CN110267538B - 紫苏醇-3-溴丙酮酸缀合物和治疗癌症的方法 - Google Patents

Abstract

NEO218(3‑溴‑2‑氧亚基‑丙酸4‑异丙烯基‑环己‑1‑烯基甲基酯)(参见式I)是由两种不相关的试剂：3‑溴丙酮酸(3‑BP；抑制癌细胞代谢的烷基化试剂)和紫苏醇(POH；具有抗癌特性的天然单萜)的共价融合产生的新型分子。还公开了合成NEO218的方法、包含NEO218的药物组合物以及使用NEO218治疗癌症的方法。

Description

紫苏醇-3-溴丙酮酸缀合物和治疗癌症的方法

技术领域

本发明涉及紫苏醇与3-溴丙酮酸的新型缀合物，以及所述化合物在癌症治疗中的用途。

背景技术

紫苏醇(“POH”)是一种单萜，且是葛缕子、薰衣草和丁香油、樱桃、蔓越莓、鼠尾草、薄荷、芹菜籽和某些其他植物的天然成分[1]。研究结果表明，这种单萜能够抑制细胞培养中肿瘤细胞的生长，并在多种动物肿瘤模型中发挥预防和治疗癌症的活性，这引起了人们对这种化合物的医学兴趣(详细参见参考文献[2])。其作用模式被认为涉及抑制Ras癌蛋白功能[3]，但更新的研究显示，额外的细胞内靶标可能介导其生物学效应，诸如端粒酶[4]、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)[5,6]和钠/钾腺苷三磷酸酶(Na/K-ATPase)[7]。在我们自己的临床前研究中，我们已经确定内质网(ER)应激是POH诱导的肿瘤细胞死亡的重要组成[8]。

最初，调查癌症患者中POH活性的临床试验基本上都不成功，主要是由于系统性活性所需的极高口服剂量(克量)导致的胃肠道毒性[9-13]。另一方面，当经鼻内吸入递送给药较小剂量时，POH有效且耐受性良好：在复发恶性胶质瘤的患者中的I/II期研究中，当通过这一替代的途径给药POH时，有令人鼓舞的活性以及肿瘤大小的消退[14-16]。在这些后来的研究中，POH治疗的副作用几乎不存在，甚至在治疗超过4年的患者中也不存在[16]，这表明鼻内递送(i)规避了口服POH的剂量限制性局限，(ii)以大大降低的总剂量发挥活性。在我们自己的临床前研究中，我们证明了鼻内给药的POH在耐药的胶质母细胞瘤的颅内小鼠模型中发挥显著的治疗作用[8]。

3-溴丙酮酸(3-BP，3-溴丙酮酸)是3-溴丙酮酸的碱性形式：

它代表了丙酮酸(丙酮酸)的合成的卤代衍生物，是几种细胞内代谢途径的关键中间体。3-BP充当高度反应性亲电烷基化剂[17]，导致受体靶标的丙酮酰化，诸如含有半胱氨酸的蛋白中的硫醇基[18,19]。已经确认许多酶是3-BP的靶标，诸如例如糖酵解途径中的己糖激酶II(HK-II)[20]和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)[21,22]，以及三羧酸循环和线粒体呼吸中的琥珀酸脱氢酶(SDH)[21]。这些酶被3-BP抑制会导致细胞能量产生的关闭和ATP池的耗尽，导致细胞死亡[23]。

3-BP已在多个临床前模型中显示出抗癌活性。它的抗癌作用模式被认为是由能量关闭、活性氧自由基的产生和细胞内信号转导的抑制[17,24-27]的结合组成的。该化合物的肿瘤特异性一般归因于糖酵解途径中HK-II和GAPDH的肿瘤特异性上调，并依赖于糖酵解途径中的HK-II和GAPDH(瓦博格效应)[20]；因此，这些靶标的抑制优先地影响肿瘤细胞。其它解释包括肿瘤特异性摄取3-BP，通过丙酮酸-乳酸转运体，诸如单羧酸转运体1(MCT-1)[28]，其被认为与正常细胞相比在肿瘤细胞中更高地表达[29-31]。

在异种移植动物肿瘤模型中，3-BP显示出对兔[32]、大鼠[33]和小鼠[34]中的肝细胞癌具有治疗作用。其它体内肿瘤模型研究了大鼠中的乳腺癌[35]和小鼠中的自发性胰腺癌[36]、结肠癌[37]、间皮瘤[38]和淋巴瘤[39]。雾化3-BP降低了暴露于致癌物苯并(a)芘的小鼠肺中的肿瘤多发率和肿瘤负荷[40]，微胶囊化3-BP阻止了原位胰腺癌小鼠模型中的肿瘤演进[41]，且晶片能够在大鼠脑中局部颅内递送3-BP用于胶质瘤治疗[42]。此外，3-BP当与某些化疗剂体内或体外联用时已显示出化学增敏作用(参见参考文献[23])。

基于临床应用，有两例报告患者接受了3-BP治疗[25,43]。在一项研究中，一名患有纤维板层肝细胞癌的青年癌症患者再次接受了3-BP的治疗，其通过经导管动脉化疗栓塞(TACE)方法递送，且耐受性良好。虽然该患者最终死亡，但他确实比预期存活长很多[43]。另一名患者是一名28岁男子，他表现为IV期转移性黑色素瘤，并接受了3-BP静脉输注。这种治疗似乎毒性最小，但其抗癌效果低，且患者最终死亡[25]。

发明内容

在本发明的一个方面，提供了紫苏醇和3-溴丙酮酸的缀合物，即

a.

i.3-溴-2-氧亚基-丙酸4-异丙烯基-环己-1-烯基甲基酯，

b.或其药学上可接受的盐。

在第二组实施方式中，本发明涉及包括3-溴-2-氧亚基-丙酸4-异丙烯基-环己-1-烯基甲基酯的药物组合物。在其中一些实施方式中，药物组合物还包括药学上可接受的赋形剂。

在第三组实施方式中，本发明涉及在需要此类治疗的患者中治疗癌症的方法，包括向所述患者给药治疗有效量的3-溴-2-氧亚基-丙酸4-异丙烯基-环己-1-烯基甲基酯。在其中一些实施方式中，所述癌症选自由以下组成的组：肺癌、耳鼻喉癌、白血病、结肠癌、黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、乳腺癌、造血系统癌、卵巢癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈部癌、胃癌、上皮内瘤变、肾癌、喉癌；白血病包括急性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病；肝癌；淋巴瘤包括霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤；骨髓瘤；纤维瘤、神经母细胞瘤；口腔癌(例如唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；肾癌；呼吸系统癌；肉瘤；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌和泌尿系统癌。

在第四组实施方式中，本发明涉及用于合成3-溴-2-氧亚基-丙酸4-异丙烯基-环己-1-烯基甲基酯的方法，包括：

将1,1-二氯二甲醚与溴丙酮酸反应以形成3-溴丙酮酰氯；以及，

将3-溴丙酮酰氯与紫苏醇反应以形成3-溴-2-氧亚基-丙酸4-异丙烯基-环己-1-烯基甲基酯。

在其中一些实施方式中，所述将1,1-二氯二甲醚与溴丙酮酸反应的步骤是在约0至约20℃的温度下进行的。在一些实施方式中，所述将3-溴丙酮酰氯与紫苏醇反应的步骤是在约-10至约10℃的温度下进行的。在一些实施方式中，所述将3-溴丙酮酰氯与紫苏醇反应的步骤是在碳酸氢钠和正庚烷的存在下进行的。

在第五组实施方式中，本发明涉及根据第四组实施方式中的任何方法的方法的产物。

附图说明

图1显示了NEO218、紫苏醇(POH)和3-溴-丙酮酸(3-BP)的化学结构。NEO218是通过共价结合POH与3-BP获得的。

图2显示了对于NEO218和3-BP在六种不同细胞系的每个中由MTT试验得到的细胞存活率与药物浓度的图。

图3显示了对于3-BP、NEO218和3-BP+POH在四种不同细胞系的每个中由MTT试验得到的细胞存活率与药物浓度的图。

图4，子图(a)-(d)显示了对于3-BP、NEO218和3-BP+POH各自在三种细胞系的每个中LDH释放/毒性与药物浓度的图，以及子图(e)显示了对于固定浓度的3-BP和NEO218，LDH释放/毒性与时间的图。

图5显示了由集落形成试验(CFA)得到的对于3-BP、NEO218和3-BP+POH各自在两种细胞系的每个中集落百分比与药物浓度的图。

图6显示了在用3-BP和NEO218处理的三种细胞系中凋亡标志物的存在的蛋白印迹(Western blot)分析，左侧子图基于浓度，且右侧子图基于时间，比较了用星形孢菌素(staurosporine)和NEO218处理的效果。

图7显示了有和无zVAD，对于NEO218和3-BP两者的细胞存活率与药物浓度的图。

图8示出了对未处理细胞以及用3-BP、NEO218和星形孢菌素处理的细胞的AnnexinV和PI的FACS分析的时间序列结果。

图9左侧子图为处理3小时之后结肠癌细胞中ATP含量百分比的直方图；右侧子图为对于NEO218和3-BP的％ATP与药物浓度的图。

图10显示了有和无NAC与GSH，对于NEO218和3-BP的细胞存活率与药物浓度的图。

图11显示了有和无丙酮酸，对于NEO218和3-BP的细胞存活率与药物浓度的图。

图12上子图显示了对于NEO218和3-BP的GAPDH活性与药物浓度的图；下子图显示了对于有NAC、有GSH以及两者都没有的NEO218和3-BP的GAPDH活性的直方图。

图13显示了GAPDH蛋白的氨基序列(以一个字母代码)，标记指示存在半胱氨酸残基。

图14显示了NEO218和3-BP各自在几种细胞系中的细胞毒性IC50，与如蛋白印迹中所示的相应的MCT1表达水平对齐。

图15显示了对于NEO218和3-BP各自在异种移植小鼠模型中的肿瘤尺寸与时间的图。

图16A-16C.MCT-1表达与3-BP化学敏感性相关。

使用以下建立的人细胞系：(A)HCT116结肠癌；(B)LN229、T98G和U251胶质瘤；(C)MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BTM-12和T47D乳腺癌；和ME16C正常乳腺上皮细胞(端粒酶永生化)。条形图示出了在用3-BP(浅灰色)或NEO218(深灰色)药物处理24小时之后，通过24小时MTT试验所测定的每种细胞系的细胞毒性IC50。具有误差条的条表示≥3个测量值，而没有误差条的图示出了两个独立测量值的平均值。中间子图示出了每种细胞系的MCT-1蛋白水平，如以肌动蛋白作为上样对照的蛋白印迹所测定的。

图17A-17C.3-BP和NEO218发挥不同的细胞毒性作用。

用浓度增加的3-BP(菱形)或NEO218(圆形)处理HCT116(MCT-1阳性)和MDA-MB-231(MCT-1阴性)细胞。(A)24小时之后进行MTT试验。未处理细胞的存活率设为100％(n＝3)。(B)16小时之后进行LDH试验。未处理细胞的LDH释放设为1。示出相对倍数增加(n＝3)。(C)所示为药物处理48小时之后，然后在不存在药物的情况下再过10-14天所形成的相对集落数。未处理的对照细胞的集落数设为100％(所示为两个独立实验的平均值)。在所有情况下，仅接受载体的细胞也作为对照；然而，没有一项试验结果显示未处理的细胞与载体处理的细胞之间存在差异。

图18A-18C：3-BP+POH的混合物不能模拟缀合的NEO218的高效力。

用浓度增加的3-BP(菱形)、NEO218(圆形)、POH(正方形)或等摩尔比混合的3-BP与POH(三角形)处理MDA-MB-231细胞。(A)24小时之后进行MTT试验。未处理的细胞的存活率设为100％(数据点为2次实验的平均值)。(B)24小时之后进行LDH试验。未处理细胞的LDH释放设为1。示出相对倍数增加(2次实验的平均值)。(C)代表性照片示出了药物处理初始48小时之后典型的集落形成。在用3-BP与POH混合(3-BP+POH)联合处理的所有情况下，所示浓度是指每一种单独药物的浓度；即100μM 3-BP+POH意为100μM 3-BP与100μM POH组合。

图19A-19C：MCT-1敲减(knockdown)影响对3-BP的细胞敏感性，但不影响对NEO218的细胞敏感性。

用靶向MCT-1的siRNA(圆圈)转染HCT116细胞，或用乱序对照(菱形)转染。(A)通过MTT试验测定对3-BP和NEO218的细胞敏感性。虚线和箭头表示IC50的偏移。注意在3-BP处理的细胞(左侧子图)中向右显著偏移，相比之下在NEO218处理的细胞(右侧子图)中向左轻微偏移。(B)以肌动蛋白作为上样对照，通过蛋白印迹分析证实了MCT-1蛋白水平的敲减。(C)还通过免疫细胞化学在单个细胞水平上证实了MCT-1敲减。为了强调MCT-1水平的显著差异，这两张照片同样地曝光过度。

图20A-20C：3-BP处理选择对NEO218仍敏感的耐药细胞。

(A)在不存在任何药物处理下(亲代细胞；左侧子图)和从用40μM 3-BP高毒性48小时处理恢复2周之后(3-BP存活者；右侧子图)HCT116细胞的免疫染色。箭头指向在其它MCT-1阳性亲代群体中一些显然呈MCT-1阴性的细胞。注意到在阳性细胞中细胞膜的优先染色，与已知的MCT-1的跨膜位置一致；在3-BP存活者中没有检测到这样的染色。(B)用浓度增加的3-BP处理细胞48小时后两周MCT-1表达水平的蛋白印迹分析。与上面示出的IHC染色一致，40μM 3-BP导致MCT-1蛋白质的损失。使用GAPDH作为上样对照。(C)在MTT试验中将3-BP存活者的化学敏感性与亲代细胞进行比较。两群体均用浓度增加的3-BP或NEO218处理。未处理细胞的存活率设为100％(n≥3±SE)。

图21A-21C：3-BP和NEO218引起坏死。

(A)在用载体、30μM 3-BP、30μM NEO218或1μM星形孢菌素(STS)处理2、4或8个小时后HCT116细胞的FACS分析。Y轴示出了碘化丙啶(PI)标记，且x轴示出了Annexin V标记。每个正方形中的上两个象限显示坏死细胞，而右下象限显示凋亡细胞。(B)凋亡标志物的蛋白印迹分析。在上部分，用30μMNEO218或1μM STS处理的各个时间点的MDA-MB-231细胞。在下部分，用所示浓度的3-BP、NEO218或STS处理HCT116细胞16小时。在所有情况下，制备细胞裂解物并分析建立好的凋亡标志物裂解的PARP、裂解的(即激活的)caspase 7(cl.C-7)和磷酸化(即活性)H2AX。使用肌动蛋白作为上样对照。(C)用50μMZ-VAD-FMK预处理HCT116细胞一小时，然后加入浓度增加的3-BP或NEO218。24小时后通过MTT试验测定细胞存活率。数据点是n＝3的平均值。

图22：3-BP和NEO218耗尽细胞ATP池。

用40μM 3-BP或NEO218处理HCT116细胞。作为参考，细胞也在无糖培养基中暴露于100nM鱼藤酮。在3和6个小时后测定ATP水平。未处理细胞中的ATP水平设为100％(相当于每一百万细胞26.6nmol)。

图23A-23C：补充的抗氧化剂阻断了药物作用，但添加丙酮酸会导致不同的结果。

(A)在存在或不存在1mM NAC、1mM GSH或50mM甲基-丙酮酸(或丙酮酸钠，其产生类似的结果)的情况下用40μM 3-BP或NEO218处理HCT116细胞。24小时后通过MTT试验测定细胞存活率。(B)用30或100μM 3-BP或NEO218处理HCT116细胞。30分钟后，制备细胞裂解物并分析GAPDH活性。(C)在存在或不存在NAC或GSH的情况下，以A中提到的浓度将未经药物处理的MDA-MB-231细胞的裂解物与3-BP或NEO218混合。温育1小时后，测定GAPDH活性。不存在药物处理下的GAPDH活性设为100％(相当于0.06个单位/分钟×10⁶个细胞)。

图24A-24C：NEO218直接与GAPDH、GSH和NAC相互作用

通过LC/MS分析对NEO218与不同靶标的直接相互作用进行分析。(A)用3-BP或NEO218温育纯化的兔GAPDH蛋白15分钟，然后进行LC/MS分析。GAPDH蛋白在指定位置含有4个半胱氨酸(Cys)，且这四个半胱氨酸在3-BP的情况下均被确定为被丙酮酸部分修饰，且在NEO218的情况下均被确定为被丙酮酸-紫苏醇部分修饰(表示为pyr)。(B)NEO218和GSH的反应产物的萃取的离子色谱(XIC)局限于质量与电荷的比值(m/z)在528和529之间。色谱图(插图)示出了具有准确离子质量为528.201(名义质量峰)的单电荷反应产物的存在，对应于NEO218和GSH的亲核取代反应。529.204处的峰的位置和相对大小对应于反应产物的¹³C同位素峰位。(C)NAC与NEO218的反应得到离子图(上子图)中所示的几种产物。在m/z 539和541处共洗脱的双同位素分布均匀(上子图中插图)，并选择进一步分析，如底部子图中两个色谱图中所示。

具体实施方式

通过共价连接两个不同的分子，3-溴丙酮酸(3-BP)和紫苏醇(POH)，合成了一种新化学实体。在本文中有时将该化合物称为NEO218。图1示出了NEO218的化学结构。

本文使用以下缩写：

c)3-BP：3-溴丙酮酸；

d)C7：caspase 7；

e)Dox：阿霉素；

f)FACS：荧光活化细胞分选；

g)GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；

h)GSH：谷胱甘肽；

i)IC50：抑制浓度

j)50％；LDH：乳酸脱氢酶；

k)MCT1：单羧酸转运体1；

l)MTT：3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑鎓溴化物；

m)NAC：N-乙酰基-半胱氨酸；

n)NEO218：3-溴-2-氧亚基-丙酸4-异丙烯基-环己-1-烯基甲基酯；

o)PARP：聚(ADP-核糖)聚合酶；

p)PI：碘化丙啶；

q)POH：紫苏醇；

r)STS：星形孢菌素；以及，

s)TMZ：替莫唑胺。

实施例1：制备POH-溴丙酮酸(3-溴-2-氧亚基-丙酸4-异丙烯基-环己-1-烯基甲基酯)；

将1,1-二氯二甲醚(2.5g，21.74mmol)缓慢加入固体溴丙酮酸(1)中，同时保持温度在20℃以下。将所得浆料缓慢加热至50℃并搅拌2.5h。冷却清液，并真空浓缩过量的二氯二甲醚以获得3-溴丙酮酰氯(2)，收率大于95％。

将3-溴丙酮酰氯(2.0g，10.78mmol)加入紫苏醇(3)(1.5g，9.85mmol)、碳酸氢钠(11.90mmol)和正庚烷(180mL)的低温混合物中，同时保持温度在10℃以下。在10℃下搅拌混合物20min，并然后允许其回温至室温。搅拌反应混合物18h，并用水(75mL)猝灭。将有机层分离并用盐水(75mL)洗涤，并在硫酸钠上干燥。将过滤后的有机层在真空下浓缩，并通过柱色谱纯化[使用Thomson单StEP 40g柱，柱尺寸：直径1.5cm，长度：30cm]并用己烷洗脱。将类似级分合并，并在真空下浓缩以得到3-溴-2-氧亚基-丙酸4-异丙烯基-环己-1-烯基甲基酯(4)为淡黄色油。重量：0.7(24％)。％。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):δ1.47(m,1H),1.74(s,3H),1.85(m,3H),2.02(m,2H),2.16(m,4H),3.85(s,2H),4.56(s,2H),4.74(d,2H),5.81(br s,1H)。

临床前研究

进行一系列体外和体内临床前实验以表征并牢固建立NEO218的有效抗癌活性。代表性结果提供如下。

体外肿瘤细胞评估

通过体外短期MTT试验(通过测定代谢活性来测量细胞的生存力)、LDH试验(测量乳酸脱氢酶的释放作为漏液细胞膜的指示，其表明了细胞死亡)和集落形成试验(CFA，其测定药物处理的细胞的长期存活力和它们产生子代集落的能力)来表征NEO218杀死肿瘤细胞的效力。使用源自乳腺癌(包括MDA-MB-231；MDA-MB-468；T47D；MCF7；MCF7/Dox；BTB12)、脑癌(T98G；U251)、卵巢癌(A2780)和结肠癌(HCT116)的几种建立的细胞系作为靶细胞。在所有情况下，将培养的细胞暴露于浓度增加的药剂24或48小时。

将来自不同癌症类型的细胞系用浓度增加的3-溴丙酮酸(3-BP)或NEO218处理。48小时后，用MTT试验测量细胞存活率。MDA-MB-231和T47D是乳腺癌细胞；T98G和U251是脑癌(胶质母细胞瘤)细胞；HCT116是结肠癌细胞；A2780是卵巢癌细胞。图2显示了在MTT试验的6个细胞系的每个中，对于NEO218和3-BP的细胞存活率与药物浓度的图。

如所示，在所有细胞系中NEO218均发挥出比3-BP更强的杀死癌细胞作用，且其IC50在15-40μM的范围内。在其中4个细胞系中，NEO218和3-BP的细胞毒性之间存在非常大的差异，而在另外2个中仅有很小的差异。图2显示，NEO218具有比3-BP更强的抗癌作用。

用混合的3-BP与POH处理不同肿瘤细胞系，并将其作用与NEO218以及单独的3-BP的作用进行比较。处理细胞24小时，并然后进行MTT试验以测量细胞存活率。

图3显示了对于3-BP、NEO218和3-BP+POH在四种不同细胞系的每个中由MTT试验得到的细胞存活率与药物浓度的图。在所有情况中，这两种成分的混合均没有达到与NEO218相比高得多的细胞毒性效力。甚至，在3-BP中添加POH也无法达到与单独的3-BP相比更高的毒性。图3的底部子图表明，单独的POH不能发挥强的细胞毒性效力，而是需要500μM及更高的浓度来达到IC50。显然，NEO218比其它任何处理都更有效得多。这些结果为该令人惊讶的发现，即NEO218的抗癌作用不能通过混合其各个成分来模拟，提供了进一步的证据。

通过LDH试验评估了NEO218相对于3-BP、POH和3-BP+POH快速杀死细胞的能力，其中LDH释放用作细胞死亡的标志。图4子图(a-d)显示了对于3-BP、NEO218和3-BP+POH各自在三种细胞系的每个中LDH释放/毒性与药物浓度的图，以及子图(e)显示了对于固定浓度的3-BP和NEO218，LDH释放/毒性与时间的图。

在图4中，子图(a)和子图(b)示出了用浓度增加的NEO218、3-BP或混合的3-BP与POH处理乳腺癌细胞系的结果。子图(c)示出了用NEO218或3-BP处理结肠癌细胞的结果。子图(d)示出了用浓度增加的POH处理两种乳腺癌细胞系的结果。在所有情况a-d中，24小时后测量LDH的释放(作为细胞死亡的标志物)。子图(e)示出了在MDA-MB-231乳腺癌细胞中响应NEO218和3-BP(单独)处理的LDH释放的时间过程。

如子图(a-b)中所示，混合的3-BP与POH不能达到比NEO218强得多的毒性效力。在HCT116细胞中，NEO218和3-BP发挥类似的效力，如子图(c)中所示。POH本身需要相当高的浓度来实现杀死细胞(即LDH释放)，如子图(d)中所示。药物处理开始后最早1小时即可检测到NEO218的细胞毒性作用，如子图(e)中所示，且在8小时前达到细胞死亡的半数最大值。

通过集落形成试验(CFA)评估了NEO218相对于3-BP、POH和3-BP+POH对肿瘤细胞存活和集落形成的作用。每培养孔接种六百个细胞，并暴露于浓度增加的NEO218、3-BP、混合的3-BP+POH或单独的POH。24小时后，将所有药物从细胞中移除并加入新鲜培养基。十至十五天后，存活的细胞已形成子代的集落，对其进行染色和计数。所有数量均与未接受任何药物处理的组织中形成的集落数量(设为100％)进行比较。

图5显示了由CFA得到的对于3-BP、NEO218和3-BP+POH各自在两种细胞系的每个中集落百分比与药物浓度的图。数据显示，NEO218强烈阻止细胞生存和集落形成，具有IC50＜10μM。3-BP的效力大幅降低，且混合的3-BP与POH与单独3-BP的处理相比不能增加抑制作用。POH本身相当无效，且在浓度高达1,000μM时也没有达到IC50，如图5的右下子图所示。

在由图2-5示出实验结果的所有实验设置中，用NEO218处理细胞会产生比用3-BP处理细胞更大的毒性。在所有细胞类型中，NEO218的IC50(药物减少50％的细胞存活的能力)在5-30μM的范围内，而3-BP的IC50在10-200μM的范围内。值得注意的是，存在明显的细胞类型特异性差异，其中一组细胞对两种药物的敏感性仅显示出很小的差异，而另一组细胞表现出非常大的差异。例如，在HCT116细胞中NEO218和3-BP的IC50非常相似，而所有乳腺癌细胞都对NEO218敏感，但对3-BP有耐药性，如图2-5中所示。

单独来看，3-BP和POH各自具有细胞毒性效力。然而，令人惊讶地发现NEO218的细胞毒性效力大于3-BP和POH的细胞毒性效力之和，如图3-5所示，表明情况并非如此。单独POH具有非常低的细胞毒性潜力，在所有细胞中的IC50均为几百微摩尔。将POH加入到3-BP中，即，将细胞暴露于3-BP与POH的混合物，不能模拟比NEO218大得多的效力，表明NEO218的细胞毒性效力大于其各部分之和。

肿瘤细胞图中包括两种已知对常规化疗药物具有耐药性的细胞系。例如，T98G胶质母细胞瘤细胞对替莫唑胺(TMZ)具有耐药性，替莫唑胺是用于恶性胶质瘤患者的目前标准的化疗治疗[44]。MCF7/Dox乳腺癌细胞对阿霉素和其它几种药物具有耐药性；事实上，它们表现出耐多种药物(多重耐药性)(mdr)表型[45]。尽管它们具有耐药表型，但两种细胞类型都被NEO218有效地杀死，如图2对于T98G细胞以及图3和图5对于MCF7/Dox细胞所示。因此，已经证明NEO218可以有效地杀死高度耐药的癌细胞。

总的来说，细胞死亡的主要机制是凋亡和坏死。凋亡细胞死亡的已确立的标志物是caspase的激活，这可以通过caspase前体转化为其裂解的(即激活的)片段来揭示[46]。其它标志物是PARP(聚-(ADP-核糖)聚合酶)的蛋白水解裂解[47]和-H2AX蛋白的出现[48]。所有这些凋亡指标均可通过蛋白印迹检测。

在一系列实验中评估NEO218诱导细胞凋亡的能力。用3-BP和NEO218处理三种不同的细胞系。收集药物处理后的细胞，并通过蛋白印迹分析细胞裂解物中是否存在三种已确立的凋亡标志物：

裂解的caspase 7(cl.C7)；

裂解的(cl.)与全长(f.l.)PARP；以及，

γ-H2AX的诱导(其指示DNA裂解)。

cl.C7和cl.PARP的出现指示正在进行凋亡过程。在所有情况中，还检测了裂解物中是否存在肌动蛋白作为对照。

用浓度增加的NEO218或3-BP处理两种乳腺癌细胞系(MCF7和MDA-MB-231)和一种结肠癌细胞系(HCT116)。作为对照，还用星形孢菌素(STS)处理它们，已知星形孢菌素是有效的凋亡诱导物[49]。凋亡标志物的存在情况的蛋白印迹分析在图6的左侧子图中示出。用STS处理，而非用NEO218或3-BP处理，导致凋亡标志物的明显出现。

图6右侧子图显示了用星形孢菌素和NEO218处理细胞的时间过程的结果。用星形孢菌素处理细胞表明会显著诱导所有3种凋亡标志物(正如引发细胞凋亡的药剂所预计的)。相比之下，NEO218几乎不影响这些相同的标志物，进一步证实了NEO218处理的细胞中没有生物学相关的凋亡。因此，证明了NEO218基本上避免了细胞凋亡。

还使用MTT试验在一系列实验中评估了NEO218诱导细胞凋亡的能力。使用凋亡阻断剂zVAD(z-VAD-FMK)，一种充当泛-caspase抑制剂的药剂。用或不用50μM zVAD处理HCT116结肠癌细胞1小时，然后用浓度增加的NEO218或3-BP处理。其后二十四小时，通过MTT试验确定细胞存活率。

图7显示了MTT试验的结果，为使用和不使用zVAD的情况下，细胞存活率与NEO218(左侧子图)和3-BP(右侧子图)两者的药物浓度的图。用zVAD预处理细胞并没有阻止NEO218或3-BP诱导细胞死亡，表明这两种药剂诱导的细胞死亡不涉及典型的细胞凋亡机制，诸如caspase激活，从而证实了NEO218基本上避免了细胞凋亡的观察。

在缺乏细胞凋亡机制在NEO218诱导的细胞死亡中扮演重要角色的迹象的情况下，坏死作为潜在的关键机制被研究。通过测量药物处理的细胞的Annexin V染色(凋亡标志物)和PI(碘化丙啶)染色(坏死标志物)，并与非药物处理的细胞(对照)进行比较，来区分凋亡和坏死细胞死亡。在处理2、4或8小时之后，通过FACS分析进行Annexin V和PI的测量。(分别)用NEO218、3-BP和星形孢菌素处理细胞，并通过荧光激活的细胞分选测定碘化丙啶(PI，坏死细胞死亡的标志物)或Annexin V(凋亡标志物)的结合。

结果如下整理在图8中：无处理(顶行)、3-BP(第二行)、NEO218(第三行)和星形孢菌素(底行)。每一个正方形(由4个象限组成)示出了活细胞(左下角象限)、凋亡细胞(右下角象限)和坏死细胞(左上角和右上角象限)的百分比。

NEO218(和3-BP)引起PI的强烈结合，而Annexin V极低。相反，星形孢菌素处理导致Annexin V的结合，但PI极低。未处理的细胞示出约90％的存活率。在NEO218处理的细胞和3-BP处理的细胞中，存在细胞到上部象限中的主要移动，表明坏死是细胞死亡的主要类型。相反，星形孢菌素(一种已知的凋亡诱导剂)优先将细胞移动到右下角，表明药物诱导的细胞死亡的主要类型是明显的凋亡。因此，NEO218基本上通过坏死导致细胞死亡。

综上所述，这些结果表明坏死而非凋亡是通过用NEO218处理引发细胞死亡的主要机制。通过观察细胞死亡的时间过程进一步支持了这一结论。如图8中以及图4(底部子图)中LDH释放的时间过程所示，NEO218相当快地，即在1-2小时内启动细胞死亡。快速细胞死亡是坏死的征兆，而不是凋亡(凋亡通常是慢很多的、高度协调的过程)。

在确定NEO218导致坏死细胞死亡之后，研究了可能导致这一结果的不同主要事件。众所周知，将细胞内ATP池的水平降低至低于大约30％将导致坏死细胞死亡[53,54]。在这些低ATP水平下，细胞无法维持基本功能。此外，由于细胞凋亡是需要能量的高度协调的“程序化”过程，因此这些低ATP水平也阻止了细胞凋亡，且细胞反而被迫进行坏死。因此，研究了NEO218对细胞能量水平，特别是ATP(三磷酸腺苷，细胞内能量转移的关键单元)的量的影响。

将HCT116结肠癌细胞用以下进行细胞处理：NEO218、3-BP；鱼藤酮(一种阻断呼吸链的线粒体毒素)；无糖培养基(“无糖”；以停止糖酵解)；以及鱼藤酮与无葡萄糖联合(以停止所有细胞内ATP生产)。处理3小时之后，使用可商购的ATP检测试剂盒来测定存在的ATP的相对水平。

结果在图9中示出。左侧子图显示了每个处理过程中得到的ATP含量百分比相对于未处理细胞的ATP含量百分比的直方图。右侧子图是％ATP与NEO218和3-BP的药物浓度的图。

图9显示，用NEO218或3-BP处理都能有效地耗竭细胞ATP池的水平。这种能量耗竭和在没有葡萄糖的情况下用鱼藤酮处理细胞实现的耗竭一样有效。鱼藤酮是线粒体呼吸的抑制剂；缺乏葡萄糖阻止糖酵解通量；因此，鱼藤酮与从细胞生长培养基中去除葡萄糖相结合将导致两个中心细胞产能途径——糖酵解和呼吸的关闭。如图9所示，响应NEO218处理的ATP水平的降低与由糖酵解停止结合抑制呼吸导致的效果相似，为由NEO218导致的能量耗竭提供了基准。在此背景下，可以得出结论，NEO218通过细胞能量的有效耗竭诱导坏死细胞死亡。

细胞应激状态，特别是氧化应激，是肿瘤细胞死亡的已知诱因。为了研究该方面，使用了两种有效的抗氧化剂——NAC(N-乙酰-半胱氨酸)和GSH(谷胱甘肽)，来确定它们是否能将NEO218诱导的细胞死亡降到最低。NAC是氨基酸半胱氨酸的N-乙酰基衍生物；它是用于治疗对乙酰氨基酚过量的一种药物[50]。GSH是由所有细胞产生的一种三肽[51]。这两种化合物都能隔绝自由基，从而防止对重要细胞成分的损害[52]。

用NAC或GSH联合NEO218或3-BP处理肿瘤细胞。在存在或不存在5mM NAC或1mM GSH的情况下，(分别)用浓度增加的NEO218和3-BP处理HCT116细胞。24小时后，通过MTT试验测定细胞存活率。

图10显示了有和无NAC与GSH，对于NEO218和3-BP的细胞存活率与药物浓度的图。数据显示，两种抗氧化剂都能有效地阻止由NEO218或3-BP诱导的细胞死亡。事实上，在这两种自由基清除剂的存在下，药物诱导的细胞死亡被完全阻止了。这些结果与NEO218(和3-BP)通过生成自由基导致细胞死亡的假设相一致。

已知3-BP抑制GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的酶活性，从而抑制糖酵解通量。丙酮酸(丙酮酸)是多种代谢途径中的关键中间体，且代表糖酵解途径的最终产物。因此，假设加入丙酮酸可以挽救这一效应，并确保在3-BP存在下的细胞存活率。

为了测试这一假设，在存在或不存在10mM丙酮酸的情况下，(分别)用浓度增加的NEO218和3-BP处理HCT116细胞。24小时后通过MTT细胞存活率试验测定细胞的存活率。

图11显示了有和无丙酮酸的情况下，细胞存活率与NEO218和3-BP的药物浓度的图。在3-BP的情况下，正如预期，过量的丙酮酸能够完全阻止细胞死亡。然而，在NEO218的情况下，丙酮酸对存活率没有任何影响，即，该代谢产物不能挽救NEO218处理的细胞。数据显示，NEO218基本上抑制了GAPDH功能。

研究了在无细胞体系中NEO218抑制GAPDH的酶功能的能力。(分别)用NEO218和3-BP温育细胞裂解物1小时，并测定GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的酶活性。施加浓度增加的NEO218和3-BP。单独地，分别将50μM NEO218和3-BP与1mM NAC或GSH一起施加。使用可商购的GAPDH活性检测试剂盒来测定GAPDH的酶活性。

图12上子图显示了GAPDH活性与NEO218和3-BP的药物浓度的图；下子图显示了对于有NAC、有GSH或两者都没有的NEO218和3-BP的GAPDH活性的直方图。NEO218和3-BP两者均导致GAPDH酶活性的有效抑制(上部子图)，但添加抗氧化剂NAC或GSH有效阻止了药物诱导的对GAPDH活性的抑制(底部子图)。NAC和GSH的保护作用是非常显著的(星号：p值＜0.01)。数据显示，NEO218基本上抑制了GAPDH酶活性。NEO218(和3-BP)抑制GAPDH，其IC50与可以有效导致细胞死亡的IC50相似。加入NAC或GSH有效地阻止了NEO218或3-BP对GAPDH的抑制，这是有趣的，因为用于这些测量的无细胞系统应该不能产生自由基。因此，很可能NAC和GSH是通过消除损害的自由基之外的机制来发挥它们的保护作用。

然后，对蛋白质进行分析质谱法。读数分析显示出由丙酮酰化修饰的两个半胱氨酸残基(位于245和282位；由椭圆形指示)。另外两个半胱氨酸残基(位于150和154位；由矩形指示)是未修饰的。

在体外用60μM 3-BP于37℃下温育三十微克的纯化GAPDH蛋白15分钟。然后使用质谱分析确定3-BP是否能直接与酶的氨基酸序列结合。

图13显示了GAPDH蛋白的氨基序列(以一个字母代码)，标记的指示存在半胱氨酸残基。发现GAPDH中所含的四个半胱氨酸中有两个已被修饰。在氨基酸245和282位的半胱氨酸证明是丙酮酸化的。很可能NEO218可以实现相同结果，并因此得出结论，GAPDH代表NEO218烷基化的主要靶标，并代表NEO218停止细胞能量产生的至少部分机制。

虽然NEO218的一些作用类似于3-BP的作用，但这两种药剂之间的主要区别在于它们诱导细胞死亡的能力。尽管NEO218在低浓度下(IC50在5和30μM之间)能杀死所有肿瘤细胞类型，但3-BP表现出的明显差异在于，其在一些细胞类型中有相似的效力，但在其它细胞类型中则需要显著更高的浓度(＞200μM)。

已知3-BP通过一种单羧酸跨膜转运体(MCT)进入细胞[31,55]。通过蛋白印迹分析测定MCT1在不同肿瘤细胞系中的表达水平，并与通过MTT试验得到的响应用NEO218或3-BP对相同细胞进行处理的细胞毒性IC50值相关联。

图14显示了NEO218和3-BP各自在几种细胞系中的细胞毒性IC50，与如蛋白印迹中所示的相应的MCT1表达水平对齐。

不同肿瘤细胞表现出有很大不同的MCT1表达水平。有趣的是，那些具有低MCT1水平的细胞(MCF7、231、T47D、BTB-12)是耐3-BP的细胞(即IC50＞300μM)，而那些具有高MCT1水平的细胞(ME16C、468、HCT116)是对由3-BP杀死敏感的细胞(IC50＜100μM)。相比之下，所有细胞，不论其MCT1表达水平，均对NEO218高度敏感(IC50＜35μM)。

基于MCT1表达水平与对NEO218和3-BP的细胞敏感性的对齐，观察到——与3-BP不同——NEO218不需要通过MCT1主动摄取来进入细胞并呈现其细胞毒性效力。因此，NEO218预期将在所有肿瘤类型中显示其抗癌活性，而不仅仅是对MCT1表达呈阳性的那些。

接下来研究了NEO218在体内的抗癌活性。将MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞皮下植入到12只裸小鼠中。两周之后，将动物分为2组，用载体(无药物)或NEO218(5mg/kg)处理。然后，在第1、5和9天给药NEO218(或载体)(共3剂，相隔4天)。从第1天(＝处理的开始)到第13天(实验结束)每3天用卡尺测量一次肿瘤生长。

图15显示了对于NEO218和3-BP各自的肿瘤尺寸与时间的图。这些子图示出了每只动物各自的肿瘤随时间的生长。左侧子图示出了接受载体的6只小鼠中的肿瘤生长；右侧子图示出了用NEO218处理的6只动物中的肿瘤生长。

如图15所示，NEO218处理的动物没有显示出大部分载体处理的动物所显示出的显著增加的肿瘤生长。在NEO218处理的小鼠中，所有动物中的肿瘤体积在实验结束时(第13天)都仍远低于200立方毫米。相比之下，6只载体处理的动物中，有4只具有的肿瘤尺寸显著大于200立方毫米。与没有接受该化合物的一组动物相比，NEO218处理导致较慢的肿瘤生长。虽然肿瘤生长没有完全被阻止，但NEO218发挥了明显的抑制作用，且可以想象用NEO218处理更长的时间将导致甚至更强的肿瘤抑制。用NEO218处理的小鼠对该化合物耐受性良好，在这些动物中没有检测到器官毒性或其它副作用。

在体外，NEO218已经在几种不同的肿瘤细胞系，包括强耐药的变体中显示出惊人的抗癌活性。此外，它还在皮下小鼠肿瘤模型中显示出抗癌活性。

与3-BP形成对比，NEO218的抗癌活性并不依赖于跨膜转运体MCT1的存在，而是显然在没有转运机制的情况下也能进入细胞。因此，无论存在或不存在MCT1，NEO218对所有肿瘤细胞类型都是有活性的。

3-BP依赖于MCT1而NEO218不依赖MCT1解释了上述几个实验结果。例如，加入丙酮酸可以挽救细胞免受3-BP的细胞毒性作用，但不能免受来自NEO218的细胞毒性作用，这可以用简单的竞争效应来解释。丙酮酸是MCT1的底物。因此，当存在过量的丙酮酸时，MCT1优先地输入丙酮酸并排除3-BP；因此，3-BP不能进入细胞且细胞存活。相比之下，NEO218不需要MCT1；因此，尽管存在过量的丙酮酸，它仍然能够进入细胞并发挥细胞毒性作用。

由NEO218引起的坏死细胞死亡是由于细胞ATP池的耗竭，其次是由于代谢酶(诸如GAPDH)的抑制。基于NEO218(和3-BP)的烷基化特性，很可能除了GAPDH之外的关键代谢酶也被丙酮酸化，并从而受到抑制。在3-BP的情况下，许多其它酶被识别为特异性靶标，诸如己糖激酶II(HK-II)[20]和琥珀酸脱氢酶(SDH)[21]。因此，可以想象NEO218也会影响这些酶，以及其它未确定的酶。由此产生的糖酵解的停止与线粒体呼吸的抑制结合，有效地耗竭了细胞ATP并迫使细胞坏死。

虽然表明两种抗氧化剂NAC和GSH在用NEO218处理期间可以保护细胞免受细胞死亡，但由NEO218引发的细胞死亡不太可能涉及或需要自由基的大量产生。而是，基于亲电和亲核的相互作用，NAC和GSH更有可能直接与NEO218和3-BP结合，产生完全无活性的NAC-NEO218和GSH-NEO218复合物。本质上，NAC(或GSH)和NEO218(或3-BP)直接相互中和。该模型得到了以下观察结果的支持，即当使用无细胞体系时，NAC或GSH也能阻止NEO218对GAPDH的灭活，表明在无法产生大量自由基的环境下，NAC和GSH也能起到保护作用。此外，GSH与3-BP形成缀合物的能力最近也得到了实验验证[56]。

NEO218的抗癌作用机制可以总结如下。NEO218直接进入肿瘤细胞，不需要特定的摄取机制。根据其亲核特点，它会将许多细胞内蛋白中的关键半胱氨酸残基丙酮酸化，导致关键代谢酶的失活和细胞能量生产的停止。由此导致的ATP池的耗竭迫使细胞进入坏死细胞死亡。总之，这些机制预期优先在癌细胞中展开，这是因为它们对糖酵解(瓦博格效应)和整体能量需求的依赖性更强，从而为用NEO218的治疗提供了治疗窗口。

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纯度

可以通过气相色谱法(GC)或高压液相色谱法(HPLC)测定NEO218的纯度。测定NEO218纯度和确定存在的杂质的其它技术包括但不限于核磁共振(NMR)光谱、质谱(MS)、GC-MS、红外光谱(IR)和薄层色谱(TLC)。手性纯度可以通过手性GC或旋光度的测量来测定。

NEO218可以通过诸如结晶的方法纯化，或者通过根据其独特的物理化学性质(例如溶解度或极性)从杂质中分离来纯化。因此，可以通过本领域已知的合适的分离技术，诸如制备色谱法、(分级)精馏或(分级)结晶，从杂质中分离NEO218。

治疗方法

本发明还提供了使用NEO218治疗疾病(诸如癌症或其它神经系统疾病)的方法。NEO218可以单独给药，或者与放疗、手术或化疗药剂联用。NEO218也可以与抗病毒药剂、抗炎药或抗生素共同给药。这些药剂可以同时或依次给药。NEO218可以在给药其它活性药剂(一种或多种)之前、期间或之后给药。

NEO218可以与放射治疗联合使用。在一种实施方式中，本发明提供了用辐射治疗肿瘤细胞(诸如恶性胶质瘤细胞)的方法，其中将细胞用有效量的NEO218治疗，并然后暴露于辐射。NEO218治疗可以在辐射之前、期间和/或之后。例如，NEO218可以在放射治疗开始前一周开始连续给药，并在放射治疗结束后继续给药两周。美国专利No.5,587,402和5,602,184。

在一种实施方式中，本发明提供了用化疗治疗肿瘤细胞(诸如恶性胶质瘤细胞)的方法，其中将细胞用有效量的NEO218治疗，并然后暴露于化疗。NEO218治疗可以在化疗之前、期间和/或之后。

NEO218可用于神经系统癌症的治疗，诸如恶性胶质瘤(例如星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤)、视网膜母细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤(I级)、脑膜瘤、转移性脑瘤、神经母细胞瘤、垂体腺瘤、颅底脑膜瘤和颅底癌。本文所用的术语“神经系统肿瘤”是指其中受试者患有神经系统细胞的恶性增殖的情况。

可以通过NEO218治疗的癌症包括但不限于肺癌、耳鼻喉癌、白血病、结肠癌、黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、乳腺癌、造血系统癌、卵巢癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈部癌、胃癌、上皮内瘤变、肾癌、喉癌；白血病包括急性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病；肝癌；淋巴瘤包括霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤；骨髓瘤；纤维瘤、神经母细胞瘤；口腔癌(例如唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；肾癌；呼吸系统癌；肉瘤；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌；泌尿系统癌，以及其它癌和肉瘤。美国专利No.7,601,355。

本发明还提供治疗CNS疾病的方法，包括但不限于原发性神经退行性疾病，诸如阿尔茨海默病、帕金森病、心理障碍、精神病和抑郁症。治疗可由NEO218单独使用或与目前用于治疗帕金森病、阿尔茨海默病或心理障碍的药物联合使用组成。

本发明还提供了改善免疫调节治疗响应的方法，包括在免疫调节治疗之前或期间将细胞暴露于有效量的NEO218的步骤。优选的免疫调节剂是细胞因子，诸如白细胞介素、淋巴因子、单核因子、干扰素和趋化因子。

本组合物可以通过本领域已知的任何方法来给药，包括但不限于鼻内、口服、经皮、眼、腹腔、吸入、静脉内、ICV、脑池内注射或输注、皮下、植入物、阴道、舌下、尿道(例如尿道栓)、皮下、肌肉内、静脉内、直肠、舌下、粘膜、眼、脊柱、鞘内、关节内、动脉内、蛛网膜下、支气管和淋巴给药。局部制剂可采用凝胶、软膏、乳膏、气雾剂等形式；鼻内制剂可作为喷雾或滴剂递送；经皮制剂可通过透皮贴剂或离子电渗给药；吸入制剂可使用雾化器或类似装置递送。组合物也可以采取片剂、丸剂、胶囊、半固体、粉剂、缓释制剂、溶液剂、悬浮剂、酏剂、气雾剂或任何其它合适的组合物的形式。

为了制备这样的药物组合物，根据常规药物组合技术，NEO218可以与药学上可接受的载体、佐剂和/或赋形剂混合。本组合物中可使用的药学上可接受的载体包括任何标准药物载体，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳剂，诸如油/水或水/油乳剂，以及各种类型的润湿剂。该组合物还可以包含固体药物赋形剂，诸如淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、脱脂乳粉等。液体和半固体赋形剂可以选自甘油、丙二醇、水、乙醇和各种油，包括石油、动物、蔬菜或合成原料的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。液体载体，特别是可注射溶液，包括水、盐水、葡萄糖水和甘醇。有关载体、稳定剂和佐剂的实例，参见由E.W.Martin编辑的《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》(Mack出版公司，第18版，1990)。这些组合物还可以包括稳定剂和防腐剂。

本文使用的术语“治疗有效量”是指足以治疗特定疾患或疾病，或替代地足以获得治疗病症或疾病的药物响应的量。确定最有效的给药方式和剂量的方法可因治疗所使用的组合物、治疗的目的、待治疗的靶细胞和待治疗的患者而异。治疗剂量通常可以滴定以最优化安全性和有效性。可以用由治疗医师选择的剂量水平和模式进行单次或多次给药。合适的剂型和给药方法可由本领域技术人员容易地确定。例如，以约0.01mg/kg至约200mg/kg，约0.1mg/kg至约100mg/kg，或约0.5mg/kg至约50mg/kg给药组合物。当本文所述的化合物与另一种药剂或疗法共同使用时，其有效量可能小于当药剂单独使用时的有效量。

透皮制剂可以通过将活性剂结合触变的或凝胶状载体(诸如纤维素基质，例如甲基纤维素或羟乙基纤维素)中来制备，然后将得到的制剂装入透皮装置中，适合安全地与穿戴者的皮肤真皮相接触。如果组合物为凝胶形式，则可将组合物擦到患者的膜例如皮肤上，优选地肩膀或上臂和或上部躯体的完整、干净且干燥的皮肤，并在其上维持一段足以将NEO218递送至患者的血清的时间。本发明的凝胶形式的组合物可以包含在管、袋或计量泵中。这样的管或袋可以包含一个单位剂量或多于一个单位剂量的组合物。计量泵可能够分配一个计量剂量的组合物。

本发明还提供了如上所述用于鼻内给药的组合物。因此，组合物可以还包括渗透促进剂。Southall et al.Developments in Nasal Drug Delivery,2000.NEO218可以以液体形式(诸如溶液剂、乳剂、悬浮剂、滴剂)或以固体形式(诸如粉剂、凝胶或软膏)鼻内给药。递送鼻内药物的装置在本领域是众所周知的。可以使用包括但不限于以下的装置进行鼻用药物递送：鼻内吸入器、鼻内喷雾装置、喷雾器、鼻用喷雾器瓶、单位剂量容器、泵、滴管、挤压瓶、喷雾器、计量剂量吸入器(MDI)、加压剂量吸入器、吹入器和双向装置。鼻用递送装置可计量给药准确的有效剂量的量至鼻腔。鼻用递送装置可用于单单位递送或多单位递送。在具体的实例中，本发明可以使用来自Kurve Technology(Bethell,Wash.)的经鼻电子雾化器(ViaNase Electronic Atomizer)(http://www.kurvetech.com)。NEO218也可以通过管、导管、注射器、包尾(packtail)、拭子、鼻塞或通过粘膜下输注来递送。美国专利公开No.20090326275、20090291894、20090281522和20090317377。

NEO218可以使用标准程序配制成气溶胶。NEO218可以用溶剂配制或不用溶剂配制，也可以用载体配制或不用载体配制。制剂可以是溶液，也可以是有一种或多种表面活性剂的水性乳液。例如，可以是从具有适当的推进剂(诸如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、碳氢化合物、压缩空气、氮气、二氧化碳或其它合适的气体)的加压容器中产生气溶胶喷雾。剂量单位可以通过提供递送计量的量的阀门来确定。泵喷雾分配器可以分配计量的剂量或具有特定颗粒或液滴大小的剂量。本文使用的术语“气溶胶”是指细小固体颗粒或液体溶液液滴在气体中的悬浮体。具体地说，气溶胶包括NEO218液滴的气载悬浮体，可以在任何合适的装置中产生，诸如MDI、喷雾器或弥雾器。气溶胶还包括悬浮在空气或其它载气中的本发明的组合物的干粉组合物。Gonda(1990)Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems 6:273-313.Raeburn et al.,(1992)Pharmacol.Toxicol.Methods27:143-159。

NEO218可以以诸如微球的形式作为粉末通过鼻用吹入器递送至鼻腔。NEO218可以被吸收至固体表面，例如载体。粉末或微球可以以干燥、空气可分配的形式给药。粉末或微球可以存储于吹入器的容器中。替代地，粉末或微球可以填充到胶囊中，诸如明胶胶囊或适合鼻用给药的其它单剂量单位。

药物组合物可以通过直接将组合物放置于鼻腔中递送至鼻腔，例如以凝胶、软膏、鼻用乳液、洗液、乳膏、鼻塞、滴管或生物粘附条的形式。在某些实施方式中，可以期望延长药物组合物在鼻腔中的停留时间，例如，以增强吸收。因此，药物组合物可以任选地与生物粘附聚合物、胶(例如黄原胶)、壳聚糖(例如高纯度阳离子多糖)、果胶(或当施加于鼻粘膜时会增稠如凝胶或乳液的任何碳水化合物)、微球(例如淀粉、白蛋白、右旋糖酐、环糊精)、明胶、脂质体、卡波姆、聚乙烯醇、海藻酸、阿拉伯胶、壳聚糖和/或纤维素(例如甲基或丙基；羟基或羧基；羧甲基或羟丙基)一起配制。

包含NEO218的组合物可以通过口腔吸入呼吸道即肺部中进行给药。

典型的用于可吸入剂的递送系统包括雾化器吸入器、干粉吸入器(DPI)和计量剂量吸入器(MDI)。

雾化器装置产生一股高速气流，其使液体形式的治疗剂喷雾成雾状。治疗剂以液体形式配制，诸如溶液或适当大小的颗粒的悬浮液。在一种实施方式中，颗粒被微粉化。术语“微粉化”定义为具有约90％或更多的颗粒直径小于约10μ。例如由PARI GmbH(Starnberg,Germany)在市场上提供的合适的雾化器装置。其它雾化器装置包括Respimat(Boehringer Ingelheim)和在例如美国专利No.7,568,480和6,123,068以及WO 97/12687中公开的那些。NEO218可以配制成水溶液或液体悬浮液在雾化器装置中使用。

DPI装置通常给药为自由流动的粉末形式的治疗剂，其可以在吸气时分散于患者的气流中。使用外部能源的DPI装置也可以用于本发明。为了获得自由流动的粉末，可以用合适的赋形剂(例如乳糖)配制该治疗剂。干粉制剂可以例如通过将具有的颗粒尺寸在约1μ和100μ之间的干乳糖与NEO218的微粉化颗粒合并并干燥混合来制备。替代地，NEO218可以在没有赋形剂的情况下配制。将制剂装进干粉分配器中，或装进吸入筒或胶囊中，用于与干粉递送装置一起使用。商业上提供的DPI装置的实例包括Diskhaler(GlaxoSmithKline,Research Triangle Park,N.C.)(参见，例如美国专利No.5,035,237)；Diskus(GlaxoSmithKline)(参见，例如美国专利No.6,378,519；Turbuhaler(AstraZeneca,Wilmington,Del.)(参见，例如美国专利No.4,524,769)；和Rotahaler(GlaxoSmithKline)(参见，例如美国专利No.4,353,365)。合适的DPI装置的其它实例在美国专利No.5,415,162、5,239,993和5,715,810中描述，并引入本文。

MDI装置通常使用压缩的推进剂气体排放被测量的治疗剂。用于MDI给药的制剂包括活性成分在液化推进剂中的溶液或悬浮液。推进剂的实例包括氢氟烷(HFA)，诸如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134a)和1,1,1,2,3,3,3-七氟正丙烷(HFA 227)以及氯氟碳化合物，诸如CCl.sub.3F。用于MDI给药的HFA制剂的其它成分包括共溶剂，诸如乙醇、戊烷、水；以及表面活性剂，诸如脱水山梨糖醇三油酸酯、油酸、卵磷脂和甘油。(参见，例如美国专利No.5,225,183，EP 0717987和WO 92/22286)。将制剂装入气溶胶筒中，其构成MDI装置的一部分。美国专利No.6,006,745和6,143,227中提供了专门开发用于HFA推进剂的MDI装置的实例。关于制备适合吸入给药的制剂和装置的方法的实例，参见美国专利No.6,268,533、5,983,956、5,874,063和6,221,398，以及WO 99/53901、WO 00/61108、WO 99/55319和WO00/30614。

NEO218可以封装在脂质体或微胶囊中，用于通过吸入递送。脂质体是由脂质双层膜和水性内部组成的囊泡。脂质膜可以由磷脂构成，其实例包括磷脂酰胆碱，诸如卵磷脂和溶血卵磷脂；酸性磷脂，诸如磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油；以及磷酸鞘酯，诸如磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂。替代地，可以添加胆固醇。微胶囊是包覆有包膜材料的颗粒。例如，包膜材料可以由成膜聚合物、疏水性增塑剂、表面活性剂或/和含氮润滑聚合物的混合物组成。美国专利No.6,313,176和7,563,768。

NEO218也可以单独使用或与其它化疗药剂联合使用，通过局部应用用于治疗局部癌，诸如乳腺癌或黑色素瘤。NEO218也可以与麻醉剂或止痛药联合使用，用于止痛药物的经皮递送。

本发明还提供了如上所述用于眼部给药的组合物。因此，组合物可以还包括渗透促进剂。对于眼部给药，本文所述的组合物可以配制成溶液、乳液、悬浮液等。适合于向眼给药化合物的各种载体均是本领域已知的。在美国专利No.6,261,547；6,197,934；6,056,950；5,800,807；5,776,445；5,698,219；5,521,222；5,403,841；5,077,033；4,882,150和4,738,851中描述了具体的非限制性实例。

NEO218可以单独给予或与其它药物联用，用于短时间或长期治疗上述疾病。本发明组合物可给药至哺乳动物，优选人类。哺乳动物包括但不限于鼠科动物、大鼠、兔、猿、牛、绵羊、猪、犬科动物、猫科动物、农场动物、运动动物、宠物、马科动物和灵长类动物。

本发明还提供了用于在体外、离体或体内抑制细胞生长的方法，其中细胞(诸如癌细胞)与本文所述的有效量的NEO218接触。

病理学细胞或组织，诸如增生性细胞或组织，可以通过将细胞或组织与有效量的本发明的组合物接触来治疗。这些细胞，诸如癌细胞，可以是原发癌细胞，或者可以是从组织库(诸如美国典型培养物保藏中心(ATCC))中获得的培养细胞。病理细胞可以是系统性癌、神经胶质瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤的细胞，也可以是系统性癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、造血癌或卵巢癌的CNS转移的细胞。这些细胞可来自脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人类。美国专利公开No.2004/0087651。Balassiano et al.(2002)Intern.J.Mol.Med.10:785-788.Thorne,et al.(2004)Neuroscience 127:481-496.Fernandes,et al.(2005)[0096]Oncology Reports 13:943-947.Da Fonseca,et al.(2008)Surgical Neurology 70:259267.Da Fonseca,et al.(2008)Arch.Immunol.Ther.Exp.56:267-276.Hashizume,etal.(2008)Neuroncology 10:112-120。

本组合物的体外效力可以使用本领域熟知的方法确定。例如，可以通过MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑鎓溴化物]细胞毒性试验研究NEO218和/或治疗剂的细胞毒性。MTT试验是基于代谢活性细胞摄取MTT(一种四唑盐)的原理，其中其被代谢成蓝色甲瓒产物，其可以通过光谱分析读出。J.of Immunological Methods 65:55 63,1983。NEO218和/或治疗剂的细胞毒性可以通过集落形成试验来研究。抑制VEGF分泌和IL-8分泌的功能性试验可以通过ELISA进行。NEO218和/或治疗剂阻断细胞周期可以通过标准碘化丙啶(PI)染色和流式细胞术来研究。侵袭抑制可以通过Boyden小室来研究。在该试验中，将一层重建的基底膜Matrigel涂覆在趋化性过滤器上，并充当Boyden小室中细胞迁移的屏障。只有具有侵袭能力的细胞才能穿过Matrigel屏障。其它试验包括但不限于细胞存活率试验、凋亡试验和形态学试验。

实施例2紫苏醇缀合3-溴丙酮酸类似物，细胞摄取不依赖于单羧酸转运体1且在耐3-BP的肿瘤细胞中具有活性

缩写：3-BP：3-溴丙酮酸；CFA：集落形成试验；GAPDH：甘油醛3-磷酸脱氢酶；GSH：谷胱甘肽；MCT-1：单羧酸转运体1；NAC：N-乙酰半胱氨酸；NEO218：紫苏醇缀合3-溴丙酮酸；POH：紫苏醇；ROS：活性氧簇；SDH：琥珀酸脱氢酶复合物。

摘要

抗癌剂3-溴丙酮酸(3-BP)被认为是一种糖酵解抑制剂，其通过能量耗竭优先杀死糖酵解癌细胞。然而，其细胞毒性活性依赖于通过跨膜单羧酸转运体1(MCT-1)输入细胞药物，这将其抗癌潜能限制在MCT-1阳性肿瘤细胞。我们生产并表征了不依赖MCT-1的3-BP类似物，称为NEO218。通过将3-BP与紫苏醇(POH)(一种天然单萜)共价缀合合成了NEO218。在存在或不存在补充的丙酮酸或抗氧化剂N-乙酰基-半胱氨酸(NAC)和谷胱甘肽(GSH)的情况下，表征了不同肿瘤细胞系对用这两种化合物治疗的响应。通过质谱分析研究药物对甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性的影响。在体外在MCT-1阳性HCT116结肠癌细胞中研究了3-BP耐药性的发展。我们的结果表明，NEO218：(i)在所有4个其半胱氨酸残基上丙酮酸化GAPDH并关闭酶活性；(ii)使细胞ATP含量严重降低至低于维持生命的水平，并(iii)引发快速坏死。有趣的是，补充抗氧化剂有效地阻止了NEO218以及3-BP的细胞毒性活性，但补充丙酮酸仅能有效地保护细胞免受3-BP的毒性，但不能免受NEO218。与3-BP不同，无论细胞的MCT-1状态如何，NEO218都能发挥其强大的细胞毒性活性。基于MCT-1-阴性细胞的出现，用3-BP处理HCT116细胞可迅速产生耐药性。但NEO218却不是这样，高度耐3-BP的细胞对NEO218仍然非常敏感。因此，我们的研究确定了肿瘤细胞对3-BP产生快速耐药性的机制，并提出NEO218为不受这种细胞防御影响的优良药剂。此外，我们的研究为关于补充抗氧化剂的作用的之前发表的模型提供了另一种解释：补充的NAC或GSH直接与3-BP相互作用，而不是猝灭活性氧簇(ROS)，从而在药物引发ROS产生之前中和药物的细胞毒性潜力。总之，我们的研究介绍了3-BP细胞毒性机制的新方面，并将NEO218表征为一种能够克服对这种关键的针对药物的细胞防御机制的类似物。

1.引言

3-溴丙酮酸(3-BP；3-溴丙酮酸)是丙酮酸的合成的卤代衍生物，具有细胞毒性活性。它充当某些蛋白质的烷基化剂，且随之而来的蛋白丙酮酰化通常导致酶活性的抑制。3-BP的最佳靶蛋白是糖酵解途径中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)[1,2]，这有助于3-BP作为糖酵解抑制剂的声誉[3-6]。肿瘤细胞比正常细胞更大程度地依赖糖酵解(瓦博格效应)，且由3-BP诱导的细胞死亡被认为是由于细胞能量池的耗竭[3,4,7]。这一观点得到了实验的进一步支持，实验表明在细胞培养中补充丙酮酸可以保护细胞免受3-BP的细胞毒性影响[8,9]。

细胞摄取3-BP需要单羧酸转运体1(MCT-1)的存在[10]，MCT-1是羧酸跨膜转运体大家族中的一员[11]。MCT-1是在大多数组织中都有表达的质子连接的转运蛋白，并对短链单羧酸表现出广泛的特异性。在糖酵解肿瘤细胞中，MCT-1通过输出乳酸支持高糖酵解通量，并通过质子的共转运维持细胞内pH值[12]。研究已经表明，MCT-1在不同类型的肿瘤中表达升高，这被认为是可在患者中实现肿瘤特异性摄取3-BP的一个迹象。然而，也有肿瘤MCT-1水平下调的实例。结合MCT-1在许多健康组织中广泛表达的普遍观察，是否容易实现3-BP的肿瘤选择性仍存在一定争议[12]。

3-BP的一些其它表型结果已经在体外描述。除GAPDH之外，来自从细菌到真菌再到人类的许多其它酶都显示被3-BP抑制，包括琥珀酸脱氢酶(SDH；复合物II)和己糖激酶II[13-21]，尽管观察到的对后者的影响并不一致[1,22]。3-BP还被报道通过细胞内谷胱甘肽的耗竭及其对线粒体的影响引起氧化应激，导致活性氧簇(ROS)水平的增加[22-24]。最近，还报道了3-BP的其它多效性，包括刺激自噬[25]、诱导内质网应激[26]以及两个关键细胞内信号传导途径——Akt/mTOR和MAP激酶通路的调节异常[27]。在体内，3-BP已经在许多动物肿瘤模型中显示出治疗潜力[6,28-30]，尽管存在肝脏毒性[31]。此外，有两个案例研究[32,33]，其中将3-BP给药至患者，且其中之一[33]在患有肝细胞癌的患者中报告了良好的响应。值得注意的是，在2016年夏天，德国健康诊所有几名患者在接受3-BP之后几天内死亡，且目前正在调查3-BP是否在这一极其不幸的结果中发挥任何作用[34]。

紫苏醇(POH)是一种单萜，且是葛缕子、薰衣草和丁香油、樱桃、蔓越莓、鼠尾草、薄荷、芹菜籽和某些其他植物的天然成分[35]。尽管该化合物在几个临床前癌症模型中显示出了良好的活性，但它没有进入临床实践，主要是因为剂量限制性肠道毒性在临床试验中变得明显[36]。然而，最近在巴西进行的I/II期临床研究表明，在没有可检测到的毒性事件的情况下，单纯经鼻吸入POH对复发性胶质母细胞瘤是有效的。基于POH的治疗潜力，我们假设将POH与3-BP共价连接可能产生一种具有内在增强的抗癌活性的新型治疗化合物，其可能也适用于耐3-BP的癌细胞。在这里，我们展示了我们的研究结果，详细描述了这种新3-BP类似物(称为NEO218)与3-BP相比的体外抗癌活性的分子和细胞表征。

2.材料和方法

2.1.药物药剂

3-BP从Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)获得，并溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以制成200mM原液。NEO218由Norac Pharma(Azusa CA)生产，并由NeOnc Technologies,Inc.(NTI,Los Angeles,CA)提供；它以200mM溶解于DMSO(Santa Cruz Biotechnology,Inc.，Santa Cruz,CA)中。等分试样保存在-20℃下长达一个月，无冷冻/解冻。Z-VAD-FMK(苄氧羰基-缬氨酰基-丙氨酰基-天冬氨酰基-[邻甲基]-氟甲基酮)是细胞浸透的泛caspase抑制剂，其不可逆地结合到caspase蛋白酶的催化位点，从Sigma-Aldrich获得并从用DMSO制备的20mM原液中使用。丙酮酸钠和丙酮酸甲酯也从Sigma-Aldrich获得。丙酮酸甲酯被认为能更有效地进入线粒体，尽管在我们的实验中两种形式的丙酮酸具有类似的效果。

2.2.细胞系和培养

使用以下人肿瘤细胞系：HCT116结肠癌；LN229、T98G和U251胶质母细胞瘤；MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BTM-12和T47D乳腺癌。ME16C是用端粒酶永生化的正常乳腺上皮细胞。所有细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)、100U/mL盘尼西林和0.1mg/mL链霉素的DMEM中，在37℃和7％CO₂气氛下于湿化温育箱中繁殖。所有细胞培养试剂均由USC/Norris综合癌症中心的细胞培养核心实验室提供，并用来自Cellgro/MediaTech(Manassas,VA)的原料制备；FBS从Omega Scientific(Tarzana,CA)获得。

2.3.MTT试验

噻唑蓝(MTT)试验如前所述进行[38]。简单地说，将细胞以2.0至8.0×10³细胞每孔接种到96孔板中，并暴露于药物治疗(或单独溶剂)24或48小时。在单独实验中，每个处理条件设为一式三份，且每个实验独立地重复几次。

2.4.集落形成试验

根据细胞系(和铺板效率)，将250-800个细胞接种到6孔板的每个孔中，并按照前面详细描述的方法进行处理[39]。12-16天之后，通过用1％亚甲蓝(甲醇中)染色4小时使集落(定义为＞50个细胞的群)可视化，并然后计数。实验重复至少一次，但更通常在不同的条件下重复。

2.5.LDH试验

根据细胞系，在96孔板中每孔接种2000至4000个细胞于50μL的体积中。第二天，将药物加入额外的50μL的培养基中。在不同的时间点(通常温育24小时之后)，移除50μL培养基并根据制造商的说明用LDH细胞毒性试验试剂盒(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)处理。该试剂盒使用产生红色甲瓒产物的酶促反应测量培养基质中的细胞外LDH，其可以用分光光度法测量。在490和680nm处测量吸光度。将所有LDH水平归一化至未经处理的对照，并表示为对照的倍数变化。

2.6.流式细胞术

使用Alexa

488Annexin V/死亡细胞凋亡试剂盒(Thermo FisherScientific)通过流式细胞仪对细胞死亡进行表征。该试剂盒包含重组的绿色荧光团缀合的Annexin V，其与凋亡细胞反应，以及DNA结合的红色荧光碘化丙啶(PI)，其不能浸透活细胞和凋亡细胞，但可染色死亡细胞。在488nm激光激发下的流式细胞术中，可以通过绿色荧光(凋亡细胞)、红色荧光(坏死/死亡细胞)和无荧光(活细胞)来区分不同的细胞群。按照制造商的说明处理对照或药物处理的细胞，然后在USC流式细胞术核心设施进行用LSR II(BDBiosciences,San Jose,CA)的每点10,000个细胞的流式细胞术。

2.7.ATP试验

用ATP比色/荧光试验试剂盒(Biovision Inc.，Milpitas,CA)测量细胞的ATP含量，其利用甘油的磷酸化来生成产物，该产物在570nm处通过比色法定量。将大约1×10⁶个细胞培养于10-cm组织培养皿中，暴露于药物处理持续不同的时间段，并然后按照制造商的说明处理。将所有ATP水平归一化至未经处理的对照，并表示为对照的百分比。

2.8.GAPDH活性试验

用比色GAPDH试验试剂盒(ScienCell Research Laboratories,Carlsbad,CA)测量GAPDH在体外的酶活性。该试验基于在3-磷酸甘油酸、ATP和GAPDH的存在下β-NADH到β-NAD的氧化。通过测定NADH氧化的速率，其与340nm处的吸光度随时间的减少(ΔA340nm/min)成正比，从而测定GAPDH活性。将十万个细胞细胞溶解在100μL细胞裂解缓冲液中，并用上述组分温育。计算吸光度在10分钟中的变化，并归一化至未经处理的对照。数据表示为对照的百分比。进行两种类型的药物处理：在一种方法中，在常规细胞培养条件下将药物加入增殖细胞30分钟；在另一种方法中，在4℃下将药物添加到细胞裂解物中1小时，

2.9.MCT1敲减

所有siRNA均购自Qiagen,Valencia,CA。为了敲减MCT1表达，我们使用siRNA Hs_SLC16A1_6(靶序列：5’-CAGCAGTATCCTGGTGAATAA-3’)。作为非沉默对照，我们使用AllStars阴性对照siRNA，其与任何已知的哺乳动物基因缺乏同源性。使用jetPRIME转染试剂和缓冲液(Polyplus Transfection,New York,NY)，用50nM siRNA转染6孔板的每孔十万个细胞。24小时之后更换培养基，并在转染后72小时对细胞进行实验。

2.10.免疫印迹

如前所述，通过蛋白印迹分析分析总细胞裂解物[40]。裂解caspase 7和PARP的初级抗体从Cell Signaling Technology(Danvers,MA)获得，且肌动蛋白(C-11)和MCT1(H-1)的抗体从Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA)获得。所有抗体均根据制造商的建议使用，除了在MCT1检测时，在将样品装载到聚丙烯酰胺凝胶上之前省略了煮沸步骤。所有免疫印迹重复至少一次以确认结果。

2.11.免疫细胞化学

将HCT116细胞以1-2×10⁵细胞每孔接种在24孔板中的玻璃盖玻片上。第二天，将细胞固定在丙酮中10min，然后用SEA封闭缓冲液(Thermo Fisher Scientific)封闭30min，并在室温下用MCT1抗体(1:50；H1,SantaCruz)温育过夜。二级抗体为生物素化马抗小鼠IgG(1:200；Vector Laboratories,Burlingame,CA)。用苏木精复染细胞20秒，并然后封固在VectaMount AQ封固介质(Vector Laboratories)中。

2.12.液相色谱-质谱法

在与Easy-nLC 1000系统连接的Q Exactive^TM Hybrid Quadrupole-Orbitrap质谱仪上进行LC/MS实验。分析柱是C18EASY-Spray柱(25cm×75μm ID，装满2μm颗粒(

孔隙尺寸))与C18筒捕获柱(5mm×300μm ID，装满5μm颗粒(

孔隙尺寸))串联连接。用300nL/min的流速和150分钟梯度来拆分反应产物。溶剂A为含有0.1％甲酸的100％水。溶剂B含量(含有0.1％甲酸的100％乙腈)在140分钟内从2增加至44％。然后在数据依赖采集模式下对拆分的反应产物进行分析，调查扫描在375至1700m/z之间，分辨率为在200m/z下70,000，且AGC目标为1e6(最大注射时间设定为60ms)。调查扫描之后，选取前10位产物离子进行破碎，归一化碰撞能量(NCE)为27，分辨率为在200m/z下17,500，且AGC目标为5e4(最大注射时间设定为64ms)。用由Thermo Scientific开发的Xcalibur^TM和Proteome Discoverer软件对原始质谱数据进行数据分析。

与GAPDH相互作用：将来自兔肌肉的纯化的GAPDH蛋白(30μg，1μg/μl)(ScienCellResearch Laboratories)与60μM 3-BP或NEO218一起在50mM碳酸氢铵中在室温下温育15min，然后存储在–20℃下直至进一步处理。使用3K离心过滤器在10,000g的力下去除试剂。然后，向过滤器添加100μL的50mM碳酸氢铵缓冲液，并添加10mM 2-碘乙酰胺处理一小时，以烷基化GAPDH上的游离半胱氨酸。消化分两步进行，总比例为1/50(胰蛋白酶/GAPDH)。首先，加入一半量的胰蛋白酶并在37℃下温育混合物两小时，同时每30分钟涡旋过滤器。其次，加入剩余量的胰蛋白酶，并将混合物温育过夜。消化16小时之后，通过加入1vol％甲酸来终止反应。将五微升的反应混合物上样至捕获柱进行分析。通过将目标反应定义为动态修饰来鉴定GAPDH胰蛋白酶肽上修饰后的半胱氨酸残基。

与GSH和NAC的相互作用：将等摩尔浓度(10mM于50μL的体积中)的NEO218和GSH或NAC在37℃或50℃下反应一小时。将反应混合物的试样上样到捕获柱上进行LC/MS分析。通过反应产物的标称m/z值峰，结合同位素分布和强度(¹³C同位素峰)来鉴定反应产物。

2.13.统计分析

所有参数数据均使用Student t-检验进行分析以计算显著性值。概率值(p)＜0.05为统计学显著的。

3.结果

3.1.细胞毒性效力新型3-BP类似物，NEO218

由于有报道称，3-BP在体外的细胞毒性作用依赖于MCT-1的存在，因此我们开始了我们的研究，通过表征MCT-1表达水平以及3-BP在我们研究中使用的各种肿瘤细胞系中的细胞毒性。我们包括了一种结肠癌细胞系(HCT116)、三种胶质母细胞瘤细胞系(LN229、T98G、U251)、四种乳腺癌细胞系(MCF7、T47D、MDA-MB-231、MDA-MB-468)、原发性乳腺癌细胞的一种培养物(BTM-12)以及正常乳腺上皮细胞建立的细胞系(ME16C)。对于所有10种细胞系，我们通过MTT试验建立了IC50(杀死50％的细胞群的药物浓度)，并通过蛋白印迹分析建立了MCT-1蛋白水平。如图16A-16C所总结的，不同细胞中MCT-1水平相差很大，且其IC50值也相差很大。然而，这两者之间存在明显的相关性：那些具有高MCT-1水平的细胞(HCT116、U251、ME16C、MDA-MB-468)比那些具有较低MCT-1水平的细胞(IC50:150-300μM)显示出显著更低的IC50(15-60μM)。这些结果与之前的数据一致，即细胞对3-BP的敏感性需要高MCT-1表达水平。

为了进一步研究3-BP的抗癌作用，我们制备了其类似物，其中单萜POH与3-BP共价缀合。这个新型嵌合体，现在由两个永久融合的抗癌化合物组成，被命名为NEO218(图1)。然后我们对所有10种细胞系进行MTT试验，以并排比较NEO212与3-BP的细胞毒性活性。有趣的是，不论MCT-1表达水平如何，NEO218在各个且每种细胞系中都具有类似的效力，IC50在15至25μM的狭窄的范围内(图16A-16C)。

为了验证这两种药剂之间的明显差异，我们仅用两种细胞系进行了额外的细胞毒性试验：HCT116细胞，代表高MCT-1表达和对3-BP的高敏感性，相比于MDA-MB-231细胞，代表非常低的MCT-1表达和对3-BP非常低的敏感性。用浓度增加的3-BP或NEO218处理这些细胞，并通过MTT短期毒性试验、乳酸脱氢酶(LDH)释放试验和长期集落形成试验(CFA)对药物影响进行定量。结果详见图17A-17C，并可以总结如下：3-BP在HCT116细胞中发挥强的效力，但在MDA-MB-231细胞中仅发挥非常小的效力，且在所有三个试验中均观察到一致结果。相比之下，NEO218在所有三个试验中的两种细胞系中都是高度有效的。在HCT116细胞中，3-BP和NEO218在非常相似的浓度上是活性的，在MTT、LDH和CFA试验中的半数最大效果分别在大约18μM、8μM和3μM。在MDA-MB-231细胞中，NEO218维持同样高的效力，但3-BP的有效浓度在三个试验中分别大大增加至约220μM、350μM和130μM(图17A-17C)。因此，无论实验评估过程如何，MCT-1阳性细胞中3-BP和NEO218的活性相似；然而，在MCT-1阴性细胞中，3-BP的活性显著降低，而NEO218则继续发挥其全细胞毒性潜能。

因为NEO218是通过两个单独的化合物的缀合产生的，其中每个化合物都已知具有抗癌潜力，所以我们接下来研究仅仅3-BP和POH的混合物是否能够模拟NEO218的活性。用NEO218、3-BP、POH或3-BP加POH的混合物处理MDA-MB-231细胞，并通过MTT、LDH和CFA试验分析。与之前一样，NEO218在所有这些试验中都是高度有效的，而3-BP的活性要低得多(图18A-18C)。单独的POH仅发挥非常弱的细胞毒性作用，IC50接近毫摩尔范围，这与分析这种化合物的抗癌作用的许多其它研究是一致的。值得注意的是，3-BP加POH的混合物并不比单独的3-BP更有活性；也就是说，向3-BP添加POH与单独的3-BP的效果相比并不会增加细胞毒性结果(图18A-18C)，表明了3-BP类似物具有新的理化性质。

3.2.MCT-1在药物效果中的作用

以上结果表明，NEO218的细胞毒性作用不需要MCT-1的存在。为了进一步验证这一结论，我们使用siRNA转染来敲减MCT-1在HCT116细胞中的表达。正如所预期的，这样的MCT-1表达的降低导致明显的对3-BP的耐药性，且IC50从20μM至67μM增加超过三倍(图19A)。相比之下，对NEO218的IC50没有增加，而是从19μM小程度上减少至15μM。作为对照，我们通过蛋白印迹(图19B)和免疫组织化学(图19C)证实了siRNA介导的MCT-1的下调。

在一些我们的用HCT116细胞进行的毒性试验中，我们注意到，在用3-BP治疗之后(但不是用NEO218治疗之后)，剂量响应曲线的斜率似乎趋向平稳(例如图17A)，表明存在小的细胞子群体，其对3-BP的耐药性高于其余细胞。在通过免疫组织化学对单个细胞进行更仔细的检查之后，我们在其它大多数MCT-1阳性群体中检测到少量的明显MCT-1阴性细胞(图20A)。通过用40μM处理HCT116细胞进一步研究该方面，显示出该浓度在MTT试验中明显减少75％存活率(图17A)且在CFA中阻断99％集落形成的浓度。在3-BP处理过夜后，静置HCT116细胞以恢复，且在约两周之后细胞群完全恢复。对这些细胞，我们称之为3-BP存活者，进行进一步分析。有趣的是，无论通过免疫组织化学(图20A)还是通过蛋白印迹(图20B)，在这些细胞中均未检测到MCT-1表达。当我们分析它们对3-BP的敏感性时，我们发现它们对这种化合物已经具有显著耐药性且IC50远高于100μM，且对于MCT-1阴性细胞所记录的IC50的范围在图16A-16C中示出。总之，这些结果表明，3-BP处理有效地选择了MCT-1阴性细胞，其以随后3-BP耐药的方式迅速恢复细胞群。有趣的是，NEO218没有这样的效果。一方面，用40μM NEO218处理HCT116细胞没有留下任何存活的细胞；另一方面，对3-BP有高度耐药性的3-BP存活者对NEO218仍保持着其高度敏感性(图20C)。

3.3.确立坏死为细胞死亡的主要类型

接下来，我们对药物诱导的细胞死亡进行了表征，并特别地试图区分响应用3-BP或NEO218处理细胞的凋亡和坏死。我们首先对药物处理的细胞进行FACS分析，以研究Annexin V阳性(凋亡标志物)相比碘化丙啶(PI)(坏死细胞标志物)结合。我们使用星形孢菌素(STS)作为凋亡细胞死亡的已确认的阳性对照。如图21A所示，STS按预期进行：用该药剂处理的HCT116细胞从左下象限(＝全活细胞)移动到右下象限(＝Annexin v阳性细胞)，然后在右上象限(＝PI阳性，死细胞)中缓慢积累。与之形成鲜明对比的是，3-BP和NEO218处理导致细胞从左下象限直接移动到右上象限。这种效果非常迅速，且早在处理开始后2小时就可检测到；在8小时时，大部分细胞是PI阳性的(图21A)，表明多数为坏死，而非凋亡。

其次，我们分析了凋亡的典型标志物，特别是PARP(聚-ADP-核糖聚合酶)的蛋白水解裂解、caspase 7(C-7)的激活以及磷酸化HA2X蛋白(-HA2X，表明DNA的损伤和降解)的出现。将HCT116和MDA-MB-231细胞用3-BP或NEO218以其各自的细胞毒性浓度处理，或用STS作为诱导凋亡的阳性对照。图21B显示，与预期一样，STS触发了PARP的显著的裂解、C-7的激活和-HA2X的出现。然而，相比之下，所有三种凋亡标志物对3-BP或NEO218的响应如果有的话也都很微弱。我们还确定了Z-VAD-FMK(一种有效的泛-caspase抑制剂)的加入是否能够影响3-BP或NEO218的细胞毒性作用。然而，如图21C所示，情况并非如此，即抑制caspase激活并不影响两种药物的细胞毒性IC50，进一步表明没有典型的凋亡事件。

众所周知，细胞凋亡是需要细胞能量的活跃过程，我们接下来测定了在药物治疗后的细胞ATP水平。作为参考，我们还在缺乏葡萄糖的培养基(以最小化糖酵解)中在鱼藤酮(线粒体呼吸复合物I抑制剂)的存在下培养细胞，这是一种已知会导致坏死细胞死亡的培养条件，因为ATP水平下降至低于～25％的操作阈值。如图22所示，在使用HCT116细胞的情况下，这种不利的培养条件确实导致快速ATP耗竭，在处理的前3小时内就突破了25％阈值，并在六小时后进一步下降至正常的约10％。惊人的相似之处在于，用3-BP或NEO218处理细胞产生几乎相同的结果(图22)。综上所述，这些结果表明，对于这两种化合物坏死是细胞死亡的主要机制，其次是细胞能量水平的严重耗竭。

3.4.药物诱导的细胞毒性的机制

在确立了3-BP和NEO218两者均可导致细胞能量生产的快速致死终止之后，我们接下来着手确定引起这种效果的原因。其他已有报道称，在体外添加过量的丙酮酸或补充抗氧化剂能够保护细胞免受3-BP的细胞毒性作用。因此，我们追踪这些线索，并研究了它们是否也适用于NEO218。在存在或不存在丙酮酸或抗氧化剂(N-乙酰半胱氨酸，NAC，和谷胱甘肽，GSH)的情况下，用NEO218或3-BP处理HCT116细胞，并在24小时后测定细胞存活率。正如预期，这三种外源添加的化合物中的每个都能对3-BP毒性发挥很大的保护作用。然而，在NEO218的情况下，存在显著的不同。虽然抗氧化处理能类似地保护细胞不受NEO218的毒性，但当添加丙酮酸时则完全没有保护作用(图23A)。(参见关于这种效果的解释的讨论)

由于3-BP已被报道为甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的抑制剂，因此我们接下来研究了GAPDH酶活性。首先，用3-BP或NEO218处理HCT116细胞，且30分钟后裂解细胞以测定GAPDH活性。如图23B中所示，GAPDH活性受到化合物的严重抑制，IC50略低于30μM。其次，在无细胞提取物中测定药物对GAPDH活性的影响，其中药物不是添加到活细胞中，而是添加到细胞裂解物中。如图23C中所示，在这些条件下两种化合物也显著降低了酶GAPDH活性。然而，令人惊讶的是，在存在抗氧化剂(NAC或GSH)的情况下，这种抑制作用被完全阻止，即使这些是无细胞反应条件，不可能通过完整的线粒体或其它细胞过程产生自由基。这一结果表明，NAC或GSH的保护作用可能不是通过它们对自由基簇的常规猝灭。(参见关于解释通过NAC和GSH的细胞保护的替代模型的讨论。)

基于已知的3-BP的烷基化性质，我们接下来解决了3-BP和NEO218两者是否能够共价丙酮酸化GAPDH蛋白的问题。GAPDH的氨基酸序列包含4个半胱氨酸(在兔中位于150、154、245、282位)，且它们的硫醇基官能团为亲核加成的潜在候选。我们用3-BP或NEO218温育纯化的兔GAPDH蛋白，并通过质谱法分析得到的产物。该分析清楚地鉴定了共价修饰的半胱氨酸。在用3-BP温育的情况下，所有4种半胱氨酸均通过加入丙酮酸而改变；在用NEO218温育的情况下，同样的四个残基显示出丙酮酸-紫苏醇部分的连接(图24A)。综合起来，以上结果表明3-BP和NEO218通过GAPDH的半胱氨酸残基的烷基化导致GAPDH酶活性的抑制，特别是活性位点Cys-150(相当于人GAPDH中的Cys-152)，已知其对酶功能最为关键[41]。

我们还认为NEO218(和3-BP)可能具有许多其它靶标，因此也研究了与GSH和NAC的潜在直接相互作用。在体外将纯化的GSH或NAC与NEO218混合，然后进行质谱分析。这两种抗氧化剂都很容易与3-BP类似物相互作用。在GSH+NEO218的情况下，反应产生了一个主要的融合产物(图24B)，这与将得到非活性复合物的亲核置换反应相一致。在NAC+NEO218的情况下，获得了许多不同的反应产物，并选择其中一个主要产物进行进一步分析。该产物的色谱图表明了亲核加成反应，其中NEO218的溴化残基可能没有离开最终的反应产物结构(图24C)，但清晰地显示了NAC与NEO218的相互作用。没有对其它反应产物进行表征。总之，这些结果显示了NEO218与GSH或NAC之间的直接相互作用。基于这一结果，将假设补充GSH或NAC主要通过淬灭烷基化化合物的亲电势来保护细胞免受NEO218(或3-BP)毒性。

4.讨论

3-BP作为肝癌的抗癌药剂正在开发中，但其确切的作用机制尚不完全清楚。例如，虽然3-BP对细胞能量水平的耗竭已经被确认，但还不完全清楚这是如何实现的，尽管经常提出通过3-BP对GAPDH(或可能是己糖激酶)的显而易见的抑制而导致的糖酵解的阻塞是其原因。许多报道已经表明氧化应激是3-BP诱导的细胞死亡的关键部分，且自噬和不同的信号通路也有所涉及。我们已经制备了NEO218，POH连接的3-BP类似物，它被证明在进一步阐明这些机制中的一些的作用中是非常有用的；此外，这种类似物揭示了在癌症治疗的背景中相关的新特征。

我们对3-BP和NEO218的体外并排分析揭示了重要的共性，以及有趣的差异，这为更好地理解3-BP的细胞毒性机制提供了关键线索。基于我们的新数据，结合其它人最近发表的相关研究结果，我们想要提出更新的3-BP作用模型(详见下文)，并引入其类似物NEO218作为进一步研究的新对象。

3-BP和NEO218之间的关键区别在于它们进入细胞的方式。已证实3-BP通过由跨膜MCT-1的主动转运进入细胞[10]，且我们证实该模型如下：(i)在所测试的所有10个不同细胞系中，3-BP的细胞毒性IC50与其各自的MCT-1蛋白水平密切相关；即具有高MCT-1蛋白水平的细胞一致地表现出比具有低MCT-1水平的细胞低得多的IC50(图16A-16C)。(ii)MCT-1的敲减导致对被3-BP杀死的增加的抗性(图19A-19C)。(iii)由于缺乏MCT-1表达而选择的HCT-116细胞对3-PB高度耐药，而MCT-1阳性亲代细胞非常敏感(图20A-20C)。这些结果与NEO218对比如下：(iv)无论MCT-1表达水平如何，NEO218在相同10个细胞系中在低浓度(15至25μM)下均同样有效。(v)MCT-1敲减之后，NEO218的IC50没有增加(图19A-19C)。(vi)由于缺乏MCT-1表达而选择的HCT-116细胞与其亲代细胞一样对NEO218敏感(图20A-20C)。此外，添加大量摩尔过量的补充丙酮酸(已知的MCT-1底物)有效地保护细胞不受3-BP毒性，但不能保护细胞不受NEO218的毒性(图23A)。总之，这些数据充分支持了我们的模型，即NEO218以不依赖MCT-1的方式有效地进入细胞。其细胞吸收的精确模式，无论是通过扩散还是通过其它主动转运机制，仍有待确立。鉴于之前的观察，紫苏醇与脂质双分子层具有动态的相互作用[42]，可以推测，这种单萜与3-BP的共价缀合赋予了嵌合化合物亲脂性性质，导致不依赖受体的膜相互作用，从而实现细胞进入。

虽然3-BP和NEO218之间细胞摄取差异很大，但这两种化合物导致细胞死亡的机制似乎是相同的，即一旦进入细胞，两种化合物似乎都会触发相同序列的事件，其中蛋白质烷基化反应是最初的关键步骤。3-BP与GAPDH的结合以及抑制其活性在之前已有报道[1,2,43]。虽然我们证实了通过3-BP和NEO218两者抑制GAPDH酶活性(图23B，23C)，但我们进一步确定了GAPDH的主要氨基酸序列中的所有4个半胱氨酸残基都是烷基化的靶标(图24A)。由于已知兔蛋白中的Cys-150(相当于人序列中的Cys-152)对酶功能至关重要[41]，因此可以合理地推断，丙酮酰化是3-BP和NEO218实现对GAPDH的抑制的关键机制。

作为一般原则，已经确认半胱氨酸是蛋白质中本质上最亲核的氨基酸，且功能半胱氨酸中的硫醇侧链容易与Michael受体型试剂相互作用(“Michael反应”)[44]。因此，将GAPDH半胱氨酸确定为3-BP和NEO218的直接靶标并不完全令人惊讶。然而，作为推论，它也表明许多其它细胞蛋白的活性可能受到这种类型的相互作用的影响。其他人的研究[45,46]，使用除了3-BP的硫醇反应性亲电试剂，发现＞500(大多数未被识别)的含有半胱氨酸的蛋白质对这种修饰有响应。虽然并不是所有这些蛋白质都一致地被所有亲电试剂修饰，但似乎某些蛋白家族比其它家族更敏感，且特定的核心基团被所有测试的亲电试剂修饰。在3-BP和NEO218的背景下，我们可以推断，除了GAPDH之外许多其它蛋白也可能成为靶标，并可能参与传递这些药剂的细胞毒性影响。事实上，已知从细菌到真菌再到人类的许多其它酶都被3-BP抑制[13-21]，包括琥珀酸脱氢酶(SDH)，其是连接三羧酸循环与电子传递链的关键酶[2,19,47]。

3-BP和NEO218的大量的潜在靶标引发了一个问题，即哪些靶标在介导药物诱导的细胞死亡中发挥关键作用。如其它研究所表明的[22,24,48]，且我们也对NEO218进行了验证(图22)，3-BP会导致细胞ATP池的严重耗竭，这种情况无法维持细胞存活，并且众所周知会不可避免地导致坏死[49-51]。因此，在3-BP和NEO218的众多潜在靶标中，GAPDH和SDH的同时抑制尤为突出，因为没有这两种酶的强烈活性，细胞不太可能产生足够的能量来存活。我们的发现进一步强调了SDH以及GAPDH的假定的重要性，即补充丙酮酸在克服NEO218诱导的细胞死亡方面完全无效(图23A)。这与其他人[8,9]和我们自己的发现形成鲜明对比(图23A)，证明了补充丙酮酸可提供对3-BP的强大保护。虽然早期的解释表明丙酮酸通过提供缺失的糖酵解最终产物来克服3-BP的毒性(即中和GAPDH抑制的后果)，但我们与NEO218的并排比较反而指出，添加(大量摩尔过量的)丙酮酸是通过对经由MCT-1的细胞摄取的有效竞争来保护细胞免受3-BP毒性。此外，从生长培养基中完全去除葡萄糖并不会显著影响我们研究中使用的肿瘤细胞的短期存活，而且明显没有模拟3-BP诱导的细胞死亡(未示出)。另一方面，同时抑制糖酵解和线粒体呼吸(通过去除葡萄糖并同时添加鱼藤酮)非常接近地模拟了由3-BP和NEO218引起的ATP耗竭的快速动力学(图22)。总之，我们的模型——与其他人的观察[47,52,53]一致——支持GAPDH和SDH的有效的同时抑制作为由3-BP和NEO218诱导的细胞死亡的关键初始触发因素，尽管其它潜在靶标的贡献是可想到的并有待确定。

响应于3-BP和NEO218的细胞处理的GAPDH抑制可能被ROS进一步加重。已经证明3-BP可以降低细胞GSH水平，导致ROS水平升高[22,23]。由于糖酵解GAPDH活性可被高ROS水平抑制[54]，因此很有可能GAPDH会由于丙酮酰化加ROS造成的双管齐下的攻击而关闭。在丙酮酰化之外，为了将ATP池耗竭到维持生命的水平之下，这种ROS造成的额外的抑制是否需要还有待确定。之前的几项研究[8,24,25,55]使用补充的抗氧化剂，主要添加GSH和NAC，作为研究ROS在3-BP诱导的细胞死亡中的作用的工具，并观察到两者中任何一个均在保护细胞免受3-BP毒性方面非常有效，类似于我们在图23A-23C中用3-BP和NEO218两者所示出的结果。虽然这一结果曾被认为表明ROS的生成对于介导由3-BP导致的细胞死亡必不可少，但我们的结果表明并非如此。

例如，在无细胞系统中3-BP和NEO218也抑制了GAPDH活性，而ROS不太可能发挥作用，且在这些条件下添加GSH或NAC也证明具有保护作用(图23C)。此外，与NEO218与GAPDH的半胱氨酸硫醇基的强相互作用相似，如通过LC/MS分析所揭示的(图24A-24C)，NEO218也与亲核GSH和NAC直接相互作用。虽然我们在质谱分析中没有包括3-BP，但由其他人作出的最近的报告显示，在不存在细胞的情况下，以及细胞内地在红细胞和MCF7细胞中，GSH与3-BP存在直接的相互作用[56]。综上所述，这些观察结果支持这样一种模型，其中摩尔过量的补充GSH和NAC通过有效结合并中和3-BP/NEO218来发挥作用，从而起初就阻止ROS产生，而不是通过二次猝灭增加水平的ROS。总而言之，虽然很明显3-BP通过耗竭细胞内GSH池[22,23,43](也可能是通过影响线粒体呼吸[57])确实增加了ROS水平，但仍有待确认这些ROS是否确实是药物诱导的细胞死亡所需要的——或者是否相反丙酮酰化介导的关键代谢酶的失活可能就足够了。

3-BP诱导的细胞死亡的机制有多种报道，如凋亡、坏死性凋亡或坏死(例如，参考文献[22,24,26,58,59])。在化疗的背景下，这种区别是重要的。正如最近的一篇综述[60]所指出的，与一些普遍持有的观点相反，坏死而不是凋亡应该是最有效化疗的优选细胞死亡模式。我们非常小心地从不同角度阐明了这一问题，包括星形孢菌素作为凋亡事件的阳性对照。我们还使用MCT-1阳性和-阴性细胞，其允许我们研究在高3-BP浓度下的事件可能与在低浓度下的事件不同的可能性。

我们所有的数据均高度一致，并指出坏死是我们的细胞系统中由3-BP和NEO218两者导致的细胞死亡的绝对主导的机制，以下观察结果支持这一观点：(i)泛-caspase抑制剂对3-BP或NEO218的细胞毒性IC50不发挥影响(图21C)。(ii)几种已确立的凋亡蛋白标志物对药物处理呈现非常小的响应(如果有的话)(图21B)。(iii)质膜的结构完整性的丧失是坏死的标志[61,62]，且可通过细胞摄取不能渗透膜的染料(诸如碘化丙啶，PI)或细胞渗漏胞质酶(诸如乳酸脱氢酶，LDH)来记录。我们的FACS分析示出了PI阳性细胞的大量积聚(图21A)和LDH的大量渗漏(图17A-17C)。质膜完整性的丧失与我们所观察到的(图22)和其他人报道的[22,24,48]由于严重ATP耗竭引起的细胞死亡一致，因为维持细胞质跨膜电化学梯度是高度依赖能量的，且其丧失不可避免地导致细胞肿胀和膜破裂(即坏死)[62]。(iv)快速细胞死亡是坏死细胞死亡的另一个特点[63]。我们在药物暴露的前2小时内检测到PI阳性和LDH释放(PI参见图21A；LDH的时间过程未示出)。(v)虽然ATP的严重耗竭已经表明应该排除任何一种程序性事件，但我们确实研究了程序性坏死，亦称坏死性凋亡[64]，作为药物诱导的细胞死亡的可能机制。在necrostatin-1(Nec-1)的存在下用3-BP或NEO218处理细胞，Nec-1是一种常用的坏死性凋亡的抑制剂[63]。然而，没有检测到Nec-1对药物诱导的细胞毒性结果的影响(未示出)。

在我们的研究中，我们将星形孢菌素作为诱导细胞凋亡的参考药剂包括在内，其对于细致区分由3-BP和NEO218诱导的坏死和凋亡事件非常有用。例如，在我们分析传统的凋亡标志物的蛋白印迹中(图21B)，我们确实检测到在药物处理之后出现了微弱的阳性信号。尽管长时间暴露这些印迹也会显著增强这些信号——并可能导致大范围的凋亡——但我们与星形孢菌素处理的细胞的比较使我们正确地看待这些信号，并证实这些信号仅在很小程度上(如果有的话)涉及凋亡过程。此外，膜完整性的丧失(坏死的特征)将使Annexin V结合，并因此重要的是记住，同样是PI阳性的Annexin V阳性细胞不是凋亡的，而是坏死的。我们的FACS分析(图21A)很好地说明了这一点，其中星形孢菌素处理的细胞首先移动到右下象限(Annexin V阳性；PI阴性)中，然后移动到右上象限(Annexin V阳性；PI阳性)中。相比之下，绝大多数用3-BP或NEO218处理的细胞并不出现在右下象限中，而是直接从左下移动到右上。结合我们详细分析的数据，在我们的研究中使用的肿瘤细胞系中，确定了坏死作为细胞死亡的明显主要形式是由3-BP及其类似物NEO218诱导。然而，应该注意的是，其它细胞类型可能有不同的响应，因为已经报道了响应3-BP的细胞类型特异性细胞死亡过程[26]。

在癌症治疗中，治疗耐药性的发展是一个普遍存在的问题，其通常意味着受影响患者的不良预后。在该背景下，有趣的是，发现单独的3-BP处理高度敏感的HCT116细胞会导致3-BP耐药细胞的快速积聚，显然是因为药物处理杀死MCT-1-阳性细胞，但允许在处理开始之前就已经存在于群体中的少数MCT-1-阴性细胞存活并逃脱(图20A-20C)。虽然未知患者中的MCT-1-阳性肿瘤组织是否存在MCT-1-阴性细胞子集，但我们的实施例提供了警示信号，即MCT-1表达的下调(图19A-19C)或者存在MCT-1-阴性肿瘤细胞亚群(图20A-20C)均会在临床上导致治疗耐药性。然而，有趣的是，没有观察到对NEO218的耐药性增加，且事实上，从3-BP处理中产生的耐药细胞对NEO218仍有很高的响应(图20A-20C)，进一步强调了这种类似物的不依赖MCT-1的功能。

5.结论

我们的结果的总和与3-BP和NEO218完成细胞杀死的分子活性是相同的这一结论是一致的。唯一值得注意的区别是，3-BP需要通过MCT-1转运进入细胞，而NEO218则不需要。然而，一旦进入细胞，3-BP和NEO218以类似的效力触发相同序列的细胞毒性事件，如下：两种药剂快速地丙酮酸化几种关键代谢酶(GAPDH、SDH和其它可能的)，从而抑制它们的活性。其直接后果是糖酵解和线粒体呼吸都停止，导致ATP水平迅速下降至低于维持生命的水平。正如众所周知的，在缺乏足够ATP的情况下，依赖能量的细胞功能丧失能力[49-51,65-67]，细胞只能坏死。然而，如果细胞仅很少地表达或不表达MCT-1，则在体外可保护细胞免受低至中等浓度的3-BP的细胞毒性影响。外推到未来用3-BP治疗癌症，这样的细胞预计会驱动治疗耐药性的出现并导致患者预后不良。有趣的是，这种体外效果在NEO218中没有观察到，这为NEO218进一步作为抗癌药剂的特性提供了理论基础。

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本发明的范围不受本文所述具体实施方式的限制。事实上，除了本文所述的修改之外的本发明的各种修改将从前面的描述和所附附图中对本领域技术人员变得显而易见。这种修改旨在落入所附权利要求的范围之内。

上述书面说明书被认为足以使本领域技术人员实施本发明。除了本文示出的和描述的修改之外的本发明的各种修改将从前面的描述中对本领域技术人员变得显而易见并落入所附权利要求的范围内。包括更正证明书在内的每份专利文件的完整公开、专利申请文件、科学论文、政府报告、网站以及本文提到的其它参考文献，其全部内容均通过引用并入本文用于所有目的。

Claims (9)

1.紫苏醇和3-溴丙酮酸的缀合物，为

3-溴-2-氧亚基-丙酸4-异丙烯基-环己-1-烯基甲基酯，

或其药学上可接受的盐。

2.一种包括3-溴-2-氧亚基-丙酸4-异丙烯基-环己-1-烯基甲基酯的药物组合物。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，还包括药学上可接受的赋形剂。

4.3-溴-2-氧亚基-丙酸4-异丙烯基-环己-1-烯基甲基酯在制备用于在需要治疗的患者中治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症选自由乳腺癌、卵巢癌、结肠癌和脑癌组成的组。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述脑癌为胶质母细胞瘤。

6.一种合成3-溴-2-氧亚基-丙酸4-异丙烯基-环己-1-烯基甲基酯的方法，包括：

a)将1,1-二氯二甲醚与溴丙酮酸反应以形成3-溴丙酮酰氯；以及，

b)将3-溴丙酮酰氯与紫苏醇反应以形成3-溴-2-氧亚基-丙酸4-异丙烯基-环己-1-烯基甲基酯。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述将1,1-二氯二甲醚与溴丙酮酸反应的步骤在0至20℃的温度下进行。

8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述将3-溴丙酮酰氯与紫苏醇反应的步骤在-10至10℃的温度下进行。

9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述将3-溴丙酮酰氯与紫苏醇反应的步骤在碳酸氢钠和正庚烷的存在下进行。

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