CN110241190B - 一种获得小鼠死亡时间间隔的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种获得小鼠死亡时间间隔的方法,包括:(1)收集小鼠样本并提取DNA,通过高通量测序对样本口腔微生物进行宏基因组分析;(2)根据口腔微生物群落的结构组成及随死亡时间增加发生的演替规律,获得相对丰度与死亡时间之间存在相关性的物种,并建立死亡时间间隔和物种相对丰度线性回归模型。本发明取样方便,降低了外界环境及检验者主观判断的影响,有利于死亡时间推断精度的提高。
Description
技术领域
本发明属于法医学领域,特别涉及一种获得小鼠死亡时间间隔的方法。
背景技术
死亡时间间隔(postmortem interval,PMI)是指发现、检查尸体时距死亡发生时的时间间隔。死亡时间推断(estimation time of death)指推测死亡至尸体检验时经历或间隔的时间,常常是法医学鉴定中首先要解决的关键和重要的问题。
目前为止,对于早期PMI推断,多侧重于对尸体现象等方面的宏观指标的观察和测量,但由于上述指标观察及检测方法受外界因素影响较大,而且易受观察者的主观经验影响,只能对死亡时间的范围进行粗略推测,根据经验基本可以得到较为接近的结果。对于晚期PMI推断的研究,受尸体自溶和腐败的影响,组织形态逐渐崩解、内源性化学物质不断降解,使形态学变化难以观察、辨认,内源性化学成份难以检测,无法建立相应的PMI推断方法。如何建立一套客观的、重复性好、可定量分析的推断PMI的研究方法,成为法医学亟待解决的难题。
微生物群落作为一种评估PMI的工具具有很好的潜力,原因有以下几点:首先,无论季节如何,微生物总是存在的,细菌尤其以其在诸如温泉和海冰等极端栖息地繁衍生息的能力而闻名。因此,微生物是一种无处不在的物理证据;其次,微生物群落对环境变化的反应往往是可预测的,这使它们成为一种优秀的预测工具;与植物等其他生物生态群落相似,微生物对环境扰动具有连续的响应。
宏基因组(metagenome)是指特定环境中全部生物遗传物质的总和,其决定生物群体的生命现象。宏基因组学(metagenomics)就是一种以环境样品中的全部的微生物群体基因组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析为研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
目前,还未有宏基因组方法应用于PMI推断的相关研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种获得小鼠死亡时间间隔的方法,克服了因为取样困难及检验者主观判断影响造成的预测死亡时间误差比较大的缺陷。
本发明提供了一种获得小鼠死亡时间间隔的方法,包括:
(1)收集小鼠样本并提取DNA,通过高通量测序对样本口腔微生物进行宏基因组分析;
(2)根据口腔微生物群落的结构组成及随死亡时间增加发生的演替规律,获得相对丰度与死亡时间之间存在相关性的物种,并建立死亡时间间隔和物种相对丰度线性回归模型。
所述步骤(1)中的小鼠样本为SPF级ICR小鼠。
所述步骤(1)中的宏基因组分析指对样本的口腔微生物群落的结构组成进行注释并统计。
所述步骤(2)中的演替规律指口腔微生物群落丰度随死亡时间增加逐渐降低。
所述步骤(2)中的物种为变形菌门Proteobacteria、γ-变形菌纲Gammaproteobacteria、肠杆菌目Enterobacteriales、肠杆菌科Enterobacteriaceae和变形杆菌属Proteus。其中,Gammaproteobacteria(γ-变形菌纲)和Proteus(变形杆菌属)是通过小鼠口腔微生物群落演替推断死亡时间的最佳潜在物种。
五个物种的相对丰度随死亡时间间隔变化分别得到的线性回归模型的方程式(x指的是死亡时间间隔,y指的是物种相对丰度)如表1所示:
表1不同物种与PMI之间的数学模型
物种名称 | 生物学分类 | 数学模型 | <![CDATA[R<sup>2</sup>]]> | P value |
Proteobacteria | Phylum | y=0.0017x﹢0.4547 | 0.9407 | 0.030 |
Gammaproteobacteria | Class | y=0.0021x﹢0.3558 | 0.9955 | 0.002 |
Enterobacteriales | Order | y=0.0035x﹢0.0504 | 0.9594 | 0.021 |
Enterobacteriaceae | Family | y=0.0035x﹢0.0504 | 0.9594 | 0.021 |
Proteus | Genus | y=0.0033x﹣0.0444 | 0.9872 | 0.006 |
本发明中使用的五个模型都能实现对小鼠死亡时间间隔的推断,其中Gammaproteobacteria和Proteus两个物种与死亡时间间隔之间建立的数学模型拟合度最好,因此Gammaproteobacteria(γ-变形菌纲)和Proteus(变形杆菌属)是通过小鼠口腔微生物群落演替推断死亡时间的最佳潜在物种。
有益效果
(1)本发明基于高通量测序技术,探讨了小鼠口腔微生物群落演替与死亡时间间隔预测之间的关系,拟合了基于口腔微生物物种相对丰度分析的死亡时间间隔预测模型。
(2)本发明选择口腔作为微生物采样点,与需要解剖的肠道采样相比,口腔采样方便得多。对口腔微生物的分析简化了分析工作,有助于聚焦到与PMI相关的目标物种。
(3)本发明为死亡时间的推断方法提供新的研究思路和基础数据,为人体死亡时间推断方法的发展提供依据。
附图说明
图1为小鼠口腔微生物相对丰度前35个属的热图。
图2为不同PMI时门水平下细菌的相对丰度(A)及变形杆菌门相对丰度变化与PMI呈高度正线性关系(B)。
图3为不同PMI时纲水平下细菌的相对丰度(A)及γ-变形杆菌纲相对丰度变化与PMI呈高度正线性关系(B)。
图4为不同PMI时目水平下细菌的相对丰度(A)及肠杆菌目相对丰度变化与PMI呈高度正线性关系(B)。
图5为不同PMI时科水平下细菌的相对丰度(A)及肠杆菌科相对丰度变化与PMI呈高度正线性关系(B)。
图6为不同PMI时属水平下细菌的相对丰度(A)及变形杆菌属相对丰度变化与PMI呈高度正线性关系(B)。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1.样本采集
(1)本实施例所涉及的动物实验均严格遵守华东理工大学动物实验规章和制度,将42只ICR小鼠分为7组,每组各有3只雌鼠及3只雄鼠。食物和水进行灭菌处理,自由取食,饲养至8周龄。
(2)实验在上海华东理工大学(31.18°N,121.43°E)进行,实验季节选取11月份,以降低噬尸性昆虫造成的干扰,控制室温及湿度,实验过程中温度变化不大,平均温度为22.4℃,相对湿度从33%到41%不等(平均37%),不通风,避光避雨水。
(3)将小鼠颈椎脱位处死,置于无菌纱布和紫外灭菌垫料的干净纸箱中,用于吸收实验中尸体产生的腐败液体,随后进行密封。
(4)选取死亡时间为0h、24h、144h及240h的小鼠进行样品采集,用高温灭菌的棉签蘸取无菌水反复转动擦拭小鼠的口腔,然后转移至无菌的EP管中,一式两份,保存于-80℃,以待研究。
2.CTAB法提取DNA
(1)向装有棉签的EP管中加入适量PBS,充分震荡,丢掉棉签,离心收集样品。
(2)加入1mL CTAB裂解液,加入溶菌酶,65℃水浴,期间颠倒混匀数次,以使样品充分裂解。
(3)离心取上清,加入等体积酚(pH 8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1),颠倒混匀,12000rpm离心10min。
(4)取上清,加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),颠倒混匀,12000rpm离心10min。
(5)吸取上清至1.5mL离心管,加入适量异丙醇,上下摇晃,-20℃沉淀。
(6)12000rpm离心10min,倒出液体,注意不要倒出沉淀。用1mL 75%乙醇洗涤2次,剩余的少量液体可再次离心收集,然后用枪头吸出。
(7)超净工作台吹干或者室温晾干。(DNA样品不要过于干燥,否则很难溶解)
(8)加入ddH2O溶解DNA样品,必要时可于55-60℃下孵育10min助溶。
(9)加RNase A1uL消化RNA,37℃放置15min。
3.PCR扩增及高通量测序
(1)琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度,取适量的样品DNA于离心管中,使用无菌水稀释样品至1ng/μL。以稀释后的基因组DNA为模板,使用带Barcode的特异细菌引物组341F(CCTAYGGGRBGCASCAG)/806R(GGACTACNNGGGTATCTAAT)对总基因组DNA进行PCR扩增,靶向16S rRNA可变区3(V3)和可变区4(V4)。
(2)PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测,然后根据PCR产物浓度进行等量混样,充分混匀后使用1×TAE浓度2%的琼脂糖胶电泳纯化PCR产物,剪切回收目标条带。
(3)使用Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48rxns建库试剂盒进行文库的构建,构建好的文库经过Qubit定量和文库检测合格后,使用Thermofisher的Ion S5TMXL进行上机测序。
该部分实验由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。
4.16S rRNA测序数据处理
使用Cutadapt(V1.9.1)先对reads进行低质量部分剪切,再根据Barcode从得到的reads中拆分出各样品数据,截去Barcode和引物序列初步质控得到原始数据(Raw reads),经过以上处理后得到的Reads需要进行去除嵌合体序列的处理,Reads序列通过(UCHIMEAlgorithm)与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列,并最终去除其中的嵌合体序列,得到最终的有效数据(Clean Reads)。5.OTU聚类和物种注释
利用Uparse软件(Uparse v7.0.1001)对所有样品的全部Clean Reads进行聚类,默认以97%的一致性(Identity)将序列聚类成为OTUs(Operational Taxonomic Units),同时会选取OTUs的代表性序列,依据其算法原则,筛选的是OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列。对OTUs代表序列进行物种注释,用Mothur方法与SILVA的SSUrRNA数据库进行物种注释分析(设定阈值为0.8-1),获得分类学信息并分别在各个分类水平:kingdom(界),phylum(门),class(纲),order(目),family(科),genus(属),species(种)统计各样本的群落组成。使用MUSCLE(Version 3.8.31)软件进行快速多序列比对,得到所有OTUs代表序列的系统发生关系。最后对各样品的数据进行均一化处理,以样品中数据量最少的为标准进行均一化处理,后续的Alpha多样性分析和Beta多样性分析都是基于均一化处理后的数据。
6.构建与PMI推断相关的线性回归模型
根据物种注释的结果,选择不同分类水平上各组丰度最高的前十种,并将其制成柱状累积图,以便直接观察样品,以便直观地观察样品的相对丰度。分析了不同分类学水平的各个物种是否与PMI存在直接的线性关系,并绘制了线性回归模型。此外,选取丰度最高的35属进行聚类,并绘制热图,如图1所示。由图1可知,随着死亡间隔时间的增加,小鼠口腔微生物的物种多样性逐渐减少,虽然是占主导位置的微生物属于相同的门,但其属于的属是不同的,因此再一次证明小鼠口腔微生物的物种组成结构随着PMI的增加是在不断变化的。
由图2-图6可知,Proteobacteria(变形菌门)、Gammaproteobacteria(γ-变形菌纲)、Enterobacteriales(肠杆菌目)、Enterobacteriaceae(肠杆菌科)和Proteus(变形杆菌属)是根据口腔微生物群落的结构组成及随死亡时间增加发生的演替规律,获得相对丰度与死亡时间之间存在相关性的物种。其中Gammaproteobacteria(γ-变形菌纲)和Proteus(变形杆菌属)是通过小鼠口腔微生物群落演替推断死亡时间的最佳潜在物种。Gammaproteobacteria(γ-变形菌纲)适用于推断早期PMI,而Proteus(变形杆菌属)更加适用于推断晚期PMI。
SEQUENCE LISTING
<110> 东华大学
中国科学院西北高原生物研究所
<120> 一种获得小鼠死亡时间间隔的方法
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cctaygggrb gcascag 17
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggactacnng ggtatctaat 20
Claims (4)
1.一种获得小鼠死亡时间间隔的方法,包括:
(1)收集小鼠样本并提取DNA,通过高通量测序对样本口腔微生物进行宏基因组分析;
(2)根据口腔微生物群落的结构组成及随死亡时间增加发生的演替规律,获得相对丰度与死亡时间之间存在相关性的物种,并建立死亡时间间隔和物种相对丰度线性回归模型;其中,所述物种为变形菌门Proteobacteria、γ-变形菌纲Gammaproteobacteria、肠杆菌目Enterobacteriales、肠杆菌科Enterobacteriaceae和变形杆菌属Proteus;所述线性回归模型的方程式如下:
变形菌门Proteobacteria:y=0.0017x﹢0.4547;
γ-变形菌纲Gammaproteobacteria:y=0.0021x﹢0.3558;
肠杆菌目Enterobacteriales:y=0.0035x﹢0.0504;
肠杆菌科Enterobacteriaceae:y=0.0035x﹢0.0504;
变形杆菌属Proteus:y=0.0033x﹣0.0444;
其中,x指死亡时间间隔,y指物种相对丰度。
2.根据权利要求1所述的一种获得小鼠死亡时间间隔的方法,其特征在于:所述步骤(1)中的小鼠样本为SPF级ICR小鼠。
3.根据权利要求1所述的一种获得小鼠死亡时间间隔的方法,其特征在于:所述步骤(1)中的宏基因组分析指对样本的口腔微生物群落的结构组成进行注释并统计。
4.根据权利要求1所述的一种获得小鼠死亡时间间隔的方法,其特征在于:所述步骤(2)中的演替规律指口腔微生物群落丰度随死亡时间增加逐渐降低。
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GR01 | Patent grant | ||
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