CN110273020A - 用于区分柑橘夏橙和普通甜橙的snp分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，更具体涉及用于区分柑橘夏橙和普通甜橙的SNP分子标记及应用，所述的引物为：SNP6‑F：CTGGGGCTACTGGGATTTCA和SNP6‑R:TAACGAAATTTGCCCGCGAA。利用本发明提供的引物可对普通甜橙可夏橙进行100%的区分，同时根据snp位点信息鉴定普通甜橙和夏橙。本发明提供的SNP分子标记操作简便，不受自然环境和人为因素等影响，在植物体的不同组织和发育时期均可检测，结果可靠。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，更具体涉及用于区分柑橘夏橙和普通甜橙的SNP分子标记及应用。
背景技术
柑橘是世界第一大水果，也是我国栽培面积最大的水果。中国是全球柑橘产量最大的生产国，柑橘产量占世界的五分之一以上。截止到2015年，我国柑橘栽培面积达260.0万公顷，产量达3600.0万吨，柑橘栽培面积和产量都有较大幅度的增长。世界范围来看，过去几十年里，各柑橘栽培地区，特别是主产地区、国家，都利用自己的地区，整合资源，大力发展柑橘产业，产品供给逐渐实现全年供应。
近些年来，我国柑橘产业结构中，宽皮柑橘包括橘类、柑类和杂柑类，比例有所下降，甜橙类种植规模不断扩大。按成熟期可将普通甜橙分成三类，即早、中、晚熟3类。早熟品种在11月份上中旬成熟，品种较少，代表品种有哈姆林甜橙；中熟品种熟期为11月下旬至12月成熟，这类品种最多，大多原产中国重庆、湖南、四川、湖北等地；夏橙是柑橘中重要的晚熟品种，分布广泛，成熟期在翌年3-5月份。随着我国柑橘品种育种进程的不断加快，甜橙的种类在不断的增多，因此将不同的甜橙种类进行有效、准确的分类和鉴定仍是一项亟待解决的问题。目前，针对于普通甜橙和夏橙种类的鉴定还仅停留在通过树体形态特征、花形态、果实外观、果实成熟期等传统手段，受环境和人为因素的影响较大。对普通甜橙和夏橙品种鉴别的不确定性，对从事柑橘研究的科研人员和柑橘产区的从业人员都有着较大的影响。一方面，无法准确区别普通甜橙和夏橙品种对于甜橙的常规杂交育种和分子育种等带来诸多不确定因素；另一方面，柑橘苗木的不纯有可能给产区果农带来经济损失，制约我国柑橘产业的健康发展。
随着测序技术的发展，基因组重测序成为动植物研究中常用的方法，通过与参考基因组比对，挖掘研究动植物的种质特性、遗传结构、遗传关系甚至历史起源等重要进化痕迹。葡萄作为第一个果树种质在2007年测序完成后，到2013年，10种果树基因组信息陆续发表，葡萄(Jaillon et al，2007)、番木瓜(Ming et al，2008)、苹果(Velasco et al，2010)、草莓(Shulaev et al，2010)、可可(Argout et al，2011)、海枣(Al-Dous et al，2011)、香蕉(D'Hont et al，2012)、梨(Wu et al，2012)、甜橙(Xu et al，2012)、桃(TheInternational Peach Genome Iniative et al，2013)完成了全基因组测序工作，为果树作物全基因组测序研究提供大量参考信息，为培育符合人们意愿的目标性状的果树育种工作提供数据平台。
近年来，分子标记随着现代分子水平研究技术的发展，从以前的形态学标记、生化标记等发展到以AFLP、SSR、SNP等为代表的新的DNA水平上的分子标记，DNA分子标记具有多态性高、数量多等特点，能够直接反应DNA分子水平的差异，相较之下更加可靠。通过全基因组重测序产生的大量SNP位点，进而过滤、筛选、验证出的可用于区分不同测序品种的SNP分子标记，具有遗传稳定性高、位点丰富且广泛、富有代表性、检测快捷，易实现自动化分析等特点。分子标记技术能快速、准确、高效对品种进行鉴定,对保证农业生产中品种的正确性具有重要的意义。
我国是世界上栽培柑橘历史最早的国家，也是柑橘重要的原产中心之一，柑橘资源丰富，品种多样。与普通甜橙相比，夏橙是柑橘中成熟期在翌年4-5月份的晚熟甜橙，开发适用于鉴别夏橙与普通甜橙的分子标记，一方面有利于我们对珍惜的柑橘品种进行鉴定和保护，另一方面可以为柑橘的分子标记育种提供更高效的筛选标记。
发明内容
本发明的目的在于利用分子标记技术，提供一种用于区分柑橘夏橙和普通甜橙的SNP 分子标记，该分子标记为SNP，位于甜橙第4号染色体第17856950个碱基，命名为SNP6，针对其设计的引物为SNP6-F：CTGGGGCTACTGGGATTTCA和SNP6-R:TAACGAAATTT GCCCGCGAA。
本发明的另一个目的在于提供了用于检测该分子标记的试剂的应用，该试剂可用于鉴定普通甜橙或夏橙，或对夏橙和甜橙进行区分；用于橙的分子育种。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
申请人从甜橙基因组网站(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/)下载甜橙基因组全序列。通过全基因组重测序筛选能够区分夏橙和普通甜橙的SNP分子标记，筛选出的SNP位点运用HRM和TOPO菌液克隆技术进行验证，最终获得SNP分子标记SNP6，该位点位于甜橙第 4号染色体第17856950个碱基。
检测甜橙第4号染色体第17856950个碱基的SNP位点的试剂在橙的分子育种中的应用属于本发明的保护范围。
检测甜橙第4号染色体第17856950个碱基的SNP位点的试剂在夏橙的鉴定中的应用也属于本发明的保护范围。
检测甜橙第4号染色体第17856950个碱基的SNP位点的试剂在普通甜橙的鉴定中的应用也属于本发明的保护范围。
检测甜橙第4号染色体第17856950个碱基的SNP位点的试剂在区分夏橙和普通甜橙中的应用也属于本发明的保护范围。
以上所述的应用中，优选的，针对该snp设计的引物为Geo19-159-F:TGATTCGTTTTGA CACAATGG和Geo19-159-R:TGCAGGCTATGGACTGAGTG。
以上所述的应用中，所述的普通甜橙包括但不限于：红肉暗柳橙、锦橙、冰糖橙、雪柑、桃叶橙、大红甜橙、哈姆林甜橙、特罗维塔、梨橙、糖橙、先锋橙和沙漠蒂甜橙；
所述的夏橙包括但不限于：无籽夏橙、卡特夏橙、奥林达夏橙、福罗斯特、德塔夏橙、蜜奈夏橙、露德红夏橙、阿尔及尔夏橙、康贝尔夏橙、五月红、刘金刚夏橙、岛仔51号、桂夏橙。
与现有技术相比，本发明的优点：
1.根据柑橘的农艺性状区分不同品种，虽然较为简单直观，但是数量少、多态性差、易受环境条件和人为因素干扰，结果准确性差，适用范围较窄。SNP分子标记操作简便，不受自然环境和人为因素等影响，在植物体的不同组织和发育时期均可检测，结果可靠。
2.本发明的开发的SNP分子标记，是首次提出的可用于区分普通甜橙和夏橙品种。
3.本发明提供的SNP分子标记引物特异性高，利用操作简单的HRM技术，能够准确的区分至少25个品种中的普通甜橙和夏橙品种。
附图说明
图1为表1中的25个橙子品种的HRM结果；
其中a为甜橙和夏橙的HRM曲线形状图，b为HRM的SNP分析结果，X1-X13为代表晚熟夏橙，T1-T12为代表中熟甜橙。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业或公开的渠道。
实施例1：
用于区分夏橙和普通甜橙SNP分子标记引物的获得：
申请人从甜橙基因组网站(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/)下载甜橙基因组全序列。通过全基因组重测序筛选能够区分夏橙和普通甜橙的SNP分子标记，筛选出的SNP位点运用 HRM和TOPO菌液克隆技术进行验证，最终获得SNP分子标记SNP6，该位点位于甜橙第 4号染色体第17856950个碱基。
针对其设计的引物为SNP6-F：CTGGGGCTACTGGGATTTCA和SNP6-R:TAACGAAATTTGCCCGCGAA。
实施例2：
用于区分夏橙和普通甜橙的SNP分子标记在品种鉴定中的应用方法：
(1)按照CTAB法分别提取待测甜橙或夏橙的DNA样品。
(2)使用移液枪参照下反应体系吸取各反应物于96孔反应板中，每孔10ul。具体反应体系如下。
a.反应体系
10ul体系的配制
| 模板DNA(ul) | 0.5 |
| 引物F(ul) | 0.7 |
| 引物R(ul) | 0.7 |
| HRM Master Mix(ul) | 5 |
| 双蒸水(ul) | 3.1 |
所述的引物F和引物R为：SNP6-F：CTGGGGCTACTGGGATTTCA和SNP6-R:TAACGAAATTTGCCCGCGAA。
(3)封板膜密封96孔板，振荡，将96孔板置于平板离心机中，离心500g即停。
(4)于480PCR仪上进行PCR反应。按照以下程序进行PCR反应。
b.PCR反应条件
(6)程序结束后的结果分析在LightCycler480软件上的基因分型溶解曲线模块(Melt Curve Genotyping)和基因扫描模块(Gene Scan)上进行。
(7)利用标记SNP6扩增的夏橙和普通甜橙品种，能够在分型曲线上清晰鉴别。具体的，用该引物，在普通甜橙和夏橙中的扩增条带大小均为165bp。在普通甜橙中该SNP位点的基因型为CC，在夏橙中该SNP位点的基因型为CT。
实施例3：
用于区分夏橙和普通甜橙的SNP分子标记在品种鉴定中的应用：
利用实施例2中的方法，对表1中的各品种甜橙和夏橙进行扩增并用HRM进行分型，扩增结果和HRM结果如表1和图1所示。
结果显示，利用本发明的分子标记可准确区分夏橙和普通甜橙，准确率达到了100％。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 用于区分柑橘夏橙和普通甜橙的SNP分子标记及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctggggctac tgggatttca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taacgaaatt tgcccgcgaa 20
Claims (6)
1.检测甜橙第4号染色体第17856950个碱基的SNP位点的试剂在橙的分子育种中的应用。
2.检测甜橙第4号染色体第17856950个碱基的SNP位点的试剂在夏橙的鉴定中的应用。
3.检测甜橙第4号染色体第17856950个碱基的SNP位点的试剂在普通甜橙的鉴定中的应用。
4.检测甜橙第4号染色体第17856950个碱基的SNP位点的试剂在区分夏橙和普通甜橙中的应用。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的应用，针对所述应用中的snp位点设计的引物为SNP6-F：CTGGGGCTACTGGGATTTCA和SNP6-R:TAACGAAATTTGCCCGCGAA。
6.根据权利要求4所述的应用，所述的普通甜橙包括：红肉暗柳橙、锦橙、冰糖橙、雪柑、桃叶橙、大红甜橙、哈姆林甜橙、特罗维塔、梨橙、糖橙、先锋橙和沙漠蒂甜橙；
所述的夏橙包括：无籽夏橙、卡特夏橙、奥林达夏橙、福罗斯特、德塔夏橙、蜜奈夏橙、露德红夏橙、阿尔及尔夏橙、康贝尔夏橙、五月红、刘金刚夏橙、岛仔51号、桂夏橙。
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|---|
| NCBI: "PREDICTED: Citrus sinensis TBC1 domain family member 15 (LOC102618520), transcript variant X2, mRNA", 《GENBANK》 * |
| QIANG XU等: "The draft genome of sweet orange (Citrus sinensis)", 《NATURE GENETICS》 * |
| 杨润婷等: "两种SNP分型方法的比较及其在柚品种鉴定中的应用", 《园艺学报》 * |
| 魏召新: "柑橘单核苷酸多态性分子标记的筛选及其在遗传多样性研究中的应用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114736984A (zh) * | 2022-03-29 | 2022-07-12 | 广东海洋大学 | 一种早期鉴别红橙变异植株的分子标记及其应用 |
| CN114736984B (zh) * | 2022-03-29 | 2023-10-20 | 广东海洋大学 | 一种早期鉴别红橙变异植株的分子标记及其应用 |
| CN116042905A (zh) * | 2023-03-10 | 2023-05-02 | 湖北省农业科学院果树茶叶研究所 | 一种用于鉴定柑橘品种的sv标记及其应用 |
| CN116042905B (zh) * | 2023-03-10 | 2024-09-10 | 湖北省农业科学院果树茶叶研究所 | 一种用于鉴定柑橘品种的sv标记及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110273020B (zh) | 2021-10-22 |
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