CN110237136A - 多甲氧基黄酮提取物在制备抵抗氧化应激产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供多甲氧基黄酮提取物在制备抵抗氧化应激产品中的应用。所述多甲氧基黄酮提取物为瓯柑果皮固相萃取后梯度洗脱粉末。瓯柑皮的多甲氧基黄酮提取物能够在人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI‑38细胞内显著增加抵御过氧化氢氧化应激损伤的能力，并使得细胞去除多甲氧基黄酮提取物后保持抵御氧化应激损伤能力。可作为功能食品、保健品或防治药物用于氧化应激损伤相关疾病的防治。
Description
技术领域
本发明属食品药品领域，涉及天然来源的瓯柑多甲氧基黄酮组分在制备氧化应激功能保护食品、保健品或防治药物中的应用，尤其涉及瓯柑多甲氧基黄酮提取物在人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞抵抗过氧化氢氧化应激时的应用。
背景技术
氧化和还原是自然界中最常见的化学反应，表现为共价电子对的电子得失或偏移。当生物体内的氧化物积累速率超过生物体还原反应和对氧化物清除速率时，将发生氧化应激损伤。已有研究表明，氧化应激损伤与多种疾病的发生发展相关，包括癌症、糖尿病、肥胖、神经系统疾病和动脉粥样硬化等。
天然产物可以帮助机体免受氧化应激损伤的危害，其中大部分为自身具有还原效应的，表现为与活性氧发生反应的“结合型”抗氧化天然活性物质，而可以增强细胞自身抗氧化能力，甚至使得细胞保持这种抵御氧化应激损伤的能力一段时间的天然活性产物，未见报道。
瓯柑(Citrus reticulata cv.Suavissima)是芸香科柑橘属的一个栽培变种，也是浙江省温州、丽水地区的传统特产，已经有两千多年的栽培历史。瓯柑在民间具有抗肿瘤、祛热生津、化痰止咳、清凉解毒等特殊食药功能，这些作用可能与瓯柑中富含多甲氧基黄酮类化合物有关。多甲氧基黄酮(Polymethoxylated Flavonoids,PMFs)是指具有4个及4个以上甲氧基取代基的黄酮类化合物，主要来源于芸香科柑橘属植物，尤其在柑橘果实的果皮中含量丰富。柑橘果实中的多甲氧基黄酮类化合物在抗肿瘤、抗炎、抗诱变和保护心血管等方面具有很好的活性，关于多甲氧基黄酮的生物活性机制研究也逐渐深入。自1934年首次分离出多甲氧基黄酮类化合物单体以来，人们对其活性进行了大量的研究。近年来研究发现，多甲氧基黄酮类化合物具有抑制癌细胞增殖、抵抗肿瘤侵袭和转移作用、促进癌细胞凋亡和自噬等生物活性。但是关于瓯柑多甲氧基黄酮组分的提高和保持细胞抵抗氧化应激损伤能力的研究，尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供多甲氧基黄酮提取物在制备抵抗氧化应激产品中的应用。所述多甲氧基黄酮提取物为瓯柑果皮的固相萃取(SPE)梯度洗脱粉末。
所述多甲氧基黄酮提取物通过以下方法制备获得：
(1)瓯柑成熟果实，经过挑选果皮无机械损伤和病虫害的果实，进行果皮和果肉分离，液氮速冻后经过低温真空干燥，磨样后得到冷冻干燥粉末。称取冷冻干燥的瓯柑果实果皮粉末用95％乙醇(固液比比1：20)超声提取三次(25℃)，每次45min，真空抽滤后，合并上清液，在旋转蒸发仪上蒸干至无乙醇相，溶于去离子水中，得到瓯柑果皮提取物水溶液。
(2)取瓯柑果皮提取物水溶液约5mL上样C18固相萃取柱(12cc/2g，Waters)，上样后固相萃取柱先用去离子水洗脱25倍柱床体积(BV)去掉极性较高的杂质，然后用35％甲醇12BV进行洗脱去掉杂质，然后用100％甲醇3BV洗脱，洗脱流速为1mL/min，收集洗脱液约12mL，洗脱液在旋转蒸发仪上36℃蒸干得到207.2mg，即为瓯柑富含多甲氧基黄酮组分的粉末。
所述产品包括功能食品、保健品或防治药物。
所述抵抗氧化应激是指在人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞中显著保持过氧化氢氧化损伤时的细胞活力；在人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞中显著抑制过氧化氢诱导的活性氧积累；在人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞中显著持续降低过氧化氢诱导的活性氧积累；在人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞瓯柑多甲氧基黄酮组分可以显著增加过氧化氢酶(CAT)和醌氧化还原酶(NQO1)的酶活力；在人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞瓯柑多甲氧基黄酮组分可以显著持续增加过氧化氢酶(CAT)和醌氧化还原酶(NQO1)的酶活力。
本发明研究证明在人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞瓯柑多甲氧基黄酮组分可以显著保持过氧化氢氧化损伤时的细胞活力。
本发明研究证明在人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞瓯柑多甲氧基黄酮组分可以显著抑制过氧化氢诱导的活性氧积累。
本发明研究证明在人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞瓯柑多甲氧基黄酮组分可以显著持续降低过氧化氢诱导的活性氧积累。
本发明研究证明在人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞瓯柑多甲氧基黄酮组分可以显著增加过氧化氢酶(CAT)和醌氧化还原酶(NQO1)的酶活力。
本发明研究证明在人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞瓯柑多甲氧基黄酮组分可以显著持续增加过氧化氢酶(CAT)和醌氧化还原酶(NQO1)的酶活力。
本发明提供多甲氧基黄酮提取物在制备抵抗氧化应激产品中的应用。瓯柑皮的多甲氧基黄酮提取物能够在人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞内显著增加抵御过氧化氢氧化应激损伤的能力，并使得细胞去除多甲氧基黄酮提取物后保持抵御氧化应激损伤能力。可作为功能食品、保健品或防治药物用于氧化应激损伤相关疾病的防治。
附图说明
附图1-1是以人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞为模型，瓯柑多甲氧基黄酮组分(PMFs)对其在过氧化氢氧化损伤时细胞活性的影响。其中二甲基亚砜(DMSO)为阴性对照(control)，N乙酰半胱甘酸(NAC)为阳性对照，瓯柑多甲氧基黄酮组分设置三个浓度梯度，分别为0.2mg/L、0.39mg/L、0.78mg/L。用SPSS软件进行差异显著性分析，进行t检验，*p<0.05，与control组比较。
附图1-2是以人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞为模型，在瓯柑多甲氧基黄酮组分(PMFs)预处理6h后去除PMFs组分，不同细胞在过氧化氢氧化损伤时细胞活性的影响。其中二甲基亚砜(DMSO)为阴性对照(control)，N乙酰半胱甘酸(NAC)为阳性对照，瓯柑多甲氧基黄酮组分设置三个浓度梯度，分别为0.2mg/L、0.39mg/L、0.78mg/L。用SPSS软件进行差异显著性分析，进行t检验，*p<0.05，与control组比较。
附图2-1是以人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞为模型，瓯柑多甲氧基黄酮组分(PMFs)对其在过氧化氢氧化损伤时细胞内活性氧含量的相对影响。其中二甲基亚砜(DMSO)为阴性对照(control)，未进行过氧化氢处理的细胞为空白对照(blank)，瓯柑多甲氧基黄酮组分设置三个浓度梯度，分别为0.2mg/L、0.39mg/L、0.78mg/L。结果表示为处理组与空白组的相对含量，用SPSS软件进行差异显著性分析，进行t检验，*p<0.05，与control组比较。
附图2-2是以人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞为模型，在瓯柑多甲氧基黄酮组分(PMFs)预处理6h后去除PMFs组分，不同细胞在过氧化氢氧化损伤时细胞内活性氧的含量。其中二甲基亚砜(DMSO)为阴性对照(control)，未进行过氧化氢处理的细胞为空白对照(blank)，瓯柑多甲氧基黄酮组分设置三个浓度梯度，分别为0.2mg/L、0.39mg/L、0.78mg/L。结果表示为处理组与空白组的相对含量，用SPSS软件进行差异显著性分析，进行t检验，*p<0.05，与control组比较。
附图3-1是以人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞为模型，瓯柑多甲氧基黄酮组分(PMFs)对其过氧化氢酶酶活性的影响。其中二甲基亚砜(DMSO)为阴性对照(control)，瓯柑多甲氧基黄酮组分设置三个浓度梯度，分别为0.2mg/L、0.39mg/L、0.78mg/L。结果表示为处理组与control组的相对含量，用SPSS软件进行差异显著性分析，进行t检验，*p<0.05，与control组比较。
附图3-2是以人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞为模型，瓯柑多甲氧基黄酮组分(PMFs)对其醌氧化还原酶酶活性的影响。其中二甲基亚砜(DMSO)为阴性对照(control)，瓯柑多甲氧基黄酮组分设置三个浓度梯度，分别为0.2mg/L、0.39mg/L、0.78mg/L。结果表示为处理组与control组的相对含量，用SPSS软件进行差异显著性分析，进行t检验，*p<0.05，与control组比较。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1瓯柑多甲氧基黄酮组分的制备
瓯柑成熟果实(采自浙江省丽水市)经过挑选果皮无机械损伤和病虫害的果实，进行果皮和果肉分离，液氮速冻后经过低温真空干燥，磨样后得到冷冻干燥粉末。称取10.3g冷冻干燥的瓯柑果实果皮粉末用95％乙醇(固液比比1：20)超声提取三次(25℃)，每次45min，真空抽滤后，合并上清液，在旋转蒸发仪上蒸干至无乙醇相，溶于去离子水中，得到瓯柑果皮提取物水溶液。
取瓯柑果皮提取物水溶液约5mL上样C18固相萃取柱(12cc/2g，Waters)，上样后固相萃取柱先用去离子水洗脱25倍柱床体积(BV)去掉极性较高的杂质，然后用35％甲醇12BV进行洗脱去掉杂质，然后用100％甲醇3BV洗脱，洗脱流速为1mL/min，收集洗脱液约12mL，洗脱液在旋转蒸发仪上36℃蒸干得到207.2mg，即为瓯柑富含多甲氧基黄酮组分的粉末。瓯柑果皮提取物中主要含有川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素。
实施例2瓯柑多甲氧基黄酮组分对人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞受到过氧化氢氧化应激损伤时细胞活性的影响
人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基于37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育，隔天更换新鲜培养液，2-3天传代1次。实验时，L02、GES、HUVEC、WI-38细胞接种于96孔板。待细胞生长至70-80％融合，弃去原培养基，分组加药。设空白对照组(无过氧化氢处理)，DMSO溶剂对照组，N乙酰半胱甘酸(NAC)对照组(终浓度为2mmol/L)和不同浓度瓯柑多甲氧基黄酮组分组(终浓度分别为0.78mg/L、0.39mg/L、0.20mg/L)。作用6h后，保留(或移除)含有多甲氧基黄酮组分的培养基，加入含有浓度为0.78mmol/L过氧化氢的无血清培养基。孵育30min后，移除原培养基，使用PBS清洗两次，然后加入含有10％CCK-8试剂的无血清培养基。孵育1h后，用酶标仪检测各孔OD值(检测波长：450nm和620nm)，用CCK-8法测定细胞活力，细胞活力计算方法为(试验孔OD450–试验孔OD620)/(空白对照OD450–空白对照OD620)。每组设定3个复孔，实验平行重复3次。
数据用平均值±标准误表示，使用SPSS软件进行数据分析，进行t检验。具体的瓯柑多甲氧基黄酮组分对人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞受到过氧化氢氧化应激损伤时细胞活性的影响见附图1。
实施例3瓯柑多甲氧基黄酮组分对人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞受到过氧化氢氧化应激损伤时细胞内活性氧含量的影响
人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基于37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育，隔天更换新鲜培养液，2-3天传代1次。实验时，L02、GES、HUVEC、WI-38细胞接种于96孔板。待细胞生长至70-80％融合，弃去原培养基，分组加药。设空白对照组(无过氧化氢处理)，DMSO溶剂对照组和不同浓度瓯柑多甲氧基黄酮组分组(终浓度分别为0.78mg/L、0.39mg/L、0.20mg/L)。作用6h后，保留(或移除)含有多甲氧基黄酮组分的培养基，加入含有浓度为0.78mmol/L过氧化氢的无血清培养基。孵育30min后，移除原培养基，使用PBS清洗两次，加入含有终浓度为10μmol/L的DCFH-DA探针的无血清培养基。孵育20min后，移除原培养基，使用无血清培养基洗3次，使用酶标仪以488nm为激发波长，以525nm为检测波长，读取各孔的荧光值。每组设定3个复孔，实验平行重复3次。
数据用平均值±标准误表示，使用SPSS软件进行数据分析，进行t检验。具体的瓯柑多甲氧基黄酮组分对人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞受到过氧化氢氧化应激损伤时细胞内活性氧的影响见附图2。
实施例4瓯柑多甲氧基黄酮组分对人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞细胞内抗氧化酶活性的影响
人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基于37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育，隔天更换新鲜培养液，2-3天传代1次。实验时，L02、GES、HUVEC、WI-38细胞接种于96孔板。待细胞生长至70-80％融合，弃去原培养基，分组加药。设DMSO溶剂对照组和不同浓度瓯柑多甲氧基黄酮组分组(终浓度分别为0.78mg/L、0.39mg/L、0.20mg/L)。作用6h后，保留(或移除)含有多甲氧基黄酮组分的培养基。使用碧云天过氧化氢酶检测试剂盒(S0051)检测过氧化氢酶(CAT)酶活性。使用Abcam公司醌氧化还原酶检测试剂盒(ab184867)检测醌氧化还原酶(NQO1)酶活性。
数据用平均值±标准误表示，使用SPSS软件进行数据分析，进行t检验。具体的瓯柑多甲氧基黄酮组分对人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞细胞内抗氧化酶的活性影响见附图3。
Claims (8)
1.一种多甲氧基黄酮提取物在制备抵抗氧化应激产品中的应用，其特征在于，所述多甲氧基黄酮提取物为瓯柑果皮固相萃取后梯度洗脱粉末。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括功能食品、保健品或防治药物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抵抗氧化应激是指在人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞中显著保持过氧化氢氧化损伤时的细胞活力。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞中显著抑制过氧化氢诱导的活性氧积累。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞中显著持续降低过氧化氢诱导的活性氧积累。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞瓯柑多甲氧基黄酮组分可以显著增加过氧化氢酶和醌氧化还原酶的酶活力。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在人肝L02细胞、人胃GES细胞、人脐静脉上皮HUVEC细胞、人成纤维WI-38细胞瓯柑多甲氧基黄酮组分可以显著持续增加过氧化氢酶和醌氧化还原酶的酶活力。
8.权利要求1所述的多甲氧基黄酮提取物的制备方法，其特征在于，通过以下步骤获得：
(1)瓯柑成熟果实，经过挑选果皮无机械损伤和病虫害的果实，进行果皮和果肉分离，液氮速冻后经过低温真空干燥，磨样后得到冷冻干燥粉末，称取冷冻干燥粉末用固液比比为1：20的95％乙醇超声提取三次，每次45min，真空抽滤，合并上清液，在旋转蒸发仪上蒸干至无乙醇相，溶于去离子水中，得到瓯柑果皮提取物水溶液；
(2)取瓯柑果皮提取物水溶液，上样C18固相萃取柱，12cc/2g，Waters，上样后固相萃取柱先用去离子水洗脱25倍柱床体积，去掉极性较高的杂质，然后用35％甲醇12柱床体积再进行洗脱去掉杂质，然后用100％甲醇3BV洗脱，洗脱流速为1mL/min，收集洗脱液，洗脱液在旋转蒸发仪上36℃蒸干得到洗脱粉末，即得瓯柑富含多甲氧基黄酮提取物。
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| CN114146124A (zh) * | 2021-11-04 | 2022-03-08 | 中山大学 | 茶枝柑胎多甲氧基黄酮类化合物在制备抗氧化剂中的应用 |
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| CN109172667A (zh) * | 2018-10-17 | 2019-01-11 | 浙江大学 | 一种瓯柑果实富含多甲氧基黄酮组分提取物的降糖用途 |
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