CN110251731A - 一种组织工程用胰岛细胞微囊及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属医学生物工程领域，涉及一种组织工程用胰岛细胞微囊及其制备方法。本发明采用海藻酸钠‑活性氨基组分‑聚乙二醇的结构，其内层由精氨酸‑甘氨酸‑天冬氨酸肽修饰的海藻酸钠对细胞进行包裹，然后用超支化聚乙烯亚胺偶联的聚赖氨酸作为稳定剂，其中超支化聚乙烯亚胺对聚赖氨酸层进行了交联加固，提高了微囊的机械性能。微囊的最外层是由单边固定在活性氨基组分的聚乙二醇链段组成，由于其具有滑动性能，对蛋白质、细胞的粘附起到抑制作用。由于聚乙二醇在人体中是趋于“隐形”的材料，故而本发明所述微囊在一定程度上可以抑制被纤维化，从而延长活性细胞的存活时间。可在一定程度上改善1型糖尿病病人血糖水平。

Description

一种组织工程用胰岛细胞微囊及其制备方法

技术领域

本发明属医学生物工程领域，涉及一种组织工程用胰岛细胞微囊及其制备方法。

背景技术

现行治疗1型糖尿病主要依赖胰岛素，但即便使用最理想的胰岛素剂量，仍有部分患者的血糖水平控制不稳定，进而引起微血管和大血管并发症，如糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变和周围血管疾病等，最终可以导致器官衰竭和死亡。

20世纪70年代末，N ajarian、Suther和Lajiader等采用经门静脉和经脾脏的方法进行同种异体胰岛细胞（Isletcell，IC）移植，治疗非自身免疫性糖尿病（DM）。1990年Sharp等报道，采用同种异体IC 移植治疗1 型DM 患者成功，这在一定程度上应归功于R icordi等在IC 分离、纯化技术上所取得的进步。然而，直到Edm onton 等报道后，IC移植才真正被作为治疗DM 的最有效方法，代替保守的药物治疗和胰腺移植。细胞或组织移植，是解决糖尿病的重要途径之一，但是本体细胞或组织来源较少，而异种细胞和人源异体细胞都存在免疫排斥反应严重的问题，限制了细胞移植的开展。

海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠（APA）微胶囊，其半通透性的囊膜将细胞包裹，只允许小分子的营养物质和细胞分泌物自由通过，限制了大分子的免疫成分和细胞进入，从而达到延长移植物存活的免疫隔离作用。自1986年，O 'shea用海藻酸钠代替聚乙烯亚胺，制成海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊开始，利用海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠（APA）微胶囊制备胰岛细胞微囊的报道就屡见不鲜，2008年Meyer T等人通过异种胰岛细胞微囊移植，维持了大鼠的正常血糖，并且未产生排斥反应。而Sun Y和Dufrane D分别在1996年和2006年利用胰岛细胞微囊在灵长类动物上取得了成功。2007-2014年，Elliott RB、Valdes-Gonzalez R、Matsumoto S等人对胰岛细胞微囊移植在人体进行了成功应用。

目前，利用海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠（APA）包裹细胞或组织的微囊化细胞工艺，主要包括：细胞与海藻酸钠溶液混合、成球、包覆聚赖氨酸、包覆海藻酸钠和洗出游离海藻酸钠、微囊液化等步骤。首先将细胞或组织与适当浓度的海藻酸钠溶液混合均匀，然后用高压静电液滴法或气流切割法将混合液滴至固化溶液中(等渗的CaCl2溶液)形成海藻酸钙微球，然后再将微球先后投入到适当浓度的聚赖氨酸溶液和海藻酸钠溶液中包覆聚赖氨酸和海藻酸钠，最后将微球投入到柠檬酸钠溶液中洗出游离的海藻酸钠，液化微球的核心，即可获得APA微囊化的细胞或组织。海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠（APA）微囊由于易吸附蛋白和细胞，容易被组织纤维化，并且其机械性能较差。

本发明采用海藻酸钠-活性氨基组分-聚乙二醇的结构，其内层由生物相容性较好的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽修饰的海藻酸钠对细胞进行包裹，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽修饰的海藻酸钠相比单纯的海藻酸钠更利于细胞的成活，并具有更强的稳定性和机械强度。然后用含有超支化聚乙烯亚胺偶联的聚赖氨酸作为稳定剂，其中超支化聚乙烯亚胺对聚赖氨酸层进行了交联加固，提高了微囊的机械性能。微囊的最外层是由单边固定在活性氨基组分的聚乙二醇链段组成，由于其具有滑动性能，对蛋白质、细胞的粘附起到抑制作用。由于聚乙二醇在人体中是趋于“隐形”的材料，故而本发明所述微囊在一定程度上可以抑制被纤维化，从而延长活性细胞的存活时间。

发明内容

本发明的目的之一是为了解决上述的技术问题而提供一种胰岛细胞微囊。

本发明的目的之二在于提供上述的一种胰岛细胞微囊的制备方法。

本发明的目的之三在于提供一种应用上述的一种胰岛细胞微囊的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种组织工程用胰岛细胞微囊的制备方法，按照如下的操作步骤进行：

（1）将胰岛细胞与浓度为15-25g/L的海藻酸钠溶液混合，制成悬浮液，使每毫升悬浮液中含1-6×106个细胞；

（2）利用喷雾装置将步骤（1）获得的悬浮液以150-1000μm直径的微滴状态分散于一种浓度为80-120mmol/L的氯化钙或乳酸钙溶液中，两种液体的比例为保证每升混合液含0.5-1×108个细胞，放置5-10分钟，待沉淀完全除去上清液，获得胰岛细胞的海藻酸钙沉淀；

（3）将步骤（2）获得的沉淀物加入到一种浓度为0.3-0.7g/L的活性氨基溶液中，二者的比例保证每升液体含0.5-1×108个细胞，混合均匀，放置5-20分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；

（4）将步骤（3）获得的沉淀物加入到浓度为100-300g/L的活性聚乙二醇溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.5-1×108个细胞，混合均匀，放置3-15分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；

（5）将步骤（4）获得的沉淀物加入到一种浓度为45-75mmol/L的柠檬酸钠溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.5-1×108个细胞，混合均匀，放置5-20分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得胰岛细胞微囊沉淀物；

（6）将步骤（5）获得的沉淀物加入到一种浓度为9g/L的氯化钠溶液中清洗，最后将沉淀物转移入细胞培养液中培养待用。

所述胰岛细胞具有85%以上的纯度。

在步骤（1）中所述精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽修饰的海藻酸钠中，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽与海藻酸钠的摩尔比为0.10-0.20:100。

在步骤（2）中将步骤（1）获得的细胞悬液以200-600μm直径的胶珠分散。

在步骤（3）中所述活性氨基溶液为含有超支化聚乙烯亚胺偶联的聚赖氨酸溶液，其中聚赖氨酸:超支化聚乙烯亚胺的质量比为90:10。

在步骤（4）中所述活性聚乙二醇为聚乙二醇琥珀酰亚胺甲酸酯、聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯、聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯、聚乙二醇琥珀酰亚胺丁酸酯、聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯、聚乙二醇琥珀酰亚胺己酸酯。

按照上述制备方法获得的组织工程胰岛细胞微囊。

所述的组织工程胰岛细胞微囊应用为：组织工程用胰岛细胞微囊通过腹腔镜植入腹腔，分泌胰岛素或胰高血糖素。

所述胰岛细胞的来源为异体或异种。

与本领域的同类现有技术相比，本发明具有下列有益效果：

1、微囊内层由生物相容性较好的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽修饰的海藻酸钠对细胞进行包裹，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽修饰的海藻酸钠相比单纯的海藻酸钠更利于细胞的成活，并使海藻酸层具有更强的稳定性和机械强度。

2、胰岛细胞微囊利用含有超支化聚乙烯亚胺、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽偶联的聚赖氨酸作为稳定剂，其中超支化聚乙烯亚胺和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸对聚赖氨酸层进行了交联加固，提高了微囊的机械性能，解决了海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠（APA）机械性能差的缺点。

3、胰岛细胞微囊的最外层是由单边固定在活性氨基组分的聚乙二醇链段组成，由于其具有滑动性能，对蛋白质、细胞的粘附起到抑制作用。由于聚乙二醇在人体中是趋于“隐形”的材料，故而本发明所述微囊在一定程度上可以抑制被纤维化，相比于传统结构的海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠（APA）微囊，可以使细胞在微囊内存活时间更长。

附图说明：

图1为胰岛细胞微囊结构示意图，其中偶联的聚赖氨酸为超支化聚乙烯亚胺和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸对聚赖氨酸层进行了偶联加固。

图2为一种组织工程用胰岛细胞微囊的制备方法。

具体实施方式：

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步的详细说明。但本发明不受这些具体实施例的限制。

实施例1组织工程胰岛细胞微囊的制备

（1）SD大鼠胰岛细胞的分离纯化

胰岛消化分离：选取成年雄性SD 大鼠，放入盒中用乙醚麻醉，固定好大鼠并继续用乙醚吸入麻醉，常规消毒手术野，从大鼠生殖部位起在腹部“V”字形切口，充分暴露胆总管，在胆总管入十二指肠处用动脉夹夹住十二指肠两端，开胸破心处死大鼠。于胆总管左右肝管分叉处用24G 套管针插入胆总管，成功后将塑料针头向胆总管内滑行约2～4mm，用镊子固定针头，避免滑动，逆行胰管灌注胶原酶V 溶液8～10ml（浓度0.8 mg/ml，含Ca2＋ 7.5mmol/ml，HEPES 10 mmol/L，pH 7．8）。迅速将十二指肠部、胃壁及与脾相连的充盈的胰腺组织仔细分离后整块取下，放入预先加入5 ml 胶原酶V溶液（浓度同上）的50 ml 离心管中，38.0 ℃恒温水浴消化。约15 min 后，胰腺组织大部分成乳糜状，加入35 ml 冷的Hanks液终止消化，轻摇振荡后4 ℃ 1000 r/min 离心3 min，弃去上清液，加入25 ml 冷的Hanks液，振摇50 s，用玻璃吸管反复吹打沉淀，使其充分分散，过800 μm 的不锈钢筛网，用Hanks液冲洗筛网，滤液用4 ℃ 1000 r/min 离心3 min，弃去上清液后将沉淀转移至15 ml 离心管中，加Hanks 液至15 ml，混匀后4 ℃ 1000 r/min 离心5 min，倒干上清。

胰岛的纯化：将上述制备得到的胰腺组织沉淀中加入5 mL Ficoll-Paque PLUS溶液，吹打使其混匀，在其顶上小心加入Hanks 液5 ml，使溶液分为2 层，2000 r/min 离心15min，吸取Han-ks 和Ficoll 交界层液面的组织悬块，即为纯化的胰岛，用Hanks 液洗涤3次后，37 ℃，体积分数为5％CO2培养箱中培养或直接微囊化。

（2）胰岛细胞微囊的制备

将胰岛细胞置于质量百分比浓度为20g/L的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽修饰的海藻酸钠溶液混合，制成悬浮液，使每毫升悬浮液中含3×106个细胞；采用Inotech IE-50REncapsulator微囊仪器，用振动喷嘴法，通过调节喷嘴大小，控制流速、振动频率等工艺参数，将细胞悬液以400-700μm直径的微滴状态喷入浓度为100 mmol/L的氯化钙溶液中，其中细胞悬浮液与氯化钙溶液的体积比为1:100。反应8分钟，以形成海藻酸钙胶珠。待胶珠沉降后，吸出上部氯化钙溶液，然后用0.9%氯化钠注射液洗涤3次后，将胶珠投入浓度为0.5g/L的活性氨基溶液中（超支化聚乙烯亚胺：聚赖氨酸的质量比为10:90），二者的比例保证每升液体含0.8×108个细胞，混合均匀，放置15分钟，待沉淀完全后除去上清液，并用0.9%氯化钠注射液洗涤沉淀物3次；将获得的沉淀物加入到浓度为150g/L的聚乙二醇琥珀酰亚胺甲酸酯溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.8×108个细胞，混合均匀，放置10分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；将获得的沉淀物加入到一种浓度为60mmol/L的柠檬酸钠溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.8×108个细胞，混合均匀，放置10分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得胰岛细胞微囊沉淀物；将囊化沉淀物加入到一种浓度为0.9%的氯化钠溶液中清洗三次，得胰岛细胞微囊。

实施例2：将胰岛细胞置于质量百分比浓度为15g/L的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽修饰的海藻酸钠溶液混合，制成悬浮液，使每毫升悬浮液中含1×106个细胞；采用InotechIE-50R Encapsulator微囊仪器，用振动喷嘴法，通过调节喷嘴大小，控制流速、振动频率等工艺参数，将细胞悬液以150-400μm直径的微滴状态喷入浓度为80 mmol/L的氯化钙溶液中，其中细胞悬浮液与氯化钙溶液的体积比为1:100。反应5分钟，以形成海藻酸钙胶珠。待胶珠沉降后，吸出上部氯化钙溶液，然后用0.9%氯化钠注射液洗涤3次后，将胶珠投入浓度为0.3g/L的活性氨基溶液中（超支化聚乙烯亚胺：聚赖氨酸的质量比为10:90），二者的比例保证每升液体含0.5×108个细胞，混合均匀，放置5分钟，待沉淀完全后除去上清液，并用0.9%氯化钠注射液洗涤沉淀物3次；将获得的沉淀物加入到浓度为100g/L的聚乙二醇琥珀酰亚胺甲酸酯溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.5×108个细胞，混合均匀，放置3分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；将获得的沉淀物加入到一种浓度为45mmol/L的柠檬酸钠溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.5×108个细胞，混合均匀，放置5分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得胰岛细胞微囊沉淀物；将囊化沉淀物加入到一种浓度为0.9%的氯化钠溶液中清洗三次，得胰岛细胞微囊。

实施例3：将胰岛细胞置于质量百分比浓度为25g/L的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽修饰的海藻酸钠溶液混合，制成悬浮液，使每毫升悬浮液中含6×106个细胞；采用InotechIE-50R Encapsulator微囊仪器，用振动喷嘴法，通过调节喷嘴大小，控制流速、振动频率等工艺参数，将细胞悬液以700-1000μm直径的微滴状态喷入浓度为120mmol/L的乳酸钙溶液中，其中细胞悬浮液与氯化钙溶液的体积比为1:100。反应10分钟，以形成海藻酸钙胶珠。待胶珠沉降后，吸出上部氯化钙溶液，然后用0.9%氯化钠注射液洗涤3次后，将胶珠投入浓度为0.7g/L的活性氨基溶液中（超支化聚乙烯亚胺：聚赖氨酸的质量比为10:90），二者的比例保证每升液体含1×108个细胞，混合均匀，放置20分钟，待沉淀完全后除去上清液，并用0.9%氯化钠注射液洗涤沉淀物3次；将获得的沉淀物加入到浓度为100g/L的聚乙二醇琥珀酰亚胺甲酸酯溶液中，二者的比例为保证每升液体含1×108个细胞，混合均匀，放置15分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；将沉淀物加入到一种浓度为60mmol/L的柠檬酸钠溶液中，二者的比例为保证每升液体含1×108个细胞，混合均匀，放置20分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得胰岛细胞微囊沉淀物；将囊化沉淀物加入到一种浓度为0.9%的氯化钠溶液中清洗三次，得胰岛细胞微囊。

比较例1：将胰岛细胞置于质量百分比浓度为10g/L的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽修饰的海藻酸钠溶液混合，制成悬浮液，使每毫升悬浮液中含0.5×106个细胞；采用Inotech IE-50R Encapsulator微囊仪器，用振动喷嘴法，通过调节喷嘴大小，控制流速、振动频率等工艺参数，将细胞悬液以50-100μm直径的微滴状态喷入浓度为50 mmol/L的氯化钙溶液中，其中细胞悬浮液与氯化钙溶液的体积比为1:100。反应3分钟，以形成海藻酸钙胶珠。待胶珠沉降后，吸出上部氯化钙溶液，然后用0.9%氯化钠注射液洗涤3次后，将胶珠投入浓度为0.1g/L的活性氨基溶液中（超支化聚乙烯亚胺：聚赖氨酸的质量比为10:90），二者的比例保证每升液体含0.3×108个细胞，混合均匀，放置3分钟，待沉淀完全后除去上清液，并用0.9%氯化钠注射液洗涤沉淀物3次；将获得的沉淀物加入到浓度为50g/L的聚乙二醇琥珀酰亚胺甲酸酯溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.3×108个细胞，混合均匀，放置1分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；将获得的沉淀物加入到一种浓度为20mmol/L的柠檬酸钠溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.3×108个细胞，混合均匀，放置3分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得胰岛细胞微囊沉淀物；将囊化沉淀物加入到一种浓度为0.9%的氯化钠溶液中清洗三次，得胰岛细胞微囊。

小鼠糖尿病模型的建立与治疗

小鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射四氧嘧啶（120 mg/kg），间隙24 h 后，再次腹腔注射四氧嘧啶（80 mg/kg），模型稳定3 d 后，断尾取血检测禁食12h 的血糖浓度，以血糖浓度高于11.1 mmol/L 者定为糖尿病鼠。

在糖尿病鼠中移植实施例1中制得的组织工程胰岛细胞微囊通过腹腔镜植入腹腔，分泌胰岛素或胰高血糖素。该实验组称为胰岛微囊移植组，同时设定三个对照组，分别为空白微囊移植组、比较例1胰岛微囊移植组和0.9%氯化钠注射液移植组。四组实验于移植后1、2、4、7、10、15d测定受试小鼠的血糖水平。以血糖下降后连续2次血糖高于11.1mmol/L的，则将第一次的时间定为移植排斥反应开始。四组实验移植后的血糖变化详见表1。

由表1可知，空白微囊移植组和0.9%氯化钠注射液移植组小鼠高血糖状态无明显变化；采用比较例1胰岛微囊移植组小鼠正常血糖水平仅能维持2d左右，而胰岛微囊微囊移植组小鼠血糖水平一直到15天的时候仍然保持正常水平，而且胰岛微囊微囊移植组小鼠的糖尿病“三多一少”症状得以缓解，同时饮食、饮水、尿量均明显减少。移植移植15 d 后从小鼠血管内回收的微囊大部分仍呈表面光滑的球形，囊内胰岛细胞经；双硫腙染色呈桔红色，证明仍具有胰岛素分泌功能。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种组织工程用胰岛细胞微囊，其特征在于，该细胞微囊按下列步骤进行：

（1）将胰岛细胞与浓度为15-25g/L精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽修饰的海藻酸钠溶液混合，制成悬浮液，使每毫升悬浮液中含1-6×10⁶个细胞；

（2）利用喷雾装置将步骤（1）获得的悬浮液以150-1000μm直径的微滴状态分散于一种浓度为80-120mmol/L的氯化钙或乳酸钙溶液中，两种液体的比例为保证每升混合液含0.5-1×10⁸个细胞，放置5-10分钟，待沉淀完全除去上清液，获得胰岛细胞的海藻酸钙沉淀；

（3）将步骤（2）获得的沉淀物加入到一种浓度为0.3-0.7g/L的活性氨基溶液中，二者的比例保证每升液体含0.5-1×10⁸个细胞，混合均匀，放置5-20分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；

（4）将步骤（3）获得的沉淀物加入到浓度为100-300g/L的活性聚乙二醇溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.5-1×10⁸个细胞，混合均匀，放置3-15分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；

（5）将步骤（4）获得的沉淀物加入到一种浓度为45-75mmol/L的柠檬酸钠溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.5-1×10⁸个细胞，混合均匀，放置5-20分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得胰岛细胞微囊沉淀物；

（6）将步骤（5）获得的沉淀物加入到一种浓度为9g/L的氯化钠溶液中清洗，最后将沉淀物转移入细胞培养液中培养待用。

2.根据权利要求1所述的组织工程用胰岛细胞微囊的制备方法，其特征在于，所述胰岛细胞具有85%以上的纯度。

3.根据权利要求1所述的组织工程用胰岛细胞微囊的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽修饰的海藻酸钠中，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽与海藻酸钠的摩尔比为0.10-0.20:100。

4.根据权利要求1所述的组织工程用胰岛细胞微囊的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中将步骤（1）获得的细胞悬液以200-600μm直径的胶珠分散。

5.根据权利要求1所述的组织工程用胰岛细胞微囊的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述活性氨基溶液为含有超支化聚乙烯亚胺偶联的聚赖氨酸溶液，其中聚赖氨酸:超支化聚乙烯亚胺的质量比为90:10。

6.根据权利要求1所述的组织工程用胰岛细胞微囊的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述活性聚乙二醇为聚乙二醇琥珀酰亚胺甲酸酯、聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯、聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯、聚乙二醇琥珀酰亚胺丁酸酯、聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯、聚乙二醇琥珀酰亚胺己酸酯。

7.按照权利要求1-6任一所述制备方法获得的组织工程胰岛细胞微囊。

8.权利要求7所述的组织工程胰岛细胞微囊应用为：组织工程用胰岛细胞微囊通过腹腔镜植入腹腔，分泌胰岛素或胰高血糖素。