CN110231329A - 利用拉曼增强光谱检测食品中杀菌剂残留的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及杀菌剂检测技术领域，具体而言，涉及一种利用拉曼增强光谱检测食品中杀菌剂残留的方法，其包括以下步骤：取剪碎后的样品加入提取溶剂中，超声提取后得提取液，样品与提取溶剂的比例为1g:5ml；在所述提取液中加入萃取剂振荡萃取后，静置分层，取萃取上层液后加入硫酸钠，经振荡后静置分层，取上清液于挥发瓶中挥发干，提取液与萃取剂的体积比为1:1；在挥发瓶中加入有机溶剂后振荡，得样品待测液；在SERS管中依次加入所述样品待测液、溶胶型纳米金和聚集剂，混匀后用拉曼光谱仪进行检测。本方法能够快速、灵敏地识别食物中的苯醚甲环唑、戊唑醇、嘧霉胺等杀菌剂，前处理程序简单，在食品快速检测领域具有广阔的应用空间。

Description

利用拉曼增强光谱检测食品中杀菌剂残留的方法
技术领域
本发明涉及杀菌剂检测技术领域，具体而言，涉及一种利用拉曼增强光谱检测食品中杀菌剂残留的方法。
背景技术
苯醚甲环唑(difenoconazole)是一种三唑类杀菌剂，其具有化学性质稳定、毒性较低以及广谱抗菌性等特点，其内吸性较强，可通过叶、根等部位吸收入至农作物体内，并运输至病害部位以发挥其杀菌作用，对多种果蔬中出现的炭疽病、叶枯病、黑腐病、白粉病等常见病症均具有很好的防治效果，尤其对蔬菜的叶斑病以及梨的黑星病有很好的防治作用，此外，还可对农作物起到刺激其生长的作用，提高果蔬的产量和品质。
戊唑醇(Tebuconazole)是一种轻乙基三唑衍生物类杀菌剂,属于麦角留醇合成抑制剂,能迅速被植物有生长力的部分吸收并主要向顶部转移，不仅具有杀菌活性，还可促进作物生长。用于防治白粉菌属、丙锈菌属、核控菌属和壳针属引起的病害如小麦白粉病、三黑穗病、玉米丝黑穗病、高梁丝黑穗病、大豆锈病、油菜菌核病、梨叶斑病、茶饼病、苹果斑点落叶病、苹果轮纹病、葡萄灰霉病等效果较好。但它也存在使用成本较高，连续单一使用容易导至病原菌产生抗性等问题。
嘧霉胺(Pyrimethanil)是近年来开发的一种苯胺基嘧啶类广谱低毒杀菌剂，对果蔬中的枯萎病以及草莓、黄瓜等作物的灰霉病等具有极好的防治效果，此外，在果蔬运输过程中可作为抑霉剂，从而起到保鲜防腐的作用。嘧霉胺具有独特的作用机理，可抑制病原菌中侵染酶的产生以阻止病原菌入侵，其具有叶片穿透及根部内吸活性，能迅速传递至作物体内各部位。
随着农作物病虫害发生率的日益增长，农药的使用量也随之增加，农药残留问题由此获得国内外科研工作者的广泛关注。上述的三者杀菌剂作为较为普遍使用的杀菌剂，但随着其使用量逐年增加，其在果蔬中的残留问题越发受到人们的关注，例如，我国强制性国家标准规定水果和蔬菜中苯醚甲环唑的最高残留量为2mg/kg，嘧霉胺的最高残留量为7mg/kg，此外，加拿大、美国和日本等国家均对我国出口的果蔬中苯醚甲环唑、戊唑醇和嘧霉胺的残留量制定了严格的标准。
目前报道的有关杀菌剂残留的分析方法有气相色谱法、高效液相色谱法、气(液)相色谱-质谱连用等，但这些方法都存在检测样品前处理程序繁琐、检测周期长等缺点。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于拉曼光谱仪的样品瓶固定装置以及拉曼光谱仪。
根据本发明实施例提供的利用拉曼增强光谱检测食品中杀菌剂残留的方法，其包括以下步骤：
取剪碎后的样品加入提取溶剂中，超声提取后得提取液，样品与提取溶剂的比例为1g:5ml；
在所述提取液中加入萃取剂振荡萃取后，静置分层，取萃取上层液后加入硫酸钠，经振荡后静置分层，取上清液于挥发瓶中挥发干，提取液与萃取剂的体积比为1:1；
在挥发瓶中加入有机溶剂后振荡，得样品待测液；
在检测容器中依次加入所述样品待测液、溶胶型纳米金和聚集剂，混匀后用拉曼光谱仪进行检测。
进一步的，所述提取溶剂为乙腈。
进一步的，所述萃取剂为丙酮。
进一步的，所述有机溶剂为乙腈。
进一步的，所述聚集剂为氯化钠溶液或氯化钾溶液。
进一步的，所述杀菌剂为苯醚甲环唑，苯醚甲环唑的表面增强拉曼光谱的特征峰为701cm-1、811cm-1、989cm-1、1089cm-1、1162cm-1和1200cm-1。
进一步的，所述杀菌剂为戊唑醇，戊唑醇的表面增强拉曼光谱的特征峰548cm-1、635cm-1、663cm-1、811cm-1、850cm-1、989cm-1、1089cm-1和1205cm-1。
进一步的，所述杀菌剂为嘧霉胺，嘧霉胺的表面增强拉曼光谱的特征峰559cm-1、621cm-1、996cm-1、1174cm-1和1308cm-1。
进一步的，拉曼光谱仪的激光功率为300mW，积分时间为10s。
进一步的，所述样品待测液、溶胶型纳米金和聚集剂的体积比为4:1:1。
本发明实施例提供的利用拉曼增强光谱检测食品中杀菌剂残留的方法能够快速、灵敏地识别食物中的苯醚甲环唑、戊唑醇、嘧霉胺等杀菌剂，前处理程序简单，在食品快速检测领域具有广阔的应用空间。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，使得本发明的其它特征、目的和优点变得更明显。本发明的示意性实施例附图及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例中油菜样品中苯醚甲环唑的特征拉曼光谱图，其中曲线a为苯醚甲环唑标准物质的拉曼光谱标准曲线，曲线b为加标0.05mg/kg苯醚甲环唑后的油菜样品的拉曼光谱曲线，曲线c为加标0.03mg/kg苯醚甲环唑后的油菜样品的拉曼光谱曲线，曲线d为加标0.01mg/kg苯醚甲环唑后的油菜样品的拉曼光谱曲线；
图2为本发明实施例中番茄样品中戊唑醇的特征拉曼光谱图，其中曲线a为戊唑醇标准物质的拉曼光谱标准曲线，曲线b为加标0.05mg/kg戊唑醇后的番茄样品的拉曼光谱曲线，曲线c为加标0.03mg/kg戊唑醇后的番茄样品的拉曼光谱曲线，曲线d为加标0.01mg/kg戊唑醇后的番茄样品的拉曼光谱曲线；
图3为本发明实施例中黄瓜样品中嘧霉胺的特征拉曼光谱图，其中曲线a为嘧霉胺标准物质的拉曼光谱标准曲线，曲线b为加标0.03mg/kg嘧霉胺后的黄瓜样品的拉曼光谱曲线，曲线c为加标0.02mg/kg嘧霉胺后的黄瓜样品的拉曼光谱曲线，曲线d为加标0.01mg/kg嘧霉胺后的黄瓜样品的拉曼光谱曲线。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤的方法不必限于清楚地列出的那些步骤，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些方法固有的其他步骤。
对于本领域普通技术人员而言，可以根据具体情况理解各术语在本发明中的具体含义。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
本申请实施例提供的利用拉曼增强光谱检测食品中杀菌剂的方法，包括以下步骤：
步骤一，样品前处理：取剪碎后的样品加入提取溶剂中，超声提取后得提取液，然后在所述提取液中加入萃取剂振荡萃取后，取萃取上层液后加入硫酸钠进行吸湿，经振荡后静置分层。其中，提取溶剂包括但不限于乙腈、甲醇和乙醇；萃取剂包括但不限于丙酮。
步骤二，制备样品待测液：取上清液于挥发瓶中挥发干，在挥发瓶中加入有机溶剂后振荡，得样品待测液。其中，有机溶剂包括但不限于甲醇、乙腈和乙醇。
步骤三，制备溶胶型纳米金：采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法。
步骤四，拉曼图谱检测：在SERS管中依次加入所述样品待测液、溶胶型纳米金和聚集剂，混匀后用拉曼光谱仪进行检测。将获得的拉曼图谱与标准品的图谱进行比对，含有相同的特征峰，则说明检出目标检测物。其中，聚集剂包括但不限于氯化钠溶液和氯化钾溶液。
上述检测方法适用的食品包括但不限于水果、蔬菜、肉类好蛋奶产品，杀菌剂包括但不限于苯醚甲环唑、戊唑醇和嘧霉胺。
实施例1：油菜中苯醚甲环唑的拉曼检测方法
步骤一，样品前处理：取3份油菜，分别加标0.01mg/kg、0.03mg/kg和0.05mg/kg的苯醚甲环唑，取剪碎后的油菜1g放于烧杯中，加入5mL乙腈提取，盖上盖子进行超声提取5min。取3ml超声提取后的提取液于样品管中，加入3ml的丙酮进行萃取，振荡10s，静置分层，然后取分层后的萃取上层液2ml于试剂瓶中，加入硫酸钠进行吸湿，振荡10s，静置分层。
步骤二，制备样品待测液：取1ml上清液于挥发瓶中，放于挥发池，直至挥发干，然后取400ul乙腈于挥发瓶内，振荡10s，得样品待测液。
步骤三，制备溶胶型纳米金：采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法，具体为将50mL浓度为0.03％氯金酸加热至沸腾后，加入浓度为1％的柠檬酸三钠溶液2.0mL，继续搅拌加热，至颜色稳定停止加热，得到溶胶型纳米金。
步骤四，拉曼图谱检测：取200ul样品待测液于SERS管中，然后加入50ul的溶胶型纳米金，再加入50ul的氯化钠溶液，混匀后用拉曼光谱仪进行检测，通过加入氯化钠溶液使溶胶型纳米金溶液内的颗粒聚集成多个粒子的聚集体，起到基底增强的效果，设置拉曼光谱仪的扫描参数为，激光功率300mW，积分时间10s，连续扫描拉曼光谱3次，最后得3次扫描光谱的平均光谱，扫描波长范围为176cm-1-2900cm-1。
图1中的a曲线给出了苯醚甲环唑标准物质(苯醚甲环唑的甲醇溶液，100μg/ml)的拉曼光谱标准曲线，由曲线a可知，苯醚甲环唑表面增强拉曼光谱的特征峰为701cm-1、811cm-1、989cm-1、1089cm-1、1162cm-1和1200cm-1，分别对应于图1中各虚线所对应的横坐标值。
图1中的曲线b、c和d分别为加标0.05mg/kg、0.03mg/kg和0.01mg/kg苯醚甲环唑后的油菜样品的拉曼光谱曲线，由图1可知，此方法可以检测到油菜中加标苯醚甲环唑后的信号。其中图1中的扫描范围只节选了300cm-1-1700cm-1，因为其他范围没有特征峰，做省略处理。
实施例2：番茄中戊唑醇的拉曼检测方法
步骤一，样品前处理：取3份番茄，分别加标0.01mg/kg、0.03mg/kg和0.05mg/kg的戊唑醇，取剪碎后的番茄1g放于烧杯中，加入5mL乙腈提取，盖上盖子进行超声提取5min。取3ml超声提取后的提取液于样品管中，加入3ml的丙酮进行萃取，振荡20s，静置分层，然后取分层后的萃取上层液2ml于试剂瓶中，加入硫酸钠进行吸湿，振荡10s，静置分层。
步骤二，制备样品待测液：取1ml上清液于挥发瓶中，放于挥发池，直至挥发干，然后取400ul乙腈于挥发瓶内，振荡20s，得样品待测液。
步骤三，制备溶胶型纳米金：采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法，具体为将50mL浓度为0.03％氯金酸加热至沸腾后，加入浓度为1％的柠檬酸三钠溶液2.0mL，继续搅拌加热，至颜色稳定停止加热，得到溶胶型纳米金。
步骤四，拉曼图谱检测：取200ul样品待测液于SERS管中，然后加入50ul的溶胶型纳米金，再加入50ul的氯化钾溶液，混匀后用拉曼光谱仪进行检测，通过加入氯化钾溶液使溶胶型纳米金溶液内的颗粒聚集成多个粒子的聚集体，起到基底增强的效果，设置拉曼光谱仪的扫描参数为，激光功率300mW，积分时间10s，连续扫描拉曼光谱3次，最后得3次扫描光谱的平均光谱，扫描波长范围为176cm-1-2900cm-1。
图2中的a曲线给出了戊唑醇标准物质(戊唑醇的甲醇溶液，1000μg/ml)的拉曼光谱标准曲线，由曲线a可知，戊唑醇表面增强拉曼光谱的特征峰为548cm-1、635cm-1、663cm-1、811cm-1、850cm-1、989cm-1、1089cm-1和1205cm-1，分别对应于图2中各虚线所对应的横坐标值。
图2中的曲线b、c和d分别为加标0.05mg/kg、0.03mg/kg和0.01mg/kg戊唑醇后的番茄样品的拉曼光谱曲线，由图2可知，此方法可以检测到番茄中加标戊唑醇后的信号。其中图2中的扫描范围只节选了300cm-1-1700cm-1，因为其他范围没有特征峰，做省略处理。
实施例3：黄瓜中嘧霉胺的拉曼检测方法
步骤一，样品前处理：取3份黄瓜，分别加标0.01mg/kg、0.02mg/kg和0.03mg/kg的嘧霉胺，取剪碎后的黄瓜1g放于烧杯中，加入5mL乙腈提取，盖上盖子进行超声提取5min。取3ml超声提取后的提取液于样品管中，加入3ml的丙酮进行萃取，振荡15s，静置分层，然后取分层后的萃取上层液2ml于试剂瓶中，加入硫酸钠进行吸湿，振荡10s，静置分层。
步骤二，制备样品待测液：取1ml上清液于挥发瓶中，放于挥发池，直至挥发干，然后取400ul乙腈于挥发瓶内，振荡15s，得样品待测液。
步骤三，制备溶胶型纳米金：采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法，具体为将50mL浓度为0.03％氯金酸加热至沸腾后，加入浓度为1％的柠檬酸三钠溶液2.0mL，继续搅拌加热，至颜色稳定停止加热，得到溶胶型纳米金。
步骤四，拉曼图谱检测：取200ul样品待测液于SERS管中，然后加入50ul的溶胶型纳米金，再加入50ul的氯化钠溶液，混匀后用拉曼光谱仪进行检测，通过加入氯化钠溶液使溶胶型纳米金溶液内的颗粒聚集成多个粒子的聚集体，起到基底增强的效果，设置拉曼光谱仪的扫描参数为，激光功率300mW，积分时间10s，连续扫描拉曼光谱3次，最后得3次扫描光谱的平均光谱，扫描波长范围为176cm-1-2900cm-1。
图3中的a曲线给出了嘧霉胺标准物质(嘧霉胺的甲醇溶液，1000μg/ml)的拉曼光谱标准曲线，由曲线a可知，戊唑醇表面增强拉曼光谱的特征峰为559cm-1、621cm-1、996cm-1、1174cm-1和1308cm-1，分别对应于图3中各虚线所对应的横坐标值。
图3中的曲线b、c和d分别为加标0.03mg/kg、0.02mg/kg和0.01mg/kg嘧霉胺后的黄瓜样品的拉曼光谱曲线，由图3可知，此方法可以检测到黄瓜中加标嘧霉胺后的信号。其中图3中的扫描范围只节选了300cm-1-1700cm-1，因为其他范围没有特征峰，做省略处理。
本说明书中部分实施例采用递进或并列的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
本申请发明内容和实施例部分给出了通过拉曼增强光谱来定性检测食品中苯醚甲环唑、戊唑醇和嘧霉胺等杀菌剂的方法，可以通过拉曼光谱图与标准光谱进行比对后，清晰的获知是否存在相对应的特征峰，来判断是否检出，与气相色谱法以及高效液相色谱法等检出方法相比，前处理程序简单，检测周期短，在食品快速检测领域具有广阔的应用空间。
需要说明的是，本申请的方法除了可以定性检测食品中苯醚甲环唑、戊唑醇和嘧霉胺等杀菌剂外，还可以进行定量检测，具体方法为：配置多个浓度梯度的杀菌剂待检测物(苯醚甲环唑、戊唑醇或嘧霉胺)的甲醇溶液，对各个浓度的杀菌剂溶液通过本申请实施例提供的方法，进行拉曼光谱扫描，得到各浓度梯度溶液的表面增强拉曼光谱图；然后以浓度为横坐标，以其中一个特征峰的峰强为纵坐标，进行谱图归一化处理，制作标准曲线用以定量；得到标准曲线的线性方程，根据线性方程可用于测定样品中的杀菌剂具体含量。该方法属于现有技术，此处不再详细赘述。
具体的，本申请实施例提供的利用拉曼增强光谱检测食品中杀菌剂的方法，包括以下步骤：
对特定的待检测物(例如苯醚甲环唑、戊唑醇或嘧霉胺)配置多个浓度梯度的标准溶液；通过拉曼光谱扫描后获得每个浓度的标准溶液对应的图谱，选取一个定量峰后得到标准曲线的线性方程，将线性方程预存在拉曼光谱仪中；当检测食品中是否含有待检测物时，测得的图谱如果出现定量峰，可以将定量峰的强度代入到预存的待检测物的线性方程，进而计算出样品待测液中的待检测物浓度，然后可以将其转化为该待检测物在食品中的浓度。上述过程通过设置在拉曼光谱仪内的处理器来进行运算，实现检测过程的自动化和智能化。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所发明的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种利用拉曼增强光谱检测食品中杀菌剂残留的方法，其特征在于，包括以下步骤：
取剪碎后的样品加入提取溶剂中，超声提取后得提取液，样品与提取溶剂的比例为1g:5ml；
在所述提取液中加入萃取剂振荡萃取后，静置分层，取萃取上层液后加入硫酸钠，经振荡后静置分层，取上清液于挥发瓶中挥发干，提取液与萃取剂的体积比为1:1；
在挥发瓶中加入有机溶剂后振荡，得样品待测液；
在检测容器中依次加入所述样品待测液、溶胶型纳米金和聚集剂，混匀后用拉曼光谱仪进行检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取溶剂为乙腈。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萃取剂为丙酮。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙腈。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚集剂为氯化钠溶液或氯化钾溶液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杀菌剂为苯醚甲环唑，苯醚甲环唑的表面增强拉曼光谱的特征峰为701cm-1、811cm-1、989cm-1、1089cm-1、1162cm-1和1200cm-1。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杀菌剂为戊唑醇，戊唑醇的表面增强拉曼光谱的特征峰548cm-1、635cm-1、663cm-1、811cm-1、850cm-1、989cm-1、1089cm-1和1205cm-1。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杀菌剂为嘧霉胺，嘧霉胺的表面增强拉曼光谱的特征峰559cm-1、621cm-1、996cm-1、1174cm-1和1308cm-1。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，拉曼光谱仪的激光功率为300mW，积分时间为10s。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品待测液、溶胶型纳米金和聚集剂的体积比为4:1:1。
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