CN110248670B

CN110248670B - 细菌组合物用于治疗有蹄类动物的脚部感染的用途

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Publication number: CN110248670B
Application number: CN201780073423.8A
Authority: CN
Inventors: 米歇尔·拉尤斯; 亚历山大·布雷姆
Original assignee: Mixscience SAS
Current assignee: Mixscience SAS
Priority date: 2016-11-30
Filing date: 2017-11-30
Publication date: 2023-05-05
Anticipated expiration: 2037-11-30
Also published as: BR112019010792A8; DK3548052T3; BR112019010792A2; EP3548052A1; ES2888999T3; CA3044013A1; FR3059237B1; PL3548052T3; US11052121B2; FR3059237A1; MX2019006086A; US20200179465A1; WO2018100292A1; EP3548052B1; CN110248670A

Abstract

本发明涉及一种细菌混合物用于预防和改善患有涉及脚部的寄生虫或细菌感染的病理的有蹄类动物的状态的用途，所述组合物包括：至少一种芽孢杆菌属细菌菌株；以及至少一种乳酸菌。

Description

细菌组合物用于治疗有蹄类动物的脚部感染的用途

本发明涉及一种组合物用于治疗动物疾病的用途。

在牛、山羊和绵羊的现代养殖中，跛行较为常见并且占兽医从业者的所有访视的三分之一。在目前集约化养殖的背景下，足部病症(无论其是否是导致跛行的原因)变得越来越频繁。足部病症有各种病因，并且其在肌肉骨骼系统上的位置是可变的。脚部周围肮脏和磨损性的环境是通常被认为促使导致动物跛行的疾病发生的一个因素。实际上，潮湿肮脏的地面和磨损性混凝土会促进并维持皮肤炎症，所述皮肤炎症会导致观察到的跛行以及这些疾病的高复发水平。

导致动物疼痛和跛行的这些应激源的组合被称为“非生物性胁迫”。这一非生物性胁迫使趾间空间或足趾本身产生磨损，导致了促进细菌或其它寄生虫进入的炎症反应，从而引起蹄皮炎和跛行。这样尤其削弱了皮肤屏障并且产生了有利于足部疾病确立和持续的条件。

市面上既有如土霉素等抗生素也有消毒剂以应用于足浴中，但给予的频率和持续时间并未标准化。并未给出根据检测到的病例的数量需要使用所述抗生素和消毒剂的指示，并且这些足浴在实践中尚未总是完全落实到位。这些治疗产品中的一些被认为是有效的(甲醛、硫酸铜)，但存在在不久的将来被禁止使用的风险，因为其对人类或环境具有毒性风险。另外，抗生素的使用也受到批评并且由于存在产生抗药性的风险而受到约束。

这在已经实施的措施不足以限制导致动物跛行的疾病的扩散时表现出对可用于控制这种疾病的手段的限制。

另外，需要提供有效的治疗方法来治疗动物并保护其健康，同时尊重环境。

已经使用了数种方法来尝试减少有蹄类动物的跛行。例如，法国申请FR3026643A1描述了芳香植物提取物与矿物质组合地用于治疗牛的莫特拉罗病(Mortellaro disease)的用途。所述动物通过摄取含有所述提取物的膳食补充剂来进行治疗，但使动物的免疫防御受到刺激。另一个实例是国际申请WO 1998047374，其描述了益生菌用于预防细菌、真菌或病毒感染的用途，所述益生菌是选自以下的芽孢杆菌菌株：凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、侧孢芽孢杆菌(Bacilluslaterosporus)和左旋乳酸芽孢杆菌(Bacillus laevolacticus)。这些益生菌用于治疗皮炎和接触性皮炎。将所论述的益生菌直接涂敷于待治疗的皮肤或粘膜。然而，益生菌的功效尚未正式得到证实。

另外，这些方法似乎并不是最有效的并且未提出针对有蹄类动物的跛行问题的更普遍的解决方案。

另外，本发明的目的是克服这些缺点。

本发明的目的之一是提出一种用于改善患有跛行的动物的生活质量的方法。

本发明的另一个目的是提供一种具有这些性质的组合物。

本发明涉及一种包括细菌混合物的组合物，其用于预防和改善患有涉及足部细菌或寄生虫感染的疾病的有蹄类动物的病状，所述组合物包括：

-至少一种芽孢杆菌属(genus Bacillus)细菌菌株，尤其至少一种枯草芽孢杆菌，

-以及至少一种乳酸细菌菌株，尤其至少一种乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和/或至少一种戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。

本发明基于发明人的惊人发现：芽孢杆菌属细菌与乳酸菌的组合显著改善了患有因足部寄生虫或细菌感染引起的跛行的有蹄类动物的病状。

在本发明中，“涉及足部寄生虫或细菌感染的疾病”意指症状与细菌有关还与病毒或寄生虫(如螨虫或节肢动物)有关的疾病。

在本发明中，如在动物饲养学中，“脚”意指四肢的端部。每只脚包括两个功能性足趾；外部或侧面足趾III和内部或内侧足趾IV以及两个非功能性辅助足趾位于脚掌表面，与第二趾骨相对。这些足趾被称为悬蹄并且是足趾II在内部以及足趾V在外部的残留部分。这里，对牛足部疾病的鉴别诊断仅考虑了掌趾关节与前肢和后肢的末端之间的解剖结构。这也可以被称为足趾区。

在本发明中，“有蹄类动物”意指在其肢体末端处有一个或多个蹄的动物。因此，蹄是围绕在行走时接触地面的一个或多个足趾的已发展成熟的角质构造。具体地说，本发明所涵盖的有蹄类动物是家养有蹄类动物，尤其是农场有蹄类动物，如猪、牛、山羊和绵羊养殖中的那些。优选的有蹄类动物是猪、母牛和小牛、山羊和绵羊，并且在较小程度上是马。

本发明中使用的芽孢杆菌属细菌是来自芽孢杆菌科、芽孢杆菌目、杆菌纲和厚壁菌门(Firmicutes phylum)的革兰氏阳性菌。

本发明的乳酸菌是革兰氏阳性菌。

本发明人已经证明，使用至少一种芽孢杆菌与至少一种乳酸菌的组合具有改善因足部感染而患有跛行的有蹄类动物的生活质量的效果。

有利的是，本发明涉及一种如上文所定义的供使用的组合物，其中所述细菌组合物含有：

-以下四种枯草芽孢杆菌菌株中的至少一种：NOL01、NOL02、NOL03和NOL04，所述菌株分别以编号CNCM I-4606、CNCM I-5043、CNCM I-4607和CNCM I-4608存放于CNCM，以及

-选自以下乳酸菌的至少一种乳酸菌：乳酸乳球菌乳酸亚种1(Lactococcuslactis spp lactis 1)菌株NOL11和戊糖片球菌2菌株NOL12，所述菌株分别以编号CNCM I-4609和CNCM I-4610存放于CNCM。

本发明的以其存放编号为参考的不同菌株已经根据布达佩斯条约(the BudapestTreaty)全部存放于巴黎巴斯德研究所(the Institut Pasteur)的国家微生物培养物保藏中心(National Collection of Cultures of Microorganisms)(CNCM)(75724巴黎企业特投15博士大街25、28号(25,28rue du Docteur Roux 75724 Paris CEDEX 15))。

-菌株NOL01于2012年3月14日以编号CNCM I-4606存放，

-菌株NOL02于2016年1月21日以编号CNCM I-5043存放，

-菌株NOL03于2012年3月14日以编号CNCM I-4607存放，

-菌株NOL04于2012年3月14日以编号CNCM I-4608存放，

-菌株NOL11于2012年3月14日以编号CNCM I-4609存放，以及

-菌株NOL12于2012年3月14日以编号CNCM I-4610存放。

本发明涉及选自菌株NOL01、NOL02、NOL03和NOL04的至少一种菌株和选自菌株NOL11和NOL12的至少一种菌株的用途。另外，本发明涵盖以下45种组合：

-NOL01和NOL11，

-NOL01和NOL12，

-NOL01、NOL11和NOL12，

-NOL02和NOL11，

-NOL02和NOL12，

-NOL02、NOL11和NOL12，

-NOL03和NOL11，

-NOL03和NOL12，

-NOL03、NOL11和NOL12，

-NOL04和NOL11，

-NOL04和NOL12，

-NOL04、NOL11和NOL12，

-NOL01、NOL02和NOL11，

-NOL01、NOL02和NOL12，

-NOL01、NOL02、NOL11和NOL12，

-NOL01、NOL03和NOL11，

-NOL01、NOL03和NOL12，

-NOL01、NOL03、NOL11和NOL12，

-NOL01、NOL04和NOL11，

-NOL01、NOL04和NOL12，

-NOL01、NOL04、NOL11和NOL12，

-NOL02、NOL03和NOL11，

-NOL02、NOL03和NOL12，

-NOL02、NOL03、NOL11和NOL12，

-NOL02、NOL04和NOL11，

-NOL02、NOL04和NOL12，

-NOL02、NOL04、NOL11和NOL12，

-NOL03、NOL04和NOL11，

-NOL03、NOL04和NOL12，

-NOL03、NOL04、NOL11和NOL12，

-NOL01、NOL02、NOL03和NOL11，

-NOL01、NOL02、NOL03和NOL12，

-NOL01、NOL02、NOL03、NOL11和NOL12，

-NOL01、NOL02、NOL04和NOL11，

-NOL01、NOL02、NOL04和NOL12，

-NOL01、NOL02、NOL04、NOL11和NOL12，

-NOL01、NOL03、NOL04和NOL11，

-NOL01、NOL03、NOL04和NOL12，

-NOL01、NOL03、NOL04、NOL11和NOL12，

-NOL02、NOL03、NOL04和NOL11，

-NOL02、NOL03、NOL04和NOL12，

-NOL02、NOL03、NOL04、NOL11和NOL12，

-NOL01、NOL02、NOL03、NOL04和NOL11，

-NOL01、NOL02、NOL03、NOL04和NOL12，以及

-NOL01、NOL02、NOL03、NOL04、NOL11和NOL12。

有利的是，本发明涉及一种如上文所定义的供使用的组合物，所述组合物含有10⁵个到10¹¹个芽孢杆菌菌落和10⁵个到10¹¹个乳酸菌菌落，所述细菌菌落以组合物的毫升数或克数计。

在本发明中，10⁵个到10¹¹个细菌菌落意指：每ml细菌培养物中约10⁵个、约5.10⁵个、约10⁶个、约5.10⁶个、约10⁷个、约5.10⁷个、约10⁸个、约5.10⁸个、约10⁹个、约5.10⁹个、约10¹⁰个、约5.10¹⁰个或约10¹¹个细菌菌落。

本领域技术人员容易知道如何确定这一细菌数量，具体地说，通过人工计数(使用Malassez载玻片)或通过使用自动细胞计数器，或通过稀释并且然后在琼脂板上接种并对菌落进行计数。

更有利的是，本发明涉及一种如上文所定义的供使用的组合物，其中至少一种芽孢杆菌菌株呈孢子化形式和/或营养体形式。

具体地说，芽孢杆菌属细菌并且具体地说，如上文所定义的菌株NOL01、NOL02、NOL03和NOL04呈孢子化形式是特别有利的并且乳酸菌菌株呈营养体形式是特别有利的。

还更有利的是，本发明涉及一种用于上述用途的组合物，其中涉及有蹄类动物的脚部的寄生虫或细菌感染的所述疾病选自莫特拉罗病、趾间皮炎、或胼胝、甲沟炎或蹄叶炎、或腐蹄病(foot rot)、球体糜烂(bulb erosion)、足趾坏死(toe necrosis)和蹄皮炎。

1974年，由Cheli和Mortellaro在米兰首次描述了莫特拉罗病或趾间皮炎。这于20世纪80年代在法国得到证实。这种疾病在法国畜牧业中似乎越来越频繁并且从长远看来存在与其管理相关的许多问题。这种疾病被认为是在足跟糜烂(趾间皮炎)和足底出血(鸡眼)之后的第三大最常见足部感染。莫特拉罗病由密螺旋体引起并且可能由坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)引起。一旦被引入农场中，莫特拉罗病就很少被根除并且在连续的爆发中会重新出现。趾间皮炎是传染性疾病，其特征在于蹄冠皮肤的局限性表面炎症，这会导致跛行。趾间皮炎特别对牛有影响。莫特拉罗病可通过肿胀的脚和趾间坏死识别。

趾间皮炎(法语中被称为“Le Fourchet”)是细菌感染。趾间皮炎是由特别喜欢温暖潮湿环境的细菌(节瘤偶蹄形菌(Dichelobacter nodosus)和坏死梭杆菌)引起的。LeFourchet或趾间皮炎从趾间皮肤的潮湿恶臭炎症开始并且蔓延到蹄角(heel horn)，在所述蹄角处，Le Fourchet或趾间皮炎会影响角质鞘。所产生的角的质量较低，并且蹄球(heelbulb)中出现裂缝。这些裂缝刺激蹄部真皮(pododerm)，这会产生更多角。从这个阶段开始，情况只会变得更糟。

胼胝或趾间增生是爪之间的皮肤的增生性炎症反应，但通常具有上述莫特拉罗病变。因此，病理起因于由密螺旋体和坏死梭杆菌引起的感染。

甲沟炎或趾间蜂窝织炎是急性软组织炎症，其特征在于蹄肿胀、发红。这些疾病是由细菌，具体地说，化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes)和坏死梭杆菌引起的。

蹄叶炎或弥漫性无菌性蹄皮炎是呈黄色/红色并且甚至可能变成蓝色的足底病变并且可能发展成溃疡。

腐蹄病是通过牧草、垫草或被受感染动物污染的途径传播的细菌性疾病。这种疾病的特征首先在于趾间空间的发红，并且然后，动物变得跛行并且有带难闻气味的渗出病变。然后，角开始腐烂、爪的某些部分坏死并且脱离动物的脚。

球体糜烂被定义为后跟区中球体的角的不规则损失，通常呈深斜槽的形式。这种细菌感染会使足跟腐烂。足趾坏死是牛脚远端的病变，这会引起偶尔严重的跛行。

蹄皮炎是通常位于脚的爪或蹄周围的皮肤的细菌性感染。已经在有蹄类动物中鉴别出了以下疾病：无菌性蹄皮炎(急性无菌性蹄皮炎(Pododermatitis aseptica acuta)、慢性无菌性蹄皮炎(Pododermatitis aseptica chronica))、化脓性蹄皮炎(Pododermatitis purulenta)、溃疡或慢性疣状蹄皮炎(canker or chronic verrucouspododermatitis)(慢性疣状蹄皮炎(Pododermatitis chronica verrucosa))、某些形式的坏疽(坏疽性蹄皮炎(Pododermatitis gangraenosa))、坏死性蹄皮炎(Pododermatitisnecrotica)、感染性蹄皮炎(Pododermatitis infectiosa)和慢性增生性蹄皮炎(Pododermatitis chronica hyperplastica)。

因此，上述组合物可以如上所述用来改善患有由上述疾病引起的跛行的动物的生活质量。确实，本发明的细菌混合物对引起所述疾病的细菌的进展具有限制作用。

通过限制病原菌的增殖，细菌混合物还具有预防作用，并且因此预防由此产生的跛行。

有利的是，本发明涉及一种如上文所定义的供使用的组合物，所述组合物呈旨在喷洒于或用于盆中的液体形式。

根据本发明的组合物不仅具体地以粉末的形式提供，而且还可以以液体的形式提供，以便更容易涂敷于有蹄类动物的脚。液体形式的这一涂敷可以通过直接喷洒或雾化到已被感染的脚上或出于预防目的仅直接喷洒或雾化到健康的脚上来实施。还可以提供被置于动物在其中行走的足浴中的液体形式的组合物，这使本发明的组合物接触有蹄类动物的脚。

更有利的是，本发明还涉及一种用于上述用途的组合物，其中所述组合物在至少一(1)升液体但最多5升液体中稀释以用于50只到60只动物。

在本发明的上下文中，有利的是将上述细菌组合物稀释在1升到5升的液体体积中以便通过喷洒来治疗50只到60只动物。

在本发明中，“至少1升液体但最多5升液体”规定，当有50只到60只动物有待治疗时(或100只到120只后脚，这是受影响最严重的脚)，可以将组合物稀释为1l、1.5l、2l、2.5l、3l、3.5l、4l、4.5l或5l。

约1l的体积特别有利于通过喷洒在脚上而具体实施的涂敷。最大的体积并且具体地说，5l是最适合足浴的。然而，最大体积可以用于喷洒或雾化。

对于100只动物，也可以使上述体积成比例地加倍，并且本领域技术人员将会知道如何进行适当的转换。

当如上所述稀释时，根据本发明的组合物具体来说是在属于水、盐水(按总体积计0.9wt.％盐溶液)或生理学上可接受用于皮肤涂敷或动物蹄角涂敷的任何其它液体的液体中。

所使用的液体还可以含有生理学上可接受的添加剂并且当液体为水时具体来说含有硫代硫酸盐。事实上，硫代硫酸盐可以中和各个水公司供应的自来水中所含的氯。液体还可以含有盐和/或染料。重要的是添加剂不会对本发明组合物中所含的细菌的活力产生影响。

有利的是，本发明涉及一种用于上述用途的组合物，其中所述组合物每3天一次到每15天一次涂敷于有蹄类动物的脚部。

用于预防动物跛行或改善动物的生活质量的适当治疗剂量是每3天一次到每两周一次地使用。

在本发明中，“每3天一次到每15天一次”意指每3天一次、每4天一次、每5天一次、每6天一次、每7天一次、每8天一次、每9天一次、每10天一次、每11天一次、每12天一次、每13天一次、每14天一次或每15天一次。

以永久方式治疗患有上述疾病的牛群是有利的。然而，治疗可以根据季节和动物的活动(特别是如果动物吃草的话)向下调节。

本发明还涉及一种如上文定义的组合物，其在治疗涉及有蹄类动物的足部寄生虫或细菌感染的疾病的情况下与至少一种消毒剂组合使用，所述至少一种消毒剂在使用所述组合物之前至少48小时使用。

在本发明中，在使用上述组合物之前，可以用消毒剂治疗有蹄类动物的脚。因此，必须在使用根据本发明的组合物之前至少48小时停用消毒剂，以免杀死组合物所含有的细菌。

所使用的消毒剂可以是本领域技术人员常用的那些，即，抗生素(例如用于母牛的土霉素)、甲醛、硫酸锌或硫酸铜、或石灰。可以使用本领域技术人员已知的其它消毒剂。

根据以下四个实例和11个附图将会更好地理解本发明：

附图说明

图1是示出了在用根据本发明的组合物进行治疗的不同日期参考母牛的脚部病状的平均评级的进展的曲线图。

图2是示出了在用根据本发明的组合物进行治疗的不同日期参考母牛的跛行的平均评级的进展的柱状图。

图3A和图3B是示出了参考母牛的4类跛行的分布的饼图。不同的类别如下：类别0呈黑色、类别1呈白色、类别2呈灰色并且类别3呈阴影。

图3A示出了试验开始时的比例。

图3B示出了试验结束时的比例。

图4是示出了在用根据本发明的组合物进行治疗的不同日期参考母牛的脚部病状的平均评级的进展的曲线图。

图5是示出了在用根据本发明的组合物进行治疗的不同日期参考母牛的跛行的平均评级的进展的柱状图。

图6A和图6B是示出了参考母牛的4类跛行的分布的饼图。不同的类别如下：类别0呈白色、类别1呈阴影、类别2呈黑色并且类别3呈黑色。

图6A示出了试验开始时的比例。

图6B示出了试验结束时的比例。

图7是示出了在用根据本发明的组合物进行治疗的不同日期参考母牛的脚部病状的平均评级的进展的曲线图。

图8是示出了在用根据本发明的组合物进行治疗的不同日期牛群中母牛的脚部病状的平均评级的进展的曲线图。

图9是示出了在用根据本发明的组合物进行治疗的不同日期牛群中母牛的脚部病状的平均评级的进展的曲线图。

图10是示出了在用根据本发明的组合物进行治疗的不同日期牛群中母牛的脚部病状的平均评级的进展的曲线图。

图11是示出了在用根据本发明的组合物进行治疗的不同日期参考母牛(带三角形的曲线)与牛群中母牛(带正方形的曲线)的脚部病状的平均评级的进展的曲线图。

图12A到图12D示出了展示在治疗开始后每个月健康脚(浅灰色)与问题脚(深灰色)在绵羊的四只脚中所占比例的曲线图。

图1A示出了左前脚的结果：柱1：1月—健康80.1％，问题19.9％；柱2：2月—健康81.4％，问题18.6％；柱3：3月—健康93.1％，问题6.9％；柱1：4月—健康92.9％，问题7.1％。

图1B示出了右前脚的结果：柱1：1月—健康80.1％，问题19.9％；柱2：2月—健康81.4％，问题18.6％；柱3：3月—健康90.3％，问题9.7％；柱1：4月—健康91.5％，问题8.5％。

图1C示出了左后脚的结果：柱1：1月—健康82.6％，问题17.4％；柱2：2月—健康81.1％，问题18.9％；柱3：3月—健康91％，问题9％；柱1：4月—健康88.5％，问题11.5％。

图1D示出了右后脚的结果：柱1：1月—健康82.9％，问题17.1％；柱2：2月—健康81.1％，问题18.9％；柱3：3月—健康91.3％，问题8.7％；柱1：4月—健康87.8％，问题12.2％。

实例：

实例1：细菌混合物的制备

在本发明的上下文中，发明人预先准备了含有以下制剂的烧瓶：

制剂1＝20ml烧瓶

-4种芽孢杆菌NOL01、NOL02、NOL03和NOL04的混合物，呈孢子化形式，每个菌株的浓度为10⁵个到10¹¹个菌落/毫升。将四种菌株等份地混合在一起，各自的比例为25:25:25:25。

-将混合物保持在-21℃与-80℃之间的温度下。

制剂2＝20ml烧瓶

-浓度为10⁵个到10¹¹个菌落/毫升的乳酸菌NOL11。

将细菌保持在-21℃与-80℃之间的温度下。

然后，本发明人制备了用于剩余实验的组合物：

-混合物：1烧瓶制剂1+1烧瓶制剂2。

实例2：关于涂敷根据本发明的组合物对患有莫特拉罗病的奶牛群的影响的研究

这项试验在先期测试之后，所述先期测试示出了在将本发明的组合物涂敷于母牛的后脚之后，一个牛群的莫特拉罗病病例减少。这项新试验的目的是：

-确认4个新牛群的结果，以确定本发明组合物对莫特拉罗病的效果，

-比较组合物与已经对牛群使用的预防性治疗的效果，

-定量测量这种治疗的功效。

对5群荷斯坦母牛实施试验，在试验中，将产品喷洒在动物的后脚上。通过监测牛群的健康状况(经兽医治疗的莫特拉罗病病例的计数和进展)来测量本发明组合物的效果。

I-牛群的特性

牛群1：诺曼底(Normandy)(卡尔瓦多斯省(Calvados)；法国)，关注

母牛数	160/170
		挤奶	3个Delaval机器人
批次数	2
		畜舍	稻草垫畜栏
更换稻草垫的频率	每天
		稻草量	高
头锁	有，但不是全部都有
		刮擦	自动，每天3次到4次
水源	钻井
		水处理	无
目前的莫特拉罗治疗	抗生素足浴+机器人消毒喷雾

牛群2：诺曼底(卡尔瓦多斯省；法国)

牛群3：诺曼底(滨海塞纳省；法国)

牛群4：诺曼底(卡尔瓦多斯省；法国)，关注

母牛数	100
		挤奶	2个机器人
批次数	--
		畜舍	稻草垫畜栏
稻草量	适度
		头锁	有
刮擦	自动
		水源	--
水处理	对氯进行处理
		目前的莫特拉罗治疗	干足浴

牛群5：诺曼底(卡尔瓦多斯省；法国)

母牛数	47+7头不产乳母牛
		挤奶	1个Delaval机器人
批次数	1
		畜舍	稻草垫畜栏
稻草量	--
		头锁	有
刮擦	--
		水源	钻井
水处理	对氯进行处理
		目前的莫特拉罗治疗	喷雾罐中的抗生素

II-所使用产品以及材料

从两个单独的20ml烧瓶制备根据本发明的组合物剂量：

·含有芽孢杆菌NOL01、NOL02、NOL03和NOL04的烧瓶1，

·含有乳球菌NOL11的烧瓶2，

如实例1所描述的。

烧瓶在其培养基中含有活细菌。烧瓶在冷冻状态下提供给农场，并且一旦收到就必须保存在冷冻机中。产品在雾化前在水中进行解冻和稀释，并且然后通过雾化进行喷洒。雾化期间使用的水不能含有氯，并且因此可能需要用硫代硫酸钠对水进行先期处理。

试验持续2个月，每周进行一次治疗。

由农民用抗生素组合物或与根据本发明的组合物中的细菌不相容的组合物实施的脚部治疗在首次涂敷根据本发明的组合物之前3天停用(第00周结束时)。产品的首次涂敷将会在第一周(2月伊始)实施。

在试验开始之前，与农民一起对牛群的健康状况实施情景分析。这项评定构成了起点，并且正是根据这项参考评估了进展。由于在试验中的大多数牛群中通过抗生素治疗或其它治疗来稳定牛群的健康状况，因此这从试验开始就停止。

农民报告其对牛群的健康状况的观察，并且定性记录在农民访视期间由技术人员保存。产品在第9周完成涂敷。

III-治疗

用法：以液体形式涂敷。每周的治疗需要一剂产品(由烧瓶B和L构成)。

治疗基于在5l水中稀释的剂量以用于治疗母牛的后脚。喷洒产品的量为每只脚约25ml(或喷洒约3秒)或者约5l产品以用于治疗100头奶牛的后脚。

制备溶液的步骤：

·使产品在15℃与25℃之间的环境温度下解冻，直到产品完全液化(约1小时±15分钟)

·在雾化器的储液器中准备5l水并且加入80mg硫代硫酸钠或10ml若液体溶液(如果水经过过氧化氢处理，则一直使用矿泉水或未经处理的水)。

·取出胶囊并移除烧瓶塞

·将两烧瓶产品倾倒入处理过的水中，并且加入约10ml E133染料(食品级亮蓝色染料)。

·混合以使产品均化，并且然后使产品静置15分钟

·按照每只脚约25ml喷洒母牛的后脚

·此治疗应当在试验的每周重复进行(总共9次治疗)。

对于牛群5，制备稀释成5l的剂量的溶液，所述溶液通常提供给100头母牛，但是仅一半溶液用于涂敷，并且其余溶液被处理掉。

IV-对措施和分析的描述

1-针对所有牛群的共性措施

每头参考母牛的病状的评级：

在试验的第一天，紧密地跟踪被农民鉴别为受到严重感染或特别容易受莫特拉罗病影响的大约十二头牛。由农民按0到10的等级给出每头母牛的病状的指示性评级，其中0表示健康母牛并且10表示被严重感染的母牛。

2-牛群的病状的总体评级：

农民还按0到10的等级给出了其牛群的病状的总体评级，其中0表示完全健康的牛群，并且10表示100％的被感染动物。

3-母牛的脚的照片，涂敷：

拍摄母牛后脚的照片，以便在不抬起脚的情况下，给出在农场的可能观察的以及Mortellero病病例的临床体征的图像。还拍摄了制备和涂敷的照片。

4-参考母牛的跛行评级：

根据以下矩阵给出参考母牛的跛行评级：

0：活动性良好—将重量和步速均匀分布在四只脚上行走，背部平坦。母牛可以长时间平稳地大步行走。

1：活动性有缺陷—行走能力不均匀(在重量或步速的分布方面)或下降；影响一个或多个脚，难以鉴别。

2：活动性降低—用易于鉴别的脚行走不均匀和/或步幅大大减小(通常与拱背相关)。

3：活动性严重降低—无法像人类那样步伐轻快地快速行走(无法跟上健康牛群)并且有2分以上的迹象。

5-针对牛群2的具体措施

洗涤期间母牛反应的评级：

在洗涤脚时给出母牛反应的评级。在莫特拉罗病的急性期发现的病变非常敏感，并且因此洗涤病脚时使用的水射流常常会激起母牛的反应，母牛会抬起或移动自己的脚。因此，使用以下评级来记录每个后脚的这一反应：

无反应-轻微反应-强烈反应

6-针对牛群5的具体措施

所有母牛的后脚的照片：

在这个农场，牛群中所有母牛均进入修剪笼(租用的或由修剪者进行操作)，并且拍摄每只后脚的照片。使用这些照片，根据以下矩阵对每只脚进行评级：

M0：健康。无趾间皮炎病变的健康母牛

M1：早期。边界清晰的病变，有“草莓色皮肤”外观，呈粉红色或灰色，小于2cm。通常很痛。

M2：急性期。由于母牛过敏和疼痛而使母牛跛行的病变。蹄角(1)边缘或爪(2)周围的局部皮肤溃疡。进展：凸起的小结节(3)或细丝(浓密毛发)(4)处的皮肤的慢性炎症和生长。常常覆盖有带恶臭的脓。

M3：愈合期。在有效治疗后出现；病变被黑痂覆盖并且变得不敏感。恢复可以是彻底的(返回到M0时期)或部分的(M4时期)

M4：疾病感染源(disease reservoir)。慢性、不活跃的、干性且不敏感的病变。生长有浓密毛发的厚重皮肤

M4-1：具有M4病变活性的M1形式，常常没有明显的边缘。

7-农民进行的记录

如果农民已经定期记录了与跛行有关的问题，则记录被收集并用于评估产品的效果(例如，跛行母牛的数量、个体处理、由于这个原因而进行的母牛宰杀等)。

还记录了农民对治疗总体效果的看法以及任何观察或评论。

同样，如果农民有关于莫特拉罗病/跛行或兽医治疗的频率的历史记录，则使用这些数据来获得与试验时期的比较点。

V-结果

牛群2

牛群2的结果：脚部病状评级

观察到问题母牛平均增加2.7个点，18头母牛中有16头母牛的跛行减少。其它两头母牛状况稳定。

图1中示出了试验过程中平均评级的进展。

跛行结果：跛行评级

在试验结束时，18头母牛中有11头母牛的跛行类别有所减少，并且未在监测的母牛中观察到恶化。结果示出在图2和图3A到图3B中。

这个牛群的结果很乐观。

在用根据本发明的组合物治疗之前，母牛每周一次接受以下治疗：

1.在挤奶室洗涤母牛脚部

2.甲醛足浴、硫酸铜和硫酸锌，其中足浴在这2个批次之间进行更换

在试验期间，每周一次通过以下方式对动物进行治疗：

1-在挤奶室洗涤母牛脚部(仅在试验的前半部分)

2-在挤奶室用喷雾器涂敷根据本发明的组合物。

根据本发明的治疗使得可以每周进行7次到8次土霉素治疗到在同一时期内进行一次或三次治疗。尽管在试验之前母牛感染的气味非常明显，但这种气味大大减少。

据农民所说，在未在挤奶室洗涤母牛脚部的情况下，微生物群落与所使用材料的涂敷比足浴系统的限制性要小。

关于修剪，在试验结束前2周对所有牛群进行修剪，而无需将试验告知修剪者。修剪者得出结论，这是他们第一年没有提到与皮炎有关的问题(牛群的污染＜5％)。

牛群3

牛群3的结果：脚部病状评级

观察到问题母牛平均增加2.9个点。14头母牛中有11头母牛的脚部病状有所改善，最后2周除外。在最后两周，刮擦问题导致生活区域的清洁度恶化，这可能增加了环境细菌计数并且对2头参考母牛的状况产生影响。

图4中示出了试验过程中平均评级的进展。

跛行结果：跛行评级

在试验结束时，14头母牛中有9头母牛的活动性良好、3头母牛未改变并且2头母牛已经恶化。然而，应该注意的是，所有参考母牛均改善一个类别。图5和图6A到图6B中示出了结果。

这个牛群的结果也很乐观。

在用根据本发明的组合物治疗之前，母牛接受甲醛足浴作为治疗。

在试验期间，在有头锁的情况下每周一次通过以下方式对动物进行治疗：使用喷雾器涂敷根据本发明的组合物。

据农民所说，在治疗前，经常发生大量跛行病例。治疗之后，只有2到3头母牛有问题，并且只有几只母牛对组合物应答不良。

农民相信了组合物的功效，即便其在试验前持怀疑态度。

牛群5

牛群5的结果：脚部病状评级

观察到问题母牛平均增加4.2个点，其中16头母牛中有15头母牛表现出脚部病状的改善。只有一头母牛状况不佳。

图7中示出了试验过程中平均评级的进展。

这个牛群的结果再次非常乐观。

在用根据本发明的组合物治疗之前，母牛通过机器人接受消毒剂涂敷(4个蹄)。

在治疗之前，分别用土霉素来治疗被严重感染的母牛。在涂敷根据本发明的组合物之后，这些治疗都不是必需的。

据农民所说，牛群得到了很好的改善，并且事实上，显著较少母牛需要陪护到挤奶室那么远。

牛群1：农民想要停止试验，因为他不得不停止他以前的做法(每天消毒，每周交替使用过氧化氢与漂白剂)并且他看到一周后他的牛群的病状恶化。

牛群3：试验自发明人看到农民在他的畜栏改变了吸收剂起停止，从常规的吸收剂切换成早晚涂敷的熟石灰。由于熟石灰具有消毒的性质，所以其它与本发明的组合物不相容。农民选择停止试验，而不是停止使用石灰。

图8到图10示出了3个农场的牛群的总体进展。

在涂敷根据本发明的组合物之后的这些结果仅在第一次涂敷后约3周可见，这是根据本发明的组合物中含有的细菌所需的时间。

停止稳定牛群病状的先前常规治疗有导致在用根据本发明组合物治疗的前2周恶化的风险。因此可能需要单独治疗每头母牛。

实例3：降低涂敷频率的测试

发明人想要测试将涂敷频率降低到每2周一次是否允许稳定情况在每周涂敷持续2个月后保持。

为此，稍微修改了前一个实例中描述的方案。对于牛群2，从2016年3月30日开始，农民切换成在等效剂量下每2周涂敷一次(对于牛群中的190头母牛，按100头母牛使用2剂)。

对于牛群5，从2016年4月15日开始,，农民切换成在等效剂量下每2周涂敷一次(对于牛群中的55头母牛，按100头母牛1剂)。

牛群3：

在治疗减少之后，参考母牛的病状继续改善并且稳定下来，脚部状况良好。此外，牛群的总体病状稳定下来，脚部状况良好。

从4月起，牛就外出了。

从每周涂敷一次切换成每两周涂敷一次使牛群的整体情况稳定下来，与脚部问题相关的状况良好。未观察到恶化。

结果示出在图11中。

下表示出了所获得的值：

母牛编号	10/02/16	17/02/16	24/02/16	02/03/16	09/03/16	16/03/16	23/03/16	07/04/16	27/04/16	11/05/16	25/05/16
												5722	10	9	9	9	9	9	9	9	7	7	6
2095	8	7	6	5	4	4	3	2	2	2	2
												5377	8	8	7	5	4	3	3	3	3	3	2
5794	8	8	7	5	5	5	5	4	2	2	2
												2105	7	6	6	4	3	3	2	1	1	2	1
5795	8	6	6	5	4	3	2	1	1	1	1
												5801	10	7.5	7	6	6	6	5	4	3	3	2
5728	7	6	6	6	6	5	3	2	2	3	2
												5788	7	6	5	4	4	3	3	2	2	2	2
1937	6.5	6	5	3.5	3	2	1	0	0	0	0
												2082	7	7	6	4.5	3	3	2	1	1	1	1
1826	8	7	6	6	6	5	5	4	3	3	2
												2077	7	6	6	4.5	3	2.5	2	1	1	1	1
5581	4	4	3.5	2	1.5	1	1	0	0	0	0
												2029	4	3	2	1.5	1	1	1	0	0	0	0
2108			10	8	6	4	3	3	2	2	2

对于牛群1：

在用于强化涂敷本发明的组合物的方案(脚部+建筑物)之前需要抗生素治疗的过渡阶段之后，牛群的总体状况显著改善。

据农民所说，他看到了他一年半以来从未经历过的情况。他试图通过切换到10/12天来略微分开涂敷，但他发现从脚开始变成粉红色开始不可以超过12天，这是症状重现的迹象。

对于牛群5：

观察到牛群的健康状况由于畜舍保养不当而严重恶化，这是由人为错误引起的。

重新取得对照物，并且用根据本发明的组合物实施对脚部和环境的强化涂敷持续1个月，以恢复牛群的健康状况。

牛群的当前病状已经得到改善，并且对牛群的修剪已经开始。

在母牛进入牧场时期，病原菌计数较低(不太常去受污染区域)，并且每2周或更长时间涂敷一次不会引起牛群的脚部病状恶化。

实例4：关于将根据本发明组合物涂敷于绵羊群的影响的研究

在这个实例中，发明人想要测试在腐蹄病的情况下根据本发明的组合物用于治疗或改善绵羊跛行的效率。

在比利牛斯-大西洋省(Pyrénées-Atlantiques department)的农场，对一群300只Lacaune品种的绵羊实施试验。

借助于足浴垫通过每周涂敷一次微生物群落持续12周用根据本发明的组合物对绵羊进行治疗。在每个涂敷日，绵羊经过垫子两次(每次挤奶一次)。

将构成根据本发明的组合物的细菌以代表40ml如实例1所描述的组合物的一剂的比率用在具有亮蓝色E133染料和硫代硫酸盐的30l水中，并且然后将溶液倾倒入足浴中。

结果

整体结果在下表中列出：

	1月	2月	3月	4月
					绵羊数	281	291	288	295
问题绵羊	91	106	94	113
					没问题	190	185	194	182
1只脚	5	0	89	110
					2只脚	69	103	5	3
3只脚	3	0	0	0
					4只脚	14	3	0	0

发现比例如下：

	1月	2月	3月	4月
					没问题	68％	64％	67％	62％
1只脚	2％	0％	31％	37％
					2只脚	25％	35％	2％	1％
3只脚	1％	1％	0％	0％
					4只脚	5％	0％	0％	0％

在绵羊的问题脚数分布上，各个日期之间的2×2卡方检验：

p值	1月	2月	3月	4月
					1月	/
2月	2.26E-04	/
					3月	2.20E-16	2.20E-16	/
4月	2.20E-16	2.20E-16	0.2214	/

除了3月与4月之外，日期之间的分布有显著差异。

在试验的第一天出现问题的绵羊在问题脚的数量方面几乎都有所改善。

然而，在停止先前的治疗之后的前几周，可能出现恶化。

在试验开始与结束之间，在整个试验中存在的82只问题绵羊中，79只绵羊在类别上有所减少。试验结束时的问题绵羊是不同的绵羊。

图12A到图12D中示出了按脚分解的结果。

这些结果表明，试验开始时整个试验中存在的96％的问题绵羊在治疗之后至少减少了一只问题脚。

另外，在试验结束时，不存在具有2个或更多个问题脚的绵羊。

总之，这些结果示出了根据本发明的组合物在跛行问题上的功效。

本发明不限于这里列出的实施例，并且其它实施例对本领域技术人员而言将会变得清楚。

Claims

1.一种将包括细菌混合物的组合物用于制备预防和改善患有涉及足部寄生虫或细菌感染的疾病的有蹄类动物的病状的药物的应用，所述组合物包括：

至少一种芽孢杆菌属(genus Bacillus)细菌菌株，尤其至少一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，

以及至少一种乳酸细菌菌株，尤其至少一种乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)或至少一种戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，

其中所述组合物含有：

以下四种枯草芽孢杆菌菌株中的至少一种：NOL01、NOL02、NOL03和NOL04，所述菌株分别以编号CNCM I-4606、CNCM I-5043、CNCM I-4607和CNCM I-4608存放于CNCM，以及

选自以下乳酸菌的至少一种乳酸菌：乳酸乳球菌乳酸亚种1(Lactococcuslactis spplactis 1)菌株NOL11和戊糖片球菌2菌株NOL12，所述菌株分别以编号CNCM I-4609和CNCMI-4610存放于CNCM。

2.根据权利要求1所述的应用，所述组合物含有10⁵个到10¹¹个芽孢杆菌菌落和10⁵个到10¹¹个乳酸菌菌落，所述细菌菌落以组合物的毫升数或克数计。

3.根据权利要求1所述的应用，其中所述至少一种芽孢杆菌菌株呈孢子化形式和/或营养体形式。

4.根据权利要求1所述的应用，其中涉及有蹄类动物的脚部的寄生虫或细菌感染的所述疾病选自莫特拉罗病(Mortellaro disease)、趾间皮炎、或胼胝、甲沟炎或蹄叶炎、或腐蹄病(foot rot)、球体糜烂(bulb erosion)、足趾坏死(toe necrosis)和蹄皮炎。

5.根据权利要求1所述的应用，所述组合物呈旨在喷洒于或用于盆中的液体形式。

6.根据权利要求1所述的应用，其中所述组合物稀释在至少1升液体到最多5升液体中以用于50只到60只动物。

7.根据权利要求1所述的应用，其中所述组合物每3天一次到每15天一次涂敷于所述有蹄类动物的脚部。

8.根据权利要求1到7中任一项所述的组合物的应用，在治疗涉及所述有蹄类动物的足部寄生虫或细菌感染的疾病的情况下，所述组合物与至少一种消毒剂组合地使用，

所述至少一种消毒剂在使用所述组合物之前至少48小时使用。