CN110194822A - 一种基于单臂TPE分子的温敏型双荧光Pdots的制备及应用 - Google Patents

一种基于单臂TPE分子的温敏型双荧光Pdots的制备及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于单臂TPE分子的温敏型双荧光Pdots的制备及应用，以AIE性质的有机小分子为荧光团，通过普通自由基聚合方法将聚ε‑己内酯作为疏水片段，聚N‑异丙基丙烯酰胺作为亲水片段共价结合为两亲性共聚物，引入Eu(Ⅲ) 离子络合，纳米沉淀制备得到可调荧光发射的单臂Pdots。采用本发明制备方法制得的单臂Pdots是粒径约为6nm的小球；具有AIE性质、双荧光性质和温度响应性，是一种优良的温敏性双荧光纳米材料；该单臂双荧光Pdots具有低毒性，更容易被Hela细胞捕获，在Hela细胞中具有优异的成像效果，可用于作为生物领域细胞示踪剂。

Description

一种基于单臂TPE分子的温敏型双荧光Pdots的制备及应用
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，涉及一种Pdots材料的制备，尤其涉及一种基于单臂TPE分子的温敏型双荧光Pdots材料的制备；该单臂TPE分子的温敏型双荧光Pdots材料分别对HepG2、A549、Hela细胞进行染色，相比于HepG2、A549细胞，Pdots更容易被Hela细胞捕获，在Hela细胞中具有优异的成像效果，可用于作为生物领域细胞示踪剂。
背景技术
如今，荧光成像的快速发展需要的生物探针要具有更强的组织穿透能力，更低的生物毒性，更高的信噪比和更好的时空分辨率。然而，目前荧光成像生物探针大多是单色荧光，由于单色荧光成像生物探针在UV-vis的激发光波长一般位于350～500 nm范围，这种短能量的光组织穿透深度低于100 μm，易对生物体造成光损伤。此外，这种激发光的吸收也可以激发生物系统的自发荧光，这将干扰真实的荧光信号，降低信噪比。在这种情况下，具有近红外光的双色荧光探针将解决上述问题，双色荧光探针可减少对生物基质的光损伤和自发荧光干涉，具有更深的穿透深度和更好的光稳定性，因此，双荧光显影剂在生物成像具有潜在的应用价值。
四苯乙烯（TPE）衍生物由于合成简单并且具有显著的聚集诱导发光（AIE）性质而成为近年来的一个研究热点。最近一些基于TPE的Pdots被报道，然而这些Pdots表现出宽的发射光谱，低的荧光亮度，限制了Pdots的生物医学应用。已知镧系元素（Eu）络合物具有极窄的发射和极高的荧光亮度，因此可以引入Eu络合物开发一种明亮的Eu-Pdots。具有温敏性材料聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)含有酰胺键，可以与镧系元素Eu配位。聚ε-己内酯（PCL）由ε-己内酯（ε-CL）开环聚合而成，具有良好的生物相容性和生物降解性，是一种被广泛使用研究的生物医用材料。
目前，具有AIE性质的双色荧光聚合物量子点应用于荧光成像的工作非常少。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于单臂TPE分子的温敏型双荧光Pdots材料的制备方法。
本发明的另一个目的是提供一种上述制备方法制得的温敏型双荧光Pdots材料在细胞成像中的应用。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种基于单臂TPE分子的温敏型双荧光Pdot材料的制备方法，具体按以下步骤进行：
1）单羟基四苯乙烯（TPE-OH）的制备：
按摩尔比1︰1～2，分别取4-羟基二苯甲酮和二苯甲酮，再取锌粉和TiCl4，所取锌粉的摩尔量为所取4-羟基二苯甲酮和二苯甲酮两者总摩尔量的1～1.5倍，所取TiCl4的摩尔量为所取4-羟基二苯甲酮和二苯甲酮两者总摩尔量的2～3倍；将4-羟基二苯甲酮、二苯甲酮和锌粉溶解于无水四氢呋喃（无水THF）中，在氮气气氛下搅拌，抽真空循环30 min，保持体系无水无氧，然后，缓慢滴加TiCl4，冰浴反应30 min，氮气气氛下，在70～75 ℃温度下回流24 h；反应结束后冷却至室温，加入质量分数为10%的K2CO3水溶液，猝灭反应，乙酸乙酯萃取、旋蒸干燥，得到白色的粗产物；粗产物过硅胶色谱柱分离（洗脱剂:V乙酸乙酯：V石油醚=1:10），得单羟基四苯乙烯（TPE-OH）；
2）单臂TPE-PCL-OH的制备：
按摩尔比1︰10～15，分别取单羟基四苯乙烯和单体ε-己内酯(ε-CL)，再取辛酸亚锡（Sn(Oct)2），所取单羟基四苯乙烯的摩尔量为所取辛酸亚锡摩尔量的15～20倍；将单羟基四苯乙烯和单体ε-己内酯溶于无水四氢呋喃，氩气气氛下于130～135 ℃的温度下搅拌20～23min，获得均相溶液；加入辛酸亚锡，聚合反应22～24 h；反应结束后在冰浴中冷却，在甲醇中沉淀得到的产物，将产物在40～45 ℃温度下真空干燥直至恒重，得到淡黄色粉末状的单臂TPE-PCL-OH；
3）单臂大分子引发剂（TPE-PCL-AZO）的制备：
按摩尔比1︰1︰2～3，分别取单臂TPE-PCL-OH、偶氮二氰基戊酸（ACVA）和4-二甲氨基吡啶（DMAP），再取二环己基碳二亚胺（DCC），DCC的摩尔量为DMAP摩尔量的0.3～0.5倍；将TPE-PCL-OH、ACVA和DMAP加入无水四氢呋喃（无水THF）中，通入氮气，搅拌溶解，再加入DCC，在70～75 ℃的温度下反应22～24 h，反应结束后冷却至室温，过滤，滤液旋转蒸发浓缩，乙醚沉淀，离心，将沉淀物纯化后真空干燥，得单臂大分子引发剂（TPE-PCL-AZO）。
4）单臂温敏型两亲性嵌段共聚物（TPE-PCL-b-PNIPAM）的制备：
按摩尔比1︰100～150，分别取单体N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）和单臂大分子引发剂（TPE-PCL-AZO），将单体N-异丙基丙烯酰胺和单臂大分子引发剂溶于无水THF中，在65～75℃温度下聚合反应22～24 h，冷却至室温，在正己烷中沉淀，离心，干燥，得到单臂温敏型两亲性嵌段共聚物（TPE-PCL-b-PNIPAM）；
5）按摩尔比为1︰200～250，分别取Eu2O3和摩尔体积浓度为1mol/L的浓盐酸，再取NH4Cl粉末，NH4Cl粉末与Eu2O3的质量比为3︰35.1，Eu2O3置于烧杯中，逐滴加入浓盐酸，再加入NH4Cl粉末，加热煮沸，干燥，得EuCl3；
6）按摩尔比1︰1～2，分别取TPE-PCL-b-PNIPAM和EuCl3，将TPE-PCL-b-PNIPAM溶于无水乙醇，再加入EuCl3，室温下搅拌22～24 h，充分发生配位反应，用正己烷沉淀，离心，纯化后得到单臂TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)；
7）单臂Pdots的制备
将单臂TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)溶解于无水THF中，得原始液，稀释该原始溶液，得稀释液，稀释液的体积为原始溶液体积的15～25倍；将该稀释液在超声作用下迅速注入盛有超纯水的比色管中，继续超声5～10 min，室温搅拌22～24 h，除去THF，纯化后得到稳定的单臂TPE分子的温敏型双荧光Pdots。
TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)的合成式如下：
TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)的结构表征：
1、TPE-PCL-b-PNIPAM和TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)的XPS谱图分析
图1为TPE-PCL-b-PNIPAM与配合物TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)的XPS能谱的宽谱和窄谱。表1是TPE-PCL-b-PNIPAM、TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)中C、N、O、Eu的结合能。
表1 TPE-PCL-b-PNIPAM、TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)中C、N、O、Eu的结合能
从图1和表1可以发现，在配合物TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)中，N1s（图1c）和O1s（图1d）的结合能分别为397.4 eV和529.7 eV，与TPE-PCL-b-PNIPAM中对应的N1s（图1a）和O1s（图1b）的结合能相比，分别增大了0.5eV和0.7eV。配合物TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)中Eu3d的结合能为1133.1 eV。因为内层电子的屏蔽作用会受到核外电子分布的变化的影响，当外层电子密度增大时，屏蔽作用增强，内层电子的结合能减小，反之结合能将增大。所以，配合物TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)中羰基氧的电子转移到Eu(Ⅲ)的外层空轨道上，使其外层电子密度增加，内层电子结合能减小，导致O→Eu3+配位键形成。此外，当Eu(Ⅲ)与氧原子配位后，氧原子将电子传给Eu(Ⅲ)，由于诱导效应使得氮原子上的电子接着转移给氧原子，导致氮原子的电子云密度相应降低，有效证明了Eu(Ⅲ)与聚合物TPE-PCL-b-PNIPAM发生了配位作用。
2、单臂Pdots的形貌
单臂Pdots是由两亲性共聚物TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)在超声作用下通过纳米沉淀法制备而得。由于溶剂质量的突然改变，聚合物链发生折叠和塌陷，导致聚合物链疏水部分TPE-PCL收缩包覆于Pdots内部而两亲性共聚物的亲水部分PNIPAM暴露于Pdots的外部，自组装成小球形状，使得Pdots均匀分散于水相中。如图2所示，TEM照片显示，制备的单臂Pdots形貌为规整的小球形且分散性好，平均粒径大约是6 nm。在室温下保存数月后，该单臂双荧光Pdots溶液仍然澄清稳定，表明该单臂双荧光Pdots具有较好的化学稳定性。
3、单臂Pdots双荧光性质
为了使单臂Pdots的的双荧光强度达到最优即在最佳激发波长下，配合物的蓝色发光与红色发光强度都要达到最强并且两者的比例相差较小。在不同激发波长下，不同质量比的Eu(Ⅲ)与聚合物（TPE-PCL-b-PNIPAM）进行配位时对单臂Pdots中两种发光强度比例的影响。如图3a～3g所示，Pdots的两种荧光强度同时受激发波长的改变以及不同质量比的Eu(Ⅲ)与聚合物（TPE-PCL-b-PNIPAM）配位的影响，并且两种发光颜色互不干扰。从图中可以看出，不同的激发下，在λem=433 nm、λem=594 nm和λem=616 nm处有发射。当激发波长为360nm、370 nm、380 nm时，Pdots的发光颜色主要为蓝色（由TPE发色团产生），而在390 nm、395nm、400 nm时，Pdots的发光颜色主要为红色(由Eu(Ⅲ)产生)。TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)在受激发后，出现Eu3+对应于594 nm磁偶极跃迁（5D0→7F1）、616 nm电偶极跃迁（5D0→7F2）。特别是在616 nm处出现非常强的锐线发射，这属于Eu3+离子的超灵敏跃迁，具有较好的单色性。
通过比对分析：掺杂不同质量的Eu3+离子对TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)的荧光强度有明显的影响。当掺杂Eu3+的质量达到最佳时(MTPE-PCL-b-PNIPAM:MEu(Ⅲ)= 1:1时，M表示摩尔比)(如图3a、3f)，TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)的两种荧光强度都达到最大值。随着掺杂Eu3+的质量增大，TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)在λem=433 nm处的荧光逐渐发生猝灭现象即“浓度猝灭”，导致单臂Pdots在λem=433 nm处荧光强度逐渐降低见图3a～图3f。这是因为加入Eu3+离子的量太多，使离子浓度升高，TPE-PCL-b-PNIPAM分子链运动受限制的区域相互交叠，导致在构成尺寸仅几个纳米的区域内，既包含Eu3+又包含限制高分子链形成离子簇。Eu3+离子相互之间距离小于多极矩相互的作用距离，发生分子间能量转移，从而出现了荧光猝灭现象。由此可得，当MTPE-PCL-b-PNIPAM:MEu(Ⅲ)= 1:1时，在不同的激发波长下，Pdots的蓝光与红光荧光强度比相差不大并且370 nm和395 nm分别是蓝光和红光的最佳激发波长。从图3g标准比色板中可以看出，Pdots的发光颜色可以随激发波长调控。
4、单臂Pdots的AIE性质
由于TPE是典型的AIE分子，在此，探讨单臂双荧光Pdots的AIE行为。单臂双荧光Pdots的荧光强度随着 TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)浓度的增大而增强。TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)在水溶液中显示出良好的溶解性，并且其在不同浓度下的荧光光谱显示在图4a中。当λex=395 nm，浓度为5 mg/mL时，TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)在433 nm处发射了较弱的蓝色荧光，而在616 nm处发射了较强的红色荧光。同时，TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)的两种荧光强度随着浓度从5 mg/mL增加到17.5 mg/mL，蓝色荧光强度几乎没有发生变化，而红色荧光强度以非线性的方式增加，如图4b。这是因为双荧光Pdot在λex=395 nm时，主要以红色荧光发射为主，当浓度增大时，Eu3+的浓度也随之增大，导致λem=616 nm处的红色荧光强度增强。另一种证明AIE行为的方法是通过在THF/CH2Cl2体系中调节不良溶剂CH2Cl2的体积分数，改变TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ) Pdots的聚集程度，致使荧光强度增大。从图4c和图4d可以看出，在λex=370 nm，随着CH2Cl2的体积不断增大，TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)在433 nm 、616nm两处发射的荧光强度逐渐增强，并且蓝色荧光强度的变化更显著。这是由于在λex=370 nm时，双荧光Pdots主要以蓝色发光为主，随着不良溶剂CH2Cl2体积的不断增大，促使聚合物链聚集，致使荧光增强。通常情况下，活细胞内浓度较大，成像时需要该类具有AIE特性的纳米探针。
5、单臂Pdots温敏性
图5(a,b)为单臂双荧光Pdots(TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ))荧光强度随温度的变化。我们考察λex=370 nm，在433 nm和616 nm处的发射受升温的影响。由图可见，随着温度的升高(10～56 ℃)，Pdots在433 nm处的荧光强度逐渐降低，而在616 nm处的荧光强度几乎不发生变化。并且从图5c可知在32 ℃时发生相转变，溶液由澄清变浑浊，由此可认为体系的LCST值约为32 ℃，然而线性PNIPAM LCST的值为32 ℃，说明少量Eu3+的掺杂对PNIPAM的热敏性影响很小。同时，这种相变过程可以通过调节温度实现可逆转换行为如图5d所示。
6、单臂Pdots细胞毒性实验与细胞成像
荧光纳米材料的生物相容性是生物应用中必须考虑的一个因素。在细胞成像中，材料的毒性是至关重要的。首先，选取三种不同细胞HepG2、A549、HeLa细胞，采用MTT法对TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ) Pdots的细胞毒性进行测试。图6b表示HepG2、A549、HeLa细胞对不同浓度的TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ) Pdots进行内吞后，在经过48 h培养后，细胞活性的变化。由图可见，单臂双荧光Pdots展现出较低的毒性，在高浓度400 μg/mL下培养48 h后，三种细胞的存活率仍然很高约90%，这表明单臂双荧光Pdots对HepG2、A549、HeLa三种细胞均具有较低的细胞毒性和较好的生物相容性，可以进行细胞成像见图6a所示。细胞成像研究由蔡司Axio Scope.A1正置荧光显微镜测得。首先，在生理环境下我们将HepG2、A549、HeLa三种细胞用100 μg/mL的Pdots培养24 h，然后将细胞固定在载玻片上，分别在370 nm和395nm的激发光源下，用蔡司Axio Scope.A1正置荧光显微镜捕获纳米粒子在430 nm~620 nm的发光信号。从图中可以看出，在不同的激发下，HepG2细胞的细胞质中可以观察到强烈的蓝色、红色荧光，这表明Pdots能够被HepG2细胞摄入并使其留在细胞质中，不能进入细胞核。从图中可以看出，单臂Pdots对A549细胞的染色效果并不是很理想，既有对细胞质染色也有对整个细胞染色并且细胞形态残缺。而在HeLa细胞的细胞质和细胞核中都可以观察到明显的蓝色、红色荧光并且对HeLa细胞的形态染色更完整。这表明Pdots更容易被HeLa细胞吞噬并使其留在整个细胞中。另外，在测试的过程中长时间照射细胞，细胞的荧光强度几乎不变，这说明我们制备的Pdots具有很好的抗光漂白性。
本发明所采用的另一个技术方案是：一种上述制备方法制得的基于单臂TPE分子的温敏型双荧光Pdots材料作为细胞成像荧光剂的应用。
本发明制备方法以AIE性质有机小分子（单臂TPE-OH）作为荧光团，通过ROP、DCC缩合、普通自由基聚合方法将聚ε-己内酯（PCL）作为疏水片段，聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)作为亲水片段共价结合为两亲性共聚物，再引入稀土离子Eu(Ⅲ)络合，通过纳米沉淀法制备可调荧光发射（蓝-红双荧光体系）的单臂Pdots：TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)。制备的单臂双荧光Pdots具有AIE性质、双荧光性质、温度响应性(LCST为32 ℃)，良好的化学稳定性和胶体稳定性，TEM显示这种Pdots具有非常小的粒子尺寸（~6 nm）。双荧光Pdots具有优异的发光性能、抗光漂白性、低毒性和生物相容性。将该单臂Pdots分别对HepG2、A549、Hela细胞进行染色，相比于HepG2、A549细胞，Pdots更容易被Hela细胞捕获，证明了该聚合物量子点在Hela细胞中具有优异的成像效果。通过细胞成像实验考察了单臂Pdots的生物应用能力，经染色后的细胞存活率均保持在90%以上，显示该单臂双荧光Pdots具有低毒性，单臂Pdots更容易被Hela细胞捕获，在Hela细胞中具有优异的成像效果，可用于作为生物领域细胞示踪剂。
附图说明
图1是本发明制备方法制得的TPE-PCL-b-PNIPAM、TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)的XPS谱图。
图2是本发明制备方法制得的单臂TPE分子的温敏型双荧光Pdots的TEM谱图。
图3是不同质量比的Eu(Ⅲ)掺杂TPE-PCL-b-PNIPAM在不同激发下的双荧光谱图((a)~(f)依次为（MTPE-PCL-b-PNIPAM:MEu(Ⅲ)=1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6)，MTPE-PCL-b-PNIPAM:MEu(Ⅲ)=1:1时不同激发下的双荧光谱图(g)，MTPE-PCL-b-PNIPAM:MEu(Ⅲ)= 1:1时不同激发下的双荧光颜色在标准比色板上的位置(h)。
图4 a是TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)不同浓度（λex=395 nm）的荧光光谱图；图4 b是相对应的荧光强度化图(蓝色发射λem=433 nm和红色发射λem=616 nm）；图4c不同CH2Cl2体积分数的TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)在THF/CH2Cl2混合溶剂中的荧光光谱图(λex=370 nm,[TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)] =30 mg/mL)；图4d相对应的荧光强度变化图(蓝色发射λem=433 nm和红色发射λem=616 nm）。
图5 a是TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)水溶液在10~56 ℃不同温度下的荧光光谱图(λex=370 nm, 50 mg/mL)；图5b相对应的荧光强度变化图(蓝色发射λem=433 nm和红色发射λem=616 nm）；图5 c和图5d是相对应的透过率与温度关系图。
图6 a)是用TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ) Pdots染色24 h的三种细胞（HepG2，A549和HeLa）的荧光显微镜图像(λex=370 nm, λex=395 nm,100 μg/mL)；图6b是用不同浓度TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ) Pdots处理48 h后三种细胞的细胞存活率图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)的制备、性能和应用作进一步说明。
实施例1
1）单羟基四苯乙烯（TPE-OH）的制备：
将0.05 mol的4-羟基二苯甲酮、0.1 mol的Zn粉和0.05 mol的二苯甲酮溶于150.0 mL无水THF中，在氮气氛下搅拌，抽真空循环30 min保持体系无水无氧。然后缓慢滴加0.27mol TiCl4，冰浴反应30 min，氩气气氛下，在70 ℃下回流24 h。反应结束后，将反应物冷却至室温，注入10% K2CO3水溶液猝灭反应。用硅胶铺垫的砂芯漏斗真空抽滤后得到滤液用乙酸乙酯萃取分离有机层。旋转蒸发除去乙酸乙酯，所得粗产物通过柱层析分离提纯（洗脱剂：V乙酸乙酯：V石油醚=1:10）得到引发剂TPE-OH，真空干燥，产率为40%。
2）单臂TPE-PCL-OH的制备：
单臂PCL-TPE-OH是由TPE-OH作为引发剂和辛酸亚锡（Sn(Oct)2）作为催化剂通过ROP反应来合成。先将17.2 mmol单体ε-己内酯(ε-CL)和1.43 mmol引发剂TPE-OH溶于10.0 mL无水THF中，然后抽真空/氮气充填三次，在130 ℃下搅拌15 min，以获得均匀溶液；随后，加入0.0715 mmol辛酸亚锡（Sn(Oct)2）开始聚合24 h。反应结束后，将粘稠的反应混合物在冰浴中冷却以停止聚合并沉淀到冰冷的甲醇中，从残余的单体和催化剂中纯化聚物，将得到的产物在40 ℃下真空干燥直至恒重，得到淡黄色粉末状产物，产率达到95%。
（2）单臂大分子引发剂（TPE-PCL-AZO）的制备
将1.0 mmol TPE-PCL-OH、1.0 mmol ACVA、3.0 mmol DMAP加入到盛有50.0 mL 无水THF的三口圆底烧瓶中，抽真空/氮气充填三次，搅拌溶解。然后1.0 mmol DCC溶于10.0 mL无水THF中缓慢加入反应烧瓶中，在75 ℃下反应24 h。反应结束后冷却至室温，过滤，滤液旋转蒸发浓缩，再用大量的乙醚沉淀，离心。将沉淀物纯化三次后真空干燥得到白色粉末。
（3）单臂温敏型两亲性嵌段共聚物（TPE-PCL-b-PNIPAM）的制备
在氮气氛围下，0.05 mmol的引发剂TPE-PCL-AZO和5 mmol的单体NIPAM溶于30.0 mL的干燥THF中，在75 ℃下聚合反应24 h。将反应混合物冷却至室温并在100 mL的正己烷中沉淀，得到白色絮状沉淀物，离心，纯化三次后在室温下真空干燥。
（4）单臂TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)的制备
Eu2O3（3.51 g，1 mmol）置于干净的烧杯中，逐滴加入浓度为1 mol/L浓盐酸约20.0mL，再加入0.1g的NH4Cl粉末（除掉少量反应产物水）。加热煮沸至近干燥，备用。
将聚合物TPE-PCL-b-PNIPAM完全溶解于20.0 mL无水乙醇中，再加入EuCl3（MTPE-PCL-b-PNIPAM：MEuCl3=1:1），室温下均匀搅拌24 h充分发生配位反应，用正己烷沉淀，离心，纯化后得到配合物。
（5）单臂Pdots的制备
单臂Pdots是通过纳米沉淀法来制备。首先将聚合物TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)溶解于无水THF中，浓度为1 mg/mL作为原始溶液备用。其次，将原始液稀释至50 μg/mL，取5 mL上述稀释液在超声作用下迅速注入盛有10 mL超纯水的比色管中。继续超声5 min后，取出比色管放在通风橱室温搅拌过夜，除去THF。最后用0.22 μm的水系过滤头过滤聚合物溶液得到稳定的单臂Pdots。在室温下保存数月后，所得的单臂双荧光Pdots溶液仍然澄清稳定，没有任何的聚集迹象。
2、细胞成像实验
分别取对数期HeLa、HepG2、A549细胞，胰酶消化后，离心收集并在显微镜下用细胞计数板计数，预先接种在24孔板的细胞爬片上。加入预先配制好的完全培养基DMEM后轻轻摇晃后放入37 ℃、5% CO2孵箱培养24 h。之后，再向每孔加入100 µg/mL的Pdots，继续培养24h。取出细胞爬片，用PBS缓冲液冲洗三次。最后在蔡司Axio Scope.A1正置荧光显微镜下进行细胞观测和照片拍摄。
实施例2
按摩尔比1︰2，分别取4-羟基二苯甲酮和二苯甲酮，再取锌粉和TiCl4，所取锌粉的摩尔量为所取4-羟基二苯甲酮和二苯甲酮两者总摩尔量的1.5倍，所取TiCl4的摩尔量为所取4-羟基二苯甲酮和二苯甲酮两者总摩尔量的3倍；将4-羟基二苯甲酮、二苯甲酮和锌粉溶解于无水四氢呋喃中，在氮气气氛下搅拌，抽真空循环30 min，保持体系无水无氧，然后，缓慢滴加TiCl4，冰浴反应30 min，氩气气氛下，在70℃温度下回流24 h；反应结束后冷却至室温，加入质量分数为10%的K2CO3水溶液，猝灭反应，乙酸乙酯萃取、旋蒸干燥，得到白色的粗产物；粗产物过硅胶色谱柱分离（洗脱剂:V乙酸乙酯：V石油醚=1:10），得单羟基四苯乙烯（TPE-OH）；按摩尔比1︰15，分别取单羟基四苯乙烯和单体ε-己内酯(ε-CL)，再取辛酸亚锡（Sn(Oct)2），所取单羟基四苯乙烯的摩尔量为所取辛酸亚锡摩尔量的20倍；将单羟基四苯乙烯和单体ε-己内酯溶于无水四氢呋喃，氩气气氛下于135 ℃的温度下搅拌23 min，获得均相溶液；加入辛酸亚锡，聚合反应24 h；反应结束后在冰浴中冷却，在甲醇中沉淀得到的产物，将产物在45℃温度下真空干燥直至恒重，得到淡黄色粉末状的单臂TPE-PCL-OH；按摩尔比1︰1︰3，分别取单臂TPE-PCL-OH、ACVA和DMAP，再取DCC，DCC的摩尔量为DMAP摩尔量的0.5倍；将TPE-PCL-OH、ACVA和DMAP加入无水四氢呋喃（无水THF）中，通入氮气，搅拌溶解，再加入DCC，在75℃的温度下反应24 h，反应结束后冷却至室温，过滤，滤液旋转蒸发浓缩，乙醚沉淀，离心，将沉淀物纯化后真空干燥，得单臂大分子引发剂（TPE-PCL-AZO）；按摩尔比1︰150，分别取单体N-异丙基丙烯酰胺和TPE-PCL-AZO，将单体N-异丙基丙烯酰胺和单臂大分子引发剂溶于无水THF中，在75 ℃温度下聚合反应24 h，冷却至室温，在正己烷中沉淀，离心，干燥，得到单臂温敏型两亲性嵌段共聚物（TPE-PCL-b-PNIPAM）；按摩尔比为1︰250，分别取Eu2O3和浓盐酸，再取NH4Cl粉末，NH4Cl粉末与Eu2O3的质量比3：35.1，浓盐酸逐滴加入Eu2O3中，再加入NH4Cl粉末，加热煮沸，干燥，得EuCl3；按摩尔比为1︰2，分别取TPE-PCL-b-PNIPAM和EuCl3，将TPE-PCL-b-PNIPAM溶于无水乙醇，再加入EuCl3，室温下搅拌24 h，充分发生配位反应，用正己烷沉淀，离心，纯化后得到单臂TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)；将单臂TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)溶于无水THF中，得原始液，稀释该原始溶液，得稀释液，稀释液的体积为原始溶液体积的25倍；将该稀释液在超声作用下迅速注入盛有超纯水的比色管中，继续超声10 min，室温搅拌24 h，除去THF，纯化后得到稳定的单臂TPE分子的温敏型双荧光Pdots。
实施例3
按摩尔比1︰1.5，分别取4-羟基二苯甲酮和二苯甲酮，再取锌粉和TiCl4，所取锌粉的摩尔量为所取4-羟基二苯甲酮和二苯甲酮两者总摩尔量的1.25倍，所取TiCl4的摩尔量为所取4-羟基二苯甲酮和二苯甲酮两者总摩尔量的2.5倍；将4-羟基二苯甲酮、二苯甲酮和锌粉溶解于无水四氢呋喃（无水THF）中，在氮气气氛下搅拌，抽真空循环30 min，保持体系无水无氧，然后，缓慢滴加TiCl4，冰浴反应30 min，氩气气氛下，在72℃温度下回流24 h；反应结束后冷却至室温，加入质量分数为10%的K2CO3水溶液，猝灭反应，乙酸乙酯萃取、旋蒸干燥，得到白色的粗产物；粗产物过硅胶色谱柱分离（洗脱剂:V乙酸乙酯：V石油醚=1:10），得单羟基四苯乙烯（TPE-OH）；按摩尔比1︰12.5，分别取单羟基四苯乙烯和单体ε-己内酯(ε-CL)，再取辛酸亚锡（Sn(Oct)2），所取单羟基四苯乙烯的摩尔量为所取辛酸亚锡摩尔量的17.5倍；将单羟基四苯乙烯和单体ε-己内酯溶于无水四氢呋喃，氩气气氛下于132.5 ℃的温度下搅拌21.5min，获得均相溶液；加入辛酸亚锡，聚合反应23 h；反应结束后在冰浴中冷却，在甲醇中沉淀得到的产物，将产物在42.5 ℃温度下真空干燥直至恒重，得到淡黄色粉末状的单臂TPE-PCL-OH；按摩尔比1︰1︰2.5，分别取单臂TPE-PCL-OH、ACVA和DMAP，再取DCC，DCC的摩尔量为DMAP摩尔量的0.4倍；将TPE-PCL-OH、ACVA和DMAP加入无水四氢呋喃（无水THF）中，通入氮气，搅拌溶解，再加入DCC，在72.5℃的温度下反应23 h，反应结束后冷却至室温，过滤，滤液旋转蒸发浓缩，乙醚沉淀，离心，将沉淀物纯化后真空干燥，得单臂大分子引发剂（TPE-PCL-AZO）；按摩尔比1︰125，分别取单体N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）和单臂大分子引发剂（TPE-PCL-AZO），将单体N-异丙基丙烯酰胺和单臂大分子引发剂溶于无水THF中，在70 ℃温度下聚合反应23 h，冷却至室温，在正己烷中沉淀，离心，干燥，得到单臂温敏型两亲性嵌段共聚物；按摩尔比为1︰225，分别取Eu2O3和浓盐酸，再取NH4Cl粉末，NH4Cl粉末与Eu2O3的质量比为3︰35.1，浓盐酸逐滴加入Eu2O3中，再加入NH4Cl粉末，加热煮沸，干燥，得EuCl3；按摩尔比1︰1.5，分别取TPE-PCL-b-PNIPAM和Eu2O3，再取NH4Cl粉末和摩尔体积浓度1 mol/L的浓盐酸，Eu2O3与浓盐酸的摩尔比为1︰225；NH4Cl粉末与Eu2O3的质量比为3︰35.1，Eu2O3置于烧杯中，逐滴加入浓盐酸，再加入NH4Cl粉末，加热煮沸，干燥，得EuCl3；按摩尔比为1︰1.5，分别取TPE-PCL-b-PNIPAM和EuCl3，将TPE-PCL-b-PNIPAM溶于无水乙醇，再加入EuCl3，室温下搅拌23h，充分发生配位反应，用正己烷沉淀，离心，纯化后得到单臂TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)；将单臂TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)溶解于无水THF中，得原始液，稀释该原始溶液，得稀释液，稀释液的体积为原始溶液体积的20倍；将该稀释液在超声作用下迅速注入盛有超纯水的比色管中，继续超声8min，室温搅拌23 h，除去THF，纯化后得到稳定的单臂TPE分子的温敏型双荧光Pdots。

Claims (2)

1.一种基于单臂TPE分子的温敏型双荧光Pdots的制备方法，其特征在于，该制备方法具体按以下步骤进行：
1）按摩尔比1︰1～2，分别取4-羟基二苯甲酮和二苯甲酮，再取锌粉和TiCl4，所取锌粉的摩尔量为所取4-羟基二苯甲酮和二苯甲酮两者总摩尔量的1～1.5倍，所取TiCl4的摩尔量为所取4-羟基二苯甲酮和二苯甲酮两者总摩尔量的2～3倍；将4-羟基二苯甲酮、二苯甲酮和锌粉溶解于无水四氢呋喃中，在氮气气氛下搅拌，抽真空循环30 min，缓慢滴加TiCl4，冰浴反应，氩气气氛下，在70～75 ℃温度下回流24 h；冷却至室温，加入K2CO3水溶液，猝灭反应，乙酸乙酯萃取、旋蒸干燥，得到白色的粗产物；粗产物过硅胶色谱柱分离，得单羟基四苯乙烯；
2）按摩尔比1︰10～15，分别取单羟基四苯乙烯和单体ε-己内酯，再取辛酸亚锡，所取单羟基四苯乙烯的摩尔量为所取辛酸亚锡摩尔量的15～20倍；将单羟基四苯乙烯和单体ε-己内酯溶于无水四氢呋喃，氩气气氛下于130～135 ℃的温度下搅拌，获得均相溶液；加入辛酸亚锡，聚合反应22～24 h；冰浴中冷却，在甲醇中沉淀得到的产物，真空干燥至恒重，得单臂TPE-PCL-OH；
3）按摩尔比1︰1︰2～3，分别取单臂TPE-PCL-OH、偶氮二氰基戊酸和4-二甲氨基吡啶，再取二环己基碳二亚胺，二环己基碳二亚胺的摩尔量为4-二甲氨基吡啶摩尔量的0.3～0.5倍；将单臂TPE-PCL-OH、偶氮二氰基戊酸和4-二甲氨基吡啶加入无水四氢呋喃中，通入氮气，搅拌溶解，再加入二环己基碳二亚胺，在70～75 ℃的温度下反应，冷却至室温，过滤，滤液旋转蒸发浓缩，乙醚沉淀，离心，将沉淀物纯化后真空干燥，得单臂大分子引发剂；
4）按摩尔比1︰100～150，分别取单体N-异丙基丙烯酰胺和单臂大分子引发剂，将单体N-异丙基丙烯酰胺和单臂大分子引发剂溶于无水THF中，在65～75 ℃温度下聚合反应，冷却至室温，在正己烷中沉淀，离心，干燥，得单臂温敏型两亲性嵌段共聚物；
5）按摩尔比为1︰200～250，分别取Eu2O3和浓盐酸，再取NH4Cl粉末，NH4Cl粉末与Eu2O3的质量比为3︰35.1，浓盐酸逐滴加入Eu2O3中，再加入NH4Cl粉末，加热煮沸，干燥，得EuCl3；
6）按摩尔比1︰1～2，分别取单臂温敏型两亲性嵌段共聚物和EuCl3，将单臂温敏型两亲性嵌段共聚物溶于无水乙醇，加入EuCl3，室温下搅拌，充分发生配位反应，用正己烷沉淀，离心，纯化后得到单臂TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)；
7）将单臂TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu(Ⅲ)溶解于无水THF中，得原始液，稀释该原始溶液，得稀释液，稀释液的体积为原始溶液体积的15～25倍；将该稀释液在超声作用下迅速注入盛有超纯水的比色管中，继续超声5～10 min，室温搅拌22～24 h，除去THF，纯化后得到稳定的单臂TPE分子的温敏型双荧光Pdots材料。
2.一种权利要求1所述的基于单臂TPE分子的温敏型双荧光Pdots材料作为细胞成像荧光剂的应用。
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