CN110275014A

CN110275014A - 一种术中快速鉴别甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移的方法

Info

Publication number: CN110275014A
Application number: CN201910663876.7A
Authority: CN
Inventors: 邹贤; 周彬; 李文新; 施龙顺; 包建东; 朱国华; 高芸; 王国瑞; 李秀龙; 杨克勤
Original assignee: Jiangsu Institute of Nuclear Medicine
Current assignee: Jiangsu Institute of Nuclear Medicine
Priority date: 2019-07-23
Filing date: 2019-07-23
Publication date: 2019-09-24
Anticipated expiration: 2039-07-23
Also published as: CN110275014B

Abstract

本发明公开一种快速检测人甲状腺球蛋白(Tg)从而快速鉴别甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移的荧光免疫层析试纸，该试纸通过双抗体夹心法和荧光免疫层析技术检测人Tg，所述抗体是利用特定的抗原表位肽制备获得。本发明能够快速准确地检测待测物中的人Tg，操作简便、快速，检测范围宽、特异性高、灵敏度好。

Description

一种术中快速鉴别甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移的方法

技术领域

本发明属于免疫检测领域，具体涉及人甲状腺球蛋白(Tg)抗原表位肽、用该抗原表位肽制备的Tg特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体、所述抗体在制备人甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移体外诊断试剂盒上的用途，相关体外诊断试剂盒，以及一种用于术中快速鉴别甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移的荧光免疫层析试纸及其制备方法。

背景技术

甲状腺癌作为内分泌肿瘤和头颈肿瘤中最常见的恶性肿瘤，发病率是近20多年来增长最快的实体恶性肿瘤。甲状腺癌发病率迅速增长主要归因于分化型甲状腺癌特别是甲状腺乳头病率的迅速增加。约 50％的PTC患者在早期或术后随访中都可能发生颈部淋巴结转移。

对于PTC颈淋巴结转移，需行颈淋巴结清扫，手术范围较广，对机体损伤较大，在《2015美国甲状腺学会成人甲状腺结节与分化型甲状腺癌诊治指南》及《2012中国甲状腺结节和分化型甲状腺癌指南》建议对于有明确颈淋巴结转移病理学依据的患者进行颈淋巴结清扫。对于PTC患者颈淋巴结转移的判断，在术前主要结合临床症状、体征、B超、CT等影像学检查和淋巴结穿刺细胞学检测。术前无法明确颈淋巴结转移，则需要行术中颈淋巴结冰冻病理学检查。术中淋巴结冰冻病理学检查，依赖于大型的病理学检测设备、专业的病理学医生以及约30分钟的等待时间。

Tg是甲状腺滤泡上皮细胞分泌的大分子糖蛋白，由甲状腺细胞合成并释放进入甲状腺滤泡的残腔中。Tg也被认为是甲状腺体形完整性的特殊标志物。在先天性甲状腺功能低下患者，检测Tg可鉴别甲状腺完全缺损、甲状腺发育不全。甲状腺癌多起源于甲状腺滤泡上皮细胞，临床上常见的多为已分化之甲状腺癌，这些已分化的甲状腺癌仍然保有甲状腺滤泡上皮细胞的特性(如摄碘、合成Tg、合成甲状腺过氧化酶等)，其转移也会将上述特性带至转移灶。因此，可以通过检测Tg这一甲状腺特有蛋白的方式来判定甲状腺癌的淋巴结转移情况，进而为外科医师手术时确定淋巴结清扫范围提供有益的指引和帮助。

免疫层析技术是出现于80年代初期的一种独特的免疫分析方式，它通常以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体 (如抗体或抗原)发生高特异高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带)，通过酶反应或直接运用可目测的标记物(如胶体金)而得到直观的实验结果(如显示出不同的颜色)。而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。免疫层析技术常见的示踪标记粒子有胶体金，乳胶，胶体硒、明胶等，其中运用最成功的标记物为胶体金。但是，胶体金免疫层析试纸条存在以下缺陷：

(1)胶体金标记过程是静电吸附过程，是一种物理吸附，故在液相中稳定性较差，往往造成已标记上的蛋白分子又再次脱落。

(2)检测结果通过显示单一的紫红色条带来判断，颜色单一，难以实现多检和联检。

(3)只有当金颗粒集聚到一定量时，人肉眼才能观察到紫红的条带，且该颜色条带与背景对比度不大，从而限制了检测灵敏度。

(4)不同的材料基质效应明显，背景干扰非常大。

(5)检测灵敏度较低。

(6)无法实现定量检测。

目前也出现了利用量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法，但是此方法并不能实现对检测物的定量检测。

此外，在检测Tg水平的免疫测定方法中，尚缺乏能够在双抗体夹心测定中可高灵敏、高特异性检测的组合，寻找更为合适的具有免疫原性的Tg抗原表位肽、制备特异性的Tg抗原及抗体也是需要解决的重点。本申请基于生物信息学、化学合成等技术，获得用于抗体制备的Tg蛋白抗原肽。随后利用该抗原肽制备了单克隆抗体和多克隆抗体，验证了抗体的特异性。结果显示筛选出的抗原肽可以有效地用于针对Tg蛋白的抗体的制备，为Tg水平的免疫测定和快速鉴别甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移提供了重要的工具。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述不足，提供一种高灵敏度和高特异性，批内、批间误差小、操作简单、成本低的快速检测Tg从而在术中快速鉴别甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移的试纸及其应用。

具体地，提供一种用于定量检测待测物中人甲状腺球蛋白(Tg) 的荧光免疫层析试纸，其中所述试纸具有底板，并且在该底板上沿使用时的层析方向依次以接触方式设置有：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，该试纸通过双抗体夹心法和荧光免疫层析技术检测人 Tg，其中：

所述双抗体夹心法采用标记有荧光微球的第一TG单克隆抗体作为检测抗体，所述第一Tg单克隆抗体利用人Tg抗原表位肽(1)和(2) 中的一个作为抗原制备获得；并且

所述双抗体夹心法采用第二Tg单克隆抗体作为捕获抗体，所述第二单克隆抗体利用人Tg抗原表位肽(1)和(2)中的另一个作为抗原制备获得；

所述人Tg抗原表位肽(1)和(2)分别为：

(1)PKRCPRSCEIRNRRLLHGV(SEQ ID NO：2)

(2)AERRFQAPEPLNWTGSWDASKPRA(SEQ ID NO：3)。

优选地，所述结合垫设置有所述标记有荧光微球的第一Tg单克隆抗体。

优选地，所述硝酸纤维素膜包括检测带和质控带，所述检测带固定有所述第二Tg单克隆抗体，所述质控带包被有能与所述标记有荧光微球的第一Tg单克隆抗体特异性结合的抗抗体，所述检测带和质控带间隔3mm至8mm。

优选地，所述单克隆抗体是由Tg抗原表位肽与载体蛋白偶联制备而成的抗原制备而得。

优选地，所述荧光微球上的荧光物质为稀土离子铕。

优选地，所述荧光微球的微球材料为聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯的共聚物。

优选地，所述底板不具有荧光性质。

优选地，所述抗抗体为羊抗鼠IgG单克隆抗体或兔抗鼠IgG单克隆抗体。

进一步地，提供一种制备本发明所述荧光免疫层析试纸的方法，其包括以下步骤：

1)提供标记有荧光微球的第一Tg单克隆抗体；

2)提供结合垫，其中在所述结合垫上结合有所述标记荧光微球的第一TG单克隆抗体；

3)提供硝酸纤维素膜，其中在所述硝酸纤维素膜上沿使用时的层析方向间隔固定第二Tg单克隆抗体和抗抗体，以分别形成检测区和质控区；

4)在底板上沿使用时的层析方向依次以接触方式设置样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素膜、吸水纸，从而制成所述荧光免疫层析试纸。

其中所述步骤1)包括：

使用pH7.2-7.6的MES活化缓冲液洗涤荧光微球，加入碳二亚胺 (EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温反应一定时间，洗涤荧光微球，用0.05M pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液复溶后加入标记抗体，室温反应2小时，加入含有10％BSA的0.05M pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液，室温反应30分钟，洗涤荧光微球，用含有1％BSA，0.1％Tween-20， 0.05M pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液复溶至原体积，定量喷涂于聚酯膜上，避光35-38℃烘干1小时，加入干燥剂封存备用。

其中在所述步骤3)中，所述检测区和质控区间隔3mm至8mm，所述第二TG单克隆抗体和所述抗抗体的包被浓度分别为0.5～2mg/ml。

本发明与现有技术相比具有以下积极效果：

(1)本发明的人Tg抗原表位肽具有良好的抗原性，用其制备的抗原免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。所述抗体能够高度特异地与样本中的Tg结合。

(2)本发明将荧光分析技术与快速层析免疫技术相结合，提供了一种用于术中快速鉴别甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移的荧光免疫层析试纸，用该试纸检测待测物中的人Tg，操作简便、快速，在5 分钟内快速检测穿刺组织液中的Tg，并且检测范围宽、特异性高、灵敏度好，为外科医师提供快速、准确、可在手术床旁实施的甲状腺癌淋巴结转移的鉴别诊断方法，以便术中更好地确定淋巴结清扫范围，降低患者术后甲状旁腺功能减退的发生率，缩短住院时间，减少医疗费用。

(3)本发明在制备所述人Tg的荧光免疫层析试纸的过程中，通过大量的试验摸索，优化了各方面的制备条件，使得用本发明的荧光免疫层析试纸进行检测时，荧光信背比大大提高，从而提高了检测灵敏度和结果可信度；此外，本发明还通过试纸的检测带与质控带的荧光强度比值的变化来反应样品中Tg的含量，这与传统的层析技术只考查检测带的绝对荧光强度相比，最大程度上减少了外界条件和背景等的影响，进一步提高了检测结果可信度。

(4)目前常用的Tg检测方法主要CLIA，CLIA法精确度和灵敏度都比较高，但对仪器设备及操作人员的要求太高，试剂成本也较贵。我们研制的荧光免疫层析试纸条具有较高的灵敏度和特异性，批内、批间误差小，与CLIA法检测所得结果没有显著差异，完全符合临床应用要求，但是操作简单，体积小、便于携带，易于保存。采用该荧光免疫层析试纸条可实现快速、单人份定量检测，更适合临床检验的需要，同时实现检测仪器和试剂的产业化，达到较好的社会效益和经济效益，值得临床推广应用。

附图说明

图1为荧光免疫层析试纸沿长度方向的剖面示意图；

图2为荧光免疫层析试纸平面示意图。

图中附图标记表示为：1-底板，2-硝酸纤维素膜，3-吸水纸，4- 样品垫，5-结合垫，6-质控带，7-检测带。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1：人Tg抗原肽的筛选

本申请中所述的Tg是本领域已知的，完整的Tg是含有2768个氨基酸的单个多肽链构成，分子量约为660000道尔顿。其氨基酸序列是本领域已知的，可以在NCBI等专业数据库中查到，具体序列如下：

人类Tg(1-2768)：

MALVLEIFTLLASICWVSANIFEYQVDAQPLRPCELQRETAFLKQADYVPQCAED GSFQTVQCQNDGRSCWCVGANGSEVLGSRQPGRPVACLSFCQLQKQQILLSGYINSTDT SYLPQCQDSGDYAPVQCDVQQVQCWCVDAEGMEVYGTRQLGRPKRCPRSCEIRNRRLLH GVGDKSPPQCSAEGEFMPVQCKFVNTTDMMIFDLVHSYNRFPDAFVTFSSFQRRFPEVS GYCHCADSQGRELAETGLELLLDEIYDTIFAGLDLPSTFTETTLYRILQRRFLAVQSVISGRFRCPTKCEVERFTATSFGHPYVPSCRRNGDYQAVQCQTEGPCWCVDAQGKEMHGTR QQGEPPSCAEGQSCASERQQALSRLYFGTSGYFSQHDLFSSPEKRWASPRVARFATSCP PTIKELFVDSGLLRPMVEGQSQQFSVSENLLKEAIRAIFPSRGLARLALQFTTNPKRLQ QNLFGGKFLVNVGQFNLSGALGTRGTFNFSQFFQQLGLASFLNGGRQEDLAKPLSVGLD SNSSTGTPEAAKKDGTMNKPTVGSFGFEINLQENQNALKFLASLLELPEFLLFLQHAIS VPEDVARDLGDVMETVLSSQTCEQTPERLFVPSCTTEGSYEDVQCFSGECWCVNSWGKE LPGSRVRGGQPRCPTDCEKQRARMQSLMGSQPAGSTLFVPACTSEGHFLPVQCFNSECY CVDAEGQAIPGTRSAIGKPKKCPTPCQLQSEQAFLRTVQALLSNSSMLPTLSDTYIPQC STDGQWRQVQCNGPPEQVFELYQRWEAQNKGQDLTPAKLLVKIMSYREAASGNFSLFIQ SLYEAGQQDVFPVLSQYPSLQDVPLAALEGKRPQPRENILLEPYLFWQILNGQLSQYPG SYSDFSTPLAHFDLRNCWCVDEAGQELEGMRSEPSKLPTCPGSCEEAKLRVLQFIRETE EIVSASNSSRFPLGESFLVAKGIRLRNEDLGLPPLFPPREAFAEQFLRGSDYAIRLAAQ STLSFYQRRRFSPDDSAGASALLRSGPYMPQCDAFGSWEPVQCHAGTGHCWCVDEKGGF IPGSLTARSLQIPQCPTTCEKSRTSGLLSSWKQARSQENPSPKDLFVPACLETGEYARL QASGAGTWCVDPASGEELRPGSSSSAQCPSLCNVLKSGVLSRRVSPGYVPACRAEDGGF SPVQCDQAQGSCWCVMDSGEEVPGTRVTGGQPACESPRCPLPFNASEVVGGTILCETIS GPTGSAMQQCQLLCRQGSWSVFPPGPLICSLESGRWESQLPQPRACQRPQLWQTIQTQG HFQLQLPPGKMCSADYAGLLQTFQVFILDELTARGFCQIQVKTFGTLVSIPVCNNSSVQ VGCLTRERLGVNVTWKSRLEDIPVASLPDLHDIERALVGKDLLGRFTDLIQSGSFQLHLDSKTFPAETIRFLQGDHFGTSPRTWFGCSEGFYQVLTSEASQDGLGCVKCPEGSYSQDE ECIPCPVGFYQEQAGSLACVPCPVGRTTISAGAFSQTHCVTDCQRNEAGLQCDQNGQYR ASQKDRGSGKAFCVDGEGRRLPWWETEAPLEDSQCLMMQKFEKVPESKVIFDANAPVAV RSKVPDSEFPVMQCLTDCTEDEACSFFTVSTTEPEISCDFYAWTSDNVACMTSDQKRDA LGNSKATSFGSLRCQVKVRSHGQDSPAVYLKKGQGSTTTLQKRFEPTGFQNMLSGLYNP IVFSASGANLTDAHLFCLLACDRDLCCDGFVLTQVQGGAI ICGLLSSPSVLLCNVKDWM DPSEAWANATCPGVTYDQESHQVILRLGDQEFIKSLTPLEGTQDTFTNFQQVYLWKDSD MGSRPESMGCRKNTVPRPASPTEAGLTTELFSPVDLNQVIVNGNQSLSSQKHWLFKHLF SAQQANLWCLSRCVQEHSFCQLAEITESASLYFTCTLYPEAQVCDDIMESNAQGCRLIL PQMPKALFRKKVILEDKVKNFYTRLPFQKLMGISIRNKVPMSEKSISNGFFECERRCDA DPCCTGFGFLNVSQLKGGEVTCLTLNSLGIQMCSEENGGAWRILDCGSPDIEVHTYPFG WYQKPIAQNNAPSFCPLVVLPSLTEKVSLDSWQSLALSSVVVDPSIRHFDVAHVSTAAT SNFSAVRDLCLSECSQHEACLITTLQTQPGAVRCMFYADTQSCTHSLQGQNCRLLLREE ATHIYRKPGISLLSYEASVPSVPISTHGRLLGRSQAIQVGTSWKQVDQFLGVPYAAPPL AERRFQAPEPLNWTGSWDASKPRASCWQPGTRTSTSPGVSEDCLYLNVFIPQNVAPNAS VLVFFHNTMDREESEGWPAIDGSFLAAVGNLIVVTASYRVGVFGFLSSGSGEVSGNWGL LDQVAALTWVQTHIRGFGGDPRRVSLAADRGGADVASIHLLTARATNSQLFRRAVLMGG SALSPAAVISHERAQQQAIALAKEVSCPMSSSQEVVSCLRQKPANVLNDAQTKLLAVSG PFHYWGPVIDGHFLREPPARALKRSLRVEVDLLIGSSQDDGLINRAKAVKQFEESQGRTSSKTAFYQALQNSLGGEDSDARVEAAATWYYSLEHSTDDYASFSRALENATRDYFIICP IIDMASAWAKRARGNVFMYHAPENYGHGSLELLADVQFALGLPFYPAYEGQFSLEEKSL SLKIMQYFSHFIRSGNPNYPYEFSRKVPTFATPWPDFVPRAGGENYKEFSELLPNRQGL KKADCSFWSKYISSLKTSADGAKGGQSAESEEEELTAGSGLREDLLSLQEPGSKTYSK (SEQ ID NO：1)

本申请发明人经过大量的理论研究和实验摸索，最终筛选得到两种具有良好的抗原性的抗原表位肽。

Tg抗原表位肽(1)包含人Tg多肽近N端第157位至175位的肽段，从而构成含19个氨基酸的抗原表位肽(1)：PKRCPRSCEIRNRRLLHGV (SEQ ID NO：2)。

Tg抗原表位肽(2)包含人Tg多肽近C端第2239位至2262位的肽段，从而构成含24个氨基酸的抗原表位肽(2)： AERRFQAPEPLNWTGSWDASKPRA(SEQ ID NO：3)

抗原表位肽的制备利用多肽自动合成仪，通过固相法合成，并通过多肽序列测定鉴定所合成的抗原表位肽序列。

实施例2：TG抗体的制备

分别将实施例1所得的TG抗原表位肽(1)和(2)与载体蛋白连接以制备免疫用抗原(1)和(2)，利用所得抗原(1)和(2)分别免疫动物，从而利用抗原(1)制备特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，并且利用抗原(2)制备特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。

1.抗原的制备：将Tg肽段分别与载体蛋白BSA连接制备成TG抗原。取本申请所述的两种抗原肽各5.0mg，溶于1mL DMF中，滴加 5mg EDC(溶于50μL H₂O)，搅拌20min后，将该反应滴加至5mg BSA(溶于1mL PBS缓冲液)中，立即加入5mg NHS，室温搅拌过夜。将反应液装入处理后的透析袋中，置于4℃冰箱内用PBS透析 3d，每天换3次透析液，冷冻干燥得Tg肽-BSA粉末，-20℃备用。

2.免疫动物制备单克隆抗体：

2.1.将100μg上述制备的Tg抗原(免疫原)与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后腹部皮下多点注射6周龄BALB/c雌性小鼠4只。接下来将100μg的纯化病毒与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化后分别进行二免、三免，每次免疫间隔14d。三免后第10天每只小鼠尾静脉采集血液，分离血清。间接ELISA测定抗体效价，将抗体效价在1：10000以上的小鼠经腹腔注射纯化病毒100μg进行加强免疫，加强免疫后第3天选取抗体效价最高的小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合。用间接ELISA方法筛选阳性克隆，利用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行3—4次亚克隆，最后得到能稳定分泌抗体的单克隆细胞株，扩大培养后液氮保存，备用。取12周龄的BALB/c雄性小鼠，每只腹腔注射0.5mL的灭菌液体石蜡，7d后腹腔注入对数生长期的阳性杂交瘤细胞(1×10⁶个/mL)，7-10d后小鼠腹部明显膨大，无菌采集腹水，11000r/min离心10min，取上清液于-80℃保存，备用。

另外，同时以Tg全长(1-2768)按照上述流程制备单克隆抗体。

2.2.测定抗体效价：用间接ELISA方法测定利用Tg抗原(1)制备的单克隆抗体(1)的效价，结果显示单抗的效价达到1:37000以上。

利用Tg抗原(2)制备的单克隆抗体(2)的效价也利用相同的方法进行测定，其效价也达到1:38000以上。二者均显著高于利用Tg全长制备的单克隆抗体的效价(1:27000)。

3.免疫动物制备多克隆抗体：

3.1.取雄性大耳白家兔2只，体重约2Kg，随机分3组，每组2 只。用两种Tg多肽抗原分别免疫每组家兔，采用皮下多点微量免疫法。①基础免疫：每只家兔注射卡介苗2.5mg持续10d；②福氏完全佐剂：用2种复合免疫原分别注射每组家兔，2mg/只兔(含BSA及多肽各约1mg)，纯多肽免疫原Tg(1-2768)注射1mg/只兔，持续28d；③福氏不完全佐剂免疫：2种复合物免疫原分别注射每组家兔1.6mg/ 只兔(含BSA及多肽各约0.8mg)，纯多肽免疫原Tg(1-2768)注射0.8mg/只兔，持续28d；④加强免疫：以后每周用3种免疫原制备的水剂分别加强免疫，剂量同③。

3.2.测定抗体效价：用间接ELISA法测定利用Tg抗原(1)制备的多克隆抗体(1)的效价，结果显示抗体效价达到1:31000以上。利用 Tg抗原(2)制备的多克隆抗体(2)的效价也利用相同的方法进行测定，其效价也达到1:32000以上。均显著高于利用纯多肽免疫原Tg(1-2768)获得的多克隆抗体的效价(1：20000)。

3.3.取血及分离血清：颈动脉插管取血，分离血清。

4.分离纯化抗体：硫酸铵沉淀后，再经Protein G(购自sigma 公司)亲和纯化。

5.抗体分装后冻干，低温保存。

实施例3：人TG抗体(1)和(2)的特异性鉴定

以ELISA进行检测。分别以人Tg蛋白、GAPDH蛋白、神经元特异性烯醇化酶NSE为检测抗原包被ELISA板，通过ELISA分别检测所制备的TG单克隆抗体(1)和(2)与不同蛋白的特异性反应，以正常 BALB/c小鼠血清作阴性对照，PBS液作空白对照。

结果：Tg单克隆抗体(1)和(2)分别只与Tg反应为阳性(P/N〉2.1)，而与GAPDH蛋白、神经元特异性烯醇化酶NSE反应为阴性，说明利用本发明的Tg表位肽(1)、(2)制备的单克隆抗体(1)和(2)均具有特异性。

利用与上述鉴定单克隆抗体特异性相同的方法进行鉴定多克隆抗体。

结果显示：Tg多克隆抗体(1)和(2)分别与Tg反应为阳性(P/N〉 2.1)，而与GAPDH蛋白、神经元特异性烯醇化酶NSE反应为阴性，说明本发明的Tg表位肽制备的多克隆抗体(1)和(2)分别具有特异性。

实施例4：用于检测待测物中人Tg的荧光免疫层析试纸的制备

1.研究对象：标本来自江原医院60例外科手术患者，均用注射器术中穿刺甲状腺腺体、胸腺、肌肉组织、脂肪组织，取样备用。

2.试剂与仪器：

免疫层析试纸分为试验组和对照组，其中试验组的荧光微球标记抗体是实施例2中利用本发明的表位肽(1)制备的单克隆抗体、检测带抗体是实施例2中利用本发明的表位肽(2)制备的单克隆抗体。而对照组1以购买的针对TG全长的2种市售抗体分别作为荧光微球标记抗体和检测带抗体，对照组2是以利用Tg表位(356-452位肽段)和Tg表位(2656-2768位肽段)制备的单克隆抗体分别作为荧光微球标记抗体和检测带抗体。

免疫层析中的质控抗体(羊抗鼠IgG)、荧光微球、荧光检测仪来自无锡市江原实业技贸公司，硝酸纤维素膜(美国Merck-Millipore 公司)，样品垫、聚酯膜、底板、吸水纸采购于上海杰一公司，CLIA 检测试剂盒，罗氏公司产品，其他试剂为国产分析纯。

3.制备方法：

3.1.1抗体标记荧光微球：使用pH7.2-7.6的MES活化缓冲液洗涤荧光微球，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温反应一定时间，洗涤荧光微球，用0.05MpH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液复溶后加入标记抗体，室温反应2小时，加入含有10％BSA的0.05M pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液，室温反应30分钟，洗涤荧光微球，用含有1％BSA，0.1％Tween-20，0.05M pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液复溶至原体积，定量喷涂于结合垫上，避光35-38℃烘干1小时，加入干燥剂封存备用；

3.1.2荧光免疫层析试纸条组装部件处理：(1)样品垫的处理使用含1％BSA、0.1％Triton100的0.02M pH7.4的磷酸盐缓冲液浸泡样品烘干。(2)硝酸纤维素膜的制备使用含1％蔗糖的0.02M pH7.4的磷酸盐缓冲液，分别将检测抗体和质控抗体稀释到1mg/ml，将二者以0.5cm的间隔喷于硝酸纤维素膜上，烘干后加入干燥剂封存备用；

3.1.3荧光免疫层析试纸条的组装：在湿度小于35％，稳定20-25℃的环境下，在PVC底板上黏贴上硝酸纤维素膜、结合了荧光微球标记的结合垫、样品垫和吸水纸形成微滤体系，切割成0.3cm宽，装入卡壳中即制成试纸条(图1-图2)。

4.检测方法：

4.1取样：用26-gague注射器针头穿刺3次取样，将取样后的针头与1ml注射器对接。

4.2样品预处理：取一支含200μl PBS缓冲液的溶液管，平衡至室温，使用前确保所有液体都在管子的底部。将穿刺取样后的注射器针头伸入缓冲液中，通过反复吸打的方式充分洗涤混匀，制成待测样品。

4.3加样：在Tg荧光免疫层析试纸的加样区加入上述待测样品 60μl，室温放置5min。

4.4检测：将反应后的荧光免疫层析试纸及校准卡插入便携式荧光免疫定量分析仪的插卡口，运行仪器，仪器自动读卡给出荧光免疫层析试纸中的质控带C值和检测带T值。

4.5结果判断：

当C<10000时，表示结果为无效检测，需要重新更换试纸检测；

当T/C≥0.2时，结果为阳性，表明穿刺物中含有Tg；

当T/C<0.2时，结果为阴性，表明穿刺物不含Tg。

5.标准曲线的绘制：将Tg标准品制成5个不同的浓度，分别为 10、50、100、200和300μg/L，每个浓度做5个平行样。

6.荧光免疫层析试纸条性能测试：(1)灵敏度：测定10个空白样，取平均值(x)和标准差(s)，计算x±s，以此数值在标准曲线上查出相对应的剂量即为该方法的灵敏度。(2)试纸条在4℃，避光条件下保存6个月后，分别抽取同一批次和不同批次的Tg荧光免疫层析试纸条，用100pg/mL浓度的标准品进行测试，计算批内和批间差CV。(3)将标准品制成与Tg标准曲线中相对应的6个浓度，进行特异性检测。

7.与电化学发光法(CLIA)检测试剂盒比较：严格按照CLIA检测试剂盒说明书操作要求，与Tg荧光检测试纸分别同时对60例患者的穿刺甲状腺标本进行平行检测。

8.统计学处理：用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析，组间用χ²检验，P＜0.05为差异有统计学意义。用配对t检验进行相关性和差异性比较。

结果与分析：

1.检测结果判读：检测时，由于层析作用液体向前移动。若试样中Tg的含量过少，试样中的Tg与结合垫上标记抗体结合的荧光微球结合形成复合物C1则相应较少，结合垫中的标记抗体与C线上的质控抗体大量结合，由此导致T线荧光比C线荧光浅很多(或完全检测不到荧光)，结果为阴性；若试样中Tg的浓度较大，则复合物C1 相应较多，与T线处的检测抗体结合并大量形成抗体-抗原-抗体复合物C2，而且试样中Tg越高，T线显色越深，结果为阳性。无论是阳性还是阴性结果，因鼠源性抗体标记的荧光微球过量包被，因而总有未结合检测抗体的部分荧光微球与C线处的羊抗鼠IgG结合，在C 线处出现荧光微球的聚集。如果C线没有荧光条带，无论T线有无荧光条带，结果均无效。

2.标准曲线绘制：按照统计学方法，以检测样品荧光值信号为纵坐标，Tg标准品浓度为横坐标(表1为试验组的数据，即利用本发明所述表位的抗体)，建立方程并拟合成标准曲线。该标准曲线的R²为0.9997，线性较好，符合定量检测的要求。而对照组1标准曲线的R²为0.9113，对照组2标准曲线的R²为0.9304，线性相对于试验组均较差。

表1 Tg标准品检测结果

3.Tg免疫层析荧光试纸条性能评价：(1)灵敏度：试验组零剂量点的T/C均值为0.18，在标准曲线上折算为0.1μg/L，该值即为试验组的灵敏度。而对照组1和2的灵敏度分别为5μg/L和3μg/L，二者相差一个数量级。(2)稳定性和精密度：试验组的标准曲线各组对应的CV值均小于5％(表1)。4℃，避光条件下保存6个月的试纸条检测时，批内和批间CV分别为4.33％和5.27％，结果表明试纸条检测稳定性和精密度较好。对照组在稳定性和精密度上与试验组相差不大。(3)特异性：将配制好的Tg标准品与甲状腺素标准品同时用试验组的试纸条进行检测，各浓度点交叉反应率CR％＝测定值甲状腺素/ 测定值Tg×100％，在上述浓度范围内，与甲状腺素的交叉反应率均小于0.1％，说明两者无交叉反应，方法特异性比较好。当采用对照组试纸条时，在低浓度点与甲状腺素的交叉反应率＞3％，特异性明显低于试验组。

4.与CLIA方法的比较：选取60例患者，穿刺其甲状腺腺体、颈淋巴结、胸腺、肌肉组织、脂肪组织，其中的Tg含量分别用CLIA 试剂盒与试验组荧光免疫层析试纸条、对照组免疫层析试纸条进行检测。结果表明，试验组免疫层析试纸条与CLIA试剂盒的相关系数为0.9957，相关性曲线为Y＝0.9798X+1.8467，其中Y为本发明的荧光免疫检测试纸条检测得到的Tg浓度(μg/L)，X为CLIA试剂盒检测得到的Tg浓度(μg/L)。可见两者的相关性良好。此外，结果显示正常甲状腺组织和非甲状腺组织的Tg浓度有显著性差异(表2)， P＜0.001，相关性具有统计学意义。而对照组1、2免疫层析试纸条与CLIA试剂盒的相关系数分别为0.9096、0.9231，相关性略低于试验组。

表2不同组织洗脱液Tg检测结果

实施例5本发明荧光免疫层析试纸用于诊断甲状腺乳头状癌(PTC) 淋巴结转移的应用

研究对象：标本来自江原医院PTC外科手术患者的76个颈淋巴结，均用注射器术中穿刺，取样备用。手术病理证实的淋巴结共76 枚，其中转移性淋巴结51枚，非转移性淋巴结25枚。

5.1取样：用26-gague注射器针头穿刺3次取样，将取样后的针头与1ml注射器对接。

5.2样品预处理：取一支含200μl PBS缓冲液的溶液管，平衡至室温，使用前确保所有液体都在管子的底部。将穿刺取样后的注射器针头伸入缓冲液中，通过反复吸打的方式充分洗涤混匀，制成待测样品。

5.3加样：在Tg荧光免疫层析试纸的加样区加入上述待测样品 60μl，室温放置5min。

5.4检测：将反应后的荧光免疫层析试纸及校准卡插入便携式荧光免疫定量分析仪的插卡口，运行仪器，仪器自动读卡给出荧光免疫层析试纸中的质控带C值和检测带T值。

5.5结果判断：

当C<10000时，表示结果为无效检测，需要重新更换试纸检测；

当T/C≥0.2时，结果为阳性，表明穿刺物中含有Tg；

当T/C<0.2时，结果为阴性，表明穿刺物不含Tg。

5.6结果分析：

表3不同淋巴结检测结果

注：数值以中位数的形式表示

结果表明转移性淋巴结组和非转移性淋巴结组之间的穿刺液Tg 有显著性差异(表3)，P＜0.001，相关性具有统计学意义。为快速诊断PTC是否发生淋巴结转移提供了可靠便捷的检测工具。

由以上实施例及考察结果可知，通过本发明的两个Tg表位肽制备的单克隆抗体能特异性识别Tg，利用其制备的荧光免疫层析定量检测方法能够在短时间准确定量Tg，与CLIA法检测所得结果没有显著差异，完全符合临床应用要求，操作简单，体积小、便于携带，易于保存，值得临床推广应用。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，完全适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

序列表

<110> 江苏省原子医学研究所

<120> 一种术中快速鉴别甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移的方法

<130> 200

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2768

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ala Leu Val Leu Glu Ile Phe Thr Leu Leu Ala Ser Ile Cys Trp

1 5 10 15

Val Ser Ala Asn Ile Phe Glu Tyr Gln Val Asp Ala Gln Pro Leu Arg

20 25 30

Pro Cys Glu Leu Gln Arg Glu Thr Ala Phe Leu Lys Gln Ala Asp Tyr

35 40 45

Val Pro Gln Cys Ala Glu Asp Gly Ser Phe Gln Thr Val Gln Cys Gln

50 55 60

Asn Asp Gly Arg Ser Cys Trp Cys Val Gly Ala Asn Gly Ser Glu Val

65 70 75 80

Leu Gly Ser Arg Gln Pro Gly Arg Pro Val Ala Cys Leu Ser Phe Cys

85 90 95

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Asp Thr Ser Tyr Leu Pro Gln Cys Gln Asp Ser Gly Asp Tyr Ala Pro

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130 135 140

Gly Met Glu Val Tyr Gly Thr Arg Gln Leu Gly Arg Pro Lys Arg Cys

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195 200 205

His Ser Tyr Asn Arg Phe Pro Asp Ala Phe Val Thr Phe Ser Ser Phe

210 215 220

Gln Arg Arg Phe Pro Glu Val Ser Gly Tyr Cys His Cys Ala Asp Ser

225 230 235 240

Gln Gly Arg Glu Leu Ala Glu Thr Gly Leu Glu Leu Leu Leu Asp Glu

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Ser Val Ile Ser Gly Arg Phe Arg Cys Pro Thr Lys Cys Glu Val Glu

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Trp Cys Val Asp Ala Gln Gly Lys Glu Met His Gly Thr Arg Gln Gln

340 345 350

Gly Glu Pro Pro Ser Cys Ala Glu Gly Gln Ser Cys Ala Ser Glu Arg

355 360 365

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370 375 380

Gln His Asp Leu Phe Ser Ser Pro Glu Lys Arg Trp Ala Ser Pro Arg

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Val Ala Arg Phe Ala Thr Ser Cys Pro Pro Thr Ile Lys Glu Leu Phe

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Val Asp Ser Gly Leu Leu Arg Pro Met Val Glu Gly Gln Ser Gln Gln

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Phe Ser Val Ser Glu Asn Leu Leu Lys Glu Ala Ile Arg Ala Ile Phe

435 440 445

Pro Ser Arg Gly Leu Ala Arg Leu Ala Leu Gln Phe Thr Thr Asn Pro

450 455 460

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465 470 475 480

Gly Gln Phe Asn Leu Ser Gly Ala Leu Gly Thr Arg Gly Thr Phe Asn

485 490 495

Phe Ser Gln Phe Phe Gln Gln Leu Gly Leu Ala Ser Phe Leu Asn Gly

500 505 510

Gly Arg Gln Glu Asp Leu Ala Lys Pro Leu Ser Val Gly Leu Asp Ser

515 520 525

Asn Ser Ser Thr Gly Thr Pro Glu Ala Ala Lys Lys Asp Gly Thr Met

530 535 540

Asn Lys Pro Thr Val Gly Ser Phe Gly Phe Glu Ile Asn Leu Gln Glu

545 550 555 560

Asn Gln Asn Ala Leu Lys Phe Leu Ala Ser Leu Leu Glu Leu Pro Glu

565 570 575

Phe Leu Leu Phe Leu Gln His Ala Ile Ser Val Pro Glu Asp Val Ala

580 585 590

Arg Asp Leu Gly Asp Val Met Glu Thr Val Leu Ser Ser Gln Thr Cys

595 600 605

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Ser Tyr Glu Asp Val Gln Cys Phe Ser Gly Glu Cys Trp Cys Val Asn

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Met Gly Ser Gln Pro Ala Gly Ser Thr Leu Phe Val Pro Ala Cys Thr

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Gly Lys Pro Lys Lys Cys Pro Thr Pro Cys Gln Leu Gln Ser Glu Gln

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Pro Thr Leu Ser Asp Thr Tyr Ile Pro Gln Cys Ser Thr Asp Gly Gln

755 760 765

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Lys Leu Leu Val Lys Ile Met Ser Tyr Arg Glu Ala Ala Ser Gly Asn

805 810 815

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Phe Pro Val Leu Ser Gln Tyr Pro Ser Leu Gln Asp Val Pro Leu Ala

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Gly Ser Tyr Ser Asp Phe Ser Thr Pro Leu Ala His Phe Asp Leu Arg

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Asn Cys Trp Cys Val Asp Glu Ala Gly Gln Glu Leu Glu Gly Met Arg

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Pro Pro Arg Glu Ala Phe Ala Glu Gln Phe Leu Arg Gly Ser Asp Tyr

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Ala Ile Arg Leu Ala Ala Gln Ser Thr Leu Ser Phe Tyr Gln Arg Arg

995 1000 1005

Arg Phe Ser Pro Asp Asp Ser Ala Gly Ala Ser Ala Leu Leu Arg Ser

1010 1015 1020

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Trp Lys Gln Ala Arg Ser Gln Glu Asn Pro Ser Pro Lys Asp Leu Phe

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Val Pro Ala Cys Leu Glu Thr Gly Glu Tyr Ala Arg Leu Gln Ala Ser

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Lys Ser Gly Val Leu Ser Arg Arg Val Ser Pro Gly Tyr Val Pro Ala

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Cys Arg Ala Glu Asp Gly Gly Phe Ser Pro Val Gln Cys Asp Gln Ala

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Thr Ile Ser Gly Pro Thr Gly Ser Ala Met Gln Gln Cys Gln Leu Leu

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Gly Phe Cys Gln Ile Gln Val Lys Thr Phe Gly Thr Leu Val Ser Ile

1330 1335 1340

Pro Val Cys Asn Asn Ser Ser Val Gln Val Gly Cys Leu Thr Arg Glu

1345 1350 1355 1360

Arg Leu Gly Val Asn Val Thr Trp Lys Ser Arg Leu Glu Asp Ile Pro

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Val Ala Ser Leu Pro Asp Leu His Asp Ile Glu Arg Ala Leu Val Gly

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Ser Glu Gly Phe Tyr Gln Val Leu Thr Ser Glu Ala Ser Gln Asp Gly

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Leu Gly Cys Val Lys Cys Pro Glu Gly Ser Tyr Ser Gln Asp Glu Glu

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1505 1510 1515 1520

Leu Gln Cys Asp Gln Asn Gly Gln Tyr Arg Ala Ser Gln Lys Asp Arg

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Gln Leu Ala Glu Ile Thr Glu Ser Ala Ser Leu Tyr Phe Thr Cys Thr

1905 1910 1915 1920

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2005 2010 2015

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2020 2025 2030

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2085 2090 2095

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2405 2410 2415

Ala Leu Ser Pro Ala Ala Val Ile Ser His Glu Arg Ala Gln Gln Gln

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<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

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1 5 10 15

His Gly Val

<210> 3

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Ala Glu Arg Arg Phe Gln Ala Pro Glu Pro Leu Asn Trp Thr Gly Ser

1 5 10 15

Trp Asp Ala Ser Lys Pro Arg Ala

20

Claims

1.一种快速检测人甲状腺球蛋白(Tg)从而快速鉴别甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移的荧光免疫层析试纸，该试纸通过双抗体夹心法和荧光免疫层析技术检测待测样品中的人Tg从而判断是否发生了甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移，其中：

所述试纸具有底板，并且在该底板上沿使用时的层析方向依次以接触方式设置有：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，该试纸通过双抗体夹心法和荧光免疫层析技术检测人Tg，其中：

所述双抗体夹心法采用标记有荧光微球的第一Tg单克隆抗体作为检测抗体，所述第一Tg单克隆抗体利用人Tg抗原表位肽(1)和(2)中的一个作为抗原制备获得；并且

所述人Tg抗原表位肽(1)和(2)分别为：

(1)PKRCPRSCEIRNRRLLHGV(SEQ ID NO：2)

(2)AERRFQAPEPLNWTGSWDASKPRA(SEQ ID NO：3)。

2.根据权利要求1所述的荧光免疫层析试纸，其特征在于，所述结合垫设置有所述标记有荧光微球的第一Tg单克隆抗体。

3.根据权利要求1或2所述的荧光免疫层析试纸，其特征在于，所述硝酸纤维素膜包括检测带和质控带，所述检测带固定有所述第二Tg单克隆抗体，所述质控带包被有能与所述标记有荧光微球的第一Tg单克隆抗体特异性结合的抗抗体，所述检测带和质控带间隔3mm至8mm。

4.根据权利要求1或2所述的荧光免疫层析试纸，其特征在于，其中所述荧光微球上的荧光物质为稀土离子铕，或所述荧光微球的微球材料为聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯的共聚物。

5.根据权利要求1或2所述的荧光免疫层析试纸，其特征在于，其中所述抗抗体为羊抗鼠IgG多克隆抗体或兔抗鼠IgG多克隆抗体。

6.一种制备根据权利要求1至5中任意一项所述的荧光免疫层析试纸的方法，其包括以下步骤：

1)提供标记有荧光微球的第一Tg单克隆抗体；

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述步骤1)包括：

使用pH7.2-7.6的MES活化缓冲液洗涤荧光微球，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温反应一定时间，洗涤荧光微球，用0.05M pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液复溶后加入标记抗体，室温反应2小时，加入含有10％BSA的0.05M pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液，室温反应30分钟，洗涤荧光微球，用含有1％BSA，0.1％Tween-20，0.05M pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液复溶至原体积，定量喷涂于结合垫上，避光35-38℃烘干1小时，加入干燥剂封存备用。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中在所述步骤3)中，所述检测区和质控区间隔3mm至8mm，所述第二TG单克隆抗体和所述抗抗体的包被浓度分别为0.5～2mg/ml。

9.权利要求1至5中任意一项所述的荧光免疫层析试纸在制备快速鉴别甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移的试剂中的用途。

10.一种非诊断目的的快速鉴别甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移的方法，包括利用权利要求1至5中任意一项所述的荧光免疫层析试纸对淋巴结穿刺液进行检测，当检测到淋巴结穿刺液中的Tg为阳性时，说明发生了甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移。