CN110234407B - 用于化妆品的肽和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有抗氧化和亮白活性的肽家族；包含所述肽的化妆品组合物以及所述肽或化妆品组合物的化妆用途和方法。

Description

用于化妆品的肽和组合物
技术领域
本发明涉及化妆品领域，更准确地涉及具有抗氧化和/或亮白活性的肽和组合物以及其在化妆品领域中的方法和用途。
背景技术
近年来，在人群中存在不断增长的预防、减少和消除由内源和环境应激物导致的皮肤瑕疵和损伤从而维持皮肤具有健康的和年轻的外表的兴趣。这导致对于导致皮肤瑕疵出现的原因以及能够预防或减轻皮肤瑕疵的化合物和组合物的寻找方面存在不断增长的兴趣。
氧化和氧化应激可能是对皮肤衰老和皮肤损伤的最有害的贡献因素，其导致皮肤细胞外基质(ECM)的降解以及尤其导致炎症过程(Bickers，D.R.Athar，M.，OxidativeStress in the Pathogenesis of Skin Disease，J.Inv.Dermatology，2006；126：2565-2575)。氧化和氧化应激的起源多种多样并且可能由例如作为生理性衰老的结果的内在因素和更重要的由于如污染、吸烟、光老化(由于UV照射的结果)的环境因素或其他明确促进衰老的环境因素导致(Farage，M.A.，Miller，K.W.，Elsner，P.，Maibach，H.I.，Intrinsicand extrinsic factors in skin ageing：a review.Int J Cosmet Sci，2008；30：87-95)。作为外部因素(例如，污染——臭氧丢失，温室气体水平高于从前以及来自人为来源的微粒物质变得更频繁与损伤健康结果相关——)的结果的氧化，近来是皮肤老化和皮肤瑕疵出现的主要促进因素之一。
氧化和氧化应激除了其他后果还产生源于氧的自由基和炎症，这相应地产生例如:
-脂双层的细胞和亚细胞的多不饱和脂肪酸(在下文中，PUFA)的过氧化，这能够导致流动性降低、功能丧失和甚至细胞死亡。丙二醛(在下文中，MDA)是来自脂质过氧化的与脱氧核糖核酸(在下文中，DNA)共价结合的主要脂质过氧化氢来源的双功能亲电体之一，其产生严重损伤细胞代谢和完整性的加合物。
-糖基化，其是还原糖和蛋白、脂质或核酸之间的非酶促反应，该反应由前述因素加速。源自糖和游离氨基之间的反应的希夫碱(Schiff bases)和Amadori产物能够与肽或蛋白的其他残基不可逆转地反应，形成蛋白加合物或交联或进行进一步氧化反应，得到高级糖基化终产物(Advanced Glycation End products)。
-其他DNA损伤。如以上已经陈述的，DNA高度易于氧化。糖磷酸盐骨架和核碱基二者都是氧化剂的直接靶标。鸟嘌呤(G)尤其对多种氧化剂的氧化敏感，所述氧化剂包括羟基自由基(·OH)，单线态氧(1O2)和过氧化亚硝酸盐的衍生物(ONOO-)。G的一般氧化形式是8-氧代G并且已经参与遗传毒性和致突变的损伤。
-色素沉着过度：色素沉着可能由于与氧化应激的增加相关的多种因素，如UV辐射，炎症，激素变化，生活方式和环境污染物。在后一情况中，芳基烃受体(在下文中，AhR)受到特别关注，因为已经描述了它在色素形成中通过调节编码黑素生成通路的酶的基因表达发挥作用(Jux，B.，Kadow，S.，Luecke，S.，Rannug，A.，Krutmann，J.和Esser，C.，The ArylHydrocarbon Receptor Mediates UVB Radiation-Induced Skin Tanning，J.ofInv.Dermatology，131(2011)203-210)，由此，由于污染物(如烟草烟雾中含有的那些)导致的其活化，造成色素沉着过度(Nakamura，M.，Ueda，Y.，Hayashi，M.，Kato，H.，Furuhashi，T.和Morita，A.，Tobacco smoke-induced skin pigmentation is mediated by the arylhydrocarbon receptor，Experimental Dermatology，22(2013)554-563)。
已经开发了多种策略和化合物以抵抗这些不希望的老化过程，如局部抗氧化剂，如，植物提取物中含有的维生素、类视黄醇、类黄酮，或抗炎症活性剂(Pillai，S.，Oresajo，C.，Hayward，J.Ultraviolet radiation and skin ageing：roles of reactive oxygenspices，inflammation and protease activation，and strategies for prevention ofinflammation induced matrix degradation–a review，Int J Cosmet Sci，2005；27:17-34)。然而，这些化合物中的一些仅能够对这些外部因素之一起作用，或与日照不相容，使得有必要使用多种产品来获得对皮肤的完全的效用。
使用抗氧化剂来亮白皮肤的行为背后的想法在于这样的假设：UV-辐射的氧化效应造成黑素生成的激活。UV辐射能够在皮肤中产生活性氧类(ROS)，其能够通过激活酪氨酸酶诱导黑素生成。氧化还原剂也可以通过与在酪氨酸酶的活性位点的铜或与邻苯醌反应以阻止黑色素中间体的氧化聚合，来影响皮肤色素沉着。抗氧化剂也能够减少已有黑色素的直接光氧化。
除了该抗氧化机制外，存在一些其他减少皮肤中色素沉着水平的策略。很多已有的亮白活性成分对黑素细胞具有抑制酪氨酸酶的效果，导致总的黑色素的产生减少(例如，曲酸或熊果苷)。其他对黑色素从黑素细胞到角质形成细胞的转移有效果(例如，烟酰胺和大豆)或增加皮肤的脱落以去除过多的黑色素含量(Gillbro JM，Olsson MJ.Themelanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents--existing and newapproaches.Int J Cosmet Sci.2011Jun；33(3):210-21)。人成纤维细胞或角质形成细胞与黑素细胞之间的旁分泌传递也促进皮肤的色素沉着(Imokawa G，Yada Y，Morisaki N，Kimura Biological characterization of human fibroblast-derived mitogenicfactors for human melanocytes.M.Biochem J.1998Mar 15；330(Pt 3):1235-9；HirobeT，Keratinocytes regulate the function of melanocytes，Dermatologica Sinica，2014；32(4))。因此，可溶因子(例如，肝细胞生长因子(HGF)、干细胞因子(SCF，也称为KIT-配体)、阿黑皮素原(Proopiomelanocortin)(POMC)、内皮素(EDN1)、神经生长因子(NGF)和Dickkopf-相关蛋白1(DKK1或TP53)的调节也是皮肤亮白剂研究中的靶标。
因此，需要找到具有广谱抗氧化和/或亮白活性的物质或活性成分，这些物质或活性成分能够用于化妆品领域以预防或治疗由于环境氧化应激(例如，污染和UV辐射)导致的皮肤瑕疵出现，以校正不希望的皮肤色素沉着和/或以预防或治疗老化或光老化皮肤瑕疵。
发明内容
本专利的发明人在深入和详尽的研究后出人意料地发现具有广谱抗氧化和/或亮白活性的肽家族，并且因此发现解决目前技术水平中提到的上述问题和需求的肽。
根据本发明的肽通过其被证明了的高抗氧化活性，在预防、减少和/或校正与氧化应激相关的皮肤瑕疵(如，皮肤肤色、色素沉着改变(如老年斑或晒斑)、由于例如减少量的胶原蛋白或弹性纤维、细胞外基质或结构性脂质的结构的损失或DNA损伤、皮肤脆弱性的增加或炎性反应的增加导致的皱纹和皮肤密度、色泽(tone)和弹性的损失)中具有优异的活性。此外，在后一活性的情况下，本发明的肽能够用于亮化和/或亮白皮肤(对皮肤提供均一颜色并且减少或防止由于源自氧化应激的炎性反应导致的皮肤的颜色和/或色泽的不希望的斑点、色素沉着和/或不平整)。
因此，在第一实施方案中，本发明涉及一组肽，所述肽显示抗氧化、美白和/或亮白活性。
在进一步的实施方案中，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含所述肽中的一种或其组合。
在另外的实施方案中，本发明涉及本发明的肽或化妆品组合物作为化妆品的用途。
本发明进一步的实施方案涉及本发明的肽或组合物用于预防、减少和/或去除皮肤中的氧化应激和/或亮白皮肤的化妆用途。
在另一实施方案中，本发明涉及减少受试者的皮肤中的氧化应激的方法，其特征在于所述方法包括使用本发明的肽或组合物。
本发明的另外的实施方案涉及亮白受试者的皮肤的方法，其特征在于其包含使用本发明的肽或组合物。
如本文中使用的术语"非环脂肪族基"和其复数形式，具有所述术语的目前技术水平中给出的一般意义。因此，这些术语是指，例如并且不限于，直链或支链烷基、烯基和炔基。
如本文中使用的术语"烷基"和其复数形式，是指具有1至24个，优选1至16个，更优选1至14个，甚至更优选1至12个，并且甚至更优选1，2，3，4，5或6个碳原子，并且其通过单键与分子的剩余部分结合的饱和的、直链或支链基团，其包括，例如并且不限于，甲基，乙基，异丙基，正丙基，i-丙基，异丁基，叔丁基，正丁基，仲丁基，正戊基，正己基，庚基，辛基，癸基，十二烷基，月桂基，十六烷基，十八烷基，戊基，2-乙基己基，2-甲基丁基，5-甲基己基和类似基团。所述烷基可以任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基如，卤代，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和烷氧基硫代。
如本文中使用的术语"烯基"和其复数形式，是指具有2至24个，优选2至16个，更优选2至14个，甚至更优选2至12个，甚至更优选2，3，4，5或6个碳原子，具有一个或多个共轭的或非共轭的碳-碳双键，优选具有1，2或3个碳-碳双键的直链或支链基团，其通过单键与分子的剩余部分结合，包括，例如并且不限于，乙烯基，油烯基，亚油烯基和类似基团。所述烯基可以任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基如，卤代，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和烷氧基硫代。
如本文中使用的术语"炔基"和其复数形式，是指具有2至24个，优选2至16个，更优选2至14个，甚至更优选2至12个，甚至更优选2，3，4，5或6个碳原子，具有一个或多个共轭的或非共轭的碳-碳三键，优选具有1，2或3个碳-碳三键的直链或支链基团，其通过单键与分子的剩余部分结合，包括，例如并且不限于，乙炔基，1-丙炔基，2-丙炔基，1-丁炔基，2-丁炔基，3-丁炔基，戊炔基，如1-戊炔基和类似基团。所述炔基可以任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基如，卤代，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和烷氧基硫代。
如本文中使用的术语"脂环基"和其复数形式，具有所述术语的技术状态给出的一般意义。因此，这些术语用于指，例如并且不限于，环烷基或环烯基或环炔基。
如本文中使用的术语"环烷基"和其复数形式，是指具有3至24个，优选3至16个，更优选3至14个，甚至更优选3至12个，甚至更优选3，4，5或6个碳原子的饱和的单环或多环脂肪族基团，并且其通过单键与分子的剩余部分结合，包括，例如并且不限于，环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基，甲基环己基，二甲基环己基，八氢茚，十氢化萘，十二氢-非那烯，金刚烷基和类似基团，并且其可以任选地被一个或多个基团取代，所述基团如，烷基，卤代，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和烷氧基硫代。
如本文中使用的术语"环烯基"和其复数形式，是指具有5至24个，优选5至16个，更优选5至14个，甚至更优选5至12个，甚至更优选5或6个碳原子的，具有一个或多个共轭的或非共轭的碳-碳双键，优选具有1，2或3个碳-碳双键的非芳香族单环或多环脂肪族基团，其通过单键与分子的剩余部分结合，其包括，例如并且不限于，环戊-1-烯-1-基和类似基团，并且其可以任选地被一个或多个基团取代，所述基团如，烷基，卤代，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和烷氧基硫代。
如本文中使用的术语"环炔基"和其复数形式，是指具有8至24个，优选8至16个，更优选8至14个，甚至更优选8至12个，甚至更优选8或9个碳原子的，具有一个或多个共轭的或非共轭的碳-碳三键，优选具有1，2或3个碳-碳三键的非芳香族单环或多环脂肪族基团，其通过单键与分子的剩余部分结合，包括，例如并且不限于，环辛-2-炔-1-基和类似基团，并且其可以任选地被一个或多个基团取代，所述基团如，烷基，卤代，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和烷氧基硫代。
如本文中使用的术语"芳基"和其复数形式，是指具有6至30个，优选6至18个，更优选6至10个，甚至更优选6或10个碳原子的芳香族基团，其包含1，2，3或4个芳环，通过碳-碳键结合或稠合，并且其通过单键与分子的剩余部分结合，包括，例如并且不限于，苯基，萘基，二苯基，茚基，菲基或蒽基等。所述芳基可以任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基如，卤代，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和烷氧基硫代。
如本文中使用的术语"芳烷基"和其复数形式，是指具有7至24个碳原子的被芳香族基团取代的烷基，并且包括，例如并且不限于，-(CH2)1-6-苯基，-(CH2)1-6-(1-萘基)，-(CH2)1-6-(2-萘基)，-(CH2)1-6-CH(苯基)2和类似基团。所述芳烷基可以任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基如，卤代，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和烷氧基硫代。
如本文中使用的术语"杂环基团"和其复数形式，是指这样的3-10元杂环基或烃环，其中环原子中的一个或多个，优选环原子中的1，2或3个，是不同于碳的元素，如氮，氧或硫，并且可以是饱和的或不饱和的。为了本发明的目的，所述杂环基可以是环体系、单环、双环或三环体系，其可以包括稠合环系；并且所述氮、碳或硫原子可以任选地在杂环基自由基中被氧化；所述氮原子可以任选地被季铵化；并且所述杂环基自由基可以是部分或完全饱和的或可以是芳香族的。随优选性增加，术语杂环是指5或6元环。所述杂环基团可以任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基如，卤代，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和烷氧基硫代。
如本文中使用的术语"杂芳基烷基"和其复数形式，是指被取代或未取代的芳香族杂环基取代的烷基，所述烷基具有1至6个碳原子和2至24个碳原子的芳香族杂环基以及1至3个非碳的原子，并且包括，例如并且不限于，-(CH2)1-6-咪唑基，-(CH2)1-6-三唑基，-(CH2)1-6-噻吩基，-(CH2)1-6-呋喃基，-(CH2)1-6-吡咯烷基和类似基团。所述杂芳基烷基可以任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基如，卤代，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和烷氧基硫代。
如本文中使用的术语"卤代"或"卤素"，是指氟，氯，溴或碘，并且其阴离子称为卤化物。
如本文中使用的，术语"衍生物"和其复数形式，都是指化妆用化合物，这源自能够用于制备化妆品的目标化合物，并且是指化妆品可接受的衍生物，因为这些可以用于制备化妆用衍生物。
如本文中使用的，术语"盐"和其复数形式是指目前技术水平中已知的那些中的任何类型的盐，例如，卤化物盐，羟基酸盐(如含氧酸盐，酸式盐，碱式盐和复盐)，羟基盐，混合盐，含氧盐或其他水合盐。该术语包含化妆用盐和化妆品可接受的盐，因为后者可以用于制备化妆用盐。
如本文中使用的，术语"异构体"和其复数形式是指光学异构体，对映异构体，立体异构体或非对映异构体。各个对映异构体或非对映异构体，以及它们的混合物，可以通过目前技术水平中已知的常规技术分离。
如本文中使用的，术语"溶剂化物"和其复数形式是指目前技术水平中已知的任意溶剂化物，如极性、非极性或两性溶剂化物，并且包括当施用或施加于目标受试者(直接地或间接地)时，提供目标化合物(一种或多种本发明的肽)的任意化妆用溶剂化物。优选地，所述溶剂化物是水合物，与醇(如甲醇，乙醇，丙醇或异丙醇)一起的溶剂化物，与酯(如乙酸乙酯)一起的溶剂化物，与醚(如甲醚，乙醚或THF(四氢呋喃))一起的溶剂化物或与DMF(二甲基甲酰胺)一起的溶剂化物，并且更优选与醇(如乙醇)一起的水合物或溶剂化物。
此外，如本文中使用的，术语“氨基酸”和其复数形式包括由遗传密码编码的氨基酸和非编码氨基酸，不论它们是天然还是非天然的并且不论它们是D-氨基酸还是L-氨基酸。非编码氨基酸的实例，不受限制，是瓜氨酸，鸟氨酸，肌氨酸，锁链素，正缬氨酸，4-氨基丁酸，2-氨基丁酸，2-氨基异丁酸，6-氨基己酸，1-萘基丙氨酸，2-萘基丙氨酸，2-氨基苯甲酸，4氨基苯甲酸，4-氯代苯基丙氨酸，2,3-二氨基丙酸，2,4二氨基丁酸，环丝氨酸，肉碱，半胱氨酸，青霉胺，焦谷氨酸，噻吩基丙氨酸，羟基脯氨酸，别构-异亮氨酸，别构-苏氨酸，异哌啶酸，异丝氨酸，苯基甘氨酸，抑制素，β-丙氨酸，正亮氨酸，N-甲基氨基酸，α-氨基酸和β-氨基酸等，以及它们的衍生物。非天然氨基酸表在目前技术水平中已知(见，例如，D.C.Roberts和F.Vellaccio的“Unusual amino acids in peptide synthesis”，ThePeptide，Vol.5(1983)，Chapter VI，Gross E.and Meienhofer J.，Eds.，Academic Press，New York，USA)。
如上文所述，在第一方面，本发明涉及式(I)的肽:
R1-Xm-AA1-AA2-AA3-AA4-Yn-R2
(I)
它们的化妆用异构体，盐，溶剂化物和/或衍生物和其混合物，其中:
X选自具有脂肪族非极性侧链的氨基酸的组；
AA1选自Asp，Glu，His或Thr；
AA2选自芳香族氨基酸的组；
AA3选自Lys，Arg，Phe，Trp或Tyr；
AA4选自Val，Ile，Leu，Lys或Arg；
Y选自具有脂肪族非极性侧链的氨基酸的组；
n和m彼此独立地选自0和1；
R1选自H，取代或未取代的非环脂肪族基，取代或未取代的脂环基，取代或未取代的杂环基，取代或未取代的杂芳基烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷基和R5-CO-，其中R5选自H，取代或未取代的非环脂肪族基，取代或未取代的脂环基，取代或未取代的杂环基，取代或未取代的杂芳基烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷基；并且
R2选自H，-NR3R4，-OR3和-SR3，其中R3和R4独立地选自H，取代或未取代的非环脂肪族基，取代或未取代的脂环基，取代或未取代的杂环基，取代或未取代的杂芳基烷基，取代或未取代的芳基，和取代或未取代的芳烷基。
预计本发明的肽中使用或存在的氨基酸是L-氨基酸，D-氨基酸或其组合。在优选的实施方案中，本发明的肽中使用的或存在的氨基酸是L-氨基酸。
优选地，上文提及的异构体是立体异构体。预计所述立体异构体是对映异构体或非对映异构体。因此，在本发明的优选的实施方案中，所述是肽是外消旋混合物，非对映混合物，纯的对映异构体或纯的非对映异构体。
在优选的实施方案中，m是1并且X是Leu。
在另一优选的实施方案，n是1并且Y是Ala。
因此，在进一步的优选的实施方案中，m是1并且X是Leu；和n是1并且Y是Ala。
在另一优选的实施方案中，m和n是0。
在一个实施方案中，AA2选自Tyr，Trp或Phe。
优选，R1是H，乙酰基(在下文中，Ac)，棕榈酰基，肉豆蔻酰基，壬二酰基，caffeloyl，壬二酸，没食子酸，羟基苯甲酸，硫辛酸，酒石酸对香豆酸，咖啡酸或阿魏酸，更优选的，R1是Ac，棕榈酰基，壬二酸，没食子酸，羟基苯甲酸，硫辛酸，酒石酸对香豆酸，咖啡酸或阿魏酸，更优选的，R1是棕榈酰基，阿魏酸或Ac，更优选的，R1是棕榈酰基或Ac，并且甚至更优选R1是Ac。
此外，优选的，R2是H或NH2，更优选NH2。
因此，在最优选的实施方案中，R1是Ac并且R2是H或NH2，更优选NH2。
在另一最优选的实施方案中，R1是阿魏酸并且R2是H或NH2，更优选NH2。
在另一优选的实施方案中，式(I)的肽是:
R1-Asp-Tyr-Lys-Val-R2(R1-SEQ ID NO：1-R2)；
R1-His-Trp-Phe-Lys-R2(R1-SEQ ID NO：2-R2)；
R1-Leu-His-Trp-Phe-Arg-Ala-R2(R1-SEQ ID NO：3-R2)，或
R1-Thr-Phe-Phe-Lys-R2(R1-SEQ ID NO：4-R2)。
更优选的，式(I)的肽是：
Ac-Asp-Tyr-Lys-Val-R2(Ac-SEQ ID NO：1-R2)；
Ac-His-Trp-Phe-Lys-R2(Ac-SEQ ID NO：2-R2)；
Ac-Leu-His-Trp-Phe-Arg-Ala-R2(Ac-SEQ ID NO：3-R2)；或
棕榈酰基-Thr-Phe-Phe-Lys-R2(棕榈酰基-SEQ ID NO：4-R2)。
甚至更优选的，式(I)的肽是:
Ac-Asp-Tyr-Lys-Val-NH2(Ac-SEQ ID NO：1-NH2)；
Ac-His-Trp-Phe-Lys-NH2(Ac-SEQ ID NO：2-NH2)；
Ac-Leu-His-Trp-Phe-Arg-Ala-NH2(Ac-SEQ ID NO：3-NH2)；或
棕榈酰基-Thr-Phe-Phe-Lys-NH2(棕榈酰基-SEQ ID NO：4-NH2)。
在另一优选的实施方案中，式(I)的肽是:
R1-Asp-Tyr-Lys-Val-R2(R1-SEQ ID NO：1-R2)；或
R1-His-Trp-Phe-Lys-R2(R1-SEQ ID NO：2-R2)。
在最优选的实施方案中，式(I)的肽是:
Ac-Asp-Tyr-Lys-Val-NH2(Ac-SEQ ID NO：1-NH2)；或
Ac-His-Trp-Phe-Lys-NH2(Ac-SEQ ID NO：2-NH2)。
在进一步的优选的实施方案中，式(I)的肽是:
Asp-Tyr-Lys-Val(SEQ ID NO：1)；或
His-Trp-Phe-Lys(SEQ ID NO：2)。
在另一优选的实施方案中，式(I)的肽是:
Leu-His-Trp-Phe-Arg-Ala(SEQ ID NO：3)。
更优选的，式(I)的肽是:
R1-Leu-His-Trp-Phe-Arg-Ala-R2(R1-SEQ ID NO：3-R2)。
甚至更优选的，式(I)的肽是:
Ac-Leu-His-Trp-Phe-Arg-Ala-NH2(Ac-SEQ ID NO：3-NH2)。
此外，在优选的实施方案中，式(I)的肽是:
阿魏酸-His-Trp-Phe-Lys-R2(阿魏酸-SEQ ID NO：2-R2)。
在该实施方案中，更优选的，式(I)的肽是:
阿魏酸-His-Trp-Phe-Lys-NH2(阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2)。
本发明的肽的活性，即，抗氧化和亮白(在下文包括的实施例中证明)，表示所述肽和包含其的所述组合物适于化妆性预防、减少或去除由氧化和/或氧化应激导致的皮肤瑕疵，例如，由于环境氧化应激(例如，污染或UV辐射)导致的皮肤瑕疵出现，由于老化或光老化导致的不希望的皮肤色素沉着或皮肤瑕疵(例如，皮肤肤色和/或皮肤色调和弹性的损失)。
在第二方面，本发明涉及包含如本文中公开的本发明的肽的组合物。
在本发明优选的实施方案中，所述组合物是化妆品组合物，其尤其提供上述化妆活性：抗氧化和亮白。
预计本发明的化妆品组合物包含本发明的一种肽或本发明的肽的组合或混合物。
在一个实施方案中，上文公开的化妆品组合物包含0.1％-0.0001％(质量/体积；即mg/ml)的本发明的肽或本发明的肽的组合。更优选的，所述组合物包含0.1％-0.001％(m/v)的本发明的肽或本发明的肽的组合。
预计本发明的化妆品组合物还包含在目前技术水平中常用的另外的化妆品成分，如，例如，辅剂如稳定剂，促溶剂，维生素，着色剂和香料；运载体；和/或其他化妆品活性成分。
所述另外的化妆品成分，必须与组合物的其余成分，特别是与本发明的组合物中包含的本发明的肽在物理学和化学上相容。同样，所述另外的化妆品成分的性质必须不是不可接受地改变本发明的化合物的益处。所述另外的化妆品成分可以是合成的或天然的来源，如，例如，植物提取物，或它们可以源自生物发酵过程(参见，例如，CTFA CosmeticIngredient Handbook，第十一版(2006))。
预计上文提及的另外的化妆品成分包含那些通常用于组合物以护理和/或清洁皮肤/或毛发的成分，如，例如，其他抑制黑色素合成的化学剂，其他美白或去色素剂，抗衰老剂，抑制NO-合成酶的化学剂，抗氧化剂，抗空气污染和/或游离自由基捕获剂，抗糖基化剂，乳化剂，润滑剂，有机溶剂，液体推进剂，皮肤调节剂如例如润湿剂，保湿物质，阿尔法羟基酸，湿润剂，维生素，色素或着色剂，染剂，凝胶聚合物，增稠剂，表面活性剂，软化剂，抗皱剂，能够减少或消除眼袋的化学剂，剥落剂，抗微生物剂，抗真菌剂，杀菌剂，刺激皮肤或表皮大分子合成和/或能够预防或抑制它们的降解的化学剂，如例如刺激胶原蛋白合成的化学剂，刺激弹性蛋白合成的化学剂，刺激层粘连蛋白合成的化学剂，抑制胶原蛋白降解的化学剂，抑制弹性蛋白降解的化学剂，刺激成纤维细胞增殖的化学剂，刺激角质形成细胞增殖的化学剂，刺激角质形成细胞分化的化学剂，刺激脂质合成和角质层的成分(神经酰胺，脂肪酸等)的合成的化学剂，脱皮剂，刺激糖胺聚糖合成的化学剂，DNA修复剂，DNA保护剂，刺激蛋白酶体活性的化学剂，止痒剂，治疗敏感皮肤的化学剂，重申剂(reaffirmingagents)，收敛剂，皮脂产生调节剂，刺激脂解的化学剂，溶脂剂，镇静剂，抗炎剂，作用于毛细血管循环和/或微循环的化学剂，作用于细胞代谢的化学剂，用于改善表皮-真皮接合的化学剂，防腐剂，香料，螯合剂，植物提取物，精油，海洋提取物，源自生物发酵过程的化学剂，矿物盐，细胞提取物和/或日光过滤物(针对紫外A和B射线作用的有机或无机光保护剂)等。
在一个实施方案中，因此，本发明的化妆品组合物，还包含其他发挥与对于本发明的肽在上文公开的那些相同、相似或不同的化妆活性的化妆活性成分或物质。
在优选的实施方案中，本发明的化妆品组合物包含日光过滤物或其组合(UVA和/或UVB辐射阻断剂)以预防色素沉着，保护皮肤免于暴露于阳光或由于日光暴露而引起的晒黑，或增加本发明的肽或组合物的能力以减少皮肤中的黑色素量和它们的色素沉积作用。日光过滤物的实例包括对-氨基苯甲酸衍生物，苯亚甲基樟脑衍生物，肉桂酸衍生物，苯并噻唑衍生物，苯并咪唑衍生物，苯甲酮衍生物，三嗪衍生物，唾液酸衍生物，二苯甲酰基甲烷衍生物，β,β-二苯基丙烯酸酯衍生物，以及纳米色素如，例如，氧化钛纳米色素，氧化铁纳米色素，氧化锌纳米色素，氧化锆纳米色素或氧化铯纳米色素。
还设想本发明的化妆品组合物包含脱落剂或其组合，其能够促进皮肤的脱落以在色素脱失治疗方面获得更大的功效。脱落剂的实例包括，阿尔法羟基酸如，乙醇酸，乳酸，柠檬酸，酒石酸，苹果酸和/或扁桃酸；贝塔羟基酸如水杨酸和其衍生物；尿素和其衍生物；白藜芦醇和其衍生物；N-乙酰基葡糖胺和其衍生物；茉莉酸和其衍生物；肉桂酸；龙胆酸；低聚果糖；槐米(Saphora japonica)提取物；以及去污剂和/或酶如，例如，舒替兰酶，木瓜提取物，菠萝蛋白酶，菠萝提取物，南瓜提取物和/或甘薯提取物等。
此外，本发明的化妆品组合物可以配制为目前技术水平中常用的任何形式，例如，溶液，混悬液，乳状液，贴剂，凝胶，乳霜，粉末，喷雾，洗液，油状物，擦剂，浆液，摩丝，软膏，棒或笔，包括“留在原处的(leave on)”和“冲洗掉的(rinse-off)”配方。本发明的化妆品组合物也可以通过目前技术水平中已知的技术方式掺合于不同类型的固体配饰如药巾，水凝胶，粘附性(或非粘附性)贴片或面膜，或其可以掺合于不同的化妆线产品如遮阳剂，粉底，洗液或卸妆液等。
还设想如在本文中公开的本发明的化妆品组合物或本发明的肽，还可以掺合入化妆品缓释系统和/或运载体如脂质体，毫米粒子，微米粒子和纳米粒子，以及在海绵状物，泡状物，胶束，毫米球，微米球，纳米球，脂球，毫米胶囊，微米胶囊和纳米胶囊中，以及微米乳状液和纳米乳状液中，用于获得活性成分的更好的穿透性。
在优选的实施方案中，本发明的化妆品组合物适合于或适应于在受试者，更优选人的脸部和/或身体上局部施用。
在第三方面，本发明涉及本发明的肽或化妆品组合物作为化妆品以预防、减少或去除受试者的皮肤中的氧化应激和/或亮白受试者的皮肤的用途。
在一个实施方案中，所述作为化妆品的用途是预防、减少或去除由于氧化和/或氧化应激导致的皮肤瑕疵，更优选的，是预防、减少或去除由于环境氧化应激(例如，污染或UV辐射)导致的皮肤瑕疵出现，由于老化或光老化导致的不希望的皮肤色素沉着或皮肤瑕疵。
在优选的实施方案中，这样的皮肤瑕疵是，皮肤肤色，色素沉着改变(如老年斑或晒斑)，由于例如细胞外基质的结构损失、皮肤脆性的增加和/或炎性反应的增加导致的皱纹和/或皮肤色调和弹性损失(Baumann，L.，Skin ageing and its treatment，J.Pathol.，2007；211:241-251)。
因此，在优选的实施方案中，上述本发明的肽或化妆品组合物作为化妆品的用途是预防、减少或去除皮肤老化和/或光老化的迹象。
在另一优选的实施方案中，本发明的肽或化妆品组合物作为化妆品的用途是用于预防、减少或去除色素沉着改变。
另外，在优选的实施方案中，受试者是人。
预计如上文公开的本发明的作为化妆品的用途，本发明的肽或组合物与一种或多种另外的活性成分和/或组合物组合使用。所述一种或多种活性成分和/或组合物可以在本发明的肽或组合物之前使用，一起使用或之后使用。
在优选的实施方案中，在如上文公开的本发明的用途中，本发明的肽和/或化妆品组合物在受试者，更优选人的面部和/或身体上局部施加。
在第四方面，本发明涉及如上文所述的本发明的肽或化妆品组合物的化妆用途，用以预防、减少或去除受试者的皮肤中的氧化应激和/或亮白皮肤。
氧化应激的预防、减少或去除和/或皮肤的亮白允许对由于环境氧化应激(例如，污染或UV辐射)导致的皮肤瑕疵出现的预防，减少或去除。这样的皮肤瑕疵的实例是，皮肤肤色，色素沉着改变(如老年斑或晒斑)，由于例如细胞外基质结构的损失、皮肤脆性的增加和/或炎性反应的增加导致的皱纹和/或皮肤色调和弹性损失(Baumann，L.Skin ageingand its treatment，J.Pathol.，2007；211:241-251)。
因此，在优选的实施方案中，本发明的肽或组合物的化妆用途是预防、减少或去除皮肤老化和/或光老化的迹象。
在另一优选的实施方案中，本发明的肽或组合物的化妆用途用于预防、减少或去除色素沉着改变。
另外，在优选的实施方案中，受试者是人。
预计在如上文公开的本发明的化妆用途中，本发明的肽或组合物用于与一种或多种另外的活性成分和/或组合物组合使用。所述一种或多种活性成分和/或组合物可以在本发明的肽或组合物之前使用，一起使用或之后使用。
在优选的实施方案中，在如上文公开的本发明的化妆用途中，本发明的肽和/或化妆品组合物，在受试者，更优选人的面部和/或身体上局部施加。
在第五方面，本发明涉及预防、减少或去除受试者的皮肤中的氧化应激的方法，其特征在于其包括使用本发明的肽或化妆品组合物。
在优选的实施方案中，受试者是人。
预计本发明的肽或组合物通过直接施用于人体的皮肤带而用于本发明的方法。在优选的实施方案中，本发明的肽或组合物以溶液，混悬液，乳状液，贴剂，凝胶，乳霜，粉末，喷雾，洗液，油状物，擦剂，浆液，摩丝，软膏，棒或笔的形式施用，包括“留在原处的”和“冲洗掉的”制剂。如上文所述，还设想本发明的肽或组合物也可以通过目前技术水平中已知的技术方式掺合于不同类型的固体配饰如药巾，水凝胶，粘附性(或非粘附性)贴片或面膜，或其可以掺合于不同的化妆线产品如遮阳剂，粉底，洗液或卸妆液等；并且因此在本发明的方法中以所述形式中的任一种使用。
如上文所述，上文公开的方法是具有化妆效果的化妆方法。
在本发明的方法中，皮肤中氧化应激的预防、减少或去除具有上述活性，效果和/或用途。
预计在如上文公开的本发明的方法中，本发明的肽或组合物与一种或多种另外的活性成分和/或组合物组合使用。所述一种或多种活性成分和/或组合物可以在本发明的肽或组合物之前使用，一起使用或之后使用。
在优选的实施方案中，在如上文公开的本发明的方法中，本发明的肽和/或化妆品组合物在受试者，更优选人的面部和/或身体上局部施加。
在最后一方面，本发明涉及亮白受试者的皮肤的方法，其特征在于其包括使用本发明的肽或组合物。
在优选的实施方案中，受试者是人。
预计本发明的肽或组合物通过直接施加于人体的皮肤带而用于本发明的方法。在优选的实施方案中，本发明的肽或组合物以溶液，混悬液，乳状液，贴剂，凝胶，乳霜，粉末，喷雾，洗液，油状物，擦剂，浆液，摩丝，软膏，棒或笔的形式施用，包括“留在原处的”和“冲洗掉的”制剂。如上文所述，还设想本发明的肽或组合物也可以通过目前技术水平中已知的技术方式掺合于不同类型的固体配饰如药巾，水凝胶，粘附性(或非粘附性)贴片或面膜，或其可以掺合于不同的化妆线产品如遮阳剂，粉底，洗液或卸妆液等；并且因此在本发明的方法中以所述形式中的任一种使用。
如上文所述，上文公开的方法是具有化妆效果的化妆方法。
在本发明的方法中，皮肤中氧化应激的预防、减少或去除具有上述效果和/或用途。
预计在如上文公开的本发明的方法中，本发明的肽或组合物与一种或多种另外的活性成分和/或组合物组合使用。所述一种或多种活性成分和/或组合物可以在本发明的肽或组合物之前使用，一起使用或之后使用。
在优选的实施方案中，在如上文公开的本发明的方法中，本发明的肽和/或化妆品组合物，在受试者，更优选人的面部和/或身体上局部施用。
如上文已指出的，本发明的肽(并且因此还有本发明的化妆品组合物)显示出广谱的抗氧化和/或亮白活性，因为它们在种类繁多的条件下都展现出所述活性。因此，所述肽和包含所述肽的组合物适于用于化妆品以预防、减少或去除在多种条件下由于氧化或氧化应激产生的皮肤瑕疵。
附图说明
为了使得更好理解，在下文参考通过实施例的方式呈现的所附附图以及参考描述性的且非限制性的实施例更详细描述本发明。
图1表示Ac-SEQ ID NO：1-NH2，Ac-SEQ ID NO：2-NH2，Ac-SEQ ID NO：3-NH2和阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2的以trolox等效性的形式的抗氧化能力(参见实施例9)。图1(A)显示对用三个测试浓度的Ac-SEQ ID NO：1-NH2的处理获得的trolox等效性，柱从左到右(x-轴)：0.01mg/ml，0.05mg/ml和0.1mg/ml。图1(B)表示对用三个相应测试浓度的Ac-SEQ IDNO：2-NH2的处理获得的trolox等效性，柱从左到右(x-轴)：0.05mg/ml，0.1mg/ml和0.5mg/ml。图1(C)表示对用三个相应测试浓度的Ac-SEQ ID NO：3-NH2的处理获得的trolox等效性，柱从左到右(x-轴)：0.01mg/ml，0.05mg/ml和0.1mg/ml。图1(D)表示对用三个相应测试浓度的阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2的处理获得的trolox等效性，柱从左到右(x-轴)：0.01mg/ml，0.05mg/ml和0.1mg/ml。作为测定的阳性对照，测试抗坏血酸2-葡糖苷(在下文中，AA-2G)和磷酸抗坏血酸酯镁(在下文中，MAP)。图1(E)表示对用三个相应测试浓度的AA-2G的处理获得的trolox等效性，柱从左到右(x-轴)：0.01mg/ml，0.05mg/ml和0.1mg/ml。图1(F)表示对用三个相应测试浓度的MAP的处理获得的trolox等效性，柱从左到右(x-轴)：0.01mg/ml，0.05mg/ml和0.1mg/ml。对于图1(A)至1(F)，y-轴表示以μM计的trolox等效性。
图2表示四个浓度的阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2和两个浓度的参比化合物抗坏血酸的抗氧化活性，通过2,2-二苯基-1-苦基肼基(在下文中，DPPH)测定的方式评估并且基于对照样品(如实施例10中解释的)标准化。x-轴上柱从左到右对应于：对照(未加入肽)；分别是30μM和60μM的抗坏血酸；和浓度为0.01mg/mL，0.05mg/mL，0.1mg/ml和0.5mg/mL的阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2。y-轴表示相对于对照条件(未加入肽)的抗氧化活性(DPPH还原的％)。
图3表示基于对照样品(如实施例11中解释的)标准化的脂质过氧化百分数，即设置对照样品中的脂质过氧化的百分数为100％并且随后与剩余样品进行比较。图3(A)表示对用三个测试浓度的Ac-SEQ ID NO：1-NH2的处理获得的脂质过氧化的百分数结果。图3(A)中x-轴中柱从左到右对应于：对照和分别用0.01mg/ml，0.05mg/ml和0.1mg/ml的Ac-SEQ IDNO：1-NH2浓度的处理。图3(B)表示对利用三个相应测试浓度的Ac-SEQ ID NO：2-NH2的处理获得的脂质过氧化的百分数结果。图3(B)中x-轴柱从左到右对应于：对照和分别用0.01mg/ml，0.05mg/ml和0.1mg/ml的Ac-SEQ ID NO：2-NH2浓度的处理。对于图3(A)和3(B)二者，y-轴表示脂质过氧化相对于在阳性对照样品中观察到的脂质过氧化的百分数。
图4表示与阳性对照样品(仅用100μM的过氧化氢处理的样品，如实施例12中解释的)相比活性氧类(由过氧化氢引起)的百分数，即设置阳性对照样品中的活性氧类百分数为100％，并且随后与剩余样品进行比较。图4(A)表示用三个测试浓度的Ac-SEQ ID NO：1-NH2的处理获得的活性氧类的百分数柱的结果。图4(A)中x-轴上柱从左到右对应于：本底状态(未进行处理的细胞)，阳性对照，氧化(用1mM抗坏血酸处理的样品)的阴性对照以及分别用0.001mg/ml，0.005mg/ml和0.01mg/ml的Ac-SEQ ID NO：1-NH2浓度的处理。图4(B)表示对用四个相应测试浓度的Ac-SEQ ID NO：2-NH2的处理获得的活性氧类的百分数的结果。图3(B)的x-轴上的柱从左到右对应于：本底状态(未进行处理的细胞)，阳性对照，阴性对照(用1mM抗坏血酸处理的样品)和分别用0.001mg/ml，0.005mg/ml，0.01mg/ml和0.05mg/ml的Ac-SEQ ID NO：2-NH2浓度的处理。对于图4(A)和4(B)二者，y-轴表示活性氧类相对于在阳性对照样品中观察到的活性氧类的百分数。
图5表示对于用Ac-SEQ ID NO：1-NH2的处理获得的高级糖基化终产物(由重金属引起)与对照样品(仅用300μM的重金属处理的样品，如实施例13中解释的)相比的百分数，即设置对照样品中高级糖基化终产物的百分数为100％并且随后与剩余样品进行比较。x-轴表示测试的样品，即柱从左到右：本底状态(未进行处理的细胞)，阳性对照，分别为0.01mg/ml，0.05mg/ml和0.1mg/ml的三个Ac-SEQ ID NO：1-NH2测试浓度。y-轴表示高级糖基化终产物相对于对照样品中观察到的高级糖基化终产物的百分数。
图6表示与对照样品(仅用合成的烟雾处理的样品，如实施例14中解释的)相比对DNA氧化(由合成的烟雾引起)的保护。为此，图6表示对于与对照样品相比或标准化后，利用Ac-SEQ ID NO：1-NH2的处理获得的8-羟基脱氧鸟苷(作为DNA氧化的测量物)的百分数(设置对照样品的百分数为100％并且随后与剩余样品进行比较)。x-轴从左到右表示：本底状态(未进行处理的细胞)，阳性对照和分别为0.01mg/ml，0.05mg/ml和0.1mg/ml的三个Ac-SEQ ID NO：1-NH2测试浓度。y-轴表示8-羟基脱氧鸟苷相对于对照样品中观察到的8-羟基脱氧鸟苷的百分数。
图7表示与对照样品(仅用合成的烟雾处理的样品，如实施例14中解释的)相比对脂氧化(由合成的烟雾引起)的保护。为此，图7表示与对照样品相比对于利用Ac-SEQ IDNO：1-NH2处理获得的MDA(为脂氧化的测量物)的百分数(设置对照样品的百分数为100％并且随后与剩余样品进行比较)。x-轴从左到右表示：本底状态(未进行处理的细胞)，对照和Ac-SEQ ID NO：1-NH2的三个测试浓度，即分别为0.01mg/ml，0.05mg/ml和0.1mg/ml。y-轴表示相对于对照样品中观察到的MDA的百分数MDA。
图8表示Ac-SEQ ID NO：1-NH2对用0.05mg/mL的肽浓度处理后HEKa细胞的基因表达谱的效果。基因表达水平的变化表示为相对于本底对照(未处理的细胞)的正或负倍数改变。y-轴上棒条从上到下是指：CYP2R1(维生素D 25-羟化酶)，NFE2L2(核因子样蛋白2)，HMOX1(血红素加氧酶-1)，GSTP1(谷胱甘肽S-转移酶P)，GSS(谷胱甘肽合成酶)，GPX1(谷胱甘肽过氧化物酶)和TRX(硫氧还蛋白)。x-轴涉及相对于或与本底对照相关的倍数改变。负的倍数改变意为相应基因下调；并且正的倍数改变意为相应基因上调。
图9表示肽Ac-SEQ ID NO：1-NH2对人皮肤移植物的抗氧化和抗污染功效。图9(A)和9(B)显示之前在暴露于污染物的混合物(重金属和烃)后用或不用肽Ac-SEQ ID NO：1-NH2处理的情况下人皮肤移植物上被AhR(图9(A))和血红素加氧酶-1(在下文中，HO-1)(图9(B))占据的表皮表面的百分数，而图9(C)表示在不暴露于污染物的情况下用或不用Ac-SEQID NO：1-NH2处理的移植物被HO-1占据的表皮表面的百分数。对于图9(A)和9(B)，x-轴从左到右表示：暴露于污染物的混合物的未处理的移植物和暴露于污染物的混合物并用Ac-SEQID NO：1-NH2处理的移植物。在这方面，图9(C)的x-轴，从左到右表示未处理的移植物和用Ac-SEQ ID NO：1-NH2处理的移植物。y-轴表示被AhR(图9(A))和HO-1(图9(B)和9(C))占据的表面的百分数，对于图9(A)和9(B)的移植物和对于图9(C)的未处理的和未暴露的移植物，将对于未处理的但暴露于污染物的混合物获得的值设为100％。
图10表示Ac-SEQ ID NO：1-NH2的亮白功效。为此，图10表示对于用Ac-SEQ ID NO：1-NH2的处理获得的，与每个处于本底状态的细胞(未进行处理的细胞)的黑色素相比，每个细胞的黑色素百分数(将本底状态的百分数设为100％并且随后与剩余样品进行比较)。使用两个浓度的曲酸作为阳性对照。x-轴从左到右表示：本底状态，10μM曲酸，50μM曲酸和测试的三个浓度的Ac-SEQ ID NO：1-NH2，分别是0.01mg/ml(17.7μM)，0.05mg/ml(88.5μM)和0.1mg/ml(177.1μM)。y-轴表示每个细胞的黑色素百分数(将对于本底状态获得的值稳定为100％)。
图11表示Ac-SEQ ID NO：2-NH2的亮白功效。为此，图11表示对于用Ac-SEQ ID NO：2-NH2的处理获得的，与每个处于本底状态的细胞(未进行处理的细胞)的黑色素相比，每个细胞的黑色素百分数(将本底状态的百分数设为100％并且随后与剩余样品进行比较)。两个浓度的曲酸用作阳性对照。x-轴从左到右表示：本底状态，10μM曲酸，50μM曲酸和测试的三个浓度的Ac-SEQ ID NO：2-NH2，分别是0.01mg/ml(15.2μM)，0.05mg/ml(76μM)和0.1mg/ml(152μM)。y-轴表示每个细胞的黑色素百分数(将对于本底状态获得的值稳定为100％)。
图12表示Ac-SEQ ID NO：3-NH2的亮白功效。为此，图12表示对于用Ac-SEQ ID NO：3-NH2的处理获得的，与每个处于本底状态的细胞(未进行处理的细胞)的黑色素相比，每个细胞的黑色素百分数(将本底状态的百分数设为100％并且随后与剩余样品进行比较)。曲酸用作阳性对照。x-轴从左到右表示：本底状态，70μM曲酸和测试的三个浓度的Ac-SEQ IDNO：3-NH2，即分别为0.01mg/ml(11.5μM)，0.05mg/ml(57.5μM)和0.1mg/ml(115μM)。y-轴表示每个细胞的黑色素百分数(将对于本底状态获得的值稳定为100％)。
图13表示阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2的亮白功效。为此，图13表示对于用阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2的处理获得的，与每个处于本底状态的细胞(未进行处理的细胞)的黑色素相比，每个细胞的黑色素百分数(将本底状态的百分数设为100％并且随后与剩余样品进行比较)。曲酸用作阳性对照。x-轴从左到右表示：本底状态，70μM曲酸和测试的三个浓度的阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2，即分别为0.005mg/mL(6.3μM)，0.01mg/ml(12.6μM)和0.05mg/ml(63μM)。y-轴表示每个细胞的黑色素百分数(将对于本底状态获得的值稳定为100％)。
图14表示肽Ac-SEQ ID NO：3-NH2对蘑菇酪氨酸酶活性in tubo的抑制效果。结果表示为与本底(未处理的细胞)相比蘑菇酪氨酸酶抑制的百分数。曲酸用作阳性对照。x-轴从左到右表示：本底状态，400μM和800μM的曲酸以及测试的三个浓度的Ac-SEQ ID NO：3-NH2，即0.1mg/mL，0.5mg/mL和1mg/mL。y-轴表示蘑菇酪氨酸酶百分数活性(将对于本底状态获得的值稳定为100％)。
图15表示肽阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2对蘑菇酪氨酸酶活性in tubo的抑制效果。结果表示为与本底(未处理的细胞)相比蘑菇酪氨酸酶抑制的百分数。曲酸用作阳性对照。x-轴从左到右表示：本底状态，400μM和800μM的曲酸和测试的三个浓度的阿魏酸-SEQ IDNO：2-NH2，即0.05mg/mL，0.1mg/ml和0.5mg/mL。y-轴表示蘑菇酪氨酸酶百分数活性(将对于本底状态获得的值稳定为100％)。
图16表示Ac-SEQ ID NO：3-NH2对用0.1mg/mL的肽浓度处理11-天(图16(A))和24-小时(图16(B))后的HEMn细胞的基因表达谱的作用。基因表达水平的改变表示为相对于本底对照(未处理的细胞)正或负倍数改变。对于图16(A)，y-轴中棒条从上到下是指：COX-1(环氧化酶-1)，MITF(黑素生成相关转录因子)，MC1R(黑皮质素-1受体)，MLAN-A(T细胞识别的黑素瘤抗原)，C-KIT(Protoongogen受体酪氨酸激酶KIT)，PMEL17(前黑素体蛋白)，DCT-TYRP2(多巴色素互变异构酶)，TYRP-1(酪氨酸酶相关蛋白1)和TYR(酪氨酸酶)。对于图16(B)，y-轴中棒条从上到下是指：BLOC-1(溶酶体相关细胞器复合物的生物发生-1)，MITF(黑素生成相关转录因子)，MC1R(黑皮质素-1受体)，MLAN-A(T细胞识别的黑素瘤抗原)，C-KIT(Protoongogen受体酪氨酸激酶KIT)，PMEL17(前黑素体蛋白)，DCT-TYRP2(多巴色素互变异构酶)，TYRP-1(酪氨酸酶相关蛋白1)和TYR(酪氨酸酶)。x-轴涉及相对于本底对照的倍数改变。负的倍数改变意为相应基因下调；并且正的倍数改变意为相应基因上调。
图17表示阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2对用0.05mg/mL的肽浓度处理11-天后HEMn细胞的基因表达谱的影响。基因表达水平的改变表示为相对于本底对照(未处理的细胞)的正或负倍数改变。y-轴的棒条从上到下是指：VDR(维生素D受体)，PMEL17(前黑素体蛋白)和DCT-TYRP2(多巴色素互变异构酶)。x-轴涉及相对于本底对照的倍数改变。负的倍数改变意为相应基因下调；并且正的倍数改变意为相应基因上调。
图18表示Ac-SEQ ID NO：3-NH2对用0.1mg/mL的肽浓度处理24-小时后HEKa细胞的基因表达谱的影响。基因表达水平的改变表示为相对于本底对照(未处理的细胞)的正或负倍数改变。y-轴的棒条从上到下是指：KITLG(KIT配体)，TP53(肿瘤蛋白p53)，DKK1(Dickkopf-相关蛋白1)和NGF(神经生长因子)。x-轴涉及相对于本底对照的倍数改变。负的倍数改变意为相应基因下调；并且正的倍数改变意为相应上调。
图19表示阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2对用0.05mg/mL的肽浓度处理24-小时后HEKa细胞的基因表达谱的影响。基因表达水平的改变表示为相对于本底对照(未处理的细胞)的正或负倍数改变。y-轴的棒条从上到下是指：KITLG(KIT配体)，POMC(阿黑皮素原)，EDN1(内皮素-1)和NGF(神经生长因子)。x-轴涉及相对于本底对照的倍数改变。负的倍数改变意为相应基因下调；并且正的倍数改变意为相应基因上调。
具体实施方式
实施例
缩写:
用于氨基酸的缩写按照Eur.J.Biochem.(1984)138:937中所述的1983IUPAC-IUB联合委员会对生物化学术语命名的建议。
2-CITrt，2-氯代三苯甲基；Ac，乙酰基；Arg，精氨酸；Asp，天冬氨酸；Boc，叔丁氧基羰基；cDNA，互补DNA；C-末端，羧基-末端；DCM，二氯甲烷；DIEA，N,N′-二异丙基乙胺；DIPCDI，N,N′-二异丙基碳二亚胺；DMF，N,N-二甲基甲酰胺；DNA，脱氧核糖核酸；DPPH，2,2-二苯基-1-苦基肼基；equiv，当量；ESI-MS，电喷雾离子化质谱；Fmoc，9-芴基甲氧基羰基；Glu，谷氨酸；HDFa，人真皮成纤维细胞，成人；HEKa，人表皮角质形成细胞，成人；HEMn，人表皮黑素细胞新生；His，组氨酸；HOBt，1-羟基苯并三唑；HPLC，高效液相色谱；Ile，异亮氨酸；INCI，化妆品成分的国际命名；MBHA，对甲基二苯甲胺；Leu，亮氨酸；L Lys，赖氨酸；Me，甲基；MeCN，乙腈；MeOH，甲醇；N-末端，氨基-末端；Palm，棕榈酰基；Pbf，2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；Phe，苯丙氨酸；RNA，核糖核酸；RT，室温；Ser，丝氨酸；tBu，叔丁基；TFA，三氟乙酸；Thr，苏氨酸；TIS，三异丙基硅烷；Trp，色氨酸；Trt，三苯基甲基或三苯甲基；Tyr，酪氨酸；Val，缬氨酸；Z，苄氧基羰基。
关于实施例中包括的化学合成过程，注意所有合成过程在装有多孔聚乙烯盘的聚丙烯注射筒或装有多孔盘的
Figure BDA0002130920430000251
反应器中进行。所有的试剂和溶剂是合成质量的并且在不进行另外处理的情况下使用。溶剂和可溶性试剂通过抽吸去除。利用哌啶-DMF(2:8，v/v)(至少1×1min，2×10min，5mL/g树脂)去除Fmoc基团(Lloyd Williams P.等，ChemicalApproaches to the synthesis of peptides and Proteins，CRC，1997，Boca Raton(Fla.，USA))。在脱保护，偶联，以及再次脱保护阶段之间，利用DMF(3×1min)和DCM(3×1min)进行洗涤，每次使用10mL溶剂/g树脂。偶联反应利用3mL溶剂/g树脂进行。通过进行茚三酮测试进行偶联的控制(Kaiser E.等人，Anal.Biochem.，1970，34：595598)。所有合成反应和洗涤在RT进行。
实施例1.本发明的肽的合成和制备。
-获得Fmoc-Xm-AA1-AA2-AA3-AA4-Yn-R2-Rink-MBHA-树脂，其中AA1是-L-Asp-或-L- Glu-；AA2是-L-Tyr-，-L-Trp-或-L-Phe-；AA3是-L-Lys-或-L-Arg-；AA4是-L-Val-，-L-Ile- 或-L-Leu-；并且n和m是0。
将重量标准化。根据描述的一般步骤将4.8g(2.5mmol)的Fmoc-Rink-MBHA树脂(官能度为0.52mmol/g)用哌啶-DMF处理以去除Fmoc基团。在存在DIPCDI(1.17mL；7.5mmol；3当量)和HOBt(1.01g；7.5mmol；3当量)的情况下，使用DMF作为溶剂，将2.55g Fmoc-L-Val-OH，2.65g Fmoc-L-Ile-OH或2.65g Fmoc-L-Leu-OH(7.5mmol；3当量)混合到脱保护的树脂上，持续1小时。
然后如一般方法中所述洗涤树脂并且重复Fmoc基团的脱保护处理，用于偶联下一个氨基酸。按照之前描述的方案，按顺序偶联3.51g Fmoc-L-Lys(Boc)-OH或4.87g Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH(7.5mmol；3当量)；随后3.45g Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH，3.95g Fmoc-L-Trp(Boc)-OH或2.91g Fmoc-L-Phe-OH(7.5mmol；3当量)；并且随后3.09g Fmoc-L-Asp(tBu)-OH或3.19g Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH(7.5mmol；3当量)，每次偶联在1.01g HOBt(7.5mmol；3当量)和1.17mL DIPCDI(7.5mmol；3当量)的存在下进行。如上文已经指出的，在每个氨基酸添加步骤之间，进行Fmoc基团的脱保护处理。
合成后，将肽树脂用DCM(5次，每次3分钟)洗涤并且在真空下干燥。
-获得Fmoc-Xm-AA1-AA2-AA3-AA4-Yn-R2-Rink-MBHA-树脂，其中X是-L-Leu-；AA1是- L-His-或-L-Thr-；AA2是-L-Tyr-，-L-Trp-或-L-Phe-；AA3是-L-Tyr-，-L-Trp-或-L-Phe-； AA4是-L-Lys-或-L-Arg-并且Y是-L-Ala-；并且n和m是1。
将重量标准化。根据所述的一般步骤将4.8g(2.5mmol)的Fmoc-Rink-MBHA树脂(官能度为0.52mmol/g)用哌啶-DMF处理，以去除Fmoc基团。在DIPCDI(1.17mL；7.5mmol；3当量)和HOBt(1.01g；7.5mmol；3当量)的存在下，使用DMF作为溶剂，将2.34g Fmoc-L-Ala-OH(7.5mmol；3当量)混合在脱保护的树脂上，持续1小时。
然后如一般方法中所述洗涤树脂并且重复Fmoc基团的脱保护处理以偶联下一个氨基酸。按照之前描述的步骤，按顺序偶联3.51g Fmoc-L-Lys(Boc)-OH或4.87g Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH(7.5mmol；3当量)；随后3.45g Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH，3.95g Fmoc-L-Trp(Boc)-OH或2.91g Fmoc-L-Phe-OH(7.5mmol；3当量)；随后3.45g Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH，3.95g Fmoc-L-Trp(Boc)-OH或2.91g Fmoc-L-Phe-OH(7.5mmol；3当量)；随后4.65g Fmoc-L-His(Trt)-OH或2.98g Fmoc-L-Thr(tBu)-OH(7.5mmol；3当量)；并且随后2.65g Fmoc-L-Leu-OH(7.5mmol；3当量)，每次偶联在1.01g HOBt(7.5mmol；3当量)和1.17mL DIPCDI(7.5mmol；3当量)的存在下进行。如上文已经指出的，在每个氨基酸添加步骤之间，进行Fmoc基团的脱保护处理。
合成后，将肽树脂用DCM洗涤(5次，每次3分钟)并且在真空下干燥。
-获得Fmoc-Xm-AA1-AA2-AA3-AA4-Yn-R2-O-2-ClTrt-树脂，其中AA1是-L-Asp-或-L- Glu-；AA2是-L-Tyr-，-L-Trp-或-L-Phe-；AA3是-L-Lys-或-L-Arg-；AA4是-L-Val-，-L-Ile- 或-L-Leu-；并且n和m是0。
将重量标准化。将1.77g Fmoc-L-Ile-OH，1.77g Fmoc-L-Leu-OH或1.70g Fmoc-L-Val-OH(5mmol；1当量)与溶解在30mL DCM中的0.85mL DIEA(5mmol；1当量)的混合物与干燥的2-氯代三苯甲基树脂(3.8g；5mmol)偶联。将它们搅拌5min，之后加入1.7mL DIEA(10mmol；2当量)。让混合物反应40min。剩余的氯基团通过用MeOH处理而封闭。
然后如一般方法中所述洗涤树脂并且重复Fmoc基团的脱保护处理以偶联下一个氨基酸。按照之前描述的步骤，顺序偶联7.02g Fmoc-L-Lys(Boc)-OH或9.74g Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH(15mmol；3当量)；随后6.90g Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH，7.90g Fmoc-L-Trp(Boc)-OH或5.82g Fmoc-L-Phe-OH(15mmol；3当量)；以及随后6.18g Fmoc-L-Asp(tBu)-OH或6.38gFmoc-L-Glu(OtBu)-OH(15mmol；3当量)，每次偶联在2.03g HOBt(15mmol；3当量)和2.3mLDIPCDI(15mmol；3当量)的存在下进行。
合成后，将肽树脂用DCM洗涤(5次，每次3分钟)并且在真空下干燥。
使用上述合成步骤，利用所需的氨基酸选择，合成以下序列:
Asp-Tyr-Lys-Val(SEQ ID NO：1)；和
Leu-His-Trp-Phe-Arg-Ala(SEQ ID NO：3)。
此外，进行适当的排列，也合成以下序列:
His-Trp-Phe-Lys(SEQ ID NO：2)；和
Thr-Phe-Phe-Lys(SEQ ID NO：4)。
实施例2.去除根据实施例1合成的肽的Fmoc N-末端保护基团。
肽酰基树脂的N-末端Fmoc基团用在DMF中的20％哌啶脱保护(1×1min+2×10min)(Lloyd Williams P.等人(1997)“Chemical Approaches to the systhesis of peptidesand Proteins”CRC，Boca Raton(Fla.，USA))。将肽酰基树脂用DMF(5×1min)，DCM(4×1min)洗涤，并且在真空下干燥。
实施例3.用于将R1乙酰基引入到根据实施例2获得的肽酰基树脂上的方法
将1mmol(1当量)的根据实施例2获得的肽酰基树脂在25当量的DIEA的存在下，使用5mL DMF作为溶剂，用25当量的乙酸酐处理。让它们反应30分钟，之后将肽酰基树脂用DMF(5×1min)，DCM(4×1min)洗涤，并在真空下干燥。
实施例4.将R1棕榈酰基引入到实施例2中获得的肽酰基树脂上的方法
在10当量的HOBt和10当量的DIPCDI的存在下，将10当量的预先溶解在DMF(1mL)中的棕榈酸混合到1mmol(1当量)的实施例2中获得的肽酰基树脂上。让它们反应过夜(约15小时)，之后将树脂用DMF(5×1min)，DCM(4×1min)，MeOH(5×1min)洗涤并在真空下干燥。
实施例5.用于将R1阿魏酸引入到实施例2中获得的肽酰基树脂上的方法
在10当量的HOBt和10当量的DIPCDI的存在下，将10当量的预先溶解在DMF(1mL)中的阿魏酸混合到1mmol(1当量)的实施例2中获得的肽酰基树脂中。让它们反应约3-4小时，之后将树脂用DMF(5×1min)，DCM(4×1min)，MeOH(5×1min)洗涤并在真空下干燥。
实施例6.从聚合支持物裂解根据实施例2，3，4和5获得的肽酰基树脂
将重量标准化。将200mg的实施例2，3，4或5中任一项中获得的干燥肽酰基树脂用5mL TFA/TIS/H2O(90:5:5)在室温搅拌处理2小时。收集过滤物并使用50mL(8至10-倍)的冷的二乙醚沉淀。将醚溶液在减压下并在室温蒸发至干燥，将沉淀物再溶解在H2O中的50％MeCN中并冻干。
实施例7.根据实施例6合成和制备的肽的表征
根据实施例5获得的肽的HPLC分析利用Shimadzu设备(Kyoto，日本)使用反相柱(150x4.6mm，XBridge Peptide BEH C18，3.5μm，Waters，USA)，以MeCN(+0.036％TFA)在H2O(+0.045％TFA)中的梯度，以1.25mL/min的流速在220nm进行。所有肽显示超过80％的纯度。获得的肽的特征通过ESI-MS在Water ZQ 4000检测器中使用MeOH作为流动相以0.2mL/min的流速确认。
实施例8.含有Ac-SEQ ID NO：1-NH2的化妆的面部用组合物的制备
根据下表1制备化妆的面部用组合物。为此，将源自A相的成分溶解在适当的容器中并且将混合物加热到70-75℃。在另一容器中将B相的成分混合并将混合物加热至70-75℃。然后，将C相(TEGOLON12-10(INCI：Nylon-12))缓慢加入至B相，搅拌，直到完全溶解。将混合物加热至70-75℃。然后在涡旋搅拌下将A相的溶液加入至B和C相的混合物，形成乳状液。接着，将D相缓慢加入至混合物中，维持搅拌直到获得均匀的乳状液。最后，利用在约30℃的混合物，缓慢加入含有化合物Ac-SEQ ID NO：1-NH2(INCI：水(Aqua)，甘油，辛乙二醇，Ac-SEQ ID NO：1-NH2)的商用制剂并保持搅拌。
表1.实施例8的化妆的面部用组合物详细内容。
Figure BDA0002130920430000301
Figure BDA0002130920430000311
Figure BDA0002130920430000321
实施例9.Trolox等效性抗氧化能力(在下文中，TEAC)
在本实施例中使用根据实施例1-6合成的肽Ac-SEQ ID NO：1-NH2，Ac-SEQ ID NO：2-NH2，Ac-SEQ ID NO：3-NH2和阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2。
在本情形中使用TEAC测定。所述测定与标准物(Trolox，维生素E的一种类似物)相比测量给定物质的抗氧化能力。
使用ABTS脱色测定测量抗氧化能力。在该测定中，预先形成的2,2'-连氮基二-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS*+)的自由基单阳离子化通过用过硫酸钾氧化ABTS产生并且在抗氧化剂(Ac-SEQ ID NO：1-NH2，Ac-SEQ ID NO：2-NH2，Ac-SEQ ID NO：3-NH2或阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2)的存在下还原。ABTS·+为蓝绿色，在650，734和820nm具有最大吸收。样品中的抗氧化剂减少ABTS·+，抑制该颜色产生到与其浓度和抗氧化能力成比例的程度。使用Polarstar Omega仪器(BMG Labtech)在734nm进行吸光度定量。
对于此实验获得的结果总结在图1中。简言之，对于Ac-SEQ ID NO：1-NH2，获得以下trolox等效性值：0.01mg/mL时为15μM，0.05mg/ml时为24μM并且0.1mg/mL时为94μM；对于Ac-SEQ ID NO：2-NH2，获得如下的trolox等效性值：0.05mg/mL时为22μM，0.1mg/mL时为49μM并且0.5mg/mL时为130μM；对于Ac-SEQ ID NO：3-NH2，获得如下trolox等效性值：0.01mg/mL时为28μM，0.05mg/mL时为59μM并且0.1mg/mL时为74μM；并且对于阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2，获得如下trolox等效性：0.01mg/mL时为59μM，0.05mg/mLl时为112μM并且0.1mg/mL时为113μM。结果还表明，阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2的抗氧化能力在浓度≥0.05mg/mL时高于AA-2G的抗氧化能力，并且在相同浓度等于trolox等效物MAP的值。此外，Ac-SEQ ID NO：2-NH2的更高测试浓度显示比AA-2G和MAP更高的抗氧化能力。
如从所述图中所示的结果推测，四种测试的肽显示重要的抗氧化能力，其对于Ac-SEQ ID NO：1-NH2，Ac-SEQ ID NO：2-NH2，Ac-SEQ ID NO：3-NH2和阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2，在更高的测试浓度分别达到94，130，74和113μM Trolox。目前技术水平中的其他抗氧化剂，如白藜芦醇，在0.02mg/ml时显示29μM Trolox的抗氧化能力，即与肽Ac-SEQ ID NO：1-NH2，Ac-SEQ ID NO：2-NH2，Ac-SEQ ID NO：3-NH2和阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2相比明显更低的抗氧化能力。
实施例10.抗氧化活性的评价
通过清除测定的方式in tubo评价肽阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2的抗氧化活性。
清除稳定DPPH游离自由基的能力能够表示为抗氧化活性的测量。
在此测定中，紫色色原(DPPH)自由基通过抗氧化剂/还原化合物被还原成相应的淡黄色肼。由供氢抗氧化剂导致的紫色色原自由基的减少通过在长波长(515–520nm)处的光密度的减少而得到监测。
简言之，将不同浓度的阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2(主要是0.01mg/mL，0.05mg/mL，0.1mg/ml和0.5mg/mL)一式三份与300μM DPPH(在MeOH中)孵育。对于在30μM和60μM处的清除剂活性评价，在测定中包括还抗坏血酸作为阳性对照。室温孵育30分钟并轻轻震荡后，使用微孔板读数器Multiskan FC(Thermo Fisher Scientific，MA，USA)确定每孔在520nm处的吸光度，与反应混合物中的DPPH残留(未清除)的量成正比。基于对照(未处理细胞)(其稳定为100％)标准化吸光度值，对于每个处理获得相应的活性百分数。
如图2中所示，阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2在更高的测试浓度(0.05mg/mL，0.1mg/ml和0.5mg/mL)按照剂量响应显示显著的抗氧化活性，DPPH的还原分别为48.3％，72.9％和90.6％。0.05mg/ml和0.1mg/mL的化合物的抗氧化活性分别与30μM(31.3％)和60μM(67.6％)的抗坏血酸的抗氧化活性相当。
实施例11.硫代巴比妥酸反应物质(在下文中，TBARS)测定。
在本实施例中还使用根据实施例1-3和6合成的肽Ac-SEQ ID NO：1-NH2和Ac-SEQID NO：2-NH2。
TBARS天然存在于生物样品中，并且随氧化应激增加。本测定通过检测MDA测量脂质过氧化水平，MDA是多不饱和脂肪酸脂质过氧化物的分解产生的化合物，并且其是细胞和组织中的氧化应激的指示剂。
从蛋黄制备小单室囊泡(在下文中，SUV)并与分析的化合物(肽Ac-SEQ ID NO：1-NH2或Ac-SEQ ID NO：2-NH2和相应对照)孵育。然后，通过加入2,2’-偶氮双(2-脒基丙烷)二盐酸盐(在下文中，AAPH)(一种能够氧化不同分子的游离自由基)诱导SUV的氧化。氧化反应随后利用丁烷化的羟基甲苯(在下文中，BHT)终止，BHT是一种具有抗氧化性质的亲脂性有机化合物。最后，加入硫代巴比妥酸(在下文中，TBA)用于通过530nm处的荧光检测和定量MDA。荧光定量通过Cytation 3(Biotek)进行。
对于此测定获得的结果总结在图3中。
对于所述两种肽，在所有测试浓度均观察到统计学上显著的脂质过氧化抑制。
实施例12.体外评价针对由过氧化氢(H2O2)诱导的氧化应激的保护功效。
随后测试根据实施例1-3和6合成的Ac-SEQ ID NO：1-NH2和Ac-SEQ ID NO：2-NH2，测试它们针对过氧化氢引起的氧化应激进行保护的能力。
将原代人表皮角质形成细胞接种在黑色96孔板的相应培养基中，并且，48小时后，用不同的分析的化合物(Ac-SEQ ID NO：1-NH2或Ac-SEQ ID NO：2-NH2)在37℃处理3小时或用抗坏血酸作为抗氧化剂对照。孵育后，将细胞用荧光探针标记45分钟并且随后加入H2O2达30分钟。最后，在激发485nm/发射520nm处确定荧光。
获得的结果总结在图4中。
如可以从此图直接得到的，两种肽都显示抑制由过氧化氢产生的氧化活性，这通过当用上述任一种肽处理时样品中检测到的活性氧类的减少来实现。值得注意的是，与Ac-SEQ ID NO：2-NH2相比，Ac-SEQ ID NO：1-NH2在所有测试浓度显示增加的活性。
实施例13.针对重金属诱导的糖基化的保护功效的体外评价(高级糖基化终产物调节)
还测试根据实施例1-3和6合成的肽Ac-SEQ ID NO：1-NH2针对重金属诱导的糖基化的保护能力。
将原代人表皮角质形成细胞接种在96-孔板的标准培养基中，并且24小时后，利用重金属(含有Fe，Pb和Cr的混合物)和肽Ac-SEQ ID NO：1-NH2同时进行处理48小时。通过竞争ELISA测定的方式，利用450nm处的吸光度测量高级糖基化终(AGE)产物水平。
该测定中获得的结果总结在图5中。
如图5中可看到的，肽Ac-SEQ ID NO：1-NH2的所有测试浓度产生统计学上显著的高级糖基化终产物的量的减少，将其水平减少至接近在本底状态(未用重金属处理的对照样品或在进行重金属处理前的经处理的样品的量或水平)观察到的水平。
实施例14.针对合成的烟雾(8-羟基-2'-脱氧鸟苷(8-OHdG)调节)诱导的DNA氧化和脂氧化的保护功效的体外评价
根据实施例1-3和6合成的肽Ac-SEQ ID NO：1-NH2的抗氧化活性，也通过用合成的烟雾处理样品进行分析。
将原代人表皮角质形成细胞接种在96-孔板的标准培养基中，并且，24小时后，用含有来自烟草烟的颗粒相(例如，镉和尼古丁)和气相(例如，甲醛(在下文中，FA)和氨基甲酸乙酯)的选择的化合物和分析的化合物(Ac-SEQ ID NO：1-NH2)的合成的烟雾同时进行处理持续48h。
处理后，裂解细胞并且分析细胞匀浆物的DNA氧化，利用450nm处的吸光度通过竞争ELISA测定的方式测量8-OHdG的水平。
此外，处理后，通过细胞内MDA的水平的方式分析脂氧化，细胞内MDA的水平通过MDA和N-甲基-2-苯基吲哚(在下文中，NMPI)之间的反应测量，产生稳定的蓝色发色团，在586nm具有吸收峰。
该测定的结果显示在图6和7中。
从两幅图可以看出，Ac-SEQ ID NO：1-NH2能够保护细胞免于DNA氧化和脂氧化。实际上，对于这两个参数，表现是相似的：较低的测试浓度显示所述参数稍微减小(非统计学显著的)，而另外两个测试浓度显示较高的、统计学显著的效果，在DNA氧化的保护的情形下，导致几乎完全抑制合成烟雾的效果，如用0.1mg/ml处理的样品中观察到的DNA氧化水平接近本底状态(即在未处理的对照样品中)中观察到的DNA氧化水平。
实施例15.抗氧化基因的表达的调节。
在HEKa细胞上体外评价Ac-SEQ ID NO：1-NH2的基因表达的调节。
简言之，将HEKa细胞以4x 105细胞/孔的密度一式两份接种在6-孔板上，并在标准培养条件(37℃，95％湿度，5％CO2)维持24小时。随后，用非毒性浓度的Ac-SEQ ID NO：1-NH2(0.05mg/mL)另外处理细胞24小时。
未处理的细胞用作本底对照。然后裂解细胞，利用RNA纯化市售试剂盒按照制造商的说明(RNeasy mini kit；Qiagen；Netherlands)进行RNA提取。然后通过纳米滴定量RNA，调节浓度并且使用市售试剂盒(High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit；Thermofisher Scientific，USA)进行反转录得到cDNA。使用Taqman技术和设计用于靶向与黑素生成以及HEMn-HEKa和HEMn-HDFa通讯相关的特定基因的探针组，将得到的cDNA用于进行RTqPCR(实时定量聚合酶链式反应)。
该实施例的结果总结在图8中。
所述图表示用0.05mg/mL的As-SEQ ID NO：1-NH2处理引起关键抗氧化基因的上调，具有以下倍数改变：CYP2R1(1.44)，NFE2L2(1.23)，HMOX1(1.48)，GSTP1(1.13)，GSS(1.10)，GPX1(1.22)和TRX(1.34)。因此，肽Ac-SEQ ID NO：1-NH2不仅表现出高的固有抗氧化活性，如实施例9中所示，而且，通过关键抗氧化基因如NFE2L2和HMOX-1的表达的增加，其能够保护多种生物结构，如针对多种应激物(如重金属和烟草烟)保护蛋白、脂质和DNA。
实施例16.Ac-SEQ ID NO：1-NH2对的人皮肤移植物抗氧化和抗污染能力。
肽Ac-SEQ ID NO：1-NH2针对人活体移植物上的污染聚集的保护功效通过观察AhR和HO-1(二者都是已知的氧化应激标志物，因为它们与抗氧化反应相关)的一般形态、免疫染色进行评估(Esser C.，Bargen I.，Weighardt H.，Haarmann-Stemmann T.，KrutmannJ.，Functions of the aryl hydrocarbon receptor in the skin，Semin Immunopathol(2013)
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简言之，将来自49岁高加索女性的人皮肤移植物在受控的条件下进行培养。制备平均直径11mm(±1mm)的21份皮肤移植物并且在BEM培养基中在37℃在湿润、5％CO2气氛下保持存活。将移植物分成5个批次：移植物对照(时间＝0)，对照批次，用上述肽处理的移植物，用污染物处理的移植物和用污染物处理并用上述肽处理的移植物。制备含有根据实施例8的Ac-SEQ ID NO：1-NH2的组合物并且在第0，1，3和4天局部施加。未处理的移植物用作对照并且未接受任何处理。对于每个条件，一半移植物之后暴露于含有苯、二甲苯、甲苯、重金属和烃的污染物混合物。使用
Figure BDA0002130920430000381
系统(BIO-EC，Longjumeau，France)用Ac-SEQID NO：1-NH2处理后3小时，进行移植物暴露并持续1.5小时。在第0天和第5天对样品进行组织学处理。在根据Masson’s三色染色Goldner variant对石蜡切片染色后进行一般形态观察。在石蜡切片上利用单克隆抗AhR抗体(Thermoscientific，ref.MA1-514，clone RPT1，MA，USA)进行AhR染色，并且对于HO-1利用单克隆抗-HO-1抗体(Novus biologicals，ref.NBP1-97507，CO，USA)进行免疫染色。最后，使用Cell^D软件(Olympus，Tokyo，Japan)进行图像分析和定量。
该实验的结果总结在图9中，其中可以观察到肽Ac-SEQ ID NO：1-NH2对人皮肤移植物(用制剂中的所述肽处理)的抗氧化功效(AhR和HO-1量)。
如在图9(C)中看到的，确认Ac-SEQ ID NO：1-NH2的抗氧化功效，因为其直接源自其增加HO-1的表达以预防氧化损伤和氧化应激的功效。当与未处理的和未暴露的移植物相比时，在用最终制剂中的肽处理皮肤移植物(不暴露于污染物)之后，HO-1的水平显著增加69％(图9C)。
如在图9(A)和9(B)中观察到的，Ac-SEQ ID NO：1-NH2显示通过减少移植物所需的抗氧化反应的抗污染和抗氧化活性，这可以容易地通过观察到的与用污染物处理和未用肽处理的表达水平相比AhR(16％)和HO-1(23％)各自的减少而确定。这是因为，用本发明的肽(在本情形中为Ac-SEQ ID NO：1-NH2)预处理会已经诱导抗氧化反应，使移植物准备了好面对任何未来或后续的氧化损害，并且因此，当所述氧化损害来到或进行(在本情形中，将细胞暴露于污染物)时，细胞需要更少的抗-氧化反应并且使用已经准备好的抗-氧化机制或针对所述氧化损害消耗已经准备好的抗氧化机制(见，例如，图9(C))。
因此，本发明的肽在氧化应激和其后续结果的预防方面有效。
特别感兴趣的是酶HO-1或HMOX-1，在遗传水平和在皮肤移植物中都检测它，已知其是经由NFE2L2活化的酶(也在智能数据基因集合中检测到)，称为抗氧化开关，其本身是结合抗氧化反应元件(ARE)的转录因子，起始一组编码有效抗氧化酶的基因的转录的增强子DNA序列(Nguyen，T.，Nioi，P.，和Pickett，C.B.，The Nrf2-Antioxidant ResponseElement Signaling Pathway and Its Activation by Oxidative Stress，J.Biol.Chem.，284(2009)13291-13295)。Ac-SEQ ID NO：1-NH2还用作污染物暴露后引起的增加的AhR表达(如在人皮肤移植物上观察到的)的调节剂，因此，预防与AhR激活相关的氧化损伤和随后的色素沉着过度，这也在体外通过抑制黑色素合成观察到。
实施例9至16中所示的结果表示本发明的肽，如通过Ac-SEQ ID NO：1-NH2，Ac-SEQID NO：2-NH2，Ac-SEQ ID NO：3-NH2和阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2展示的，不仅具有有效的抗氧化活性，而且所述活性是广谱的。即，在对于所有测试参数的所有测试的氧化条件下，所述肽显示显著和重要的活性。
因此，这些实验结果表明这些肽用于化妆品组合物或方法以预防，减少和/或去除与氧化和氧化应激相关的皮肤瑕疵，例如，皮肤肤色，色素沉着改变或其他年龄相关或环境相关的皮肤瑕疵的可行性。这也是因为，分析的活性与氧化应激直接相关(Gkogkolou P，
Figure BDA0002130920430000401
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Figure BDA0002130920430000403
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Figure BDA0002130920430000404
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实施例17.亮白活性研究。
在本实施例中使用根据实施例1-6合成的肽Ac-SEQ ID NO：1-NH2，Ac-SEQ ID NO：2-NH2，Ac-SEQ ID NO：3-NH2和阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2。
将原代人表皮黑素细胞在6-孔板中孵育4天，并且随后用要分析的化合物(Ac-SEQID NO：1-NH2，Ac-SEQ ID NO：2-NH2，Ac-SEQ ID NO：3-NH2或阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2)处理7天。处理后，匀浆细胞，利用Multiskan FC(Thermo Fisher Scientific，MA，USA)通过450nm吸光度定量细胞内黑色素含量。
在该实施例中获得的结果总结在图10至13中。
可以容易从图10和11中显示的结果得知的，当与曲酸(用于此活性的参比化合物)相比时，在所有测试浓度，肽Ac-SEQ ID NO：1-NH2和Ac-SEQ ID NO：2-NH2都具有显著更高的亮白或美白活性。该增加的活性是对于两个曲酸浓度观察到的活性的两倍至多于四倍。此外，还值得注意的是，甚至在较低浓度，与曲酸相比，本发明的肽发挥显著增加的亮白活性(观察到，当与50μM的曲酸相比时，对于Ac-SEQ ID NO：1-NH2-17.7μM-和Ac-SEQ ID NO:2-NH2-15.2μM使用较低浓度)。
如在图12和13中观察到的，肽Ac-SEQ ID NO：3-NH2和阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2还显示黑色素含量的显著减少，在Ac-SEQ ID NO：3-NH2的情况下(0.1mg/mL时高达49.3％)，其高于阳性参比对照(用曲酸处理)，但在阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2的情况下(0.05mg/mL时36％的减少)，与阳性参比对照(用曲酸处理)相当。
实施例18.酪氨酸酶活性的评价
in tubo评价肽Ac-SEQ ID NO：3-NH2和阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2抑制酪氨酸酶活性的能力。
简言之，将不同浓度的Ac-SEQ ID NO：3-NH2和阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2(0.1，0.5和1mg/mL)以及阳性对照曲酸(400和800μM)与重组蘑菇酪氨酸酶孵育30分钟，之后加入L-DOPA(L-3,4二羟基苯丙氨酸，2.5mg/mL于PBS中)。在室温反应2小时后，使用微孔板读数器Multiskan FC(Thermo Fisher Scientific，MA，USA)确定每孔在450nm处的吸光度，其与反应混合物中多巴色素的量成正比。
相对于未处理的孔(对照)(其确定为100％)标准化吸光度值，从而获得每个测试条件的活性百分数。
结果总结在图14和15中。
图14中的结果显示用0.5mg/mL(30.6％)和1mg/mL(58.1％)的Ac-SEQ ID NO：3-NH2处理后酪氨酸酶活性的显著减少，达到与800μM曲酸相接近的百分数。类似地，阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2引起酪氨酸酶活性的剂量响应性减少，在0.05mg/mL，0.1mg/ml和0.5mg/mL时分别减少12％，46.5％和71％(参见图15)。
实施例19.黑素生成通路的基因表达的调节
在体外在两个不同的细胞类型(HEMn和HEKa)上评价Ac-SEQ ID NO：3-NH2和阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2肽对基因表达的调节。
简言之，将HEKa细胞以4x 105细胞/孔的密度一式两份接种在6-孔板中，并维持标准培养条件(37℃，95％湿度，5％CO2)24小时。然后，将细胞用非毒性浓度的Ac-SEQ ID NO：3-NH2(0.1mg/mL)或阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2(0.05mg/mL)处理另外24小时。
在HEMn细胞的情形中，在标准培养条件(37℃，95％湿度，5％CO2)下将细胞维持培养12天(从第0天至第11天，11-天处理)，并且从第4天至第11天用非毒性浓度的Ac-SEQ IDNO：3-NH2(0.1mg/mL)或阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2(0.05mg/mL)处理。
此外，将HEMn细胞在标准培养条件(37℃，95％湿度，5％CO2)下维持培养24h，并用非毒性浓度的Ac-SEQ ID NO：3-NH2(0.1mg/mL)处理另外24h。
未处理的细胞用作本底对照。然后将细胞裂解，利用RNA纯化市售试剂盒(RNeasymini kit，Qiagen，Netherlands)按照生产商的说明进行RNA提取。然后通过纳米滴定量RNA，调节浓度并且使用市售试剂盒(高容量cDNA反转录试剂盒–ThermofisherScientific，USA)进行反转录得到cDNA。使用Taqman技术和一组设计靶向与黑素生成和HEMn-HEKa以及HEMn-HDFa通讯相关的特定基因的探针组，将得到的cDNA用于进行RTqPCR(实时定量聚合酶链式反应)。
该实施例的结果总结在图16至19中(图16和17对应于HEMn的调节，图18和19对应于HEKa的调节)。
所述图16表示在11天处理中用0.1mg/mL的Ac-SEQ ID NO：3-NH2处理(图16)引起黑素生成通路中涉及的数个基因的下调，倍数改变如下：COX-1(-1.51)，MITF(-1.48)，MC1R(-1.28)，MLAN-A(-1.88)，C-KIT(-1.78)，PMEL17(-2.30)，DCT-TYRP2(-1.40)，TYRP-1(-1.64)和TYR(-1.66)。当在24h进行处理时，也观察到该下调基因表达的趋势。
在阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2的情形中(图17)，观察到VDR基因的上调(倍数改变为1.48)和稍微的下调PMEL17和DCT-TYRP2的趋势。
图18和19显示HEMn-HEKa通讯和黑素生成因子的释放中涉及的基因调节。用0.1mg/mL的Ac-SEQ ID NO：3-NH2处理HEKa细胞24小时引起KITLG，TP53和NGF的下调以及DKK-1的上调(图18)。较低浓度的阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2(0.05mg/mL)引起KITLG，POMC，EDN1和NGF的下调(图19)。
上述结果表明本发明的肽用于增亮或亮白皮肤的化妆品组合物或方法的可行性，所述本发明的肽如Ac-SEQ ID NO：1-NH2，Ac-SEQ ID NO：2-NH2，Ac-SEQ ID NO：3-NH2和阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2示例的。
Figure IDA0002130920480000011
Figure IDA0002130920480000021

Claims (16)

1.式(I)的肽:
R1-Xm-AA1-AA2-AA3-AA4-Yn-R2
(I)
它们的化妆用异构体、盐、溶剂化物和/或衍生物和其混合物，其中:
X选自具有脂肪族非极性侧链的氨基酸的组；
AA1选自Asp，Glu，His或Thr；
AA2选自芳香族氨基酸的组；
AA3选自Lys，Arg，Phe，Trp或Tyr；
AA4选自Val，Ile，Leu，Lys或Arg；
Y选自具有脂肪族非极性侧链的氨基酸的组；
n和m彼此独立地选自0和1；
R1选自H，取代或未取代的非环脂肪族基，取代或未取代的脂环基，取代或未取代的杂环基，取代或未取代的杂芳基烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷基和R5-CO-，其中R5选自H，取代或未取代的非环脂肪族基，取代或未取代的脂环基，取代或未取代的杂环基，取代或未取代的杂芳基烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷基；并且
R2选自H，-NR3R4，-OR3和-SR3，其中R3和R4独立地选自H，取代或未取代的非环脂肪族基，取代或未取代的脂环基，取代或未取代的杂环基，取代或未取代的杂芳基烷基，取代或未取代的芳基，和取代或未取代的芳烷基。
2.根据权利要求1所述的肽，其特征在于所述氨基酸是L-氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的肽，其特征在于m是1并且X是Leu。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的肽，其特征在于n是1并且Y是Ala。
5.根据权利要求1至2中任一项所述的肽，其特征在于R1是阿魏酸。
6.根据权利要求1至2中任一项所述的肽，其特征在于R1是乙酰基。
7.根据权利要求1至2中任一项所述的肽，其特征在于R2是H或NH2。
8.根据权利要求1至2中任一项所述的肽，其特征在于所述式(I)的肽是:
R1-Asp-Tyr-Lys-Val-R2(R1-SEQ ID NO：1-R2)；
R1-His-Trp-Phe-Lys-R2(R1-SEQ ID NO：2-R2)；
R1-Leu-His-Trp-Phe-Arg-Ala-R2(R1-SEQ ID NO：3-R2)；或
R1-Thr-Phe-Phe-Lys-R2(R1-SEQ ID NO：4-R2)。
9.根据权利要求1至2中任一项所述的肽，其特征在于所述式(I)的肽是:
Ac-Asp-Tyr-Lys-Val-NH2(Ac-SEQ ID NO：1-NH2)；
Ac-His-Trp-Phe-Lys-NH2(Ac-SEQ ID NO：2-NH2)；
阿魏酸-His-Trp-Phe-Lys-NH2(阿魏酸-SEQ ID NO：2-NH2)；或
Ac-Leu-His-Trp-Phe-Arg-Ala-NH2(Ac-SEQ ID NO：3-NH2)。
10.根据权利要求1至2中任一项所述的肽，其特征在于所述式(I)的肽是:
Ac-Asp-Tyr-Lys-Val-NH2(Ac-SEQ ID NO：1-NH2)；或
Ac-His-Trp-Phe-Lys-NH2(Ac-SEQ ID NO：2-NH2)。
11.化妆品组合物，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的肽。
12.根据权利要求11所述的化妆品组合物，其特征在于其包含0.1％-0.0001％m/v的所述肽。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的肽或根据权利要求11或12所述的化妆品组合物作为化妆品用于预防、减少或去除受试者的皮肤中的氧化应激和/或亮白受试者的皮肤的用途。
14.根据权利要求1至10中任一项所述的肽或根据权利要求11或12所述的化妆品组合物用于预防、减少或去除受试者的皮肤中的氧化应激和/或亮白受试者的皮肤的化妆用途。
15.预防、减少或去除受试者的皮肤中的氧化应激的用于非治疗目的的方法，其特征在于其包括使用根据权利要求1至10中任一项所述的肽或根据权利要求11或12所述的组合物。
16.亮白受试者的皮肤的用于非治疗目的的方法，其特征在于其包括使用根据权利要求1至10中任一项所述的肽或根据权利要求11或12所述的化妆品。
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