CN110193029B - 益生菌的结肠靶向给药方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及益生菌的结肠靶向给药方法。具体地，一方面涉及一种呈小丸形式的益生菌组合物，其由素丸以及涂渍包裹于该素丸表面的包衣层构成；所述素丸包含：益生菌、磷脂、甘油酯、聚丙烯酸树脂等。所述益生菌例如是鼠李糖乳酸菌、长双歧杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种、动物双歧杆菌乳酸亚种、乳双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌等，还涉及这些组合物的制备方法以及使用此类组合物以实现益生菌的结肠靶向给药方法。本发明组合物能够有效地将益生菌靶向给药到达结肠部位。

Description

益生菌的结肠靶向给药方法

技术领域

本发明涉及益生菌的结肠靶向给药方法，还涉及用于结肠靶向给药的益生菌组合物。

背景技术

当前存在用于补充人和动物两者的营养的各种各样的组合物。可以提供这些补充物以改变、降低或提高个体的肠道内的微生物群，从而对消化产生期望的作用。理想地，补充可以基于改变人体的胃肠(GI)道内的特定细菌为个体(包括人)培养改进的微生物群。这种类型的补充可以通过使用益生菌进行，所述益生菌理解为存活的微生物，当以有效量给予时，其向宿主赋予健康或营养益处。

益生菌可以向宿主提供各种各样的益处，例如保持健康的胃肠菌群，增强免疫力，防止腹泻、特应性皮炎和其他疾病等。

胃肠道下部尤其是结肠部分的菌群在维持人体正常消化道功能方面发挥重要作用，然而菌群失调所引发的问题也是普遍的、严重的，例如可能由于菌群失调引发便秘、腹泻等。近年还有诸多文献报道菌群失调与某些精神疾病例如自闭症等有关。据信通过施用益生菌能够使胃肠道恢复正常的菌群。

然而，由于通常情况下益生菌在暴露于较低pH环境时，会造成益生菌死亡或失活，特别是暴露于胃酸环境下时情况更为严重。对于需要到达结肠部位的益生菌，在近中性例如pH6.5～7.0的小肠部位亦应尽可能地避免暴露于肠液。因此靶向结肠部位施用治疗剂尤其是益生菌这类对环境非常敏感的物质是非常大的挑战。

CN 108066296 A(中国专利申请号201611013848.3)公开了一种呈片剂形式的生物学活性组分结肠靶向组合物，包括：羟丙甲纤维素、生物学活性组分和辅料，其中，所述羟丙甲纤维素的重量百分含量为10～99％，所述生物学活性组分的重量百分含量为1～60％，辅料的重量百分含量为0～80％；其中，所述羟丙甲纤维素的粘度>1000mPa.s。生物学活性组分为微生物，尤其是益生菌，例如：双歧杆菌、乳杆菌或革兰氏阳性球菌中的一种或多种；双歧杆菌是乳双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌和青春双歧杆菌中的一种或多种；所述乳杆菌是嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌亚种、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌中的一种或多种；所述革兰氏阳性球菌是粪链球菌和乳球菌中的一种或多种。该片剂形式的组合物中益生菌的量为0.01亿-1200亿cfu/g。片剂的单片质量≤500mg，直径≤10mm。

CN 107998152 A(中国专利申请号201711339231.5)亦公开了一种呈片剂形式的结肠释放的益生菌片，其特征在于，所述益生菌片由含益生菌物料和结肠释放材料组成，所述结肠释放材料作为包衣材料对含益生菌物料进行包衣，含益生菌物料包含益生菌药粉和药学上可以接受的辅料，结肠释放材料包括果胶钙、聚丙烯酸树脂、壳聚糖、直链淀粉、瓜耳豆胶、硫酸软骨素或海藻酸钠中的一种或多种，结肠释放材料用量占片芯重量的5-10％。益生菌药粉为长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、德式乳杆菌保加利亚亚种的一种或几种。

众所周知，涉及下消化道菌群失调的人群通常为老人或者小儿，他们在服用上述片剂时是相当困难的，另外由于这些片剂是由特殊的延迟释放配方制备的，不能将它们掰碎或捣碎再服用，否则会造成药物的提前释放。

因此，提供一种能够定向于结肠部位释放的益生菌小丸制剂，仍是本领域技术人员迫切期待的。并且由于此类小丸制剂本身能够耐受胃、十二指肠、小肠部位的消化液而直达结肠，因此这种益生菌小丸能够非常方便地与其它食物尤其是流食混合后服用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够定向于结肠部位释放的益生菌小丸制剂，期待此类小丸制剂能够耐受胃、十二指肠、小肠部位的消化液而直达结肠，并且能够非常方便地与其它食物尤其是流食混合后服用。已经出人意料的发现，通过本发明方法制备的益生菌小丸型组合物可以实现上述目的，本发明因此而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了一种呈小丸形式的益生菌组合物，其由素丸以及涂渍包裹于该素丸表面的包衣层构成。

根据本发明的益生菌组合物，其中所述素丸包含：益生菌、磷脂、甘油酯、聚丙烯酸树脂、丙二醇、聚乙烯醇、乳糖、微晶纤维素。

根据本发明的益生菌组合物，其中所述益生菌是存活的益生菌。

根据本发明的益生菌组合物，其中聚丙烯酸树脂是甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯以30：70～40： 60比例的共聚物，例如是以35：65比例的共聚物，其通常称为聚丙烯酸树脂III。

根据本发明的益生菌组合物，其中聚乙烯醇的平均分子量为50000～100000。

根据本发明的益生菌组合物，其中素丸中包含如下比例的物质：益生菌10～100亿cfu、磷脂 5～20mg、甘油酯5～20mg、聚丙烯酸树脂120～150mg、丙二醇40～60mg、聚乙烯醇60～90mg、乳糖 300～400mg、微晶纤维素200～300mg。

根据本发明的益生菌组合物，所述益生菌可以是以其商业化来源的形式或者可以是经培养扩增过的形式，不论何种形式，其在组合物添加时的量以cfu单位计。通常地，用于制备发明所述组合物的益生菌是粉末状态的。

根据本发明的益生菌组合物，所述益生菌包含存活的微生物细胞。

根据本发明的益生菌组合物，所述存活的微生物细胞包括鼠李糖乳酸菌(Lactobacillus rhamnosus)。

根据本发明的益生菌组合物，所述存活的微生物细胞包括长双歧杆菌BB536(Bifidobacterium longum BB536)、长双歧杆菌婴儿亚种35624(Bifidobacterium longumsubsp.infantis 35624)、动物双歧杆菌乳酸亚种BB-12(Bifidobacterium animalissubsp.lactis BB-12)或其任何组合。

根据本发明的益生菌组合物，所述存活的微生物细胞例如是乳双歧杆菌(例如BLa80)、鼠李糖乳杆菌(例如R11)、嗜酸乳杆菌(例如LA85)、长双歧杆菌(例如R175)、嗜酸乳杆菌(例如R418)。

根据本发明的益生菌组合物，所述磷脂包括至少一种磷脂。在一个实施方案中，所述至少一种磷脂包含卵磷脂。

根据本发明的益生菌组合物，所述甘油酯包括至少一种甘油酯。在一个实施方案中，所述至少一种甘油酯包含甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯或其任何组合，例如是甘油三硬脂酸酯、甘油三山俞酸酯等。

根据本发明的益生菌组合物，其中所述素丸中的乳糖还或以用相应量的甘露醇或山梨醇代替。

根据本发明的益生菌组合物，其中所述素丸是通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)通过搅拌使益生菌、磷脂、甘油酯、丙二醇充分混合均匀，接着加入聚丙烯酸树脂和聚乙烯醇混合均匀，最后加入乳糖、微晶纤维素混合均匀，得混合粉末；

(2)在搅拌下向所得混合粉末中以喷雾的方式添加占混合末粉重量17％～20％的水，接着通过揉合使水均匀渗入到粉末中，得到的混合物料手握能成团且挤压即散；接着将该混合物料置于密闭容器内并在2～6℃温度处静置24～30小时；

(3)在挤出滚圆制粒机上将上一步骤所得混合物料进行制粒，所得颗粒在室温通风处干燥使水分降至3％以下，即得素丸。

根据本发明的益生菌组合物，所述10～100亿cfu益生菌若为干品其通常为10～200mg的重量，尤其是10～100mg的重量，若为湿品在投料时预先干燥或浓缩到益生菌物料小于200mg的重量，优选的是预先干燥或浓缩到益生菌物料达20～200mg的重量，尤其是10～100mg的重量，对于呈液体或半固体形式的益生菌原料，其中的液体是水，在干燥或浓缩过程中残存的情况下，这些水分能够发挥润湿/ 粘合剂的作用，从而有助于混合物料粘结成团。

根据本发明的益生菌组合物，其中所述素丸的粒度为0.3～1.5mm优选为0.3～1.2mm，水分含量小于3％优选小于2.5％优选为1％～2.5％。

根据本发明的益生菌组合物，其中所述包衣层包括如下比例的物料：聚丙烯酸树脂450～500mg例如480mg，氢氧化钾3～5mg例如4mg，柠檬酸三乙酯40～60mg例如50mg，滑石粉180～220mg例如 200mg，甲基硅油1.5～2.5mg例如2mg。

根据本发明的益生菌组合物，所述包衣层中的聚丙烯酸树脂是甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯以 30：70～40：60比例的共聚物，例如是以35：65比例的共聚物(其通常称为聚丙烯酸树脂III)，或者例如是以1：2比例的共聚物(市售商品尤特奇S100即为此比例共聚物)。

根据本发明的益生菌组合物，所述包衣层的物质在涂渍包裹于素丸表面之前，用水配制成包衣液。配制这种水分散包衣液的方法是本领域技术人员公知的。

根据本发明的益生菌组合物，所述包衣层在涂渍包裹于素丸表面之前是照如下方式配制成的包衣液：将氢氧化钾用水配制成浓度为0.8～1.2mol/L的溶液；在容器中在搅拌下分次将聚丙烯酸树脂撒入 2～2.5倍重量的水中，搅拌5-10分钟后，滴加氢氧化钾溶液，继续搅拌8～12小时，接着加入柠檬酸三乙酯，再搅拌1～2小时；另将滑石粉加至4～6倍重量的水中，接着加入甲基硅油，混匀，再用高剪切匀化机匀化10-20分钟；将两液混合，经80目筛过滤，得到包衣液。

根据本发明的益生菌组合物，所述包衣层与素丸的重量比为1：8～12，例如为1：10。

根据本发明的益生菌组合物，所述包衣层是通过将其物料配制成包衣液后，在流化床包衣机上使包衣液涂渍于所述素丸表面并干燥而形成的。

根据本发明的益生菌组合物，其是通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)通过搅拌使益生菌、磷脂、甘油酯、丙二醇充分混合均匀，接着加入聚丙烯酸树脂和聚乙烯醇混合均匀，最后加入乳糖、微晶纤维素混合均匀，得混合粉末；

(2)在搅拌下向所得混合粉末中以喷雾的方式添加占混合末粉重量17％～20％的水，接着通过揉合使水均匀渗入到粉末中，得到的混合物料手握能成团且挤压即散；接着将该混合物料置于密闭容器内并在2～6℃温度处静置24～30小时；

(3)在挤出滚圆制粒机上将上一步骤所得混合物料进行制粒，所得颗粒在室温通风处干燥使水分降至3％以下，即得素丸；

(4)将包衣层的物料配制成包衣液：将氢氧化钾用水配制成浓度为0.8～1.2mol/L的溶液；在容器中在搅拌下分次将聚丙烯酸树脂撒入2～2.5倍重量的水中，搅拌5-10分钟后，滴加氢氧化钾溶液，继续搅拌8～12小时，接着加入柠檬酸三乙酯，再搅拌1～2小时；另将滑石粉加至4～6倍重量的水中，接着加入甲基硅油，混匀，再用高剪切匀化机匀化10-20分钟；将两液混合，经80目筛过滤，得到包衣液；

(5)在流化床包衣机中将包衣液喷雾包裹于素丸表面并继续在流化床包衣机中使包衣丸干燥至水分小于3％，即得。

根据本发明的益生菌组合物，其中在用包衣液对素丸进行包衣的过程中，物料温度在25～35℃范围内，尤其是在25～32℃范围内，尤其是在25～30℃范围内。

根据本发明的益生菌组合物，其呈包衣小丸的形式，小丸的粒度为0.4～1.5mm优选为0.5～1.2mm，水分含量小于3％优选小于2.5％优选为1％～2.5％。

进一步的，本发明第二方面提供了制备本发明第一方面任一实施方案所述益生菌组合物的方法，其包括如下步骤：

(1)通过搅拌使益生菌、磷脂、甘油酯、丙二醇充分混合均匀，接着加入聚丙烯酸树脂和聚乙烯醇混合均匀，最后加入乳糖、微晶纤维素混合均匀，得混合粉末；

(2)在搅拌下向所得混合粉末中以喷雾的方式添加占混合末粉重量17％～20％的水，接着通过揉合使水均匀渗入到粉末中，得到的混合物料手握能成团且挤压即散；接着将该混合物料置于密闭容器内并在2～6℃温度处静置24～30小时；

(3)在挤出滚圆制粒机上将上一步骤所得混合物料进行制粒，所得颗粒在室温通风处干燥使水分降至3％以下，即得素丸；

(4)将包衣层的物料配制成包衣液：将氢氧化钾用水配制成浓度为0.8～1.2mol/L的溶液；在容器中在搅拌下分次将聚丙烯酸树脂撒入2～2.5倍重量的水中，搅拌5-10分钟后，滴加氢氧化钾溶液，继续搅拌8～12小时，接着加入柠檬酸三乙酯，再搅拌1～2小时；另将滑石粉加至4～6倍重量的水中，接着加入甲基硅油，混匀，再用高剪切匀化机匀化10-20分钟；将两液混合，经80目筛过滤，得到包衣液；

(5)在流化床包衣机中将包衣液喷雾包裹于素丸表面并继续在流化床包衣机中使包衣丸干燥至水分小于3％，即得。

根据本发明第二方面的方法，其中在用包衣液对素丸进行包衣的过程中，物料温度在25～35℃范围内，尤其是在25～32℃范围内，尤其是在25～30℃范围内。

进一步的，本发明第三方面提供了一种营养组合物，其包括：

本发明第一方面任一实施方案所述益生菌组合物；和

用于给使用者提供营养的蛋白质源。

根据本发明第三方面的营养组合物，所述益生菌组合物占所述营养组合物总重量的0.1～20％，例如0.5～10％，例如1～5％。当然根据不同使用者的具体情况，益生菌组合物在所述营养组合物中的比例还可以在更宽的范围内调整、改变。

根据本发明第三方面，所述营养组合物可以是本发明第一方面所述益生菌组合物与所述蛋白质源的预先配制物，例如在制备得到本发明第一方面所述益生菌组合物后立即与所述蛋白质源混配制得所述营养组合物；所述营养组合物亦可以是本发明第一方面所述益生菌组合物与所述蛋白质源的临时配制物，例如在制备得到本发明第一方面所述益生菌组合物后将其单独包装，然后在使用它时或者在将来使用它们时，例如在3个月内或者1个月内或者1个星期内即将使用它们时，使这种益生菌组合物与所述蛋白质源混配制得所述营养组合物。

本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

在这些实施方案中，所述营养组合物包含存活的微生物细胞，例如存活的鼠李糖乳酸菌细胞。而且，所述基质可以包含水解蛋白质源、果胶、另外的脂质或其任何组合。所述营养组合物可以为粉末的配方，例如粉末的婴儿配方。而且，所述至少一种甘油酯可以包括甘油单酯、甘油二酯或其任何组合。

在本发明的一个实施方案中，所述存活的益生菌可以为鼠李糖乳酸菌(其在本发明中亦可标记为 LGG)、长双歧杆菌BB536(其在本发明中亦可标记为BB536)、长双歧杆菌婴儿亚种35624(其在本发明中亦可标记为35624)、动物双歧杆菌乳酸亚种BB-12(其在本发明中亦可标记为BB-12)或其任何组合。这些益生菌均可以容易地通过市售途径购得，例如可以从丹麦科汉森或者从美国杜邦公司购得。

应当理解以上描述和以下详述两者提供本公开的实施方案且旨在向其所要求保护的本公开的性质和特征提供理解的综述或框架。

现在将详细提及本公开的实施方案，在下文描述其一个或多个实例。通过解释本公开的营养组合物提供各个实例且并不是限制。实际上，本领域技术人员显而易见的是在不偏离本公开的范围的情况下，可以对本公开的教导进行各种修改和改变。例如，作为一个实施方案的部分说明或描述的特征可以与另一个实施方案一起使用以产生又一个实施方案。

因此，本公开旨在涵盖在随附权利要求及其等价物内进行的这些修改和改变。本公开的其他目的、特点和方面在以下详述中公开或由以下详述而显而易见。本领域普通技术人员应当理解本发明的讨论只是例示性实施方案的描述，且并不旨在限制本公开的更广泛的方面。

“营养组合物”表示满足受试者的营养素需求的至少一部分的物质或制剂。术语“营养剂”、“营养配方”、“肠内营养剂”和“营养补充剂”在本发明的整个公开内容中用作营养组合物的非限制性实施例。而且，“营养组合物”可以指液体、粉末、凝胶、膏剂、固体、浓缩物、悬浮液或肠内配方、口腔配方、婴儿配方、儿科受试者配方、儿童配方、成长乳和/或成人配方的即用型形式。

术语“肠内”表示可通过胃肠或消化道递送或在胃肠或消化道内递送。“肠内给予”包括到消化道中的口腔喂养、胃内喂养、经幽门给予或任何其他的给予。“给予”比“肠内给予”更加广泛且包括胃肠外给予或由此将物质摄取到受试者的身体中的任何其他的给予途径。

“儿科受试者”表示年龄小于13岁的人。在一些实施方案中，儿科受试者是指小于8岁的人类受试者。在其他实施方案中，儿科受试者是指年龄为1-6岁的人类受试者。在又一个实施方案中，儿科受试者是指年龄为6-12岁的人类受试者。

“婴儿”表示年龄从出生至不超过1岁的范围的人类受试者且包括0-12个月矫正年龄的婴儿。短语“矫正年龄”表示婴儿的实足年龄减去婴儿早产的时间量。因此，如果怀胎已达足月，矫正年龄为婴儿的年龄。术语婴儿包括低出生重量的婴儿、非常低出生重量的婴儿和早产婴儿。“早产婴儿”为在少于约37周妊娠之后出生的婴儿。文中所用的“足月婴儿”表示在至少约37周妊娠之后出生的婴儿。

“儿童”表示年龄为12个月-约12岁范围的受试者。在一些实施方案中，儿童为年龄为1-12岁的受试者。在其他实施方案中，术语“儿童”指1-约6岁或约7-约12岁的受试者。在其他实施方案中，术语“儿童”指年龄为12个月-约12岁的任何范围。

“儿童的营养产品”是指满足儿童的营养素需求的至少一部分的组合物。成长乳(GUM)为儿童的营养产品的例子。

文中所用的“水解蛋白质”表示蛋白质水解产物。在本公开内，水解蛋白质和蛋白质水解物可互换地用于描述蛋白质水解产物；充分水解的蛋白质用于描述其中至少70％、更优选至少约90％的水解蛋白质具有少于2000道尔顿的分子量的蛋白质水解产物。

术语“水解度”是指至肽键被水解方法破坏的程度。

术语“不含蛋白质”表示包含不可测量的量的蛋白质，如通过标准蛋白质检测方法例如十二烷基(月桂基)硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或分子排阻色谱测量。在一些实施方案中，所述营养组合物基本上不含蛋白质，其中“基本上不含”在下文限定。

“婴儿配方”表示满足婴儿的营养素需求的至少一部分的组合物。

术语“成长乳”是指宽类别的营养组合物，其旨在用作多样化膳食的一部分以便支持年龄为约1-约 6岁的儿童的正常生长和发育。

“基于乳的”表示包含从哺乳动物的乳腺汲取或提取的至少一种组分。在一些实施方案中，基于乳的营养组合物包含衍生自驯养的有蹄动物、反刍动物或其他哺乳动物或其任何组合的乳的组分。而且，在一些实施方案中，基于乳的表示包含牛酪蛋白、乳清、乳糖或其任何组合。而且，“基于乳的营养组合物”可以指包含本领域已知的任何乳衍生的或基于乳的产品的任何组合物。

“营养完全”表示可以用作营养唯一来源的组合物，其将供应基本上所有的所需要的日常量的维生素、矿物质和/或痕量元素以及蛋白质、碳水化合物和脂质。实际上，“营养完全”描述营养组合物，其提供支持受试者的正常生长和发育所需要的足够量的碳水化合物、脂质、必需脂肪酸、蛋白质、必需氨基酸、条件必需氨基酸、维生素、矿物质和能量。

对于早产婴儿“营养完全”的组合物将通过定义定性和定量地提供早产婴儿生长所需要的足够量的所有碳水化合物、脂质、必需脂肪酸、蛋白质、必需氨基酸、条件必需氨基酸、维生素、矿物质和能量。对足月婴儿“营养完全”的组合物将通过定义定性和定量地提供足月婴儿生长所需要的足够量的所有碳水化合物、脂质、必需脂肪酸、蛋白质、必需氨基酸、条件必需氨基酸、维生素、矿物质和能量。对儿童“营养完全”的组合物将通过定义定性和定量地提供儿童生长所需要的足够量的所有碳水化合物、脂质、必需脂肪酸、蛋白质、必需氨基酸、条件必需氨基酸、维生素、矿物质和能量。

当应用到营养素时，术语“必需”是指无法通过身体以足以正常生长和保持健康的量合成且因此必需通过膳食供应的任何营养素。当应用到营养素时，术语“条件必需”表示在身体无法获得足够量的前体化合物以进行内生合成的条件下，营养素必须由膳食供应。

术语“益生菌”表示对宿主的健康发挥有益作用的具有低的或没有致病性的微生物。“存活的益生菌”表示对宿主的健康发挥有益作用的存活或活性的微生物。

术语“失活益生菌”或“失活LGG”表示其中所提及的益生菌或鼠李糖乳酸菌GG(LGG)生物体的代谢活性或繁殖能力降低或损害的益生菌。

“甘油酯”表示衍生自甘油或糖主链的任何分子，其中用脂肪酸将羟基基团中的一个或多个酯化。在一些实施方案中，甘油酯组分包含甘油单酯、甘油二酯、单糖酯、二糖酯或其组合。

“磷脂”表示衍生自磷脂酸的任何分子，其中将来自甘油主链的一个或两个碳酯化成脂肪酸，且将封端的碳之一酯化成磷酸酯基团。在某些实施方案中，磷酸酯基团为还被酯化成另一种功能分子例如胆碱、丝氨酸或肌醇的磷酸二酯。在一些实施方案中，磷脂组分包含甘油磷脂和/或磷酰基甘油。而且，磷脂组分可以包含溶血磷脂，其中来自甘油主链的碳之一保持为未酯化的羟基基团。且在一些实施方案中，磷脂组分包含卵磷脂，其可以例如从大豆或从蛋黄提取且可以包含磷脂酰基-胆碱、磷脂酰基- 肌醇和磷脂酰基丝氨酸的组合。在一些实施方案中，磷脂可以包含大豆卵磷脂、蛋卵磷脂、乳脂衍生的磷脂或其组合。

本公开的营养组合物可以基本上不含文中所述的任何任选或选择的成分，前提是剩余的营养组合物仍包含文中所述的所有需要的成分或特点。在该上下文中，且除非另有指定，否则术语“基本上不含”表示所选择的组合物可以包含小于功能量的任选成分，通常小于0.1％重量，且还包含0％重量的这种任选或选择的成分。

本公开对单数特征或限制的所有提及应当包括相应的复数特征或限制，且反之亦然，除非另有指定或通过所提及的上下文作出明确相反说明。

文中所用的方法或方法步骤的所有组合可以以任何顺序进行，除非另有指定或通过提及组合的上下文作出明确相反说明。

本公开的方法和组合物(包括其组分)可以包含、由或基本上由文中所述的实施方案的必需要素和限制以及文中所述的或另外在营养组合物中有用的任何另外或任选成分、组分或限制组成。

文中所用的术语“约”应当视为指规定为任何范围的端点的两个数字。对范围的任何提及应当认为是对该范围内的任何子集提供支持。

本发明组合物的益生菌生物体可以对个体的健康和福利发挥有益作用。合适的益生菌的例子包括但不限于酵母菌(例如酿酒酵母(Saccharomycescereviseae))、霉菌(例如曲霉(Aspergillus)、根霉 (Rhizopus)、毛霉(Mucor))和细菌(例如乳杆菌)。合适的益生菌微生物的具体例子为：黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(A.oryzae)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、地衣芽孢杆菌 (B.licheniformis)、肠膜芽孢杆菌(B.mesentericus)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、纳豆芽孢杆菌(B.natto)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、动物双歧杆菌(B. animalis)、短双歧杆菌(B.breve)、双歧双歧杆菌(B.bifidum)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、乳双歧杆菌 (B.lactis)、长双歧杆菌(B.longum)、长双歧杆菌BB536(B.longum BB536)、长双歧杆菌AH1206(NCIMB: 41382，其在本文中亦可记为AH1206)、短双歧杆菌AH1205(NCIMB:41387)、婴儿双歧杆菌 35624(NCIMB:41003，其在本文中亦可记为35624)、长双歧杆菌AH1714(NCIMB 41676)、动物双歧杆菌乳酸亚种BB-12(DSM号10140)、假长双歧杆菌(B.pseudolongum)、嗜热双歧杆菌(B.thermophilum)、 Candidapintolepesii、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、乳脂肠球菌(Enterococcuscremoris)、二丁酮肠球菌(E.diacetylactis)、粪肠球菌(E.faecium)、中间型肠球菌(E.intermedius)、乳酸肠球菌(E.lactis)、E. muntdi、嗜热肠球菌(E.thermophilus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、消化乳杆菌(L. alimentarius)、食淀粉乳杆菌(L.amylovorus)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)、短乳杆菌(L.brevis)、干酪乳杆菌(L.case)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、纤维二糖乳杆菌(L.cellobiosus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(L. delbrueckii ss.bulgaricus)、香肠乳杆菌(L.farciminis)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、加氏乳杆菌(L. gasseri)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、乳乳杆菌(L.lactis)、植物乳杆菌(L.plantarum)、约氏乳杆菌(L. johnsonii)、路氏乳杆菌(L.reuteri)、鼠李糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌GG(ATCC号53103，其在本文中亦可记为LGG)、清酒乳杆菌(L.sakei)和唾液乳杆菌(L.salivarius)及其任何组合。在一个实施方案中，本发明益生菌可以为存活或非存活的。在本公开中有用的益生菌可以为天然存在的、合成的或通过生物体的基因操作开发的，不管这种新的源现在是已知的或之后开发的。

在本公开的一个实施方案中，鼠李糖乳酸菌GG可以通过本发明组合物用作益生菌。鼠李糖乳酸菌GG在授权给Sharwood等的美国专利申请4,839,281中描述，其通过引用以其整体结合到文中。特别地，Sharwood等将鼠李糖乳酸菌GG描述为一种物类，其中细菌对肠内的细胞具有显著的粘着力，同时能够在低pH下存活并产生大量的乳酸。

所选择的益生菌在与本公开的组合物组分组合之前优选浓缩至湿膏状的稠度。以干燥形式的益生菌起始也是一个备选方案，尽管可以包括较少或较大的浓度，这取决于具体的益生菌生物质和随后的加工步骤。

根据本文制备的益生菌组合物可以与营养产品组合以形成新颖的营养组合物。例如，益生菌组合物可以与营养产品例如婴儿配方或儿童的营养产品组合以形成益生菌营养组合物。在另一个实施方案中，本发明益生菌组合物可以与人乳增强剂组合，将所述人乳增强剂加到人乳以便增强人乳的营养价值。

本发明人已经出人意料的发现，通过在素丸中添加聚乙烯醇和丙二醇以及在制备素丸过程中使混合物料置于密闭容器内并在2～6℃温度处静置24～30小时，能够使本发明所制得的呈小丸形式的益生菌组合物能通过pH值小于7的肠部而到达pH＝7.5～7.8的结肠部。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。以下实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。在以下各试验中，以干物料投料的10～100亿cfu的益生菌的重量均在28～83mg范围内(例如实施例1～5分别为73mg、38mg、91mg、47mg、67mg)。由于本发明涉及活菌制剂的制备以及它们的性质考察，在进行所有实验时应事先对物料、器具、试验环境进行除菌处理或保持在无菌净化环境下进行。在以下各试验中，所涉及的配方仅仅表示各物料的比例关系，在实际制备过程中，每批投料根据设备的规模确定，一般而言，实际投料时每批次至少是1000克的投料批量。下面实例所用益生菌均是购自丹麦科汉森并且是呈干粉状态的。

实施例1：益生菌组合物

(a)素丸配方：

益生菌(LGG)50亿cfu、

卵磷脂10mg、

甘油三硬脂酸酯10mg、

聚丙烯酸树脂(III)130mg、

丙二醇50mg、

聚乙烯醇(Mr80000)75mg、

乳糖350mg、

微晶纤维素250mg。

(b)素丸制备：

(1)通过搅拌使益生菌、磷脂、甘油酯、丙二醇充分混合均匀，接着加入聚丙烯酸树脂和聚乙烯醇混合均匀，最后加入乳糖、微晶纤维素混合均匀，得混合粉末；

(2)在搅拌下向所得混合粉末中以喷雾的方式添加占混合末粉重量18％的水，接着通过揉合使水均匀渗入到粉末中，得到的混合物料手握能成团且挤压即散；接着将该混合物料置于密闭容器内并在 2～6℃温度处静置28小时；

(3)在挤出滚圆制粒机(XYT-LTAES全自动低温挤出滚圆球形微丸制粒机，如下文未另外说明，均是采用此设备)上将上一步骤所得混合物料进行制粒，所得颗粒在室温通风处干燥使水分降至3％以下，即得素丸。

(c)包衣层配方：

聚丙烯酸树脂(尤特奇S100)480mg，

氢氧化钾4mg，

柠檬酸三乙酯50mg，

滑石粉200mg，

甲基硅油2mg。

包衣层与素丸的重量比为1：10。

(d)素丸包衣：

(4)将包衣层的物料配制成包衣液：将氢氧化钾用水配制成浓度为1mol/L的溶液；在容器中在搅拌下分次将聚丙烯酸树脂撒入2.5倍重量的水中，搅拌8分钟后，滴加氢氧化钾溶液，继续搅拌10小时，接着加入柠檬酸三乙酯，再搅拌1.5小时；另将滑石粉加至5倍重量的水中，接着加入甲基硅油，混匀，再用高剪切匀化机匀化15分钟；将两液混合，经80目筛过滤，得到包衣液；

(5)在流化床包衣机中将包衣液喷雾包裹于素丸表面并继续在流化床包衣机中使包衣丸干燥至水分小于3％，即得。

流化床包衣条件是本领域技术人员公知的，特别是根据具体设备进行确定，尤其可以从设备供应商处获得，如未另外说明，本发明流化床包衣设备采用如下典型的包衣工艺参数：

设备：Glatt流化床包衣机(WSG15)；输液泵：蠕动泵(硅胶管内径Φ3mm)；气动喷枪(喷嘴直径Φ1.2mm)；包衣工艺参数：

	预热	喷雾	干燥
				耗时	约5分	38分	3分
进风风门设置	30	40	30
				进风风量	1m<sup>3</sup>/分	1.3m<sup>3</sup>/分	1m<sup>3</sup>/分
进风温度	42℃	40℃	40℃
				出风温度	32℃	26℃	30℃
物料温度	30℃	25℃	28℃
				雾化喷气压力	1.8bar	1.8bar	1.8bar
喷液速率	---	10g/分	---

喷液速率：10g包衣混悬液/分/Kg物料，物料蒸发速率：8.5g/分/Kg物料。

实施例2：益生菌组合物

(a)素丸配方：

益生菌(BB536)30亿cfu、

卵磷脂8mg、

甘油三硬脂酸酯15mg、

聚丙烯酸树脂(III)140mg、

丙二醇45mg、

聚乙烯醇(Mr60000)80mg、

乳糖320mg、

微晶纤维素280mg。

(b)素丸制备：

(1)通过搅拌使益生菌、磷脂、甘油酯、丙二醇充分混合均匀，接着加入聚丙烯酸树脂和聚乙烯醇混合均匀，最后加入乳糖、微晶纤维素混合均匀，得混合粉末；

(2)在搅拌下向所得混合粉末中以喷雾的方式添加占混合末粉重量17％的水，接着通过揉合使水均匀渗入到粉末中，得到的混合物料手握能成团且挤压即散；接着将该混合物料置于密闭容器内并在 2～6℃温度处静置24小时；

(3)在挤出滚圆制粒机上将上一步骤所得混合物料进行制粒，所得颗粒在室温通风处干燥使水分降至3％以下，即得素丸。

(c)包衣层配方：

聚丙烯酸树脂(尤特奇S100)460mg，

氢氧化钾4.5mg，

柠檬酸三乙酯45mg，

滑石粉210mg，

甲基硅油2.5mg。

包衣层与素丸的重量比为1：9。

(d)素丸包衣：

(4)将包衣层的物料配制成包衣液：将氢氧化钾用水配制成浓度为1.2mol/L的溶液；在容器中在搅拌下分次将聚丙烯酸树脂撒入2倍重量的水中，搅拌10分钟后，滴加氢氧化钾溶液，继续搅拌8小时，接着加入柠檬酸三乙酯，再搅拌1小时；另将滑石粉加至4倍重量的水中，接着加入甲基硅油，混匀，再用高剪切匀化机匀化20分钟；将两液混合，经80目筛过滤，得到包衣液；

(5)在流化床包衣机中将包衣液喷雾包裹于素丸表面并继续在流化床包衣机中使包衣丸干燥至水分小于3％，即得。

实施例3：益生菌组合物

(a)素丸配方：

益生菌(AH1206)70亿cfu、

卵磷脂15mg、

甘油三硬脂酸酯8mg、

聚丙烯酸树脂(III)120mg、

丙二醇55mg、

聚乙烯醇(Mr90000)70mg、

乳糖380mg、

微晶纤维素220mg。

(b)素丸制备：

(1)通过搅拌使益生菌、磷脂、甘油酯、丙二醇充分混合均匀，接着加入聚丙烯酸树脂和聚乙烯醇混合均匀，最后加入乳糖、微晶纤维素混合均匀，得混合粉末；

(2)在搅拌下向所得混合粉末中以喷雾的方式添加占混合末粉重量20％的水，接着通过揉合使水均匀渗入到粉末中，得到的混合物料手握能成团且挤压即散；接着将该混合物料置于密闭容器内并在 2～6℃温度处静置28小时；

(3)在挤出滚圆制粒机上将上一步骤所得混合物料进行制粒，所得颗粒在室温通风处干燥使水分降至3％以下，即得素丸。

(c)包衣层配方：

聚丙烯酸树脂(尤特奇S100)490mg，

氢氧化钾3.5mg，

柠檬酸三乙酯55mg，

滑石粉190mg，

甲基硅油1.5mg。

包衣层与素丸的重量比为1：11。

(d)素丸包衣：

(4)将包衣层的物料配制成包衣液：将氢氧化钾用水配制成浓度为0.8mol/L的溶液；在容器中在搅拌下分次将聚丙烯酸树脂撒入2.5倍重量的水中，搅拌5分钟后，滴加氢氧化钾溶液，继续搅拌12小时，接着加入柠檬酸三乙酯，再搅拌2小时；另将滑石粉加至6倍重量的水中，接着加入甲基硅油，混匀，再用高剪切匀化机匀化10分钟；将两液混合，经80目筛过滤，得到包衣液；

(5)在流化床包衣机中将包衣液喷雾包裹于素丸表面并继续在流化床包衣机中使包衣丸干燥至水分小于3％，即得。

实施例4：益生菌组合物

(a)素丸配方：

益生菌(BB-12)100亿cfu、

豆磷脂20mg、

甘油三山俞酸酯5mg、

聚丙烯酸树脂(III)150mg、

丙二醇40mg、

聚乙烯醇(Mr50000)90mg、

乳糖400mg、

微晶纤维素200mg。

(b)素丸制备：

(1)通过搅拌使益生菌、磷脂、甘油酯、丙二醇充分混合均匀，接着加入聚丙烯酸树脂和聚乙烯醇混合均匀，最后加入乳糖、微晶纤维素混合均匀，得混合粉末；

(2)在搅拌下向所得混合粉末中以喷雾的方式添加占混合末粉重量18％的水，接着通过揉合使水均匀渗入到粉末中，得到的混合物料手握能成团且挤压即散；接着将该混合物料置于密闭容器内并在 2～6℃温度处静置24小时；

(3)在挤出滚圆制粒机上将上一步骤所得混合物料进行制粒，所得颗粒在室温通风处干燥使水分降至3％以下，即得素丸。

(c)包衣层配方：

聚丙烯酸树脂(尤特奇S100)450mg，

氢氧化钾5mg，

柠檬酸三乙酯40mg，

滑石粉220mg，

甲基硅油1.75mg。

包衣层与素丸的重量比为1：8。

(d)素丸包衣：

(4)将包衣层的物料配制成包衣液：将氢氧化钾用水配制成浓度为1mol/L的溶液；在容器中在搅拌下分次将聚丙烯酸树脂撒入2.25倍重量的水中，搅拌5-10分钟后，滴加氢氧化钾溶液，继续搅拌 10小时，接着加入柠檬酸三乙酯，再搅拌1.5小时；另将滑石粉加至5倍重量的水中，接着加入甲基硅油，混匀，再用高剪切匀化机匀化15分钟；将两液混合，经80目筛过滤，得到包衣液；

(5)在流化床包衣机中将包衣液喷雾包裹于素丸表面并继续在流化床包衣机中使包衣丸干燥至水分小于3％，即得。

实施例5：益生菌组合物

(a)素丸配方：

益生菌(35624)10亿cfu、

豆磷脂5mg、

甘油三硬脂酸酯20mg、

聚丙烯酸树脂(III)120mg、

丙二醇60mg、

聚乙烯醇(Mr100000)60mg、

乳糖300mg、

微晶纤维素300mg。

(b)素丸制备：

(1)通过搅拌使益生菌、磷脂、甘油酯、丙二醇充分混合均匀，接着加入聚丙烯酸树脂和聚乙烯醇混合均匀，最后加入乳糖、微晶纤维素混合均匀，得混合粉末；

(2)在搅拌下向所得混合粉末中以喷雾的方式添加占混合末粉重量19％的水，接着通过揉合使水均匀渗入到粉末中，得到的混合物料手握能成团且挤压即散；接着将该混合物料置于密闭容器内并在 2～6℃温度处静置30小时；

(3)在挤出滚圆制粒机上将上一步骤所得混合物料进行制粒，所得颗粒在室温通风处干燥使水分降至3％以下，即得素丸。

(c)包衣层配方：

聚丙烯酸树脂(尤特奇S100)500mg，

氢氧化钾3mg，

柠檬酸三乙酯60mg，

滑石粉180mg，

甲基硅油2.25mg。

包衣层与素丸的重量比为1：12。

(d)素丸包衣：

(4)将包衣层的物料配制成包衣液：将氢氧化钾用水配制成浓度为1mol/L的溶液；在容器中在搅拌下分次将聚丙烯酸树脂撒入2.5倍重量的水中，搅拌7分钟后，滴加氢氧化钾溶液，继续搅拌10小时，接着加入柠檬酸三乙酯，再搅拌1.2小时；另将滑石粉加至5倍重量的水中，接着加入甲基硅油，混匀，再用高剪切匀化机匀化15分钟；将两液混合，经80目筛过滤，得到包衣液；

(5)在流化床包衣机中将包衣液喷雾包裹于素丸表面并继续在流化床包衣机中使包衣丸干燥至水分小于3％，即得。

实施例6：益生菌组合物

分别参照实施例1的配方和制法，不同的仅是将其中的益生菌替换为以下五种：乳双歧杆菌 BLa80、鼠李糖乳杆菌R11、嗜酸乳杆菌LA85、长双歧杆菌R175、嗜酸乳 杆菌R418，得到可分别称为实施例61、实施例62……实施例65的五个实施例的五种包衣丸。

实施例11：益生菌组合物

分别参照实施例1～5的配方和制法，不同的仅是将其中聚乙烯醇取消不用，得到可分别称为实施例111、实施例112……实施例115的五个实施例的五种包衣丸。

实施例12：益生菌组合物

分别参照实施例1～5的配方和制法，不同的仅是将其中丙二醇取消不用，得到可分别称为实施例 121、实施例122……实施例125的五个实施例的五种包衣丸。

实施例13：益生菌组合物

分别参照实施例1～5的配方和制法，不同的仅是在素丸制备的步骤(2)中，取消最后将混合物料置于密闭容器内并在2～6℃温度处静置24～30小时的操作而是直接进行后续操作，得到可分别称为实施例131、实施例132……实施例135的五个实施例的五种包衣丸。

实施例14：益生菌组合物

分别参照实施例1～5的配方和制法，不同的仅是在素丸制备的步骤(2)的最后将混合物料置于密闭容器内并在室温处静置24～30小时，得到可分别称为实施例141、实施例142……实施例145的五个实施例的五种包衣丸。

测定以上实施例1～6以及实施例11～14所得包衣丸的粒度和水分，结果如下：

实施例1～6和实施例11～14全部包衣丸粒度均在0.5～1.2mm范围内，均值均在0.74～1.03mm范围内，例如实施例1包衣丸粒度均在0.5～1.0mm范围内，均值0.87mm，例如实施例2包衣丸粒度均在 0.5～0.9mm范围内，均值0.85mm；

实施例1～6和实施例11～14全部包衣丸水分含量均在1％～2.5％范围内，例如实施例1包衣丸水分含量2.16％，例如实施例2包衣丸水分含量1.93％。

实验例1：模拟的溶出试验

以考察结肠释药性模型药物5-氨基水杨酸代替益生菌的模拟丸进行模拟的溶出试验。

包衣的模拟丸制备：分别参照实施例1～3的配方和制法，不同的仅是将其中的益生菌用等重量的 5-氨基水杨酸代替，分别得到模拟丸1、模拟丸2、模拟丸3；参照实施例1的配方和制法，不同的仅是将其中的益生菌用等重量的5-氨基水杨酸代替并且将其中聚乙烯醇取消不用，得到模拟丸4；参照实施例1的配方和制法，不同的仅是将其中的益生菌用等重量的5-氨基水杨酸代替并且将其中丙二醇取消不用，得到模拟丸5；参照实施例1的配方和制法，不同的仅是将其中的益生菌用等重量的5-氨基水杨酸代替并且将其中聚乙烯醇和丙二醇取消不用，得到模拟丸6；参照实施例1的配方和制法，不同的仅是将其中的益生菌用等重量的5-氨基水杨酸代替并且在素丸制备的步骤(2)中取消最后将混合物料置于密闭容器内并在2～6℃温度处静置24～30小时的操作而是直接进行后续操作，得到模拟丸 7；参照实施例1的配方和制法，不同的仅是将其中的益生菌用等重量的5-氨基水杨酸代替并且在素丸制备的步骤(2)的最后将混合物料置于密闭容器内并在室温处静置24～30小时，得到模拟丸8。模拟丸1～8全部包衣丸粒度均在0.5～1.1mm范围内，均值均在0.78～0.94mm范围内，例如模拟丸1粒度均在0.4～1.0mm范围内，均值0.84mm；模拟丸1～8全部包衣丸水分含量均在1％～2.5％范围内，例如模拟丸1丸水分含量2.03％。

按照中国药典(2015年版四部0931溶出度与释放度测定法第一法转篮法，50r/min，溶出介质 900ml，37℃，使测试样品模拟丸1～7(250mg小丸，由于颗粒较大，在转篮中不会泄漏)分别在人工胃液(pH1.2)中进行2h、在人工肠液(pH6.8磷酸盐缓冲液)中进行6h、在人工结肠液(pH7.8磷酸盐缓冲液) 中进行2h的溶出，测定溶出度(n＝6)，结果如下：

样品	pH1.2/2h	pH6.8/6h	pH7.8/2h
				模拟丸1	13.2％	13.6％	92.6％
模拟丸2	11.7％	14.5％	91.1％
				模拟丸3	12.4％	16.2％	94.6％
模拟丸4	78.3％	96.6％	98.6％
				模拟丸5	72.7％	93.7％	96.3％
模拟丸6	84.1％	97.1％	98.2％
				模拟丸7	85.8％	98.7％	97.6％
模拟丸8	82.5％	97.6％	96.3％

根据上表结果可见，模拟丸1～3在人工胃液(pH1.2)中进行2h溶出后溶出量小于14％，在人工肠液(pH6.8磷酸盐缓冲液)中进行6h溶出后溶出量小于20％，表明基本上未溶出(众所周知，基本上未溶出并不表示溶出量接近0，此11～16％溶出量是药物突释造成的，固体制剂均会有此现象)，而在人工结肠液(pH7.8磷酸盐缓冲液)中进行2h的溶出后溶出量达91％以上，说明这些配方在结肠中呈现优良溶出性能但是在胃及小肠等pH尤其小于7.0的环境中溶出量相当小。令人遗憾的发现是，未使用本发明处方/工艺制备的模拟丸4～8在胃液和小肠液中迅速释放。

补充试验：参照模拟丸1的配方和制法，不同的仅是将其中的乳糖用等量甘露醇或山梨醇代替，制得模拟丸1a和模拟丸1b，再照上表所涉及的方法进行试验，结果在三种溶出介质中两种模拟丸的结果与模拟丸1的结果基本相同，在胃液中分别为12.7％和13.4％、在肠液中分别为13.3％和14.1％、在结肠液中分别为93.7％和92.2％。

实验例2：活菌数检测实验

测定益生菌包衣小丸在进行溶出处理前、后的活菌数，比较小丸在溶出处理后的活菌变化。

参照CN108066296A之[0074]～[0078]的方法准备益生菌培养条件。

按照中国药典(2015年版四部0931溶出度与释放度测定法第一法转篮法，50r/min，250ml经121℃15min灭菌处理的介质，37℃)，精密称取包衣小丸1g置转篮中(小丸粒径比转篮孔大，不会漏出)，将此小丸分别在人工胃液(pH1.2)中进行2h、在人工肠液(pH6.8磷酸盐缓冲液)中进行6h、在人工结肠液(pH7.8磷酸盐缓冲液)中进行2h的溶出，溶出完毕后，提出转篮，吹干；配合使用适量人工结肠液倒出小丸置玻璃研钵中研均并补加人工结肠液至50ml，混匀后取1ml混合液10倍倍比稀释，稀释后取各个稀释度0.1ml涂布于MRS培养基上。

对于未进行溶出度处理的包衣小丸，精密称取包衣小丸1g置玻璃研钵中研匀并补加人工结肠液至 50ml，混匀后取1ml混合液10倍倍比稀释，稀释后取各个稀释度0.1ml涂布于MRS培养基上，用于测试溶出前菌落数。

将涂布后的平板至于厌氧袋中放在37℃恒温培养箱中培养48h后将平板取出进行菌落计数。

试验样品为实施例1～5和实施例11～14的全部包衣丸。对于每一样品，测定其未进行溶出、人工胃液(pH1.2)中进行2h溶出、在人工肠液(pH6.8磷酸盐缓冲液)中进行6h溶出、在人工结肠液(pH7.8 磷酸盐缓冲液)中进行2h溶出四种情况下的菌落数，以某样品在某溶出条件下的溶出后菌落数除以溶出前菌落数再乘以100％所得百分数，表示该包衣小丸在该溶出条件处理后的溶出残余菌百分数，结果(n＝5的均值)如下：

(1)人工胃液中：实施例1～5包衣丸溶出残余菌百分数分别为：89.6％、87.3％、86.2％、84.5％、 85.8％；实施例11五个包衣丸溶出残余菌百分数均在1.2～5.7％范围内，例如实施例111为2.3％；实施例12五个包衣丸溶出残余菌百分数均在0.4～3.4％范围内，例如实施例121为1.8％；实施例13五个包衣丸溶出残余菌百分数均在1.6～5.2％范围内，例如实施例131为3.1％；实施例14五个包衣丸溶出残余菌百分数均在0.8～4.3％范围内，例如实施例141为2.6％。

(2)人工肠液中：实施例1～5包衣丸溶出残余菌百分数分别为：86.7％、84.1％、89.6％、85.4％、 87.5％；实施例11五个包衣丸溶出残余菌百分数均在0.5～3.2％范围内，例如实施例111为2.5％；实施例12五个包衣丸溶出残余菌百分数均在1.9～4.6％范围内，例如实施例121为3.1％；实施例13五个包衣丸溶出残余菌百分数均在1.2～4.1％范围内，例如实施例131为2.2％；实施例14五个包衣丸溶出残余菌百分数均在1.5～3.8％范围内，例如实施例141为2.8％。

(3)人工结肠液中：实施例1～5包衣丸溶出残余菌百分数分别为：3.5％、2.2％、4.1％、0.7％、1.3％；实施例11五个包衣丸溶出残余菌百分数均在0.7～4.4％范围内，例如实施例111为2.2％；实施例12五个包衣丸溶出残余菌百分数均在1.2～3.8％范围内，例如实施例121为2.6％；实施例13五个包衣丸溶出残余菌百分数均在0.6～2.6％范围内，例如实施例131为1.1％；实施例14五个包衣丸溶出残余菌百分数均在1.4～4.2％范围内，例如实施例141为2.4％。

从上述结果可见：实施例1～5包衣丸在胃液和肠液中溶出处理后，大部分未溶出，仍然残留在溶出篮的颗粒中，这些颗粒中的益生菌在后续研磨液中能够测定到，因此在胃液和肠液中溶出残余菌百分数在80％以上；但是实施例1～5包衣丸在结肠液中溶出处理后，绝大部分溶出，溶出篮的颗粒中基本上无残留，因此在结肠液中溶出残余菌百分数在5％以下；而实施例11～14包衣丸在胃液、肠液、结肠液中溶出处理后，绝大部分溶出，溶出篮中基本上无残留，因此在三种溶出液中溶出残余菌百分数在5％以下。即，实施例1～5包衣丸在胃液和肠液中不溶，但是可以在结肠液中溶解，即实现益生菌的靶向定位释放；而实施例11～14包衣丸在胃液、肠液、结肠液中均能溶解，不能靶向定位释放到结肠部位。

补充试验：参照实施例1的配方和制法，不同的仅是将其中的乳糖用等量甘露醇或山梨醇代替，制得包衣的补充丸1a和补充丸1b，再照本实验例2的活菌数检测实验测定，结果在三种溶出介质中两种补充丸的结果与实施例1包衣丸的结果基本相同(n＝5的均值)：在胃液中溶出残余菌百分数分别为 87.7％和89.1％、在肠液中溶出残余菌百分数分别为88.6％和85.6％、在结肠液中溶出残余菌百分数分别为2.2％和1.7％。

本说明书引用的所有参考文献，包括而不限于所有的论文、出版物、专利、专利申请、简报、教科书、报告、底稿、小册子、书籍、互联网文章、杂志文章、期刊等，通过引用以其整体结合到本说明书中。本文的参考文献的讨论仅仅意在概括其作者所做出的断言，并非承认任何参考文献构成现有技术。申请人保留对所引用的参考文献的准确性和相关性提出异议的权利。

虽然使用特定术语、装置和方法描述了本公开的实施方案，但是这类描述只用于说明目的。所用词汇是描述词汇而不是限制词汇。应当理解在不偏离随附权利要求书中阐述的本公开的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可进行变动和改变。另外，应当理解各种实施方案的方面可全部或部分互换。例如，虽然业已例示用于生产根据那些方法制备的市售无菌液体营养补充物的方法，还可以考虑其他使用。因此，随附权利要求书的精神和范围不应限于其中所含优选形式的描述。

Claims (18)

1.一种呈小丸形式的益生菌组合物，其由素丸以及涂渍包裹于该素丸表面的包衣层构成；

素丸中包含如下比例的物质：益生菌10~100亿cfu、磷脂5~20mg、甘油酯5~20mg、聚丙烯酸树脂120~150mg、丙二醇40~60mg、聚乙烯醇60~90mg、乳糖300~400mg、微晶纤维素200~300mg；

所述包衣层包括如下比例的物料：聚丙烯酸树脂450~500mg，氢氧化钾3~5mg，柠檬酸三乙酯40~60mg，滑石粉180~220mg，甲基硅油1.5~2.5mg；

所述素丸是通过包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)通过搅拌使益生菌、磷脂、甘油酯、丙二醇充分混合均匀，接着加入聚丙烯酸树脂和聚乙烯醇混合均匀，最后加入乳糖、微晶纤维素混合均匀，得混合粉末；

(2)在搅拌下向所得混合粉末中以喷雾的方式添加占混合粉末重量17%~20%的水，接着通过揉合使水均匀渗入到粉末中，得到的混合物料手握能成团且挤压即散；接着将该混合物料置于密闭容器内并在2~6°C温度处静置24~30小时；

(3)在挤出滚圆制粒机上将上一步骤所得混合物料进行制粒，所得颗粒在室温通风处干燥使水分降至3%以下，即得素丸。

2.根据权利要求1的益生菌组合物，聚丙烯酸树脂是甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯以30：70~40：60比例的共聚物。

3.根据权利要求1的益生菌组合物，聚丙烯酸树脂是甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯以35：65比例的共聚物。

4.根据权利要求1的益生菌组合物，聚乙烯醇的平均分子量为50000~100000。

5.根据权利要求1的益生菌组合物，所述磷脂是卵磷脂。

6.根据权利要求1的益生菌组合物，所述甘油酯包括至少一种选自下列的甘油酯：甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯。

7.根据权利要求1的益生菌组合物，所述益生菌是存活的益生菌，其是选自下列的活的微生物：长双歧杆菌BB536、长双歧杆菌婴儿亚种35624、动物双歧杆菌乳酸亚种BB-12、乳双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌。

8.根据权利要求1的益生菌组合物，其中所述素丸中的乳糖还可以用相应量的甘露醇或山梨醇代替。

9.根据权利要求1的益生菌组合物，所述包衣层的物质在涂渍包裹于素丸表面之前，用水配制成包衣液。

10.根据权利要求1的益生菌组合物，所述包衣层与素丸的重量比为1：8~12。

11.根据权利要求1的益生菌组合物，所述包衣层与素丸的重量比为1：10。

12.根据权利要求1的益生菌组合物，所述包衣层是通过将其物料配制成包衣液后，在流化床包衣机上使包衣液涂渍于所述素丸表面并干燥而形成的。

13.根据权利要求12的益生菌组合物，在用包衣液对素丸进行包衣的过程中，物料温度在25~35℃范围内。

14.根据权利要求12的益生菌组合物，在用包衣液对素丸进行包衣的过程中，物料温度在25~32℃范围内。

15.根据权利要求12的益生菌组合物，在用包衣液对素丸进行包衣的过程中，物料温度在25~30℃范围内。

16.根据权利要求1的益生菌组合物，其呈包衣小丸的形式，小丸的粒度为0.4~1.5mm，水分含量小于3%。

17.根据权利要求1的益生菌组合物，其呈包衣小丸的形式，小丸的粒度为0.5~1.2mm，水分含量为1%~2.5%。

18.一种营养组合物，其包括：权利要求1-17任一项所述益生菌组合物和用于给使用者提供营养的蛋白质源。