CN110243852A - 植物叶片蜡质含量测量方法 - Google Patents

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Abstract

本发明植物叶片蜡质含量测量方法，包括如下步骤：S1，确定植物叶片中蜡质的最佳提取时间；S2，获取植物叶片中蜡质的含量。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：将植物叶表皮蜡质形态观测与其测定相结合，利用电镜扫描观测不同提取时间下的蜡质形态，准确确定了不同植物叶片的最佳提取时间。在最佳提取时间下进行叶片蜡质物质的提取和测定，能较好地规避植物叶片所带来的一些杂质，保证叶片蜡质提取的效果。

Description

植物叶片蜡质含量测量方法
技术领域
本发明属于环境样品污染物检测领域，具体涉及一种基于电镜扫描确定最佳提取时间的植物叶片蜡质含量测量方法。
背景技术
植物的表皮蜡质通常被认为是一类不溶于水而易溶于有机溶剂的混合物，它覆盖于植物各器官和组织表面，是植物进行自我防护的一道屏障。它的组成成分复杂，不同的植物组成成分也不同，主要是由碳原子数在20～34碳之间的特长链脂肪酸及其衍生物(包括烷烃、醇、醛、脂肪酸和酯等)组成，还包括萜类和其他微量次级代谢物，如固醇和类黄酮类物质。蜡质在植物适应干旱环境以及各种非生物和生物逆境过程中发挥重要作用，如限制非气孔性水分散失、抵抗紫外辐射、抵御病虫害以及防止温度胁迫侵害植物内部组织等。另外蜡质对植物叶片和果实的形态发育和花粉发育也有重要影响，进而影响植物的育性。前人的研究表明，植物蜡质具有很好的生态学功能，为植物适应不同生境提供保证，而蜡质的物理和化学属性是其生态学功能得以实现的基础。
目前植物叶片蜡质含量的测定主要是根据经验设置提取时间，对采集的叶片样品进行三氯甲烷提取，然后采用称量法或气相色谱测定法进行测定，但具体提取时间尚无科学统一的认定。
现有技术，中国发明专利《定量评估植物叶片滞留不同粒径颗粒物质量及总量的方法》(申请号：201710508678.4)公开了定量评估植物叶片滞留不同粒径颗粒物质量及总量的方法，先将采集的植物叶片用水清洗，然后对该洗涤液进行分级过滤处理，再对各级过滤处理后的滤膜进行烘干并得到烘干后滤膜的质量，得到叶面滞留的不同粒径颗粒物质量；再将用水清洗后的叶片用有机溶剂清洗，然后对该洗涤液进行分级过滤处理，再对各级过滤处理后的滤膜进行烘干并得到烘干后滤膜的质量，得到叶蜡质中包裹的不同粒径颗粒物质量；再对用水清洗分级过滤和用有机溶剂清洗分级过滤后的最后一级过滤液进行TDS的测定；最后通过以上得到的数据计算植物叶片滞留不同粒径颗粒物质量及总量。本发明能够精确植物叶片滞留的PM>10、PM10、PM2.5-10、PM0.1-2.5等不同粒径范围颗粒物质量及颗粒物总量。
但是，由于植物自身的生物学分类的不同，在长期进化的过程中，不同科属的植物叶片蜡质含量也有较明显的差异。在测定叶片表面蜡质的时候，用三氯甲烷提取除蜡时间上各种植物也存在较大差异。提取时间过短则蜡质无法充分除去，提取时间过长则会使得叶片表皮细胞遭到破坏而使得一些脂溶性物质被提取出来。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种解决上述技术问题的植物叶片蜡质含量测量方法。
为了解决上述技术问题，本发明植物叶片蜡质含量测量方法，包括如下步骤：
S1，确定植物叶片中蜡质的最佳提取时间；
S2，获取植物叶片中蜡质的含量。
优选地，S1包括：
S1.1，制备不同提取时间的植物叶片成为观测样本；
S1.2，获取植物叶片表皮蜡质形态。
优选地，S1.1包括：
S1.1.1，将待测样品切割成待测样品块；
S1.1.2，将待测样品块置于三氯甲烷溶剂中；
S1.1.3，放入震荡仪中进行震荡；
S1.1.4，在不同的提取时间分别提取待测样品块。
优选地，S1.1.1中，对阔叶植物切割成1cm×1cm的正方形待测样品块，对针叶植物切成长度为1cm的待测样品块。
优选地，S1.1.4中在不同的提取时间分别提取三块待测样品块。
优选地，S1.1.4中，在30s、1min、2min、5min、10min、15min及20min分别提取待测样品块。
优选地，S1.2包括：
S1.2.1，通过扫描电镜获取在各个不同的提取时间及放大倍数下提取的待测样品块的处理照片；
S1.2.2，将处理照片与原始照片进行比较，确定植物叶片中蜡质的最佳提取时间；其中最佳提取时间为叶表皮凹凸不平的结构突出明显，且叶表皮基本结构未被破坏的时间。
优选地，S1.2.1中，放大倍数为200倍、500倍、1000倍、2000倍、5000倍及10000倍。
优选地，S2中，通过称重法获取植物叶片中蜡质的含量；
其中，W为单位叶面积蜡质含量，M1为锥形瓶质量，M2为锥形瓶和蜡质物质总质量，S为测试叶片面积。
优选地，还包括S0，选取不同的植物叶片；其中
植物叶片分别位于间隔至少100m的树木上、植物叶片生长在离地2m-3m处、且植物叶片分别位于东南西北四个方向。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：将植物叶表皮蜡质形态观测与其测定相结合，利用电镜扫描观测不同提取时间下的蜡质形态，准确确定了不同植物叶片的最佳提取时间。在最佳提取时间下进行叶片蜡质物质的提取和测定，能较好地规避植物叶片所带来的一些杂质，保证叶片蜡质提取的效果。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显。
图1为本发明植物叶片蜡质含量测量方法流程图；
图2为不同时间提取香樟叶片表皮蜡质后的背面扫描电镜观察图；其中
图2A为香樟原始照片；图2B为在30s时提取的香樟叶片；图2C为在1min时提取的香樟叶片；图2D为在2min时提取的香樟叶片；图2E为在5min时提取的香樟叶片；图2F为在10min时提取的香樟叶片；图2G为在15min时提取的香樟叶片；图2H为在20min时提取的香樟叶片；
图3为不同时间提取雪松叶片表皮蜡质后的背面扫描电镜观察图；其中
图3A为雪松原始照片；图3B为在30s时提取的雪松叶片；图3C为在1min时提取的雪松叶片；图3D为在3min时提取的雪松叶片；图3E为在5min时提取的雪松叶片；图3F为在10min时提取的雪松叶片；
图4为不同时间提取桂花叶片表皮蜡质后的背面扫描电镜观察图；其中
图4A为桂花原始照片；图4B为在40s时提取的桂花叶片；图4C为在1min时提取的桂花叶片；图4D为在4min时提取的桂花叶片；图4E为在5min时提取的桂花叶片；图4F为在10min时提取的桂花叶片；
图5为某生长季十种代表植物叶片蜡质含量图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
1、样品采集及预处理
2018年5月，于上海市闵行区上海交通大学闵行校区校园内，以垂柳、池杉、桂花、广玉兰、龙柏、水杉、雪松、香樟、银杏和二球悬铃木十个树种为目标树种，选取5棵成熟的(树龄10-20年)、大小相似、生长健康且外表无损伤的乔木，且两棵树之间间隔至少100m。在离地2-3m处，从东南西北四个方向分别采集健康完整的叶片，混合后作为一个样品。样品采集后，迅速放入聚乙烯袋中，避光运回实验室。将叶片用流动水冲洗三遍，再用去离子水冲洗三遍并擦干，待用。
2、确定叶片蜡质提取最佳时间：
2.1制备不同提取时间的植物叶片观测样本
将采集的待测样品用小刀切成1cm×1cm的小块多块(针叶树种切成1cm的长度即可)，并将其置于30mL三氯甲烷溶剂中，放入震荡仪中于常温下加速提取，控制提取时间分别在30s、1min、2min、5min、10min、15min和20min，再用镊子将叶片于溶液中取出，擦净表面三氯甲烷，再放入冻干机中吹干，作为观察样本。
2.2利用扫描电镜观测植物叶片表皮蜡质形态
将每个树种在各个时间下的样本用导电胶粘在托盘上，抽真空后喷金镀膜，置于扫描电镜下观察。每个样本每个时间下于200、500、1000、2000、5000、10000不同的放大倍数下拍摄腹、背两面表皮蜡质残留情况的照片，与未经提取处理的样本照片进行比较，进而确定每个树种最佳的蜡质提取时间，如图1所示。
以雪松、桂花、香樟为例，香樟不同时间提取叶片表皮蜡质后的背面扫描电镜观察如图2A～图2H所示。雪松不同时间提取叶片表皮蜡质后的背面扫描电镜观察如图3A～图3F所示，桂花不同时间提取叶片表皮蜡质后的背面扫描电镜观察如图4A～图4F所示。
不同树种叶片蜡质最佳提取时间如表1所示。
表1
树种 腹面最佳时间/min 背面最佳时间/min 最佳时间/min
雪松 2 2 2
桂花 10 10 10
香樟 15 20 20
3、蜡质含量的测定
用电子天平称取锥形瓶的质量，记为M1，再倒入30mL三氯甲烷溶液，将扫描后的叶片放入其中，在25℃和最佳提取时间下，置于震荡仪中以120rpm转速进行震荡处理，再用镊子将叶片取出，将余下的溶液放入通风橱内，待三氯甲烷完全挥发后，再称取锥形瓶与蜡质的总质量，记为M2，由前后两次锥形瓶质量差可算得蜡质的质量。将取出的叶片用扫描仪对其进行扫描，再用ImageJ软件计算其叶面积S。带入公式，则可以计算出叶片蜡质含量：
式中，W为单位叶面积蜡质含量，M1为锥形瓶质量，M2为锥形瓶和蜡质物质总质量，S为测试叶面积。为减小误差，每个树种进行三组重复，取平均值为最终的蜡质含量。
不同树种叶片中蜡质含量如图5所示，ABCD表示在0.05水平上存在显著性差异，abcd表示在0.01水平上存在显著性差异。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (10)

1.一种植物叶片蜡质含量测量方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，确定植物叶片中蜡质的最佳提取时间；
S2，获取植物叶片中蜡质的含量。
2.根据权利要求1所述的植物叶片蜡质含量测量方法，其特征在于，S1包括：
S1.1，制备不同提取时间的植物叶片成为观测样本；
S1.2，获取植物叶片表皮蜡质形态。
3.根据权利要求2所述的植物叶片蜡质含量测量方法，其特征在于，S1.1包括：
S1.1.1，将待测样品切割成待测样品块；
S1.1.2，将待测样品块置于三氯甲烷溶剂中；
S1.1.3，放入震荡仪中进行震荡；
S1.1.4，在不同的提取时间分别提取待测样品块。
4.根据权利要求3所述的植物叶片蜡质含量测量方法，其特征在于，S1.1.1中，对阔叶植物切割成1cm×1cm的正方形待测样品块，对针叶植物切成长度为1cm的待测样品块。
5.根据权利要求3所述的植物叶片蜡质含量测量方法，其特征在于，S1.1.4中在不同的提取时间分别提取三块待测样品块。
6.根据权利要求3或5所述的植物叶片蜡质含量测量方法，其特征在于，S1.1.4中，在30s、1min、2min、5min、10min、15min及20min分别提取待测样品块。
7.根据权利要求2所述的植物叶片蜡质含量测量方法，其特征在于，S1.2包括：
S1.2.1，通过扫描电镜获取在各个不同的提取时间及放大倍数下提取的待测样品块的处理照片；
S1.2.2，将处理照片与原始照片进行比较，确定植物叶片中蜡质的最佳提取时间；其中
最佳提取时间为叶表皮凹凸不平的结构突出明显，且叶表皮基本结构未被破坏的时间。
8.根据权利要求7所述的植物叶片蜡质含量测量方法，其特征在于，S1.2.1中，放大倍数为200倍、500倍、1000倍、2000倍、5000倍及10000倍。
9.根据权利要求1所述的植物叶片蜡质含量测量方法，其特征在于，S2中，通过称重法获取植物叶片中蜡质的含量；
其中，W为单位叶面积蜡质含量，M1为锥形瓶质量，M2为锥形瓶和蜡质物质总质量，S为测试叶片面积。
10.根据权利要求1所述的植物叶片蜡质含量测量方法，其特征在于，还包括S0，选取不同的植物叶片；其中
植物叶片分别位于间隔至少100m的树木上、植物叶片生长在离地2m-3m处、且植物叶片分别位于东南西北四个方向。
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