的养殖鲍产量近14万吨，产值超200亿元；其中，福建省是我国鲍的主产区，其产量约占全国的80％。而现阶段又以皱纹盘鲍(Haliotis discushannai)为最主要的养殖品种，其自然分布于辽东、山东半岛一带温水海域，于2000年前后被引入福建养殖，自此，我国的鲍鱼养殖业也进入了高速发展期。尽管鲍鱼养殖业在福建省蓬勃发展，但面临的挑战依然不少，低氧胁迫就是其中的主要问题之一。
造成福建省养殖鲍面临低氧胁迫的原因有很多，如养殖密度过高、水流不畅、自然灾害(赤潮)等。但有两个条件因素尤其值得注意。其一，高温本身是造成环境低氧问题的主要原因之一：皱纹盘鲍的南移养殖使其面临着前所未有的高温环境，温度升高不仅会降低海水中氧的溶解度，还会提升鲍的代谢速率，尤其在夏季，这一矛盾将更加突出(Hamburgeret al,1994；Vaquer-Sunyer and Duarte,2011)。其二，福建省特有的养殖模式(笼养+混合新鲜海藻)也使鲍养殖业深陷严重低氧胁迫的困境：当养殖笼具中充满新鲜海藻时，这些饵料不仅会影响鲍笼和外界水体的水流交换，还会因为呼吸作用与鲍竞争氧气。
因此，培育耐低氧的新品种(系)对鲍养殖业可持续发展的至关重要，而新品种培育要解决的首要问题就是实现鲍耐低氧性状的精确测定。传统的测评方法，如半致死溶解氧浓度(LC50)、半致死时间(LT50)等，以鲍的存活与否作为研究对象，对生物样品的损害极大，测试结束后，大部分个体都无法存活或是性腺无法正常发育；而且，这些方法大多不能对个体的耐低氧能力进行准确测定，不利于筛选低氧耐受个体，因而在育种应用中受限。
Stillman(1996)以及Dong and Williams(2011)等开发完善了非侵入式的心率监测技术，并基于此技术开发了用于测定变温动物耐高温性能的指标——阿氏拐点温度(Arrhenius break temperatures，ABT)。这一测评方法也在鲍中得到了应用(Chen etal.,2016,Alter et al.,2017)。由于以心率为研究对象并采用了非入侵式的监测技术，大大降低了高温评测中鲍的死亡情况，同时它还具有测定周期短、精确性高、可个体分析等优点。在此基础上，我们进行了更深入的研究，通过无损测定不同溶氧下心率的变化情况，开发了可以衡量鲍耐低氧性能的参数——拐点氧溶度(Break point for dissolvedoxygen，BPDO)，这种方法也具有损伤小、可个体测定等优点，因而在鲍耐低氧性状育种研究中的前景十分广阔。
发明内容
本发明的目的在于针对现有测评方法的缺失，提供一种可快速准确测定鲍鱼的耐低氧性能，同时具有适用范围广、对鲍鱼损伤小等优点，且能应用于鲍耐低氧品种(系)培育工作中测评方法的一种用于快速测定鲍耐低氧能力的方法。
本发明包括以下步骤：
1)测评前，应对样品进行严格驯化，针对不同的鲍种类，需设置适宜的驯化条件，驯化期间，采用标准程序养殖；
在步骤1)中，所述针对不同的鲍种类需设置不同的适宜养殖条件，所述驯化条件可包括温度、溶氧、盐度、氨氮水平等；就我国几种常见的鲍种类(皱纹盘鲍、西盘鲍、绿盘鲍等)，其适宜的暂养温度可为20～24℃，溶氧的饱和度可为90.0％以上，盐度可为28～32；所述标准程序养殖可包括定时投饵、及时清理食物残渣和粪便等；所述驯化的时间不小于1周。
2)取驯化后的鲍鱼样品用于后续评测，首先需对鲍壳表面进行清理，在PowerLab仪器所附带的LabChat软件中设置相关参数，便于传感器与壳面紧密粘合，而后在鲍心脏上方的壳上，固定红外传感器，获得稳定易读的心电图；
在步骤2)中，所述鲍鱼样品可为壳长不小于2.5cm的鲍鱼样品；所述LabChart软件的相关参数设置可为：量程(2～5V)、低通(1～10Hz)、交流耦合，以此获得完整光滑的波形图，利于后续的数据分析。
3)将粘有传感器的鲍放置于装有海水容器中，通过水浴使测定过程中容器内的水温恒定，待样品恢复后，以恒定速率充入氮气与空气的混合气体，使样品所处水体的溶解氧水平下降，直至水中溶氧不足1.00mg/L；
在步骤3)中，所述容器可采用塑料制箱、结晶皿等；所述样品恢复的时间最好不少于15min；所述溶解氧水平下降的方法可为：设置混合气体的总流速为2L/min，测定过程中空气流量由2L/min逐渐降低至0，氮气流量由0逐渐提升至2L/min，利用流量计将空气与氮气的流速进行20等分，每10min改变1单位的流量大小(提升1单位的氮气流速或降低1单位的空气流速，交替进行)，如此可将水中的溶氧降低速率控制在每小时1～1.5mg/L。
4)测定过程中，利用LabChart软件实时记录鲍的心率变化情况，溶氧水平则利用溶氧仪进行记录，以溶氧值为X轴，统计所得鲍心率值为Y轴，绘制散点图，而后进行回归分析和曲线拟合，获得相应曲线方程并联立，计算出交点的横坐标值，即为所需的BPDO值。
在步骤4)中，利用一般线性回归模型对溶氧-心率散点图进行分段线性拟合，利用R软件完成BPDO的计算。
本发明通过记录不同溶氧条件下鲍的心率情况，而后进行线性回归分析，计算鲍心率发生显著改变时的溶解氧溶度(拐点氧溶度)，并利用这一指标数值大小实现不同样本耐低氧性能高低的评估。本发明具有准确快捷、对样品损伤小、可个体测定等优点。
附图说明
图1为同一鲍样品在正常溶氧(6.18mg/L)与低氧(0.96mg/L)条件下心率的差异。
图2为拐点氧溶度(BPDO)示意图。
图3为20℃条件下皱纹盘鲍与绿盘鲍的BPDO值。
图4为28℃条件下皱纹盘鲍与绿盘鲍的BPDO值
图5为不同温度下皱纹盘鲍与西氏鲍种的BPDO值变化。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
本发明实施例包括以下步骤：
1)测评前，应对样品进行严格驯化，针对不同的鲍种类，需设置适宜的驯化条件，驯化期间，采用标准程序养殖；所述针对不同的鲍种类需设置不同的适宜养殖条件，就我国几种常见的鲍种类(皱纹盘鲍、西盘鲍、绿盘鲍等)，其适宜的暂养温度可为20～24℃，溶氧的饱和度可为90.0％以上，盐度可为28～32；所述驯化条件可包括温度、溶氧、盐度、氨氮水平等；所述标准程序养殖可包括定时投饵、及时清理食物残渣和粪便等；所述驯化的时间不小于1周。
2)取驯化后的鲍鱼样品用于后续评测，所述鲍鱼样品的壳长不小于2.5cm；首先需对鲍壳表面进行清理，便于传感器与壳面紧密粘合，而后在PowerLab仪器所附带的LabChat软件中设置相关参数，所述LabChart软件的相关参数设置可为：量程(2～5V)、低通(1～10Hz)、交流耦合，可获得完整光滑的波形图，利于后续的数据分析，在鲍心脏上方的壳上，固定红外传感器，获得稳定易读的心电图。
3)将粘有传感器的鲍放置于装有海水容器中，通过水浴使测定过程中容器内的水温恒定，待样品恢复后，以恒定速率充入氮气与空气的混合气体，使样品所处水体的溶解氧水平下降，直至水中溶氧不足1.00mg/L；所述容器采用塑料制箱、结晶皿等；所述样品恢复的时间最好不少于15min；所述溶解氧水平下降的方法为：设置混合气体的总流速为2L/min，测定过程中空气流量由2L/min逐渐降低至0，氮气流量由0逐渐提升至2L/min，利用流量计将空气与氮气的流速进行20等分，每10min改变1单位的流量大小(提升1单位的氮气流速或降低1单位的空气流速，交替进行)，如此可将水中的溶氧降低速率控制在每小时1～1.5mg/L。
4)测定过程中，利用LabChart软件实时记录鲍的心率变化情况，溶氧水平则利用溶氧仪进行记录，以溶氧值为X轴，统计所得鲍心率值为Y轴，绘制散点图，而后利用一般线性模型进行拟合和回归分析，获得相应曲线方程并联立，计算出交点的横坐标值，即为所需的BPDO值，BPDO的计算利用R软件完成。
图1给出同一鲍样品在不同溶氧条件下的心率情况，当水中溶氧为6.18mg/L时，此样品的心率为46beats/min，而当溶氧降低至0.96mg/L时，鲍的心率会降低至31beats/min，两种状态下差异十分显著。
以溶氧值为横坐标，鲍心率对数为纵坐标作图，所得结果如图2所示，随着溶氧的降低，鲍的心率呈现先微小波动，当低至某一临界值后，心率急剧下降的趋势。对心率的这两段变化分别进行线性拟合，获得相应的回归方程，两个方程交点的横坐标即为拐点氧溶度(BPDO)。
以下给出具体实施例。
实施例1
参见图3和4，以皱纹盘鲍(晋江群体)与绿盘鲍为实验材料，分别对其BPDO值进行了测定。由图3可以看出，当实验温度为20℃时(图3)，皱纹盘鲍的BPDO值为2.11±0.23mg/L，绿盘鲍的为2.05±0.18mg/L，二者无显著差异。而当实验温度升高至28℃时(图4)，绿盘鲍的BPDO值为2.44mg/L，皱纹盘鲍的则超过3mg/L，二者的差异达显著水平，表明在这一温度条件下，绿盘鲍的耐低氧能力显著优于皱纹盘鲍。
实施例2
参见图5，挑取壳长相近、正常喂养的同龄皱纹盘鲍(洋下群体)和西氏鲍进行BPDO的测定。结果如图5所示：随着实验温度升高，两种鲍的BPDO值都逐渐上升，其中皱纹盘鲍的BPDO值由1.80mg/L上升至3.06mg/L，上升了1.26mg/L，但在西氏鲍中，BPDO值提高了不到1.00mg/L。单因素方差分析的结果表明，在每个温度条件下，西氏鲍的BPDO值都低于皱纹盘鲍，表明其耐低氧能力显著优于皱纹盘鲍。
Claims (10)
1.一种用于快速测定鲍耐低氧能力的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)测评前，应对样品进行严格驯化，针对不同的鲍种类，需设置适宜的驯化条件，驯化期间，采用标准程序养殖；
2)取驯化后的鲍鱼样品用于后续评测，首先需对鲍壳表面进行清理，在PowerLab仪器所附带的LabChat软件中设置相关参数，便于传感器与壳面紧密粘合，而后在鲍心脏上方的壳上，固定红外传感器，获得稳定易读的心电图；
3)将粘有传感器的鲍放置于装有海水容器中，通过水浴使测定过程中容器内的水温恒定，待样品恢复后，以恒定速率充入氮气与空气的混合气体，使样品所处水体的溶解氧水平下降，直至水中溶氧不足1.00mg/L；
4)测定过程中，利用LabChart软件实时记录鲍的心率变化情况，溶氧水平则利用溶氧仪进行记录，以溶氧值为X轴，统计所得鲍心率值为Y轴，绘制散点图，而后进行回归分析和曲线拟合，获得相应曲线方程并联立，计算出交点的横坐标值，即为所需的BPDO值。
2.如权利要求1所述一种用于快速测定鲍耐低氧能力的方法，其特征在于在步骤1)中，所述驯化条件包括温度、溶氧、盐度、氨氮水平，所述针对不同的鲍种类需设置不同的适宜养殖条件，适宜的暂养温度为20～24℃，溶氧的饱和度为90.0％以上，盐度为28～32。
3.如权利要求1所述一种用于快速测定鲍耐低氧能力的方法，其特征在于在步骤1)中，所述驯化的时间不小于1周。
4.如权利要求1所述一种用于快速测定鲍耐低氧能力的方法，其特征在于在步骤1)中，所述标准程序养殖包括定时投饵、及时清理食物残渣和粪便。
5.如权利要求1所述一种用于快速测定鲍耐低氧能力的方法，其特征在于在步骤2)中，所述鲍鱼样品为壳长不小于2.5cm的鲍鱼样品。
6.如权利要求1所述一种用于快速测定鲍耐低氧能力的方法，其特征在于在步骤2)中，所述LabChart软件的相关参数设置为：量程(2～5V)、低通(1～10Hz)、交流耦合，以此获得完整光滑的波形图，利于后续的数据分析。
7.如权利要求1所述一种用于快速测定鲍耐低氧能力的方法，其特征在于在步骤3)中，所述容器采用塑料制箱、结晶皿。
8.如权利要求1所述一种用于快速测定鲍耐低氧能力的方法，其特征在于在步骤3)中，所述样品恢复的时间不少于15min。
9.如权利要求1所述一种用于快速测定鲍耐低氧能力的方法，其特征在于在步骤3)中，所述溶解氧水平下降的方法为：设置混合气体的总流速为2L/min，测定过程中空气流量由2L/min逐渐降低至0，氮气流量由0逐渐提升至2L/min，利用流量计将空气与氮气的流速进行20等分，每10min改变1单位的流量大小，如此将水中的溶氧降低速率控制在每小时1～1.5mg/L。
10.如权利要求1所述一种用于快速测定鲍耐低氧能力的方法，其特征在于在步骤3)中，在步骤4)中，利用一般线性回归模型对溶氧-心率散点图进行分段线性拟合，利用R软件完成BPDO的计算。
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| 韦柳枝: "低溶解氧对中国明对虾生长的影响及其机制的实验研究", 《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111096255A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-05-05 | 天津市胸科医院 | 一种非手术介入的鱼类的人工肺系统及其应用 |
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