CN110269834B - 一种赤红球菌提取物的制备方法及在抗污染化妆品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了赤红球菌（Rhodococcusruber）提取物在抗污染化妆品中的应用。本发明还公开了上述赤红球菌（Rhodococcusruber）提取物的制备方法，以赤红球菌（Rhodococcusruber）为发酵菌株，将其在种子培养基中扩培后，移入发酵培养基中培养，离心或者过滤处理，洗涤得到赤红球菌（Rhodococcusruber）菌体，将菌体细胞破碎，溶媒萃取，浓缩干燥后即得赤红球菌（Rhodococcusruber）提取物。本发明制备的赤红球菌（Rhodococcusruber）提取物天然安全，具有激活体内细胞活性，增强免疫、预防及修复肌肤损伤，并且工艺简单，易于操作和工业化生产，可应用在抗污染化妆品。

Description

一种赤红球菌提取物的制备方法及在抗污染化妆品中的应用
技术领域
本发明属于微生物和化妆品领域，涉及一种赤红球菌(Rhodococcusruber)，具体来说是一种赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物的制备方法及在抗污染化妆品中的应用。
背景技术
近些年来，随着工业化和城市化的推进，人类面临的环境污染源急剧增加。目前，环境恶化和大气污染已成为我们日常接触的常态和环境监测指标。全球各国都在治理和防治环境污染给人类带来的健康损害，其中大气污染最为严重和直接，尤其是城市情况较甚。
皮肤是人体与外界接触的第一道屏障，面临着巨大压力。由于大气污染物粘附于表面，不断释放其所吸附的有毒有害的物质，一些小分子的物质可以通过毛囊或者角质层进入到皮肤深处，破坏皮肤屏障，损害肌肤健康细胞，引起皮肤老化或者炎症，从而引起肌肤过敏、色斑沉积、特异性皮炎、粗糙、暗黄、下垂无光、皱纹等皮肤疾病问题。文献(黄洁芳，蒋丽刚等.具有抗污染功效护肤品配方设计及其成分功效测试方法.[J]香料香精化妆品，2017,12(6)：71-77)报道大气污染物主要包括悬浮微粒(PM10和PM2.5)、多环芳烃(PAHs)、挥发性有机物(VOCs)、氮氧化物(NOX)、硫氧化物(SOX)、一氧化碳(CO)和臭氧(O3)等有害物质。其中，雾霾的元凶PM2.5对皮肤的侵略不可忽视。PM2.5是指环境空气重空气动力学当量直径小于等于2.5um的颗粒物，表面积大，活性强，具有细小多孔结构，较易附带有毒、有害物质，虽然PM2.5无法直接穿透过肌肤，但其易粘附于亲脂性的皮肤表面，不断释放所吸附的有害物质，利用毛囊作为通道进入皮肤深层，破坏肌肤健康细胞，引起皮肤衰老、过敏、皮炎等症状。
因此，开发具有抗污染化妆品成为化妆品公司关于的焦点，也越来越引起化妆品工作者的重视。消费者的抗污染需求也在增加。目前市面上也慢慢出现一些抗污染化妆品和/或原料，解决/抵御肌肤面临的粉尘、雾霾、颗粒、有害气体、紫外线等污染物对皮肤的健康造成损害等问题。
如：专利CN 105125449 B提到的抗污染化妆品组合物由欧夏至草提取物、翼籽辣木籽提取物、野大豆提取物和紫茉莉提取物组合而成的，通过在皮肤上形成物理阻隔膜，减少污染物在皮肤上的吸附。专利CN 109875931 A中提到的具有抗污染功效的化妆品添加剂及其化妆品，其中化妆品添加剂包含由莼菜叶提取物、夏栎根提取物、翼籽辣木籽提取物、草绿盐角草提取物、出芽短梗霉发酵产物、银杏叶提取物，是通过增强皮肤屏障，对皮肤起到隔离及防御功能。
目前关于赤红球菌(Rhodococcusruber)主要的研究在于其对有机物毒物或污染物的降解，石油污染的生物修复、污水处理、霉菌毒素、有机染料及农药降解；专利CN108295095 A提到红色诺卡氏菌细胞壁骨架可以用作痤疮治疗上的药物。对于赤红球菌(Rhodococcusruber)在抗污染化妆品中的应用未见报道。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物的制备方法及在抗污染化妆品中的应用。
本发明提供了赤红球菌(Rhodococcusruber)的提取物抗污染化妆品中的应用。
进一步的，所述的赤红球菌(Rhodococcusruber)为诺卡氏红球菌属赤红球菌(Rhodococcusruber)。
本发明还提供了上述的一种赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物的制备方法，以赤红球菌(Rhodococcusruber)为发酵菌株，将其在种子培养基中扩培后，移入发酵培养基中培养，离心或者过滤处理，洗涤得到赤红球菌(Rhodococcusruber)菌体，将菌体细胞破碎，溶媒萃取，浓缩干燥后即得赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物。
进一步的，将扩培后的赤红球菌(Rhodococcusruber)接种到发酵培养基中，20-37℃、50-200r/min进行发酵培养。
进一步地，所述的溶媒为水、乙醇、甘油、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙酸乙酯、石油醚、正丁烷、丙酮中的任意一种或者两种以上的混合溶液。
本发明还提供了一种抗污染化妆品，包含上述的有效活性量的赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物。
进一步的，所述的赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物在化妆品中的体积分数为0.0001‰-10％。
进一步的，所述的赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物在化妆品中的体积分数优化为0.001‰-5％。
进一步的，所述的赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物在化妆品中的体积分数优化为0.001‰-1％。
本发明提供的赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物，具有激活机体细胞活性，增强免疫和促进细胞修复；同时还提供了其在抗污染化妆品中的应用及其概念。
本发明所述的赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物为诺卡氏红球菌属赤红球菌(Rhodococcusruber)的发酵培养物，具有激活集体细胞活性，增强免疫，如：增强T细胞、巨噬细胞、NK细胞活性，具有致有丝分裂原活性，诱导机体产生干扰素、NO等作用，促进细胞修复，其作用机理：具有超强的渗透性，能迅速渗入皮肤深层，增强体内巨噬细胞和自然杀伤细胞的免疫活性，调动肌肤免疫细胞活性，从而提高皮肤自身免疫力，从根本上改善皮肤质量。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明制备的赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物天然安全，不刺激，具有激活体内细胞活性，增强免疫、预防及修复肌肤损伤，并且工艺简单，易于操作和工业化生产，可应用在抗污染化妆品。此外，其不含激素、汞、铅等重金属；可在化妆品/功能性化妆品/天然化妆品中有良好的应用前景。
具体实施方式
为了更好地说明本发明涉及的内容，现结合下面具体实施例对本发明进行详细的说明阐述，但并不表示本发明的内容仅限于此。
本发明下述的实施例中用到的赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物是以市售的赤红球菌(Rhodococcusruber)菌株制备得到的。
下述种子培养基和发酵培养基均为：葡萄糖20g/L，葡萄果浆25g/L，蛋白胨15g/L，NaCl 10g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，pH6.5-7.0。
F-12K完全培养基：含10％胎牛血清和100U/ml青霉素及0.1mg/ml链霉素。
实施例1赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物的制备
将赤红球菌(Rhodococcusruber)斜面菌苔在种子培养基中扩培后，接种到发酵培养基中，20℃、150r/min进行发酵培养48h，离心或者过滤处理，洗涤得到赤红球菌(Rhodococcusruber)菌体，菌体细胞破碎，采用体积分数为95％乙醇萃取，浓缩干燥后即得赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物。
实施例2赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物的制备
将赤红球菌(Rhodococcusruber)斜面菌苔在种子培养基中扩培后，接种到发酵培养基中，30℃、150r/min进行发酵培养48h，离心或者过滤处理，洗涤得到赤红球菌(Rhodococcusruber)菌体，菌体细胞破碎，采用体积分数为95％乙醇萃取，浓缩干燥后即得赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物。
实施例3赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物毒性测试
3.1口服毒性
取6只健康小鼠，分2组，一组为对照组，另一组为实验组，给药高浓度的赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物液，浓度为40mg/mL，每只小鼠给药0.8mL，观察14天，后停药继续在观察14天，对照组注射同样剂量的生理盐水，观察。结果显示：给药高浓度的赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物14天后，未见小鼠有任何异常，后有观察14天未见小鼠有任何毒性反应。实验测得口服给药LD50>1.6g/kg，可以说明赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物天然、比较安全。
3.2长期毒性
取6只大鼠，分2组，一组为对照组，另一组为实验组，实验组中大鼠皮内注射赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物(200μg/只)，对照组中的大鼠注射等量的生理盐水，连续6个月，观察小鼠的活动及机体体内指标。
实验结果显示：注射赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物的大鼠生长正常，体重随时间递增，食欲良好，大小便无异常；动物的心率和ECG的各个间期和PR间期T波的数值均在正常范围，为正常心电图；外周血液中的血红蛋白、红细胞、血小板、白细胞及分类计数各项指标变化均在正常范围内，血清SGPT和BUN的含量各组无明显差异(P>0.05)，心、肝、肺、脾、肾、脑和睾丸等实质脏器组织学检查，内脏切片未见明显的病理变化。
说明赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物对动物无慢性毒性。
实施例4赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物对巨噬细胞影响
4.1液体的配制
细污染物颗粒的悬浊液：取Fe2O3溶于F-12K完全培养基，配制成浓度为150ug/mL，超声震荡均匀后，保存备用。
赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物液：取赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物溶于F-12K完全培养基，配制成浓度为10ug/mL，超声震荡均匀后，保存备用。
4.2细胞的活性测试
取处于对数期的大鼠巨噬细胞NR8383，细胞密度为1×105/ml，以1 000r/min离心6min后，将细胞接种于无菌96孔板(每孔100μl)，置于37℃、5％CO2的培养箱培养24h。分别加入150ug/mL Fe2O3颗粒悬液，10ug/mL赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物液，及同时加入150ug/mL Fe2O3颗粒悬液及10ug/mL赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物液暴露大鼠巨噬细胞NR838324h，每组3次重复，对照组：F-12K培养基+大鼠巨噬细胞NR8383。采用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定吸光度(A)值，具体操作方法严格按照MTT试剂盒说明书进行；并计算细胞存活率：
细胞存活率＝暴露组A值/对照组A值×100％(参考文献：Mitkus RJ，Powell J，Zeisler R，et al.Comparative physicochemical and biological characterizationof NIST interim reference material PM2.5and SRM 1648in human A549and mouseRAW 264.7cells[J].Toxicol In Vitro，2013，27:2289-2298.)实验结果如下表1。
表1 Fe2O3颗粒、赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物对大鼠巨噬细胞NR8383存活率的影响
Figure BDA0002134764630000061
从实验结果可以看出，Fe2O3粉尘颗粒污染物对大鼠巨噬细胞NR8383具有毒害作用，使其存活率降低；而赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物可以使大鼠巨噬细胞NR8383增加，刺激其进行分裂增长；当含有Fe2O3粉尘颗粒污染物和赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物时，大鼠巨噬细胞NR8383的存活率减缓较慢；可以说明，本发明提供的赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物可以刺激大鼠巨噬细胞NR8383的活性，通过其吞噬功能清除Fe2O3粉尘颗粒污染物，减少/降低污染物带来的危害。
实施例5赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物对污染物的附着测试
选择20名(每组5名)马路协勤人员，用洗手液将双手清洗干净，用纸巾擦干。在左前臂处选择一处2*2cm面积的皮肤，涂抹含/不含有赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物的乳液0.3g，按摩涂抹至完成吸收；在右前臂处(大约与左前臂处相同位置)同样选择一处2*2cm面积的皮肤涂抹水0.3g，按摩涂抹至完成吸收。然后请他们在马路边上执勤4h后用3M胶带将前臂上的污染物粘下，称重，取平均值，乳液配方及测试结果如下表。
从上述表2和3我们实验结果可以看出，在涂抹有一量的乳液后，左前臂污染物的量降低，涂抹添加含有赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物的乳液，污染物的量有明显的降低。与不含有赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物的配方4相比，配方1-3中含有赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物，可以看到，涂抹配方1-3乳液的执勤人员所沾染的污染物的量较涂抹配方4乳液的执勤人员所沾染的污染物的量明显减少。因此，可以说明含有本发明提供的赤红球菌(Rhodococcusruber)提取物可以减少污染物的吸附，抵御和防护皮肤受环境中污染物的损伤。
表2抗污染测试结果
配方 左前臂污染物量/g 右前臂污染物量/g 减少率/％
配方1 0.049 0.081 39.51
配方2 0.035 0.068 48.53
配方3 0.039 0.087 55.17
配方4 0.063 0.079 20.25
表3测试过程中使用的乳液配方
Figure BDA0002134764630000071
注：配方4为对照基质乳液。
上述实施例为本发明构思下的基本说明，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，依据本发明的技术方案所作的改变、修饰、替代、组合、简化、均应为等效的置换方式，包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.赤红球菌的提取物在制备抗污染化妆品中的应用，其特征在于，提取物的制备方法是以赤红球菌为发酵菌株，将其在种子培养基中扩培后，移入发酵培养基中，20-37℃、50-200r/min进行发酵培养，离心或者过滤处理，洗涤得到赤红球菌菌体，将菌体细胞破碎，95%乙醇萃取，浓缩干燥后即得赤红球菌提取物，所述的赤红球菌为诺卡氏红球菌属赤红球菌。
2.一种抗污染化妆品，其特征在于，包含权利要求1所述的有效活性量的赤红球菌提取物。
3.根据权利要求2述的一种抗污染化妆品，其特征在于，所述的赤红球菌提取物在化妆品中的质量百分比为0.0001‰-10%。
4.根据权利要求3述的一种抗污染化妆品，其特征在于，所述的赤红球菌提取物在化妆品中的百分比为0.001‰-5%。
5.根据权利要求4述的一种抗污染化妆品，其特征在于，所述的赤红球菌提取物在化妆品中的百分比为0.001‰-1%。
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