CN110249043A - 用于控制细胞行为的三维微环境结构、用于控制细胞行为的三维表面以及用于制造阵列和三维微环境结构的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用于控制细胞行为的三维微环境结构、用于控制细胞行为的三维表面、以及用于制造阵列和三维微环境结构的方法。

Description

用于控制细胞行为的三维微环境结构、用于控制细胞行为的 三维表面以及用于制造阵列和三维微环境结构的方法
技术领域
本公开涉及用于控制细胞，包括干细胞如多能干细胞的行为的三维微环境结构，用于控制细胞行为的表面和阵列，以及用于制造三维微环境结构的方法。
背景技术
通过生物化学线索(biochemical cue)和物理线索(physical cue)定义的细胞的微环境在广泛范围的细胞行为中是决定性的因素，细胞行为包括细胞粘附、生长、分化和细胞特异性功能的表达。众所周知，细胞通常与它们周围的微环境相互作用以存活和生物学上起作用或决定它们分化的方向。
组织中大多数细胞通过一系列复杂的细胞外基质蛋白在各方面被包围，所述细胞外基质蛋白在在指导细胞功能上至关重要。细胞通过特异性细胞表面受体如整联蛋白受体结合至细胞外基质，并且这个结合可起到直接影响细胞功能的生物化学线索的作用。此外，细胞外基质充当存在于组织中的生物化学刺激和机械刺激的调节因子。例如，细胞外基质蛋白可扣押(sequester)和释放生长因子，控制营养物供给的速度，以及控制细胞形状和将机械信号传递给细胞表面。细胞外基质的机械顺从性(mechanical compliance)在控制细胞功能中也是重要因素。因此，细胞生长、分化、迁移、细胞凋亡或进行其他特异性功能的最终命运可被认为是对与这些细胞外基质微环境效应子分子相互作用的协调响应。
已经进行了许多尝试以通过将细胞粘附配体并入到生物材料中形成三维微环境。已经开发了生物衍生材料或合成材料作为细胞外基质微环境以获得对材料的控制，并且因此获得对它们诱导的细胞行为的控制。在一个实例中，将具有RGD肽基序的基于可交联透明质酸、藻酸盐或聚乙二醇的水凝胶接枝到聚合物主链上。
与天然的细胞外基质蛋白相关的复杂性，包括复杂的结构组成、纯度、免疫原性和病原体传播，已促使用作二维或三维细胞外基质微环境模拟物的合成生物材料的开发，以模拟天然细胞外基质和细胞外基质结合的生长因子的调节特征。
细胞外基质和生长因子信号传导环境是调节细胞命运的重要机制。通过组合的信号传导途径进行这些微环境刺激。这些信号传导途径之间的相互作用对于决定细胞命运至关重要。例如，成纤维细胞增殖和分化为肌成纤维细胞以及增加的胶原合成在正常伤口修复中是关键事件，并且成纤维细胞增殖和分化受组合的信号传导途径的控制(非专利文献1)。然而，由于缺乏物理或生物化学线索，常规技术不能通过同时激活至少两种不同的细胞表面受体创造诱导组合的信号传导途径的微环境。本发明研究了一种能够精细控制细胞行为如细胞粘附、迁移、生长和分化的技术，从而完成了本公开。
公开的总结
本公开涉及能够精确地控制细胞行为如细胞粘附、迁移、生长和分化的三维微环境结构，用于控制细胞行为的表面和阵列，以及用于制造三维微环境结构的方法。
公开
技术问题
本公开的目的是提供一种能够精确地控制细胞行为如细胞粘附、迁移、生长和分化的三维微环境结构，用于控制细胞行为的表面和阵列，以及一种用于制备三维微环境结构的方法。
技术方案
本公开提供用于控制细胞行为的三维微环境结构，其包括：纳米纤维膜；和两种或更多种肽基序，包括P1(第一肽)基序和P2(第二肽)基序。
在本公开中，两种或更多种肽基序可结合至细胞上两种或更多种不同的受体，从而产生用于控制细胞行为的信号。
在本公开中，细胞行为可以是选自由细胞粘附、迁移、生长、增殖、形态发生、分化和细胞凋亡组成的组的一种或多种。
在本公开中，细胞行为可为细胞生长。
在本公开中，纳米纤维膜可包括PVDF、PAN、PES、PU和PLA中的一种或多种。
在本公开中，在肽基序中的P1(第一肽)基序可控制整联蛋白受体活性，并且P2(第二肽)基序可控制整联蛋白共同受体活性，从而产生用于控制细胞行为的信号。
在本公开中，共同受体可为FGF受体、Frizzled受体、TGF受体、EGF受体、LIF受体、BMP受体、钙黏着蛋白、多配体聚糖和白介素受体中的一种或多种。
在本公开中，P1(第一肽)基序可激活α3β1、α5β1、α6β1、α9β1、ανβ3、ανβ5整联蛋白受体和肝素受体中的一种或多种。
在本公开中，P1(第一肽)基序可激活α5β1整联蛋白受体。
在本公开中，P1(第一肽)基序可选自RGD、PHSRN-RGDSP、GRGDSP、KLDAPT、SPPRRARVT和KNNQKSEPLIGRKKT。
在本公开中，P1(第一肽)基序可为PHSRN-RGDSP。
在本公开中，P1(第一肽)基序可激活α6β1整联蛋白受体。
在本公开中，P1(第一肽)基序可衍生自层粘连蛋白α5的LG结构域。
在本公开中P1(第一肽)基序可选自GKNTGDHFVLYM、VVSLYNFEQTFML、RFDQELRLVSYN、RLVSYSGVLFFLK、ASKAIQVFLLGG、VLVRVERATVFS、TVFSVDQDNMLE、RLRGPQRVFDLH、FDLHQNMGSVN、QQNLGSVNVSTG和SRATAQKVSRRS。
在本公开中，P1(第一肽)基序可为VVSLYNFEQTFML。
在本公开中，P1(第一肽)基序可激活每种整联蛋白α5β1和整联蛋白α6β1。
在本公开中，P1(第一肽)基序可为作为整联蛋白α5β1活化基序的PHSRN-RGDSP或作为整联蛋白α5β1活化基序的VVSLYNFEQTFML。
在本公开中，共同受体可包括Frizzled受体、LIF受体、FGF受体和TGF受体。
在本公开中，共同受体可为选自Frizzled受体、LIF受体、FGF受体和TGF受体中的三种共同受体。
在本公开中，共同受体可为选自Frizzled受体、LIF受体、FGF受体和TGF受体中的两种共同受体。
在本公开中，共同受体可为Frizzled受体和TGF受体。
在本公开中，共同受体可为Frizzled受体。
在本公开中，在肽基序中的P1(第一肽)基序可控制TGF受体活性，并且P1(第一肽)基序可控制TGF共同受体活性。
在本公开中，共同受体可为Frizzled受体、FGF受体、EGF受体、钙黏着蛋白、多配体聚糖和白介素受体中的一种或多种。
在本公开中，共同受体可为FGF受体和Frizzled受体。
在本公开中，激活Frizzled受体的基序可以是选自LCCGRGHRTRTQRVTERCNC和LGTQGRLCNKTSEGMDGCEL中的一种或多种。
在本公开中，激活TGF受体的基序可选自MHRMPSFLPTTL或LTGKNFPMFHRNL。
在本公开中，激活FGF受体的基序可选自FLPMSAKS、HFKDPKRLYCK、ANRYLAMKEDGRLLAS、KTGPGQKA或WYVALKRTGQYKLG。
在本公开中，P2(第二肽)基序可为激活LIF受体的基序，并且可选自IVPLLLLVLH和YTAQGEPFPNNVEKLCAP。
在本公开中，肽基序可在0.001mg/ml至10mg/ml的浓度被引入。
在本公开中，肽基序可为连接至粘附蛋白的那些肽基序。
在本公开中，粘附蛋白可为贻贝粘蛋白。
本公开提供一种用于控制细胞行为的表面，表面包括结合至细胞受体的两种或更多种肽基序，其包括P1(第一肽)基序和P2(第二肽)基序，其中肽基序结合至细胞上两种或更多种不同的受体，从而产生用于控制细胞行为的信号。
表面可为多孔表面、非多孔表面或其组合。
表面可为纳米纤维、水凝胶和颗粒中的一种或多种的表面。
在本公开中，细胞行为可以是选自由细胞粘附、迁移、生长、增殖、形态发生、分化和细胞凋亡组成的组中的一种或多种。
在本公开中，两种或更多种不同的受体可为整联蛋白受体和整联蛋白共同受体。
在本公开中，共同受体可以是选自FGF受体、Frizzled受体、TGF受体、EGF受体、LIF受体、BMP受体、钙黏着蛋白、多配体聚糖和白介素受体中的一种或多种。
在本公开中，共同受体可为FGF受体、Frizzled受体、TGF受体、EGF受体、LIF受体、BMP受体、钙黏着蛋白、多配体聚糖和白介素受体中的一种或多种。
在本公开中，共同受体可以是选自FGF受体、BMP受体、EGF受体和Frizzled受体中的一种或多种。
在本公开中，共同受体可为Frizzled受体。
在本公开中，共同受体可为FGF受体。
在本公开中，两种或更多种不同的受体可为整联蛋白-Frizzled受体、整联蛋白-LIF受体、整联蛋白-BMP受体、整联蛋白-FGF受体和整联蛋白-EGF受体中的任何一种。
在本公开中，两个或更多个肽基序可为整联蛋白-结合基序和整联蛋白共同受体-结合基序。
在本公开中，整联蛋白-结合基序可结合至a3b1、a5b1、a6b1、a9b1和avb3整联蛋白中的一种或多种。
在本公开中，整联蛋白共同受体-结合基序可为结合至整联蛋白-Frizzled受体、整联蛋白-LIF受体、整联蛋白-BMP受体、整联蛋白-FGF受体和整联蛋白-EGF受体中的一种或多种的基序。
在本公开中，两种或更多种肽基序可为PHSRN-RGDSP。
本公开提供一种用于控制细胞行为的阵列，阵列包括选自权利要求1的结构和权利要求32的表面中的两种或更多种。
本公开提供一种制造用于控制细胞行为的三维微环境结构的方法，方法包括步骤：1)制备包含选自PVDF、PAN、PES和PLA中的一种或多种聚合物材料的组合物；2)制备包含肽基序的组合物；和3)混合1)的组合物和2)的组合物，然后静电纺丝。
本公开提供一种制造用于控制细胞行为的三维微环境结构的方法，方法包括步骤：1)静电纺丝包含选自PVDF、PAN、PES和PLA中的一种或多种聚合物材料的组合物，从而制造三维结构；和2)用包含肽基序的组合物涂覆三维结构。
有益效果
本文公开的三维微环境结构、表面、阵列和三维微环境结构制造方法具有精确地控制细胞行为如细胞粘附、迁移、生长和分化的效果。
附图说明
图1示出为了确认用作细胞外基质模拟物的肽基序位于纳米纤维表面上进行的银染色的结果。
图2A描述了具有纤维直径分别为200nm、500nm和800nm的纳米纤维的照片，并且图2B描述了具有纤维直径分别为600nm和1000nm的纳米纤维的照片。
图3示出表明当细胞外基质模拟物被引入至纳米纤维表面时，可获得具有颗粒尺寸为500nm至5μm的颗粒的结果。
图4为本公开的阵列布局的实例。
图5示意性地表示具有位于其表面上的肽基序的膜。
图6A是本公开的结构的实例。
图6B示出为了确认肽基序存在于纳米纤维膜表面进行的荧光染色的结果。
图6C示出蛋白质掺混和纺丝以及基序对细胞(mESCs)粘附的影响。
图7示出根据本公开用于涂覆和评估20种肽的阵列。
图8至图10示出表明衍生自纤连蛋白(如PHSRN-RGDSP)、层粘连蛋白(如RNIAEIKDI)或钙黏着蛋白(如ADTPPV)的肽对干细胞粘附和菌落形成是有效的结果。
图11示出为了检测每种基序对胚胎干细胞自我更新和菌落大小的影响进行的AP染色的结果。
图12示出用于蛋白涂覆的涂覆方法(2D板涂)的效果。
图13和图14示出为了检测同时控制两种关键受体的活性对胚胎的干细胞自我更新和菌落大小的影响进行的AP染色的结果。
图15示出二维检测hiPSCs中蛋白质基序的影响的结果。
图16示出二维检测hiPSCs中蛋白质基序的影响的结果。
图17示出AP染色的结果。
图18示出检测mESCs中PHSRN-RGDSP基序的密度的影响的结果。
图19示出蛋白涂覆浓度对hiPSC培养(2D平板)的影响。
图20示出控制PVDF膜的厚度的结果。
图21示出仅包括个体基序的微环境阵列。
图22是示出每种肽基序对细胞的迁移的影响的图。
图23示出划痕试验的代表性结果。
图24示出本公开的实施例12中进行的实验的结果。
【图1】
具体实施方式
本公开涉及能够精确地控制细胞行为如细胞粘附、迁移、生长和分化的三维微环境结构，用于控制细胞行为的表面和阵列，以及用于制造三维微环境结构的方法。
本公开中的“三维结构”意味着包括用于细胞粘附、迁移、生长和分化目的的任何三维结构。此外，本公开中的“微环境”为用于实现细胞外天然的细胞外基质的任何生物、化学和物理的元素。
根据本公开用于控制细胞行为的三维微环境结构包括纳米纤维膜和肽基序。
本公开提供用于控制细胞行为的三维微环境结构，其包括：纳米纤维膜；和两种或更多种肽基序，包括P1(第一肽)基序和P2(第二肽)基序。
在本公开中，细胞行为可以是选自由细胞粘附、迁移、生长和分化组成的组中的一种或多种。特别地，优选为细胞生长。
本公开的纳米纤维膜可包括纳米纤维，所述纳米纤维包含聚合物材料或由聚合物材料制备。聚合物材料可以为可被静电纺丝的聚合物，并且其实例包括，但不限于，聚乙二烯(PVDF)、聚丙烯腈(PAN)、聚醚砜(PES)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚丙交酯乙醇酸(polylactide glycolic acid)(PLGA)、聚己酸内酯、聚环氧烷等。特别地，本公开的纳米纤维膜优选地包括PVDF、PAN、PES和PLA中的一种或多种。
本公开的聚合物材料可选自具有分子量在至少100,000道尔顿(Da)至数百万道尔顿(Da)的范围中的那些聚合物材料，并且优选地具有分子量为300,000Da
至500,000Da。
本公开的肽基序可结合至细胞上的受体，从而产生控制细胞行为的信号。优选地，可同时包括两种或更多种肽基序，并且因此可结合至细胞上的两种或更多种不同的受体，从而产生用于控制细胞行为的信号。
在本公开中，肽基序中的P1(第一肽)基序可控制整联蛋白受体活性，并且P2(第二肽)基序可控制整联蛋白共同受体活性，从而产生用于控制细胞行为的信号。
本公开的肽基序优选地包括整联蛋白-结合基序和整联蛋白共同受体-结合基序。整联蛋白-结合基序可以为结合至选自a3b1、a5b1、a6b1、a9b1和avb3整联蛋白中的一种或多种整联蛋白的基序，并且整联蛋白共同受体-结合基序可以为结合至选自整联蛋白-Frizzled受体、整联蛋白-LIF受体、整联蛋白-BMP受体、整联蛋白-FGF受体和整联蛋白-EGF受体中的一种或多种受体的基序。
具体地，本公开的肽基序可控制整联蛋白-Frizzled受体、整联蛋白-LIF受体、整联蛋白-BMP受体、整联蛋白-FGF受体和整联蛋白-EGF受体中的一种或多种的活性。
特别地，在本公开中，使用两种不同的受体进行的人类诱导的多能干细胞的培养的实验，揭示自我更新和生长/增殖的效果按细胞受体整联蛋白-Frizzed受体>整联蛋白-LIF受体>整联蛋白-FGF受体的顺序更好，并且使用四种不同的受体进行的人类诱导的多能干细胞的培养的实验以检测组合对细胞受体活化的影响，揭示包括Frizzled或TGFβ受体的四种类型的组合具有维持菌落大小、自我更新能力和分化能力的优异效果。
本公开的肽基序优选地包括RGD、PHSRN-RGDSP、SPPRRARVT、TWYKIAF、RKRLQVQLSIRT、NRWHSIYITRFG、GIIFFL、RYVVLPR、RNIAEIKDI、WQPPRARI、KNNQKSEPLLIGRKKT、KKQRFRHRNRKGYRSG、LCCGRGHRTRTQRVTERCNC、LGTQGRLCNKTSEGMDGCEL、IVPLLLLVLH、YTAQGEPFPNNVEKLCAP、LFSHAVSSNG、ADTPPV、DQNDN和LRAHAVDING中的一种或多种，并且基本上优选地包括PHSRN-RGDSP。
肽基序优选地被引入至三维微环境结构或其表面，其中浓度为0.001mg/ml至10mg/ml，最优选地0.01mg/ml至1mg/ml。
更优选地，本公开的肽基序可以为连接至贻贝粘蛋白的那些肽基序。贻贝粘蛋白可以是商业上可得的材料或可被合成的或从自然来源获得。商业上可得的贻贝粘蛋白的实例包括，但不限于，由Kollodis BioSciences,Inc.(North Augusta，South Carolina，USA)销售的MAPTrixTM ECM。MAPTrixTM ECM为Kollodis BioSciences,Inc开发的基于贻贝粘蛋白的细胞外基质模拟物材料。这种材料是与各种细胞外基质衍生的肽功能化重组以模拟天然存在的细胞外基质的生物活性的贻贝粘蛋白，并且实验上证明与天然的或重组的细胞外基质蛋白相比，该材料具有与原代细胞培养中的天然细胞外基质蛋白相似的生物活性。预先设计的细胞外基质模拟物MAPTrixTM ECM非常有利于产生合成的三维细胞外基质微环境结构。例如，其可提供合成的三维微环境结构，其细胞特异性地被调节或根据用户的定义被调节，并且因此它可以精确地模拟天然微环境，从而由此提供的生化线索类似于由自然的微环境提供的生物线索。
MAPTrixTM ECM为与生物活性肽功能化重组的贻贝粘蛋白。在本公开中，贻贝粘蛋白可单独使用或作为融合蛋白，其包括：第一肽，其对应于由SEQ ID NOs:8至SEQ ID NOs:10中的任一代表的足蛋白FP-5或由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6代表的足蛋白3(FP-3)的C-末端、N-末端或二者；和至少一种第二肽，其选自由贻贝粘蛋白FP-1(SEQ ID NO:1、2或3)或每种蛋白的片段组成的组。
在本公开中，生物活性肽对于模拟天然的细胞外基质的微环境结构是必需的。此外，还可包括另外的组分如生长因子，例如成纤维细胞生长因子(FGF)或P物质，以进一步提高细胞外基质模拟物材料对细胞和组织培养物、医疗器械和治疗或其他相关应用的有益效果。
通过基因重组技术，可将生物活性肽添加至贻贝粘蛋白的C-末端、N-末端或二者。此外，可将这些生物活性肽不仅添加至融合的贻贝粘蛋白的C-末端或N-末端，还添加在融合蛋白的组分之间。例如，细胞外基质-或生长因子-衍生的肽可被添加在融合蛋白FP-151的FP-1和FP-5之间。此外，生物活性肽可为存在于融合蛋白的两端或融合蛋白的组分之间的不同的细胞外基质-或生长因子-衍生的肽。
生物活性肽为衍生自细胞外基质蛋白的天然的或合成的肽，并且模拟天然的细胞外基质的生物化学线索或生物物理线索。细胞外基质蛋白可为纤维蛋白，如胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白或玻连蛋白。细胞外基质蛋白可影响细胞表面受体如可又结合至多价细胞外基质蛋白的整联蛋白的活性，并且然后通过与粘着斑复合物中的激酶和接头蛋白共聚激活信号传导途径。例如，衍生自纤连蛋白、层粘连蛋白或玻连蛋白的包含RGD的肽片段可调节整联蛋白活性。
本公开提供用于控制细胞行为的表面，其在微环境方面定义为3D表面、微环境表面或三维微环境表面。本公开的表面是用于控制细胞行为的表面，其包括两种或更多种肽基序，包括P1(第一肽)基序和P2(第二肽)基序，其结合至细胞受体，其中肽基序可结合至细胞上两种或更多种不同的受体，从而产生用于控制细胞行为的的信号。
本公开的表面可意指细胞培养结构本身，如纳米纤维、水凝胶、颗粒、纤维素或玻璃纤维，或可为其表面。特别地，表面可以是包括包含聚乙二烯(PVDF)的各种材料的图案或多孔纳米纤维本身，或可为其表面。
本公开的表面可以是用于控制细胞行为的表面，其包括结合至细胞受体的两种或更多种肽基序，其中肽基序可结合至细胞上两种或更多种不同的受体，从而产生用于控制细胞行为的信号。
在本公开中，细胞行为可为选自由细胞粘附、迁移、生长和分化组成的组中的一种或多种，并且两种或更多种不同的受体可以为整联蛋白受体和整联蛋白共同受体。此外，两种或更多种不同的受体可以为整联蛋白-Frizzled受体、整联蛋白-LIF受体、整联蛋白-BMP受体、整联蛋白-FGF受体和整联蛋白-EGF受体中的任何一种。
同时，以上描述的关于用于控制细胞行为的三维微环境结构的内容同样地适用于包括本公开的表面中的肽基序和/或受体的所有情况。
本公开的一个实例中，表面包括包含衍生自纤连蛋白结构域III的肝素-结合基序或α5β1整联蛋白-活化基序的基质蛋白。肝素-结合基序或α5β1整联蛋白-活化基序优选地选自RGD(SEQ ID NO:15)、GRGDSP(SEQ ID NO:16)、PHSRN-RGDSP(SEQ ID NO:17)、SPPRRARVT(SEQ ID NO:18)、WQPPRARI(SEQ ID NO:19)、KNNQKSEPLIGRKKT(SEQ ID NO:20)或激活基序的α5β1整联蛋白和基序-结合的肝素的组合。
在另一实例中，本公开的表面包括包含衍生自层粘连蛋白α5LG结构域或层粘连蛋白α1的α6β1整联蛋白-活化基序的基质蛋白，其支持干细胞自我更新和多能性。α6β1整联蛋白-活化基序优选地选自GKNTGDHFVLYM(SEQ ID NO:22)、VVSLYNFEQTFML(SEQ ID NO:23)、RFDQELRLVSYN(SEQ ID NO:24)、RLVSYSGVLFFLK(SEQ ID NO:25)、ASKAIQVFLLGG(SEQ IDNO:26)、VLVRVERATVFS(SEQ ID NO:27)、TVFSVDQDNMLE(SEQ ID NO:28)、RLRGPQRVFDLH(SEQID NO:29)、FDLHQNMGSVN(SEQ ID NO:30)、QQNLGSVNVSTG(SEQ ID NO:31)、SRATAQKVSRRS(SEQ ID NO:32)、TWYKIAFQRNRK(SEQ ID NO:45)和NRWHSIYITRFG(SEQ ID NO:46)。
在另一实例中，本公开的表面包括包含α6β1-结合基序和α5β1整联蛋白-活化基序的组合基序的基质蛋白，以支持干细胞的多能性和自我更新。组合基序优选地为PHSRN-RGDSP(SEQ ID NO:17)和NRWHSIYITRFG(SEQ ID NO:46)的组合，其支持干细胞的多能性和自我更新。
本公开提供FGF模拟物，其包括用衍生自canofin结构域或hexafin结构域的FGF-衍生肽基序功能化的重组的贻贝粘蛋白。FGF模拟物肽基序优选地选自衍生自HFKDPKRLYCK(SEQ ID NO:34)、FLPMSAKS(SEQ ID NO:35)或KTGPGQKAIL(SEQ ID NO:36)的canofin结构域，或衍生自ANRYLAMKEDGRLLAS(SEQ ID NO:33)的hexafin结构域。
本公开提供用于控制细胞行为的阵列，其包括选自三维微环境结构和表面中的两种或更多种。
根据本公开的用于控制细胞行为的阵列的一种实施方式在实施例4和图7中示出。
以上描述的关于用于控制细胞行为的三维微环境结构和/或表面的内容同样地适用于包括本公开的阵列中的肽基序和/或受体的所有情况。
本公开提供用于制造用于控制细胞行为的三维微环境结构的方法。具体地，该方法可包括步骤：1)制备包含选自PVDF、PAN、PES和PLA中的一种或多种聚合物材料的组合物；2)制备包含肽基序的组合物；和3)混合1)的组合物和2)的组合物，然后静电纺丝。
此外，根据本公开用于制造用于控制细胞行为的三维微环境结构的方法可包括步骤：1)静电纺丝包含选自PVDF、PAN、PES和PLA中的一种或多种聚合物材料的组合物，从而制造三维结构；和2)用包含肽基序的组合物涂覆三维结构。
以上描述的关于用于控制细胞行为的三维微环境结构和/或表面和/或阵列的内容同样地适用于包括根据本公开用于制造用于控制细胞行为的三维微环境结构的方法中的肽基序和/或受体的所有情况。
在下文中，本公开将参考实施例更具体地描述。然而，这些实施例仅为本公开的阐述，另外并不限制本公开的范围。
实施例1：通过静电纺丝将肽基序引入至纳米纤维表面
实验方法
1)制备静电纺丝溶液：四种合成聚合物：PVDF(平均分子量：200kDa；购自SigmaAldrich(St.Louis，USA))、PAN(平均分子量：200kDa)、PES和PLA(平均分子量：200kDa；购自Sigma Aldrich(St.Louis，USA))中的每种被制备为在溶剂DMAc中浓度为12重量％至18重量％。
接下来，将细胞外基质模拟物MAPTrixTM(购自Kollodis Biosciences(NorthAugusta，SC，USA))溶于水/DMAc的混合溶剂中，然后将1)的合成聚合物溶液添加至其中，从而制备具有浓度为15重量％至18重量％的静电纺丝溶液。
此时，DMAc和THF被用作溶剂，并且控制溶剂的混合比例以调节纤维直径。
例如，为了制备具有纤维直径为200nm的纤维，纺丝溶液的浓度设定为15重量％并且溶剂(DMAc/THF)的混合比例设定为7/3。在这种状态下，进行静电纺丝。
为了制备具有纤维直径为5,600nm的纤维，纺丝溶液的浓度设定为18重量％并且溶剂(DMAc/THF)的混合比例定为7/3。在这种状态下，进行静电纺丝。
此外，为了制备具有纤维直径为800nm至1000nm的纤维，纺丝溶液的浓度设定为18重量％并且溶剂(DMAc/THF)的混合比例设定为5/5。在这种状态下，进行静电纺丝。
作为静电纺丝条件，使用21kV的电压和0.1mL/min的注射速度，其对所有纺丝溶液是不变的，但是喷嘴和收集器(collector)之间的距离被调节至10cm至11cm，以便从每种溶液中容易地形成纳米纤维。在室(chamber)内的温度和湿度保持在恒定的温度和湿度(30℃和60％)的同时，进行静电纺丝。为了控制纤维直径，根据可纺性(spinnability)和纤维直径分布调节温度和湿度。
每次静电纺丝的组成和静电纺丝条件在以下表1和表2中示出。
表1.静电纺丝溶液的组成(结构成分)
聚合物 溶液 MAPTr ix<sup>TM</sup> 溶液(1mL)
100mg PVDF 5mL DMAc 7mg DW/DMAc(0.1/0.9)
100mg PES 5mL DMAc 7mg DW/DMAc(0.1/0.9)
100mg PAN 5mL DMAc 7mg DW/DMAc(0.1/0.9)
100mg PLGA 5mL DMAc 7mg DW/DMAc(0.1/0.9)
50mg PVDF/50mg PAN 5mL DMAc 7mg DW/DMAc(0.1/0.9)
50mg PVDF/50mg PES 5mL DMAc 7mg DW/DMAc(0.1/0.9)
表2.静电纺丝的参数
E-溶液 浓度 电压(kV) 速度(mL/min) 距离(cm)
PVDF 18％ 21 0.1 11
PES 18％ 21 0.1 10
PAN 18％ 21 0.1 10
PLGA 18％ 21 0.1 11
PVDF/PAN 18％ 21 0.1 10
PVDF/PES 18％ 21 0.1 10
E-溶液是根据以上所述的方法制备的静电纺丝的生物功能性组分。
实验结果
通过电子显微镜确认形成纳米纤维膜，其中起细胞外基质模拟物作用的肽基序位于纳米纤维表面上。此外，通过染色测试确认肽基序存在于纳米纤维表面上。也就是说，纯的PVDF(PVDF对照)未被染色，并且因此没有变色，因为蛋白的胺基(-NH2)未存在其上；然而，由于NH2基团的存在，添加其中的具有每种蛋白(MAP、Combo或RGD)的纳米纤维表面可被染色。
实验结果在图1中示出。图1示出为了确认起细胞外基质模拟物作用的肽基序位于纳米纤维表面上进行的银染色的结果。
根据常规技术将肽基序引入至纳米纤维表面的功能化需要额外的工艺，如化学固定肽基序以将肽基序引入至纳米纤维表面上的表面处理工艺，但本公开基于热力学原理，并且不需要添加或补充常规的静电纺丝工艺，这表明本发明具有经济和简单的优势。
实施例2：具有受控的纤维直径的纳米纤维膜
实验方法
1)为了控制纳米纤维直径，选择PVDF作为代表，并且使用与PVDF共混的PVDF共聚物来制备混合物。作为PVDF共聚物，使用具有分子量为400,000、600,000和650,000的PVDF共聚物以制备具有各种纤维直径的纳米纤维膜。
2)在PVDF和PVDF共聚物的混合比例从1:1变化至1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8和1:9的同时，观察PVDF共聚物的分子量和混合比例对直径的控制的影响。
静电纺丝工艺和条件与如实施例1中所述的一样。
实验结果
实验结果在图2中示出。图2A描述了具有纤维直径分别为200nm、500nm和800nm的纳米纤维的照片，并且图2B描述了具有纤维直径分别为600nm和1000nm的纳米纤维的照片。
实验结果显示优化PVDF和PVDF共聚物的混合比例和PVDF的分子量，使得可能制备具有纤维直径分别为200nm、500nm和800nm的纳米纤维膜。
纳米纤维的直径是影响细胞粘附和生长的一个重要因素。在本公开中，实现具有改变的纳米纤维直径的膜基材，同时通过细胞外基质形成的生物化学环境保持恒定。在根据常规技术的化学固定方法中，由于肽基序和纳米纤维表面之间的化学反应是随机反应，因此不总是实现恒定的密度或取向，但是，在本公开中，可制造具有精确地控制的纳米纤维直径的膜，同时总是保持恒定的密度或取向。
实施例3：包含颗粒的纳米纤维的制造
实验方法
1)为了将包括细胞外基质模拟物的颗粒引入至纳米纤维的表面，将碳酸氢钠溶于1mL的水中以获得10mM缓冲溶液(pH 6.5)，并且将10mg的EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)和5mg的S-NHS溶于缓冲溶液中，从而制备水溶液。
2)接下来，将0.1mg的具有纤连蛋白模拟物PHSRN-RGDSP肽基序的贻贝蛋白溶于1mL的水中，从而制备反应溶液。
3)将EDC/S-NHS溶液添加至纳米纤维膜-涂覆的微孔板中并且培养30分钟以便存在纳米纤维膜上的MAPTrix的-COOH基团被激活。
此后，将2)的反应溶液添加至纳米纤维表面以便其与纳米纤维表面上的-COOH基团反应形成颗粒。
实验结果
实验结果在图3中示出。图3示出表明当细胞外基质模拟物被引入至纳米纤维表面时，可获得具有颗粒尺寸为500nm至5μm的颗粒的结果。
纳米纤维的表面形貌是构成细胞的微环境的重要因素之一，并且已确认肽基序存在于颗粒表面，使得其可通过表面形貌和肽基序的组合制造能够更精确地控制细胞行为的膜。
实施例4：微环境阵列的制备
实施例4-1：肽基序与纳米纤维膜表面的连接
实验方法
1)根据实施例1制备纳米纤维膜，其具有存在于其表面上的12种纤连蛋白-衍生的肽基序中的每一种(参见图4中示出的布局)。
2)接下来，将包括每种肽基序的膜涂覆在12孔板上，并且图4示出阵列布局。
3)此时，10种肽基序的序列，包括SEQ ID NO：15至SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：43的序列，在说明书中作为代表描述。
实验结果
图5描述了具有纤维直径分别为200nm、500nm和800nm的膜的电子显微照片。图5示意地呈现具有位于其表面上的肽基序的膜，以及图6B示出为了确认肽基序存在于纳米纤维膜表面上进行的荧光染色的结果。
从实验结果可以确认肽基序存在于纳米纤维表面上并且可制造具有纤维直径为200nm、500nm和800nm的膜，使得可制造能够精确地控制细胞微环境的细胞培养表面。
此外，图6C示出蛋白质掺混和纺丝以及基序对细胞(mESCs)粘附的影响，并且本文使用的术语如以下指示：
-PVDF：通过仅纺丝PVDF获得的样品；
-PVDF-MAP：通过在PVDF的纺丝期间，将MAP(贻贝粘蛋白)掺混并纺丝获得的样品；
-PVDF-Combo：通过在PVDF的纺丝期间，将Combo(MAP-联合体(纤连蛋白基序：PHSRN+GRGDSP))掺混并纺丝获得的样品。
从实验结果可以确认当仅纺丝PVDF时，mESCs几乎不粘附，但是当将蛋白与PVDF一起掺混并纺丝时，大量细胞粘附，并且当使用基序(Combo)时，大量细胞粘附。此外，细胞的粘附以PVDF<PVDF-MAP<PVDF-Combo的顺序更高。此外，蛋白的掺混和纺丝是有效的并且使得基序有效。
实施例4-2：选择有效用于干细胞粘附和菌落形成的肽基序
实验方法
1)将根据实施例1通过掺混并纺丝Combo制造的600nm纳米纤维膜涂覆在20种肽中的每一种上，所述肽包括纤连蛋白、层粘连蛋白、WNT、LIF和钙黏着蛋白-类似的肽，从而制备阵列(图7示出根据本公开用于涂覆和评估20种类型的肽的阵列)。
2)为了单独或组合地使用肽实现各种微环境，使用包括整联蛋白-结合基序如RGD(SEQ ID NO:15)、GRGDSP(SEQ ID NO:16)、PHSRN-RGDSP(SEQ ID NO:17)或KLDAPT(SEQ IDNO:43)，其结合至整联蛋白、LIF受体或Frizzled受体；和肝素-结合基序如SPPRRARVT(SEQID NO:18)、WQPPRARI(SEQ ID NO:19)、KNNQKSEPLIGRKKT(SEQ ID NO:20)、ATETTITIS或YEKPGSPPREVVPRPRPGV的MAPTrixTM，以在每个孔中创造细胞外微环境表面。
20种肽基序的序列包括RGD、PHSRN-RGDSP、SPPRRARVT、TWYKIAF、RKRLQVQLSIRT、NRWHSIYITRFG、GIIFFL、RYVVLPR、RNIAEIKDI、WQPPRARI、KNNQKSEPLLIGRKKT、KKQRFRHRNRKGYRSG、LCCGRGHRTRTQRVTERCNC、LGTQGRLCNKTSEGMDGCEL、IVPLLLLVLH、YTAQGEPFPNNVEKLCAP、LFSHAVSSNG、ADTPPV、DQNDN、LRAHAVDING等。
实验结果
实验结果在图8至图10中示出。
图8至图10示出表明衍生自纤连蛋白(如PHSRN-RGDSP)、层粘连蛋白(如RNIAEIKDI)或钙黏着蛋白(如ADTPPV)的肽对干细胞粘附和菌落形成是有效的结果。
如图所示，可以证实衍生自纤连蛋白(如PHSRN-RGDSP)、层粘连蛋白(如RNIAEIKDI)或钙黏着蛋白(如ADTPPV)的肽对干细胞粘附和菌落形成是有效的。然而，PHSRN-RGDSP引起与Matrigel的水平相当的细胞粘附和菌落大小，因此在随后的实验中使用PHSRN-RGDSP。
实施例5：肽基序对干细胞培养的影响
实验方法
1)为了研究通过使用实施例4中制备的阵列显示出优异的胚胎干细胞自我更新和生长的微环境，进行细胞培养实验。
2)将含有血清替代媒介和LIF的细胞培养基分配到每个孔中，然后在其中培养小鼠来源的胚胎干细胞96小时，之后通过AP染色检测每种微环境对胚胎干细胞自我更新和菌落大小的影响。
为了验证肽基序的作用，在对比实验中使用不具有肽基序的纳米纤维和PDL-涂覆的表面作为对照。
实验结果
实验结果在图11和图12中示出。
图11示出为了检测每种基序对胚胎干细胞自我更新和菌落大小的影响进行的AP染色的结果。
通过AP染色检测每种基序对胚胎干细胞自我更新和菌落大小的影响，并且如图11中示出，结果证实包括PHSRN-RGDSP基序的纳米纤维表现出优异的自我更新效果和最大的菌落尺寸。
图12示出用于蛋白涂覆的涂覆方法(二维板涂)的效果，并且实验结果如下。
涂覆的蛋白：0.5mg/ml Combo
(A)：蛋白溶液被立即添加并涂覆在NHS/EDC溶液上
(R)：在除去NHS/EDC溶液后，蛋白溶液被涂覆。
因此，在(A)中，观察到蛋白为颗粒，但在(R)中，没有观察到颗粒。此外，在(A)中，在mESCs培养期间保持具有良好维持的干性的菌落形状，但在(R)中，存在许多没有维持的干性的分化的细胞。这表明蛋白涂覆的形状根据涂覆方法而变化，并且颗粒的形成对mESCs的培养具有更好的作用。
这个实验揭示优化纳米纤维表面上肽基序类型和细胞培养表面的形貌可以大大地改善干细胞的自我更新和菌落大小。
实施例6：细胞受体激活基序的组合对人类诱导多能干细胞培养的影响(1)
实验方法
根据实施例1和实施例2，制造具有受控纳米纤维直径为200nm的膜。此时，制备的纳米膜表面具有能够同时控制三种受体(整联蛋白-FGF受体、整联蛋白-Frizzled受体和整联蛋白-LIF受体)的活性的肽基序，以证实在决定干细胞行为的七种关键受体中被证实对实施例5中的干细胞培养具有影响的基序中，能够同时控制不同受体的肽的组合的协同效应。
制备具有三种微环境的膜并且将其涂覆在6孔板上。以与实施例5中所述相同的方式进行人类诱导的多能干细胞的培养，并且检测每种微环境对干细胞行为的影响。
实验结果
实验结果在图13和图14中示出。图13和图14示出为了检测同时控制两种关键受体的活性对胚胎的干细胞自我更新和菌落大小的影响进行的AP染色的结果。
具体地，图13示出了通过在平板上涂覆PHSRN-RGDSP和每种FGF蛋白并检测涂覆的蛋白是否可同时控制整联蛋白-FGF受体并检测蛋白涂覆浓度的影响而获得的结果。
从实验结果可以证实单独用PHSRN-RGDSP涂覆的平板和用PHSRN-RGDSP和每种FGF蛋白的组合涂覆的平板之间的细胞形状和菌落大小是不同的。可以看出，当用FGF3蛋白涂覆平板时，与用FGF1或FGF4涂覆的平板相比，干细胞的形状更好并且菌落尺寸增加。此外，可以看出，随着涂覆蛋白的量的增加，菌落尺寸变小，但干细胞的形状变得更好。这表明用PHSRN-RGDSP和FGF3蛋白的组合的涂覆比单独用PHSRN-RGDSP的涂覆对人类诱导的多能干细胞的培养具有更好的效果。
此外，如图14A至图14C中示出，可以证实当整联蛋白受体和FGF受体同时被控制时，比当整联蛋白受体单独被控制可获得更好的自我更新结果，并且细胞形状和菌落大小也接近阳性对照Matrigel的那些。
细胞形状和菌落大小的比较表明整联蛋白-Frizzed受体和整联蛋白-LIF受体的控制具有比整联蛋白-FGF受体的控制更好的效果。干细胞形状和菌落大小的比较表明自我更新和生长/增殖效果按整联蛋白-Frizzed受体>整联蛋白-LIF受体>整联蛋白-FGF受体的顺序更好。
特别地，整联蛋白-Frizzed受体的组合在维持干细胞分化潜能方面高于Matrigel水平并且表现出与iMatrix类似的效果。
从实验结果可以证实在这个实施例中决定干细胞行为的七种受体对干细胞分化潜能的维持和干细胞的自我更新具有不同程度的贡献，并且当两种受体同时被控制时，整联蛋白受体和Frizzled受体的组合是最接近体内微环境的模拟物。
实施例7：细胞受体激活基序的组合对人类诱导的多能干细胞培养的影响(2)
实验方法
根据实施例6，制备具有存在于其表面的肽基序的平板。此时，平板表面具有结合至每个受体的肽基序，以同时控制七种受体中的四种受体的活性。
根据如实施例5和实施例6中所述的相同程序，检测每种微环境对人类诱导的多能干细胞培养的影响。
通过每个孔板上涂覆的表面控制的组合受体是整联蛋白-Frizzed-FGF-TGFβ受体、整联蛋白-LIF-FGF-TGFβ、整联蛋白-Frizzled-LIF-TGFβ和整联蛋白-Frizzled-LIF-FGF受体。
实验结果
实验结果在图15和图16中示出。
图15显示二维检测hiPSCs细胞中蛋白质基序的影响的结果，并且如下显示。
在2D平板上涂覆蛋白后hiPSCs的培养
对照：Matrigel
涂覆的蛋白：五种蛋白，Combo、FGF3、TGFb1、Wnt5a和LIF1。“所有”表明用所有蛋白的混合物(每种蛋白以浓度为0.1mg/ml添加)涂覆。符号“-”表明从混合物溶液中排除的蛋白(例如，-FGF3表明仅FGF从五种蛋白的混合物溶液中排除)。
*-表明用Combo单独涂覆，并且MAP表明用0.1mg/ml Combo+0.4mg/ml MAP涂覆。
从实验结果示出，当仅用Combo涂覆平板时，所有hiPSC都以分化的形式生长，并且当添加MAP时，hiPSCs生长，但菌落大小变更小。此外，在不存在FGF3的情况下，菌落大小变更小，并且在不存在TGFb1和Wnt5a的情况下，菌落大小变更大，但出现分化形式。在不存在LIF1的情况下，菌落形状变得更好，涂覆的蛋白质基序效果存在差异，并且由于蛋白质基序的添加，hiPSCs的菌落形状也发生了变化。
此外，图16示出二维检测hiPSCs中蛋白质基序的影响的结果。具体地，其示出在2D平板上涂覆蛋白质和培养hiPSCs后分析干性标记物的表达的结果，并且显示如下：
对照：Matrigel
涂覆的蛋白：五种蛋白，Combo、FGF3、TGFb1、Wnt5a和LIF1。“所有”表明用所有蛋白的混合物(每种蛋白以浓度为0.1mg/ml添加)涂覆。符号“-”表明从混合物溶液中排除的蛋白(例如，-FGF3表明仅有FGF从五种蛋白的混合物溶液中排除)。
*-表明仅用Combo涂覆，并且MAP表明用0.1mg/ml Combo+0.4mg/ml MAP涂覆。
其示出分析hiPSCs中干性标记物(Oct4和Sox2)的表达的结果，并且显示如下。
从实验结果可以看出，当仅用Combo涂覆平板时，细胞以与Matrigel的水平相似水平的粘附，但是干性标记物的表达是弱的，并且当用Combo和基序的混合物涂覆平板时，干性标记物的表达强于Matrigel，并且当不存在FGF3时，hiPSCs的菌落形状变更小，并且干性标记物的表达变更弱。此外，确认当不存在TGFb1和Wnt5a时，干性标记物的表达变更弱，并且用基序混合物涂覆对于维持hiPSCs的干性是有效的，并且细胞的形状和干性标记物的表达取决于使用的基序的类型变化。
如实施例6中提到的，七种受体对于干细胞自我更新具有不同程度的贡献。此外，这个实施例中四种受体的组合与两种受体的组合的比较表明四种受体的组合比两种受体的组合表现出更好的结果。
当检测每种受体的贡献程度时，可以看出LIF受体的贡献程度最低，并且FGF受体的贡献程度比LIF受体的贡献程度更高，但是比Frizzled或TGFβ受体的贡献程度更低。特别地，可以看出，包含Frizzled或TGFβ受体的组合比Matrigel具有更好的自我更新效果并且具有与iMatrix的水平相当的效果。
实施例8不同物理环境对人类诱导的多能干细胞培养的影响(3)
实验方法
根据实施例1和实施例2，制备具有纳米纤维直径为200nm(Combo-A类型)、600nm(Combo-B类型)和1000nm(Combo-C类型)的膜。此时，膜表面具有PHSRN-RGDSP，其为整联蛋白结合肽基序。
根据在实施例6和实施例7中所述的相同程序，检测每种微环境对人类诱导的多能干细胞的培养的影响。
实验结果
实验结果在图17中示出。
为了检测纳米纤维直径对干细胞培养的影响，分析在图17中示出的AP染色结果。结果是，随着直径增长，干细胞粘附和菌落大小增加。可以看出，在具有相同直径的纳米纤维中，粘附的细胞的数量和菌落大小随着PHSRN-RGDSP的密度的增加而增加。具体地，图17显示如下。
PVDF膜的纤维直径的控制
掺混纺丝的蛋白质：10mg/ml Combo
PVDF(不具有蛋白)
Combo掺混纺丝A类型：纤维直径为200nm
Combo掺混纺丝B类型：纤维直径为600nm
Combo掺混纺丝C类型：纤维直径为1000nm。
从实验结果可以确认，当包括A类型、B类型和C类型Combo基序时，细胞粘附增加，并且细胞粘附取决于纤维直径确实不同。此外，粘附的程度显示A＝B<C。(在图17中，Combo掺混纺丝A类型、B类型和C类型膜)。
参见图17，可以看出，当mESCs培养在由Combo掺混纺丝获得的膜中时，随着纤维直径的增长，更大量的细胞粘附和生长，并且在由Combo掺混纺丝获得的膜中的mESCs的菌落形状相较于在用作对照的PDL中更好。总之，可以看出，mESCs的干性被很好地维持。
可以看出，增长纳米纤维直径对维持干细胞的自我更新和分化潜能是有利的。
实施例9：整联蛋白结合基序的密度的作用(i)
实验方法
为了检测在纳米纤维表面中整联蛋白-结合基序PHSRN-RGDSP的密度对干细胞的培养的影响，当根据实施例1制造纳米纤维时，使用10mg和20mg的量的细胞外基质模拟物MAPTrixTM PHSRN-RGDSP，以便改变纳米纤维表面中PHSRN-RGDSP的密度。检测PHSRN-RGDSP的密度对干细胞的自我更新和菌落大小的影响。
实验结果
实验结果在图18中示出。图18示出检测mESCs中PHSRN-RGDSP基序的密度的作用的结果。具体的实验条件和结果如下：
当根据实施例1和实施例2制造Combo掺混-纺丝B类型膜时添加10mg和20mg的量的蛋白，然后在膜上培养mESCs并且检测mESCs的菌落大小和形状。
对照：PDL
掺混-纺丝的蛋白质基序：10mg PHSRN-RGDSP和20mg PHSRN-RGDSP
在图18中可以看出，随着PHSRN-RGDSP的表面密度增加，干细胞的粘附和菌落大小也增加。也就是，PHSRN-RGDSP的表面密度在干细胞的自我更新和生长中起重要作用。然而，可以看出，该自我更新与在PDL上的自我更新相比仍处于较低水平。为了证实对应于PDL上的水平的表面密度，进行另外的实验，并且其内容将在以下实施例10中提出(整联蛋白结合基序的密度的作用(ii))。
可以看出，膜示出比PDL的自我更新更低的自我更新，其中PDL为用于干细胞培养的普通材料，但是当PHSRN-RGDSP的密度增加时，可以获得改善自我更新的作用。
实施例10：整联蛋白结合基序的密度的作用(ii)
实验方法
为了进一步检测整联蛋白结合基序PHSRN-RGDSP的密度对干细胞培养的的影响，使用EDC/NHS催化剂将PHSRN-RGDSP模拟物涂覆在2D平板表面上，并且根据在实施例6和实施例7中所述的程序检测PHSRN-RGDSP的浓度(即，表面密度)对干细胞的行为的影响。涂覆溶液中PHSRN-RGDSP的浓度分别为0.01mg/ml、0.06mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml和1mg/ml。
实验结果
实验结果在图19中示出。图19示出蛋白涂覆浓度对hiPSC培养(2D平板)的影响，并且在以下条件下进行用于检测该影响的实验。
对照：Matrigel
涂覆蛋白：MAP和Combo
涂覆浓度：0.01mg/ml、0.06mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml和1mg/ml。
参见图19，可以看出，当用MAP涂覆平板时，hiPSCs几乎不粘附，并且当用0.5mg/ml的MAP涂覆平板时，细胞粘附并生长，但是没有形成正常的菌落，并且当用Combo涂覆平板时，hiPSCs粘附并生长，并且随着Combo的浓度的增长，更大量的细胞粘附并生长，与在Matrigel上生长相似。此外，可以看出，蛋白的涂覆浓度影响hiPSCs的培养并且基序(Combo)是有效的。
可以证实，随着PHSRN-RGDSP涂覆浓度(即在表面上PHSRN-RGDSP的密度)增加，细胞的粘附增加并且菌落大小也增加。如在图19中示出的AP染色结果中观察的，可以看出，当PHSRN-RGDSP的涂覆浓度为0.1mg/mL或更高时，获得与Matrigel上观察到的水平相当的细胞粘附性能和菌落大小。
检测与在Matrigel上观察的水平相当的用于获得自我更新和生长效果的最小浓度，并且获得的结果可用作确定用于同时控制关键的整联蛋白受体的活性的最小浓度的指示。
实施例11：测量纳米膜厚度对干细自我更新的影响(保持以上所述的条件，除了厚度)
实验方法
根据实施例1和实施例2，制造具有纳米纤维直径为600nm和1000nm的膜。在制造期间，控制膜的厚度。具有纤维直径为600nm的膜被制造为具有1.5μm、2.8μm和5.5μm的厚度，并且具有纤维直径为1000nm的膜被制造为具有3μm、5μm和7μm的厚度。此时，提供用PHSRN-RGDSP掺混纺丝制造膜。根据在实施例5中所述的程序检测取决于膜的厚度的干细胞的行为。
实验结果
实验结果在图20中示出。图20示出控制PVDF膜的厚度的结果，并且实验条件和结果如下：
掺混纺丝的蛋白质：10mg/ml Combo
Combo掺混纺丝B类型：纤维直径为600nm
Combo掺混纺丝C类型：纤维直径为1μm。
从实验结果可以看出，当包括B类型或C类型Combo基序时，细胞粘附增加，取决于膜的厚度细胞粘附确实不同。此外，粘附以B<C的顺序更高。同时，通过AP染色检测膜厚度对干细胞行为的影响。
从实验结果可以看出，在具有纳米纤维直径为600nm和1000nm的所有膜中，取决于膜厚度自我更新效率确实不同，并且随着膜厚度变厚，干细胞的数量增加。
此外，实验结果显示随着膜厚度变厚，干细胞培养的效果更好。
实施例12：细胞迁移阵列
实验方法
根据实施例1和实施例2，制造具有纤维直径为200nm的纳米纤维膜。为了探索适合于构成皮肤组织的上皮HaCaT(角化细胞)和HS27(成纤维细胞)细胞的生长和迁移的微环境，制备四种层粘连蛋白-衍生的肽基序和四种胶原-衍生的肽基序，并且在涂覆有每种基序的表面上制备包含生长因子基础FGF和FGF模拟肽的16种微环境。图21示出仅包括个体基序的微环境阵列。使用这个阵列，分配HaCaT和HS27细胞，并且探索对细胞生长和迁移有效的微环境。
通过划痕试验检测每种微环境对上皮细胞的迁移的影响。
实验结果
实验结果在图22至图24中示出。图22为示出每种肽基序对细胞迁移的影响的图，并且在其中可以看出，层粘连蛋白-衍生的肽基序的效果比胶原-衍生的肽基序的效果更好。此外，可以看出，存在每个基序的最佳浓度，在该浓度迁移达到最大。
然而，如在图24中可以看出，包含生长因子的微环境已引起促进全部细胞迁移。此外，可以看出，在包含生长因子FGF的微环境中，胶原-衍生的肽基序或层粘连蛋白-衍生的肽基序的效果的差异被抵消(offset)。
图23示出划痕试验的代表结果，并且在其中可以看出随着时间流逝细胞迁移的程度。在图23A中，胶原-衍生的肽基序GLPGER示出对细胞迁移的低影响。然而，在图23B中，层粘连蛋白-衍生的肽基序IKVAV示出对细胞迁移的高影响。
上皮细胞的迁移对伤口愈合过程是必要的，并且当实现优化每种类型细胞的迁移的微环境时，伤口愈合时间可被缩短。本公开可提供优化每种类型的细胞的迁移的微环境，因此可用于伤口敷料材料等的开发。
序列表
SEQ ID NO:1
衍生自足蛋白1(FP-1，紫贻贝(Mytilus edulis))的串联重复十肽的模型肽
:Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
SEQ ID NO:2
衍生自足蛋白1(FP-1，紫贻贝)的2次重复的序列
:Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro ProThr Tyr Lys
SEQ ID NO:3
衍生自足蛋白1(FP-1，紫贻贝)的6次重复的序列
:Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser TyrPro ProThr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr LysAla Lys Pro Ser Tyr ProPro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser TyrPro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser TyrPro Pro Thr Tyr Lys
SEQ ID NO:4
足蛋白类型2(FP-2，加州贻贝(Mytilus californianus))的部分序列
:Glu Val His Ala Cys Lys Pro Asn Pro Cys Lys Asn Asn Gly ArgCys TyrPro Asp Gly Lys Thr Gly Tyr Lys Cys Lys Cys Val Gly Gly Tyr Ser Gly Pro ThrCys Ala Cys
SEQ ID NO:5
足蛋白类型3(FP-3，紫贻贝)
:Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly GlyAsn Tyr Asn Arg Tyr Gly Gly Ser Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn AsnGly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Glu Phe Glu Phe
SEQ ID NO:6
足蛋白类型3(FP-3，地中海贻贝(Mytilus galloprovincialis)：mgfp-3A)
:Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly GlyAsn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn Asn Gly TrpLys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr
SEQ ID NO:7
足蛋白类型4(加州贻贝)的部分序列
:Gly His Val His Arg His Arg Val Leu His Lys His Val His Asn His ArgVal Leu His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His Val His Arg HisGln Val Leu His Lys His Val His Asn His Arg Val Leu His Lys His Leu His LysHis Gln Val Leu His
SEQ ID NO:8
足蛋白类型5(FP-5，紫贻贝)
:Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr His TyrHis Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys TyrTyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys TyrLeu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly SerSer
SEQ ID NO:9
足蛋白5(FP-5，紫贻贝)
:Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His TyrHis Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys TyrTyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys TyrLeu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly GlySer Ser
SEQ ID NO:10
足蛋白5(FP-5，厚壳贻贝(Mytilus coruscus))
:Tyr Asp Asp Tyr Ser Asp Gly Tyr Tyr Pro Gly Ser Ala Tyr Asn Tyr ProSer Gly Ser His Trp His Gly His Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Gly LysLys Tyr Tyr Tyr Lys Phe Lys Arg Thr Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala ArgLys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys His Tyr Gly Gly Ser Ser Ser
SEQ ID NO:11
贻贝粘蛋白足蛋白类型5，来自(地中海贻贝)
:Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His TyrHis Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys TyrTyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys TyrLeu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly GlySer Ser
SEQ ID NO:12
贻贝粘蛋白足蛋白类型6
:Gly Gly Gly Asn Tyr Arg Gly Tyr Cys Ser Asn Lys Gly Cys Arg Ser GlyTyr Ile Phe Tyr Asp Asn Arg Gly Phe Cys Lys Tyr Gly Ser Ser Ser Tyr Lys TyrAsp Cys Gly Asn Tyr Ala Gly Cys Cys Leu Pro Arg Asn Pro Tyr Gly Arg Val LysTyr Tyr Cys Thr Lys Lys Tyr Ser Cys Pro Asp Asp Phe Tyr Tyr Tyr Asn Asn LysGly Tyr Tyr Tyr Tyr Asn Asp Lys Asp Tyr Phe Asn Cys Gly Ser Tyr Asn Gly CysCys Leu Arg Ser Gly Tyr
SEQ ID NO:13
杂交贻贝粘蛋白(FP-151，基于MEFP-5的：Kollodis)
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro ProThr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr ProPro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser TyrPro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn AlaTyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr LysGly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly LysTyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Tyr Tyr GlyGly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr ProPro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser TyrPro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro SerTyr Pro Pro Thr Tyr Lys
SEQ ID NO:14
杂交贻贝粘蛋白(FP-151，基于MGFP-5的)
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro ProThr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr ProPro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser TyrPro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn ThrTyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr LysGly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly LysTyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr TyrGly Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro SerTyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys ProSer Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala LysPro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
SEQ ID NO:15
纤连蛋白-衍生的肽(RGD)
:Arg Gly Asp
SEQ ID NO:16
纤连蛋白-衍生的肽(GRGDSP)
:Gly Arg Gly Asp Ser Pro
SEQ ID NO:17
纤连蛋白-衍生的肽(PHSRN-RGDSP)
:ProH is Ser Arg Asn Arg Gly Asp Ser Pro
SEQ ID NO:18
纤连蛋白-衍生的肽(SPPRRARVT)
:Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr
SEQ ID NO:19
纤连蛋白-衍生的肽(WQPPRARI)
:Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile
SEQ ID NO:20
:纤连蛋白-衍生的肽(KNNQKSEPLIGRKKT)
Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr
SEQ ID NO:21
层粘连蛋白-衍生的肽(RKRLQVQLSIRT)
:Arg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr
SEQ ID NO:22
层粘连蛋白-衍生的肽(GKNTGDHFVLYM)
:Gly Lys Asn Thr Gly Asp His Phe Val Leu Tyr Met
SEQ ID NO:23
层粘连蛋白-衍生的肽(VVSLYNFEQTFML)
:Val Val Ser Leu Tyr Asn Phe Glu Gln Thr Phe Met Leu
SEQ ID NO:24
层粘连蛋白-衍生的肽(RFDQELRLVSYN)
:Arg Phe Asp Gln Glu Leu Arg Leu Val Ser Tyr Asn
SEQ ID NO:25
层粘连蛋白-衍生的肽(RLVSYSGVLFFLK)
:Arg Leu Val Ser Tyr Ser Gly Val Leu Phe Phe Leu Lys
SEQ ID NO:26
层粘连蛋白-衍生的肽(ASKAIQVFLLGG)
:Ala Ser Lys Ala Ile Gln Val Phe Leu Leu Gly Gly
SEQ ID NO:27
层粘连蛋白-衍生的肽(VLVRVERATVFS)
:Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Pro
SEQ ID NO:28
层粘连蛋白-衍生的肽(TVFSVDQDNMLE)
:Thr Val Phe Ser Val Asp Gln Asp Asn Met Leu Glu
SEQ ID NO:29
层粘连蛋白-衍生的肽(RLRGPQRVFDLH)
:Arg Leu Arg Gly Pro Gln Arg Val Phe Asp Leu His
SEQ ID NO:30
层粘连蛋白-衍生的肽(FDLHQNMGSVN)
:Phe Asp Leu His Gln Asn Met Gly Ser Val Asn
SEQ ID NO:31
层粘连蛋白-衍生的肽(QQNLGSVNVSTG)
:Gln Gln Asn Leu Gly Ser Val Asn Val Ser Thr Gly
SEQ ID NO:32
层粘连蛋白-衍生的(SRATAQKVSRRS)
:Ser Arg Ala Thr Ala Gln Lys Val Ser Arg Arg Ser
SEQ ID NO:33
FGF-衍生的肽(ANRYLAMKEDGRLLAS)
:Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser
SEQ ID NO:34
FGF-衍生的肽(HFKDPKRLYCK)
:His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys
SEQ ID NO:35
FGF-衍生的肽(FLPMSAKS)
:Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser
SEQ ID NO:36
FGF-衍生的肽(KTGPGQKA)
:Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala
SEQ ID NO:37
TGF-衍生的肽(LTGKNFPMFHRN)
:Leu Thr Gly Lys Asn Phe Pro Met Phe His Arg Asn
SEQ ID NO:38
TGF-衍生的肽(MHRMPSFLPTTL)
:Met His Arg Met Pro Ser Phe Leu Pro Thr Thr Leu
SEQ ID NO:39
WNT-衍生的肽(LCCGRGHRTRTQRVTERCNC)
:Leu Cys Cys Gly Arg Gly His Arg Thr Arg Thr Gln Arg Val Thr Glu ArgCys Asn Cys
SEQ ID NO:40
WNT-衍生的肽(LGTQGRLCNKTSEGMDGCEL)
:Leu Gly Thr Gln Gly Arg Leu Cys Asn Lys Thr Ser Glu Gly Met Asp GlyCys Glu Leu
SEQ ID NO:41
LIF-衍生的肽(IVPLLLLVLH)
:Ile Val Pro Leu Leu Leu Leu Val Leu His
SEQ ID NO:42
LIF-衍生的肽(YTAQGEPFPNNVEKLCAP)
:Tyr Thr Ala Gln Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Val Glu Lys Leu Cys AlaPro
SEQ ID NO:43
纤连蛋白-衍生的肽(KLDAPT)
:Lys Leu Asp Ala Pro Thr
SEQ ID NO:44
纤连蛋白-衍生的肽(EILDVPSTT)
:Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr Thr
SEQ ID NO:45
层粘连蛋白-衍生的肽(TWYKIAFQRNRK)
:Thr Trp Tyr Lys Ile Ala Phe Gln Arg Asn Arg Lys
SEQ ID NO:46
层粘连蛋白-衍生的肽(NRWHSIYITRFG)
:Asn Arg Trp His Ser Ile Tyr Ile Thr Arg Phe Gly
现有技术文件
专利文件
专利文件1：美国专利公布序列号2006-0134050
序列表
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 衍生自足蛋白1(FP-1，紫贻贝)的串联重复十肽的模型肽
<400> 1
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 衍生自足蛋白1(FP-1，紫贻贝)的2次重复的序列
<400> 2
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
1 5 10
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
11 15 20
<210> 3
<211> 60
<212> PRT
<213> 衍生自足蛋白1(FP-1，紫贻贝)的6次重复的序列
<400> 3
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr
1 5 10 15
Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
20 25 30
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr
35 40 45
Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
50 55 60
<210> 4
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 足蛋白类型2(FP-2, 加州贻贝)的部分序列
<400> 4
Glu Val His Ala Cys Lys Pro Asn Pro Cys Lys Asn Asn Gly Arg
1 5 10 15
Cys Tyr Pro Asp Gly Lys Thr Gly Tyr Lys Cys Lys Cys Val Gly
20 25 30
Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Ala Cys
35
<210> 5
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 足蛋白类型3(FP-3, 紫贻贝)
<400> 5
Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly
1 5 10 15
Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Gly Ser Arg Arg Tyr Gly Gly
20 25 30
Tyr Lys Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg
35 40 45
Lys Tyr Tyr Glu Phe Glu Phe
50
<210> 6
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 足蛋白类型3(FP-3, 地中海贻贝: mgfp-3A)
<400> 6
Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly
1 5 10 15
Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys
20 25 30
Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr
35 40 45
Tyr
<210> 7
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自足蛋白类型4(加州贻贝)的部分序列
<400> 7
Gly His Val His Arg His Arg Val Leu His Lys His Val His Asn
1 5 10 15
His Arg Val Leu His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His
20 25 30
Gly His Val His Arg His Gln Val Leu His Lys His Val His Asn
35 40 45
His Arg Val Leu His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His
50 55 60
<210> 8
<211> 75
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 足蛋白类型5(FP-5, 紫贻贝)
<400> 8
Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr
1 5 10 15
His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly
20 25 30
Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr
35 40 45
Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg
50 55 60
Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser
65 70 75
<210> 9
<211> 76
<212> PRT
<213> 足蛋白5(FP-5, 紫贻贝)
<400> 9
Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr
1 5 10 15
His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly
20 25 30
Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr
35 40 45
Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg
50 55 60
Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser
65 70 75
Ser
<210> 10
<211> 71
<212> PRT
<213> 足蛋白5(FP-5, 厚壳贻贝)
<400> 10
Tyr Asp Asp Tyr Ser Asp Gly Tyr Tyr Pro Gly Ser Ala Tyr Asn
1 5 10 15
Tyr Pro Ser Gly Ser His Trp His Gly His Gly Tyr Lys Gly Lys
20 25 30
Tyr Tyr Gly Lys Gly Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Phe Lys Arg Thr
35 40 45
Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys
50 55 60
Gly Tyr Lys Lys His Tyr Gly Gly Ser Ser Ser
65 70
<210> 11
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 贻贝粘蛋白足蛋白类型5，来自(地中海贻贝)
<400> 11
Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr
1 5 10 15
His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly
20 25 30
Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr
35 40 45
Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg
50 55 60
Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser
65 70 75
Ser
<210> 12
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 贻贝粘蛋白足蛋白类型6
<400> 12
Gly Gly Gly Asn Tyr Arg Gly Tyr Cys Ser Asn Lys Gly Cys Arg
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Ile Phe Tyr Asp Asn Arg Gly Phe Cys Lys Tyr Gly
20 25 30
Ser Ser Ser Tyr Lys Tyr Asp Cys Gly Asn Tyr Ala Gly Cys Cys
35 40 45
Leu Pro Arg Asn Pro Tyr Gly Arg Val Lys Tyr Tyr Cys Thr Lys
50 55 60
Lys Tyr Ser Cys Pro Asp Asp Phe Tyr Tyr Tyr Asn Asn Lys Gly
65 70 75
Tyr Tyr Tyr Tyr Asn Asp Lys Asp Tyr Phe Asn Cys Gly Ser Tyr
80 85 90
Asn Gly Cys Cys Leu Arg Ser Gly Tyr
95
<210> 13
<211> 194
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 杂交贻贝粘蛋白(FP-151, 基于MEFP-5的：Kollodis)
<400> 13
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr
1 5 10 15
Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
20 25 30
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr
35 40 45
Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
50 55 60
Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr
65 70 75
His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly
80 85 90
Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr
95 100 105
Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg
110 115 120
Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala
125 130 135
Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
140 145 150
Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala
155 160 165
Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
170 175 180
Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
185 190
<210> 14
<211> 196
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 杂交贻贝粘蛋白(FP-151, 基于MGFP-5的)
<400> 14
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr
1 5 10 15
Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
20 25 30
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr
35 40 45
Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
50 55 60
Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr
65 70 75
His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly
80 85 90
Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr
95 100 105
Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg
110 115 120
Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser
125 130 135
Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser
140 145 150
Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr
155 160 165
Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser
170 175 180
Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr
185 190 195
Lys
<210> 15
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纤连蛋白-衍生的肽(RGD)
<400> 15
Arg Gly Asp
1
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纤连蛋白-衍生的肽(GRGDSP)
<400> 16
Gly Arg Gly Asp Ser Pro
1 5
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纤连蛋白-衍生的肽(PHSRN-RGDSP)
<400> 17
ProH is Ser Arg Asn Arg Gly Asp Ser Pro
1 5 10
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纤连蛋白-衍生的肽(SPPRRARVT)
<400> 18
Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr
1 5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纤连蛋白-衍生的肽(WQPPRARI)
<400> 19
Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile
1 5
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纤连蛋白-衍生的肽(KNNQKSEPLIGRKKT)
<400> 20
Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr
1 5 10 15
<210> 21
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 层粘连蛋白-衍生的肽(RKRLQVQLSIRT)
<400> 21
Arg Lys Arg Leu Gln Val Gln Leu Ser Ile Arg Thr
1 5 10
<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 层粘连蛋白-衍生的肽(GKNTGDHFVLYM)
<400> 22
Gly Lys Asn Thr Gly Asp His Phe Val Leu Tyr Met
1 5 10
<210> 23
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 层粘连蛋白-衍生的肽(VVSLYNFEQTFML)
<400> 23
Val Val Ser Leu Tyr Asn Phe Glu Gln Thr Phe Met Leu
1 5 10
<210> 24
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 层粘连蛋白-衍生的肽(RFDQELRLVSYN)
<400> 24
Arg Phe Asp Gln Glu Leu Arg Leu Val Ser Tyr Asn
1 5 10
<210> 25
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 层粘连蛋白-衍生的肽(RLVSYSGVLFFLK)
<400> 25
Arg Leu Val Ser Tyr Ser Gly Val Leu Phe Phe Leu Lys
1 5 10
<210> 26
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 层粘连蛋白-衍生的肽(ASKAIQVFLLGG)
<400> 26
Ala Ser Lys Ala Ile Gln Val Phe Leu Leu Gly Gly
1 5 10
<210> 27
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 层粘连蛋白-衍生的肽(VLVRVERATVFS)
<400> 27
Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Pro
1 5 10
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 层粘连蛋白-衍生的肽(TVFSVDQDNMLE)
<400> 28
Thr Val Phe Ser Val Asp Gln Asp Asn Met Leu Glu
1 5 10
<210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 层粘连蛋白-衍生的肽(RLRGPQRVFDLH)
<400> 29
Arg Leu Arg Gly Pro Gln Arg Val Phe Asp Leu His
1 5 10
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 层粘连蛋白-衍生的肽(FDLHQNMGSVN)
<400> 30
Phe Asp Leu His Gln Asn Met Gly Ser Val Asn
1 5 10
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 层粘连蛋白-衍生的肽(QQNLGSVNVSTG)
<400> 31
Gln Gln Asn Leu Gly Ser Val Asn Val Ser Thr Gly
1 5 10
<210> 32
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 层粘连蛋白-衍生的(SRATAQKVSRRS)
<400> 32
Ser Arg Ala Thr Ala Gln Lys Val Ser Arg Arg Ser
1 5 10
<210> 33
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FGF-衍生的肽(ANRYLAMKEDGRLLAS)
<400> 33
Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser
1 5 10 15
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FGF-衍生的肽(HFKDPKRLYCK)
<400> 34
His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys
1 5 10
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FGF-衍生的肽(FLPMSAKS)
<400> 35
Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser
1 5
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FGF-衍生的肽(KTGPGQKA)
<400> 36
Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala
1 5
<210> 37
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGF-衍生的肽(LTGKNFPMFHRN)
<400> 37
Leu Thr Gly Lys Asn Phe Pro Met Phe His Arg Asn
1 5 10
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGF-衍生的肽(MHRMPSFLPTTL)
<400> 38
Met His Arg Met Pro Ser Phe Leu Pro Thr Thr Leu
1 5 10
<210> 39
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WNT-衍生的肽(LCCGRGHRTRTQRVTERCNC)
<400> 39
Leu Cys Cys Gly Arg Gly His Arg Thr Arg Thr Gln Arg Val Thr Glu Arg Cys Asn Cys
1 5 10 15 20
<210> 40
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WNT-衍生的肽(LGTQGRLCNKTSEGMDGCEL)
<400> 40
Leu Gly Thr Gln Gly Arg Leu Cys Asn Lys Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu
1 5 10 15 20
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LIF-衍生的肽(IVPLLLLVLH)
<400> 41
Ile Val Pro Leu Leu Leu Leu Val Leu His
1 5 10
<210> 42
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LIF-衍生的肽(YTAQGEPFPNNVEKLCAP)
<400> 42
Tyr Thr Ala Gln Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Val Glu Lys Leu Cys Ala Pro
1 5 10 15
<210> 43
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纤连蛋白-衍生的肽(KLDAPT)
<400> 43
Lys Leu Asp Ala Pro Thr
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纤连蛋白-衍生的肽(EILDVPSTT)
<400> 44
Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr Thr
1 5
<210> 45
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 层粘连蛋白-衍生的肽(TWYKIAFQRNRK)
<400> 45
Thr Trp Tyr Lys Ile Ala Phe Gln Arg Asn Arg Lys
1 5 10
<210> 46
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 层粘连蛋白-衍生的肽(NRWHSIYITRFG)
<400> 46
Asn Arg Trp His Ser Ile Tyr Ile Thr Arg Phe Gly
1 5 10

Claims (50)

1.一种用于控制细胞行为的三维微环境结构，其包括：纳米纤维膜；和两种或更多种肽基序，其包括P1(第一肽)基序和P2(第二肽)基序。
2.权利要求1所述的三维微环境结构，其中所述两种或更多种肽基序结合至所述细胞上的两种或更多种不同的受体，从而产生用于控制所述细胞行为的信号。
3.权利要求1所述的三维微环境结构，其中所述细胞行为是选自由细胞粘附、迁移、生长、增殖、形态发生、分化和细胞凋亡组成的组中的一种或多种。
4.权利要求1所述的三维微环境结构，其中所述细胞行为是细胞生长。
5.权利要求1所述的三维微环境结构，其中所述纳米纤维膜包括PVDF、PAN、PES、PU和PLA中的一种或多种。
6.权利要求1所述的三维微环境结构，其中在所述肽基序中所述P1(第一肽)基序控制整联蛋白受体活性，并且所述P2(第二肽)基序控制整联蛋白共同受体活性，从而产生用于控制所述细胞行为的信号。
7.权利要求6所述的三维微环境结构，其中所述共同受体为FGF受体、Frizzled受体、TGF受体、EGF受体、LIF受体、BMP受体、钙黏着蛋白、多配体聚糖和白介素受体中的一种或多种。
8.权利要求1所述的三维微环境结构，其中所述P1(第一肽)基序激活α3β1、α5β1、α6β1、α9β1、ανβ3和ανβ5整联蛋白受体和肝素受体中的一种或多种。
9.权利要求1所述的三维微环境结构，其中所述P1(第一肽)基序激活α5β1整联蛋白受体。
10.权利要求1所述的三维微环境结构，其中所述P1(第一肽)基序选自RGD、PHSRN-RGDSP、GRGDSP、KLDAPT、SPPRRARVT和KNNQKSEPLIGRKKT。
11.权利要求1所述的三维微环境结构，其中所述P1(第一肽)基序为PHSRN-RGDSP。
12.权利要求1所述的三维微环境结构，其中所述P1(第一肽)基序激活α6β1整联蛋白受体。
13.权利要求12所述的三维微环境结构，其中所述P1(第一肽)基序衍生自层粘连蛋白α5的LG结构域。
14.权利要求13所述的三维微环境结构，其中所述P1(第一肽)基序选自GKNTGDHFVLYM、VVSLYNFEQTFML、RFDQELRLVSYN、RLVSYSGVLFFLK、ASKAIQVFLLGG、VLVRVERATVFS、TVFSVDQDNMLE、RLRGPQRVFDLH、FDLHQNMGSVN、QQNLGSVNVSTG和SRATAQKVSRRS。
15.权利要求13所述的三维微环境结构，其中所述P1(第一肽)基序为VVSLYNFEQTFML。
16.权利要求6所述的三维微环境结构，其中所述P1(第一肽)基序激活α5β1和α6β1整联蛋白受体中的每一种。
17.权利要求6所述的三维微环境结构，其中所述P1(第一肽)基序为作为α5β1整联蛋白激活基序的PHSRN-RGDSP或作为α5β1整联蛋白激活基序的VVSLYNFEQTFML。
18.权利要求6所述的三维微环境结构，其中所述共同受体包括Frizzled受体、LIF受体、FGF受体和TGF受体。
19.权利要求6所述的三维微环境结构，其中所述共同受体为选自Frizzled受体、LIF受体、FGF受体和TGF受体中的三种共同受体。
20.权利要求6所述的三维微环境结构，其中所述共同受体为选自Frizzled受体、LIF受体、FGF受体和TGF受体中的两种共同受体。
21.权利要求6所述的三维微环境结构，其中所述共同受体为Frizzled受体和TGF受体。
22.权利要求6所述的三维微环境结构，其中所述共同受体为Frizzled受体。
23.权利要求1所述的三维微环境结构，其中在肽基序中所述P1(第一肽)基序控制TGF受体活性，并且所述P1(第一肽)基序控制TGF共同受体活性。
24.权利要求23所述的三维微环境结构，其中所述共同受体为Frizzled受体、FGF受体、EGF受体、钙黏着蛋白、多配体聚糖和白介素受体中的一种或多种。
25.权利要求23所述的三维微环境结构，其中所述共同受体为FGF受体和Frizzled受体。
26.权利要求18所述的三维微环境结构，其中激活Frizzled受体的基序是选自LCCGRGHRTRTQRVTERCNC和LGTQGRLCNKTSEGMDGCEL中的一种或多种。
27.权利要求23所述的三维微环境结构，其中激活TGF受体的基序选自MHRMPSFLPTTL或LTGKNFPMFHRNL。
28.权利要求18所述的三维微环境结构，其中激活FGF受体的基序选自FLPMSAKS、HFKDPKRLYCK、ANRYLAMKEDGRLLAS、KTGPGQKA或WYVALKRTGQYKLG。
29.权利要求6所述的三维微环境结构，其中所述P2(第二肽)基序为激活LIF受体的基序，并且选自IVPLLLLVLH和YTAQGEPFPNNVEKLCAP。
30.权利要求1所述的三维微环境结构，其中所述肽基序以0.001mg/ml至10mg/ml的浓度被引入。
31.权利要求1所述的三维微环境结构，其中所述肽基序为连接至粘附蛋白的那些肽基序。
32.权利要求1所述的三维微环境结构，其中所述粘附蛋白为贻贝粘蛋白。
33.一种用于控制细胞行为的表面，所述表面包括结合至细胞受体的两种或更多种肽基序，所述肽基序包括P1(第一肽)基序和P2(第二肽)基序，其中所述肽基序结合至所述细胞上的两种或更多种不同的受体，从而产生用于控制所述细胞行为的信号。
34.权利要求33所述的表面，其中所述表面为多孔表面、非多孔表面或其组合。
35.权利要求33所述的表面，其中所述表面为纳米纤维、水凝胶和颗粒中的一种或多种的表面。
36.权利要求33所述的表面，其中所述细胞行为是选自由细胞粘附、迁移、生长、增殖、形态发生、分化和细胞凋亡组成的组中的一种或多种。
37.权利要求33所述的表面，其中所述两种或更多种不同的受体为整联蛋白受体和整联蛋白共同受体。
38.权利要求37所述的表面，其中所述共同受体为选自FGF受体、Frizzled受体、TGF受体、EGF受体、LIF受体、BMP受体、钙黏着蛋白、多配体聚糖和白介素受体中的一种或多种。
39.权利要求37所述的表面，其中所述共同受体为FGF受体、Frizzled受体、TGF受体、EGF受体、LIF受体、BMP受体、钙黏着蛋白、多配体聚糖和白介素受体中的一种或多种。
40.权利要求37所述的表面，其中共所述同受体是选自FGF受体、BMP受体、EGF受体和Frizzled受体中的一种或多种。
41.权利要求37所述的表面，其中所述共同受体为Frizzled受体。
42.权利要求37所述的表面，其中所述共同受体为FGF受体。
43.权利要求37所述的表面，其中所述两种或更多种不同的受体为整联蛋白-Frizzled受体、整联蛋白-LIF受体、整联蛋白-BMP受体、整联蛋白-FGF受体和整联蛋白-EGF受体中的任何一种。
44.权利要求32所述的表面，其中所述两种或更多种肽基序为整联蛋白-结合基序和整联蛋白共同受体-结合基序。
45.权利要求44所述的表面，其中所述整联蛋白-结合基序为结合至a3b1、a5b1、a6b1、a9b1和avb3整联蛋白中的一种或多种的基序。
46.权利要求44所述的表面，其中所述整联蛋白共同受体-结合基序为结合至整联蛋白-Frizzled受体、整联蛋白-LIF受体、整联蛋白-BMP受体、整联蛋白-FGF受体和整联蛋白-EGF受体中的一种或多种的基序。
47.权利要求44所述的表面，其中所述两种或更多种肽基序为PHSRN-RGDSP。
48.一种用于控制细胞行为的阵列，其包括选自权利要求1所述的结构和权利要求32所述的表面中的两种或更多种。
49.一种制造用于控制细胞行为的三维微环境结构的方法，所述方法包括步骤：
1)制备包含选自PVDF、PAN、PES和PLA中的一种或多种聚合物材料的组合物；
2)制备包含肽基序的组合物；和
3)混合1)的组合物和2)的组合物，然后静电纺丝。
50.一种制造用于控制细胞行为的三维微环境结构的方法，所述方法包括步骤：
1)静电纺丝包含选自PVDF、PAN、PES和PLA中的一种或多种聚合物材料的组合物，从而制造三维结构；和
2)用包含肽基序的组合物涂覆所述三维结构。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102065171B1 (ko) * 2019-02-20 2020-01-13 (주)케어젠 대기오염물질에 의한 피부 손상 방지 및 항노화용 펩타이드와 이의 용도
WO2021133143A1 (ko) * 2019-12-27 2021-07-01 주식회사 아모라이프사이언스 세포배양기재 및 이의 제조방법
WO2022131809A1 (en) * 2020-12-16 2022-06-23 TME Therapeutics Co., Ltd. Protein substrate to bind growth factor
WO2023158285A1 (en) * 2022-02-21 2023-08-24 TME Therapeutics Co., Ltd. Gf binding ecm mimetic coated microcarrier

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100297768A1 (en) * 2003-11-05 2010-11-25 Michigan State University Nanofibrillar structure and applications including cell and tissue culture
WO2014042463A1 (en) * 2012-09-13 2014-03-20 Kollodis Korea, Co., Ltd. Synthetically designed extracellular microenvironment

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI2784084T2 (sl) 2003-07-08 2024-02-29 Novartis Pharma Ag Antagonistična protitelesa proti IL-17 A/F heterolognim polipeptidom
US20070231362A1 (en) 2006-04-04 2007-10-04 3M Innovative Properties Company Schistose microfibrillated article for cell growth
WO2011115420A2 (en) * 2010-03-16 2011-09-22 Kollodis Biosciences, Inc. Adhesive extracellular matrix mimetic
WO2014034146A1 (ja) 2012-09-03 2014-03-06 三菱レイヨン株式会社 細胞培養用モジュール
US20150003068A1 (en) * 2013-07-01 2015-01-01 Chao-Chin Yeh Arc led lamp

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100297768A1 (en) * 2003-11-05 2010-11-25 Michigan State University Nanofibrillar structure and applications including cell and tissue culture
WO2014042463A1 (en) * 2012-09-13 2014-03-20 Kollodis Korea, Co., Ltd. Synthetically designed extracellular microenvironment

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SEUNG TAE LEE ,等: "Engineering integrin signaling for promoting embryonic stem cell self-renewal in a precisely defined niche", 《BIOMATERIALS 》 *
YONG CHEOL SHIN ,等: "Biomimetic Hybrid Nanofiber Sheets Composed of RGD Peptide-Decorated PLGA as Cell-Adhesive Substrates", 《J. FUNCT. BIOMATER.》 *

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