CN110237059B - 丹参酮类化合物在制备bcr-abl蛋白降解剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丹参酮类化合物在制备BCR‑ABL蛋白降解剂中的应用，该丹参酮类化合物选自丹参新酮和/或去氢丹参新酮，结构式分别如下；BCR‑ABL蛋白选自野生型BCR‑ABL蛋白或T315I突变型BCR‑ABL蛋白。本发明还公开了该丹参酮类化合物在制备克服或逆转针对T315I突变引起的伊马替尼耐药性的药物，以及制备治疗耐药的BCR‑ABL阳性的白血病药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物的技术领域，尤其涉及一种丹参酮类化合物在制备BCR-ABL蛋白降解剂、制备克服或逆转针对T315I突变引起的伊马替尼耐药性的药物以及制备治疗耐药的BCR-ABL阳性的白血病药物中的应用。
背景技术
慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一种起源于骨髓造血干/祖细胞的恶性增殖性疾病。95％的CML患者具有特征性的费城(Philadelphia，Ph)染色体，该染色体是由于9号染色体和22号染色体长臂之间的相互易位t(9，22)(q34，q11.21)所致，由此形成了BCR-ABL融合基因，其编码的BCR-ABL是一种具有组成型活化的酪氨酸激酶活性的致癌融合蛋白。BCR-ABL通过激活一系列的细胞信号转导途径，如:RAF/MEK/ERK，PI3K/AKT和JAK/STAT等，促使细胞持续恶性增殖，抑制细胞凋亡，进而促进白血病发生发展。
近年来，随着BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)伊马替尼的应用，极大地改善了CML患者的预后，5年无事件生存率(EFS)和总生存率(OS)分别达到83％和89％，然而目前临床BCR-ABLTKIs耐药问题日益严重。CML对伊马替尼的耐药现象于2000年首次报道，由于BCR-ABL融合蛋白中abl的TKIs结合区域发生突变，阻止了BCR-ABL激酶抑制剂的结合，进而降低了对激酶抑制剂的敏感性。其中BCR-ABL T315I突变耐药CML患者是现阶段的治疗难点，Dasatinib、Nilotinib等第二代Bcr-Abl TKI均无法有效解决T315I突变引起的耐药问题。普纳替尼(Ponatinib)是现阶段FDA唯一批准用于T315I突变治疗的第三代Bcr-Abl TKI，但其导致严重心血管毒副反应和耐药发生。因此，开发安全有效的新型药物，进而设计高效安全的治疗方案是当前亟待解决的重要问题。
丹参，又名赤参、紫丹参、红根等，始载于汉代的《神农本草经》，其性苦、微寒，归心、肝经，具有活血化瘀和凉血消痈等功效。丹参新酮(miltirone)、去氢丹参新酮(1,2-Didehydromiltirone)是一类从丹参中提取的松香烷类三环二萜化合物。现代药理学研究表明，丹参新酮具有抗氧化、抗焦虑和抑制肿瘤细胞增殖的功效。已有研究报道，去氢丹参新酮具有较好的抗神经炎症(《中国药理学通报》2016年2期)、抗利什曼原虫和疟原虫活性以及抑制人口腔表皮样癌细胞增殖活性(J Nat Prod.2001
Nov；64(11):1398-403.)。另有研究报道，去氢丹参新酮具有较强的丁酰胆碱酯酶抑制活性，有望被开发成为抗老年痴呆症药物(Planta Med.2011Sep；77(14):1594-6.)。
我们前期研究报道，丹参新酮、去氢丹参新酮可显著诱导醌还原酶活性增强(Rapid Commun.Mass Spectrom.2009；23:2857–2866)。但迄今，尚无丹参新酮或去氢丹参新酮下调野生型及T315I突变型BCR-ABL蛋白表达水平、诱导慢性粒细胞白血病细胞凋亡的研究报道。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明公开了一种丹参酮类化合物在制备针对野生型及T315I突变型的BCR-ABL蛋白降解剂中的应用，以及进一步用于制备克服或逆转针对T315I突变引起的伊马替尼耐药性的药物以及制备治疗耐药的BCR-ABL阳性的白血病药物中的应用。
具体技术方案如下：
一种丹参酮类化合物在制备BCR-ABL蛋白降解剂中的应用，所述丹参酮类化合物选自丹参新酮和/或去氢丹参新酮，结构式分别如下：
BCR-ABL蛋白选自野生型BCR-ABL蛋白或T315I突变型BCR-ABL蛋白。
本发明公开的丹参新酮具有如上式(I)的结构，去氢丹参新酮具有如上式(II)的结构。
丹参新酮与去氢丹参新酮的制备可参考申请公布号为CN 101732294 A的中国专利文献中公开的内容。
经试验发现：
所述丹参酮类化合物对人慢性粒细胞白血病细胞K562和32D-P210-T315I细胞的增殖均具有显著的抑制作用，尤其是针对T315I突变型的32D-P210-T315I细胞，增殖抑制活性尤其显著，2.11μM的丹参新酮可达半数抑制率，1.36μM的去氢丹参新酮可达半数抑制率。
所述丹参酮类化合物可以诱导人慢性粒细胞白血病K562细胞、32D-P210-T315I细胞的凋亡，对T315I突变型的32D-P210-T315I细胞尤其显著，5μM丹参新酮作用时的凋亡率高达86.7％。
所述丹参酮类化合物还可明显上调人慢性粒细胞白血病K562细胞、32D-P210细胞、32D-P210-T315I细胞中凋亡标记蛋白(剪切型的caspase3、PARP)的表达水平，降低人类慢性粒细胞白血病K562细胞、32D-P210细胞、32D-P210-T315I细胞中BCR-ABL蛋白的表达。2μM丹参新酮处理K562细胞、32D-P210细胞、32D-P210-T315I细胞24小时，BCR-ABL的蛋白表达水平分别降低了约38％、76％、60％。。1μM去氢丹参新酮处理K562细胞、32D-P210-T315I细胞24小时，BCR-ABL的蛋白表达水平分别降低了约80％、84％。
可知，所述丹参酮类化合物可抑制K562细胞、32D-P210-T315I细胞的增殖，促进K562细胞、32D-P210-T315I细胞的凋亡以及野生型和T315I突变型BCR-ABL蛋白的降解，因此，可作为野生型和T315I突变型BCR-ABL蛋白降解剂使用。
优选地，所述丹参酮类化合物选自去氢丹参新酮。经试验发现，所述去氢丹参新酮具有更优异的蛋白降解效果。
优选地，所述丹参酮类化合物可与普纳替尼(Ponatinib)联用。经试验发现，相较于丹参酮类化合物与普纳替尼的单独应用，两者的联用具有更为优异的蛋白降解效果。
优选地，所述丹参酮类化合物与普纳替尼的摩尔比为100～200:1。在上述优选的剂量范围内，两者联合应用协同诱导慢性粒细胞白血病细胞的凋亡，且随着浓度的增高，其协同诱导细胞凋亡作用亦逐渐增强。
所述BCR-ABL蛋白降解剂，以所述丹参酮类化合物、或者是所述丹参酮类化合物与普纳替尼作为主药。优选地，所述BCR-ABL蛋白降解剂，原料中还包括药剂辅料。包括稀释剂、吸收剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂等等。可根据药物的具体剂型加入本领域常见的药剂辅料。
本发明还公开了所述丹参酮类化合物在制备克服或逆转针对T315I突变引起的伊马替尼耐药性的药物中的应用。
优选地，在所述药物中，可将所述丹参酮类化合物可与普纳替尼联用；两者的摩尔比为100～200:1。
所述药物中，以所述丹参酮类化合物、或者是所述丹参酮类化合物与普纳替尼作为主药，优选地，原料中还包括药剂辅料。可根据药物的具体剂型加入本领域常见的药剂辅料。
本发明还公开了所述丹参酮类化合物在制备治疗耐药的BCR-ABL阳性的白血病药物中的应用，所述耐药的BCR-ABL阳性的白血病是由T315I突变引起的伊马替尼耐药的白血病，或者是野生型BCR-ABL引起的多药耐药的白血病。
优选地，在所述药物中，可将所述丹参酮类化合物可与普纳替尼联用；两者的摩尔比为100～200:1。
所述药物中，以所述丹参酮类化合物、或者是所述丹参酮类化合物与普纳替尼作为主药，优选地，原料中还包括药剂辅料。可根据药物的具体剂型加入本领域常见的药剂辅料。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明公开了所述丹参酮类化合物在制备针对野生型及T315I突变型的BCR-ABL蛋白降解剂中的应用，尤其是针对T315I突变型的BCR-ABL蛋白具有优异的蛋白降解效果。可显著抑制32D-P210-T315I细胞的增殖；可诱导32D-P210-T315I细胞的凋亡；可明显上调32D-P210-T315I细胞中凋亡标记蛋白(剪切型的caspase3、PARP)的表达水平，并降低32D-P210-T315I细胞中BCR-ABL蛋白的表达。因此，可替代普纳替尼用于有效解决T315I突变引起的耐药问题，以避免普纳替尼使用时带来的毒副反应。
本发明还公开了所述丹参酮类化合物进一步用于制备克服或逆转针对T315I突变引起的伊马替尼耐药性的药物以及制备治疗耐药的BCR-ABL阳性的白血病药物中的应用。
本发明还公开了所述丹参酮类化合物与普纳替尼联用，利用两者的相互协同作用，分别用于制备BCR-ABL蛋白降解剂、克服或逆转针对T315I突变引起的伊马替尼耐药性的药物以及治疗耐药的BCR-ABL阳性的白血病药物。
附图说明
图1为丹参新酮对慢性粒细胞白血病K562细胞增殖抑制作用；
图2为丹参新酮对慢性粒细胞白血病32D-P210细胞增殖抑制作用；
图3为丹参新酮对慢性粒细胞白血病32D-P210-T315I细胞增殖抑制作用；
图4为丹参新酮诱导慢性粒细胞白血病K562细胞凋亡的流式图；
图5为丹参新酮诱导慢性粒细胞白血病32D-P210细胞凋亡的流式图；
图6为丹参新酮诱导慢性粒细胞白血病32D-P210-T315I细胞凋亡的流式图；
图7为丹参新酮对慢性粒细胞白血病K562细胞凋亡标记蛋白的影响；
图8为丹参新酮对慢性粒细胞白血病32D-P210细胞凋亡标记蛋白的影响；
图9为丹参新酮对慢性粒细胞白血病32D-P210-T315I细胞凋亡标记蛋白的影响；
图10为丹参新酮对慢性粒细胞白血病K562细胞BCR-ABL蛋白的影响；
图11为丹参新酮对慢性粒细胞白血病32D-P210细胞BCR-ABL蛋白的影响；
图12为丹参新酮对慢性粒细胞白血病32D-P210-T315I细胞BCR-ABL蛋白的影响；
图13为去氢丹参新酮对慢性粒细胞白血病K562细胞增殖抑制作用；
图14为去氢丹参新酮对慢性粒细胞白血病32D-P210-T315I细胞增殖抑制作用；
图15为去氢丹参新酮对慢性粒细胞白血病K562细胞凋亡标记蛋白的影响；
图16为去氢丹参新酮对慢性粒细胞白血病32D-P210-T315I细胞凋亡标记蛋白的影响；
图17为去氢丹参新酮对慢性粒细胞白血病K562细胞BCR-ABL蛋白的影响；
图18为去氢丹参新酮对慢性粒细胞白血病32D-P210-T315I细胞BCR-ABL蛋白的影响；
图19为丹参新酮与普纳替尼联合应用诱导慢性粒细胞白血病K562细胞凋亡的流式图；
图20为丹参新酮与普纳替尼联合应用诱导慢性粒细胞白血病32D-P210-T315I细胞凋亡的流式图；
图21为去氢丹参新酮与普纳替尼联合应用诱导慢性粒细胞白血病K562细胞凋亡的流式图；
图22为去氢丹参新酮与普纳替尼联合应用诱导慢性粒细胞白血病32D-P210-T315I细胞凋亡的流式图；
图23为普纳替尼对慢性粒细胞白血病K562细胞的增殖抑制作用；
图24为普纳替尼对慢性粒细胞白血病32D-P210-T315I细胞的增殖抑制作用；
图25为隐丹参酮对慢性粒细胞白血病K562细胞的增殖抑制作用；
图26为隐丹参酮对慢性粒细胞白血病32D-P210-T315I细胞的增殖抑制作用；
图27为隐丹参酮对慢性粒细胞白血病K562细胞BCR-ABL蛋白的影响；
图28为隐丹参酮对慢性粒细胞白血病32D-P210-T315I细胞BCR-ABL蛋白的影响；
图29为隐丹参酮与普纳替尼联合应用诱导慢性粒细胞白血病K562细胞凋亡的流式图；
图30为隐丹参酮与普纳替尼联合应用诱导慢性粒细胞白血病32D-P210-T315I细胞凋亡的流式图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1丹参新酮对人慢性粒细胞白血病K562细胞、32D-P210细胞、32D-P210-T315I细胞的增殖活性的抑制试验：
实验方法：用RPMI 1640培养基含10％FBS(GIBCO)培养慢性粒细胞白血病K562细胞、或32D-P210细胞、或32D-P210-T315I细胞，再将上述细胞分别按8000个/孔的密度接种于96孔板(平行三复孔)，每孔体积200μL，丹参新酮的浓度设定为0、1μM、2μM、5μM、10μM。加入配置好的上述浓度的丹参新酮，于37℃、5％CO2培养箱培养24小时。待药物孵育结束后，每孔加入10μL的CCK-8(DOJINDO)，继续孵育1-2小时，在ThermoVarioskan Flash多功能酶标仪上选择波长450nm测定吸光度值。
计算丹参新酮的抑制率％＝(阴性对照组-用药组)/(阴性对照组-三复孔培养基背景平均值)×100％，上述实验重复3次，以获取精确地抑制率，细胞存活率为100％-抑制率％。
CCK-8结果显示丹参新酮对慢性粒细胞白血病细胞K562增殖的抑制作用会随浓度(0、1μM、2μM、5μM、10μM)的增加而呈上升趋势，4.59μM的丹参新酮即可对K562增殖抑制达半数抑制率(如图1所示)。
CCK-8结果显示丹参新酮对32D-P210细胞的抑制随着浓度(0，1μM，2μM，5μM，10μM)的增加而呈上升趋势，1.82μM的丹参新酮即可达半数抑制率(如图2所示)。
CCK-8结果显示丹参新酮对32D-P210-T315I细胞的抑制随着浓度(0，1μM，2μM，5μM，10μM)的增加而呈上升趋势，2.11μM的丹参新酮即可达半数抑制率(如图3所示)。
实施例2丹参新酮诱导人慢性粒细胞白血病K562细胞、32D-P210细胞、32D-P210-T315I细胞的凋亡试验：
实验方法：K562细胞、或32D-P210细胞、或32D-P210-T315I细胞用含10％FBS(GIBCO)的RPMI 1640培养基于37℃5％CO2培养。将上述细胞接种于6孔板，不同浓度的丹参新酮(0，1μM，2μM，5μM)作用于细胞24h后，收集细胞，经AnnexinⅤ-PE和7-AAD(7-氨基放线菌素D)双染色后，流式细胞仪检测。
经测试：
人慢性粒细胞白血病细胞K562的凋亡率随着丹参新酮浓度的增加而增加，1μM、2μM、5μM丹参新酮作用时的凋亡率分别为4.5％、13.6％、50.1％(如图4所示)。
32D-P210胞的凋亡率随着丹参新酮浓度的增加而增加，1μM、2μM、5μM丹参新酮作用时的凋亡率分别为6.3％、53.7％、76％(如图5所示)。
32D-P210-T315I细胞的凋亡率随着丹参新酮浓度的增加而增加，1μM、2μM、5μM丹参新酮作用时的凋亡率分别为9.2％、46.6％、86.7％(如图6所示)。
实施例3丹参新酮对人慢性粒细胞白血病K562细胞、32D-P210细胞、32D-P210-T315I细胞中凋亡标记蛋白的影响试验：
实验方法：K562细胞、或32D-P210细胞、或32D-P210-T315I细胞按照标准方法培养，所用培养基为含10％FBS(GIBCO)的RPMI 1640。向培养基中加入不同浓度的丹参新酮(0，1μM，2μM，5μM)，37℃5％CO2培养箱(Thermo)孵育，待药物处理24小时后，收集细胞至15mL离心管中，离心800rpm，5分钟。弃上清，加入1mL4℃预冷的1×PBS(pH7.4±0.2)清洗细胞，转到1.5mL的Eppendorf管中，离心800rpm，5分钟。弃上清，加入0.1mL的RIPA裂解液，冰上裂解细胞30分钟。细胞充分裂解后，将裂解液离心12000rpm，15分钟，把上清液移至另一个1.5mL的Eppendorf管中，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后，等体积加入2×SDS上样缓冲液(0.5mol/L Tris·HCL(pH 6.8)，10％SDS，0.01％bromophenolblue，20％glycerol，β-巯基乙醇,双蒸水)，置于95℃5分钟使蛋白彻底变性，冰上冷却，即为制备好的细胞蛋白样液。取10μL细胞蛋白样液，经10％的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，随后通过电泳转移(恒流300mA，2h)到PVDF膜上。转移完毕后，5％脱脂奶粉室温封闭1小时，TBST(1mol/L Tris·HCL(pH 7.5)，NaCl，0.2％Tween-20，蒸馏水)缓冲液清洗3次，每次5分钟，一抗(封闭液稀释到1：1000的caspase3、PARP、β-actin)4℃孵育过夜，TBST缓冲液清洗3次，每次10分钟，随后将膜与用HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗孵育，室温孵育1小时，TBST清洗3次，每次10分钟。利用凝胶成像系统Chemi Dox XRS采集图像，检测膜上结合蛋白的表达水平。
经测试：
剪切型的caspase3、PARP在2～5μM的丹参新酮处理时开始上升，并且随着用药浓度的升高，上升的趋势也愈来愈明显。说明丹参新酮能明显的诱导人类慢性粒细胞白血病细胞K562的凋亡(如图7所示)。
剪切型的caspase3、PARP在2～5μM的丹参新酮处理时开始上升，并且随着用药浓度的升高，上升的趋势也愈来愈明显。说明丹参新酮能明显的诱导人类慢性粒细胞白血病细胞32D-P210的凋亡(如图8所示)。
剪切型的caspase3、PARP在2～5μM的丹参新酮处理时开始上升，并且随着用药浓度的升高，上升的趋势也愈来愈明显。说明丹参新酮能明显的诱导32D-P210-T315I细胞的凋亡(如图9所示)。
实施例4丹参新酮对人类慢性粒细胞白血病K562细胞、32D-P210细胞、32D-P210-T315I细胞中BCR-ABL蛋白的影响试验：
实验方法：K562细胞、或32D-P210细胞、或32D-P210-T315I细胞按照标准方法培养，所用培养基为含10％FBS(GIBCO)的RPMI 1640。向上述培养基中加入不同浓度的丹参新酮(0，1μM，2μM，5μM)，37℃5％CO2培养箱(Thermo)孵育，待药物处理24小时后，收集细胞至15mL离心管中，离心800rpm，5分钟。弃上清，加入1mL4℃预冷的1×PBS(pH7.4±0.2)清洗细胞，转到1.5mL的Eppendorf管中，离心800rpm，5分钟。弃上清，加入0.1mL的RIPA裂解液，冰上裂解细胞30分钟。细胞充分裂解后，将裂解液离心12000rpm，15分钟，把上清液移至另一个1.5mL的Eppendorf管中，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后，等体积加入2×SDS上样缓冲液(0.5mol/L Tris·HCL(pH 6.8)，10％SDS，0.01％bromophenolblue，20％glycerol，β-巯基乙醇,双蒸水)，置于95℃5分钟使蛋白彻底变性，冰上冷却，即为制备好的细胞蛋白样液。取10μL细胞蛋白样液，经10％的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，随后通过电泳转移(恒流300mA，2h)到PVDF膜上。转移完毕后，5％脱脂奶粉室温封闭1小时，TBST(1mol/L Tris·HCL(pH 7.5)，NaCl，0.2％Tween-20，蒸馏水)缓冲液清洗3次，每次5分钟，一抗(封闭液稀释到1：1000的BCR-ABL、β-actin)4℃孵育过夜，TBST缓冲液清洗3次，每次10分钟，随后将膜与用HRP标记的二抗孵育，室温孵育1小时，TBST清洗3次，每次10分钟。利用凝胶成像系统Chemi Dox XRS采集图像，检测膜上结合蛋白的表达水平。
经测试：
丹参新酮显著抑制K562细胞中BCR-ABL的蛋白表达水平，且呈现明显的剂量依赖性。2μM的丹参新酮处理24小时后，BCR-ABL的蛋白表达水平降低了约38％。5μM的丹参新酮处理后，BCR-ABL的蛋白表达水平降低了约49％(如图10所示)。
丹参新酮显著抑制32D-P210细胞中BCR-ABL的蛋白表达水平，且呈现明显的剂量依赖性。1μM的丹参新酮处理24小时后，BCR-ABL的蛋白表达水平降低了约34％；2μM的丹参新酮处理后，BCR-ABL的蛋白表达水平降低了约76％；5μM的丹参新酮处理后，BCR-ABL的蛋白表达水平降低了约88％(如图11所示)。
丹参新酮显著抑制32D-P210-T315I细胞中BCR-ABL的蛋白表达水平，且呈现明显的剂量依赖性。1μM的丹参新酮处理24小时后，BCR-ABL的蛋白表达水平降低了约33％；2μM的丹参新酮处理后，BCR-ABL的蛋白表达水平降低了约60％；5μM的丹参新酮处理后，BCR-ABL的蛋白表达水平降低了约73％(如图12所示)。
实施例5去氢丹参新酮对人慢性粒细胞白血病K562细胞、32D-P210-T315I细胞的增殖活性的抑制试验：
实验方法同实施例1，经测试，
CCK-8结果显示去氢丹参新酮对慢性粒细胞白血病细胞K562增殖的抑制作用会随浓度(0、1μM、2μM、5μM、10μM)的增加而呈上升趋势，3.11μM的去氢丹参新酮即可对K562增殖抑制达半数抑制率(如图13所示)。
CCK-8结果显示去氢丹参新酮对32D-P210-T315I细胞的抑制随着浓度(0，1μM，2μM，5μM，10μM)的增加而呈上升趋势，1.36μM的去氢丹参新酮即可达半数抑制率(如图14所示)。
实施例6去氢丹参新酮对人慢性粒细胞白血病K562细胞、32D-P210-T315I细胞中凋亡标记蛋白的影响试验：
实验方法同实施例3，经测试，
剪切型的caspase3、PARP在2～5μM的去氢丹参新酮处理时开始上升，并且随着用药浓度的升高，上升的趋势也愈来愈明显。说明去氢丹参新酮能明显的诱导人类慢性粒细胞白血病K562细胞的凋亡(如图15所示)。
剪切型的caspase3在1～5μM的丹参新酮处理时开始上升，并且随着用药浓度的升高，上升的趋势也愈来愈明显。说明丹参新酮能明显的诱导人类慢性粒细胞白血病细胞32D-P210-T315I的凋亡(如图16所示)。
实施例7去氢丹参新酮对人类慢性粒细胞白血病K562细胞、32D-P210-T315I细胞中BCR-ABL蛋白的影响试验：
实验方法同实施例4，经测试，
1μM的去氢丹参新酮处理K562细胞24小时后，BCR-ABL的蛋白表达水平降低了约80％。2μM的去氢丹参新酮处理后，BCR-ABL的蛋白表达水平降低了约82％；5μM的去氢丹参新酮处理后，BCR-ABL的蛋白表达水平降低了约95％(如图17所示)。
1μM的去氢丹参新酮处理32D-P210-T315I细胞24小时后，BCR-ABL的蛋白表达水平降低了约84％；2μM的去氢丹参新酮处理后，BCR-ABL的蛋白表达水平降低了约82％；5μM的去氢丹参新酮处理后，BCR-ABL的蛋白表达水平降低了约95％(如图18所示)。
实施例8丹参新酮与普纳替尼联合应用诱导慢性粒细胞白血病细胞K562、32D-P210-T315I细胞的凋亡试验：
实验方法同实施例2，经测试，
如图19所示：丹参新酮(1～2μM)与普纳替尼(10nM)选定剂量范围内，两者联合应用能协同诱导慢性粒细胞白血病细胞K562的凋亡，并且随着丹参新酮浓度的增高，对细胞诱导凋亡的作用逐渐增强。单独应用1μM丹参新酮时凋亡率为5.8％，单独应用2μM丹参新酮时凋亡率为16％，单独应用10nM普纳替尼时凋亡率为34.2％。1μM丹参新酮与普纳替尼联合应用时凋亡率为49.5％，2μM丹参新酮与普纳替尼联合应用时凋亡率为61.1％。
如图20所示：丹参新酮(1～2μM)与普纳替尼(10nM)选定剂量范围内，两者联合应用能协同诱导慢性粒细胞白血病细胞32D-P210-T315I的凋亡，并且随着丹参新酮浓度的增高，对细胞诱导凋亡的作用逐渐增强。单独应用1μM丹参新酮时凋亡率为9.2％，单独应用2μM丹参新酮时凋亡率为46％，单独应用10nM普纳替尼时凋亡率为17.6％。1μM丹参新酮与普纳替尼联合应用时凋亡率为35.9％，2μM丹参新酮与普纳替尼联合应用时凋亡率为71.6％。
实施例9去氢丹参新酮与普纳替尼联合应用诱导慢性粒细胞白血病细胞K562、32D-P210-T315I细胞的凋亡试验：
实验方法同实施例2，经测试，
如图21所示：去氢丹参新酮(1～2μM)与普纳替尼(10nM)选定剂量范围内，两者联合应用能协同诱导慢性粒细胞白血病细胞K562的凋亡，并且随着丹参新酮浓度的增高，对细胞诱导凋亡的作用逐渐增强。单独应用1μM去氢丹参新酮时凋亡率为10.4％，单独应用2μM去氢丹参新酮时凋亡率为20.6％，单独应用10nM普纳替尼时凋亡率为34.2％。1μM去氢丹参新酮与普纳替尼联合应用时凋亡率为56.8％，2μM去氢丹参新酮与普纳替尼联合应用时凋亡率为63.7％。
如图22所示：去氢丹参新酮(1～2μM)与普纳替尼(10nM)选定剂量范围内，两者联合应用能协同诱导慢性粒细胞白血病细胞32D-P210-T315I的凋亡，并且随着丹参新酮浓度的增高，对细胞诱导凋亡的作用逐渐增强。单独应用1μM去氢丹参新酮时凋亡率为37.8％，单独应用2μM去氢丹参新酮时凋亡率为57.2％，单独应用10nM普纳替尼时凋亡率为17.6％。1μM去氢丹参新酮与普纳替尼联合应用时凋亡率为68.4％，2μM去氢丹参新酮与普纳替尼联合应用时凋亡率为89.2％。
对比例1普纳替尼单独应用对慢性粒细胞白血病细胞K562、32D-P210-T315I细胞的增殖活性的抑制试验：
实验方法同实施例1，经测试，
CCK-8结果显示普纳替尼对慢性粒细胞白血病细胞K562增殖的抑制作用会随浓度(0、1nM、2nM、5nM、10nM)的增加而呈上升趋势，2.3nM的普纳替尼即可对K562增殖抑制达半数抑制率(如图23所示)。
CCK-8结果显示普纳替尼对慢性粒细胞白血病细胞32D-P210-T315I增殖的抑制作用会随浓度(0、1nM、2nM、5nM、10nM)的增加而呈上升趋势，20.11nM的普纳替尼即可对32D-P210-T315I增殖抑制达半数抑制率(如图24所示)。
对比例2隐丹参酮对慢性粒细胞白血病K562细胞、32D-P210-T315I细胞的增殖活性的抑制试验：
实验方法同实施例1，经测试，
CCK-8结果显示隐丹参酮对慢性粒细胞白血病细胞K562增殖的抑制作用会随浓度(0、1μM、2μM、5μM、10μM)的增加而呈上升趋势，16.21μM的隐丹参酮即可对K562增殖抑制达半数抑制率(如图25所示)。
CCK-8结果显示隐丹参酮对32D-P210-T315I细胞的抑制随着浓度(0，1μM，2μM，5μM，10μM)的增加而呈上升趋势，12.95μM的隐丹参酮即可达半数抑制率(如图26所示)。
对比例3隐丹参酮对慢性粒细胞白血病K562细胞、32D-P210-T315I细胞中BCR-ABL蛋白的影响试验：
实验方法同实施例4，经测试，
1μM、2μM的隐丹参酮处理K562细胞24小时后，BCR-ABL的蛋白表达水平未见明显降低；5μM的隐丹参酮处理后，BCR-ABL的蛋白表达水平降低了约25％(如图27所示)。
1μM、2μM的隐丹参酮处理32D-P210-T315I细胞24小时后，BCR-ABL的蛋白表达水平未见明显降低；5μM的隐丹参酮处理后，BCR-ABL的蛋白表达水平降低了约30％(如图28所示)。
对比例4隐丹参酮与普纳替尼联合应用诱导慢性粒细胞白血病细胞K562、32D-P210-T315I细胞的凋亡试验：
实验方法同实施例2，经测试，
如图29所示：隐丹参酮(1～2μM)与普纳替尼(10nM)选定剂量范围内，两者联合应用未见明显协同诱导慢性粒细胞白血病细胞K562的凋亡。单独应用1μM隐丹参酮时凋亡率为1.6％，单独应用2μM隐丹参酮时凋亡率为2.2％，单独应用10nM普纳替尼时凋亡率为34.2％。1μM隐丹参酮与普纳替尼联合应用时凋亡率为35.7％，2μM隐丹参酮与普纳替尼联合应用时凋亡率为37.8％。
如图30所示：隐丹参酮(1～2μM)与普纳替尼(10nM)选定剂量范围内，两者联合应用未见明显协同诱导慢性粒细胞白血病细胞32D-P210-T315I的凋亡。单独应用1μM隐丹参酮时凋亡率为2.7％，单独应用2μM隐丹参酮时凋亡率为2.5％，单独应用10nM普纳替尼时凋亡率为17.6％。1μM隐丹参酮与普纳替尼联合应用时凋亡率为20％，2μM隐丹参酮与普纳替尼联合应用时凋亡率为21.8％。
Claims (3)
1.一种丹参酮类化合物在制备治疗耐药的BCR-ABL阳性的白血病药物中的应用，其特征在于：所述丹参酮类化合物选自丹参新酮和/或去氢丹参新酮，结构式分别如下：
所述耐药的BCR-ABL阳性的白血病是由T315I突变引起的伊马替尼耐药的白血病。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述丹参酮类化合物与普纳替尼联用；
所述丹参酮类化合物与普纳替尼的摩尔比为100～200:1。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述耐药的BCR-ABL阳性的白血病药物，原料中还包括药剂辅料。
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