CN110161220A - 一种机器人化测细胞弹性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种机器人化测细胞弹性的方法，属于细胞级别的显微操作。该方法利用一个传输微管进行存储和传输细胞，利用测量微管插入传输微管拾取目标细胞，在传输微管内施加负压拉开黏连的多余细胞以确保显微视野范围内只有一个待测细胞，然后用测量微管测量细胞弹性，实现了机器人化的测细胞弹性。该方法包括：传输微管和测量微管的水平度检测；自动化细胞传输和细胞黏连检测；破坏细胞黏连的压强计算；自动化细胞弹性测量。实验结果表明，该方法能够连续操作20个细胞，操作速度是现有方法的4倍。

Description

一种机器人化测细胞弹性的方法

技术领域

本发明涉及细胞级别的显微操作领域，具体涉及一种机器人化测细胞弹性的方法。

背景技术

细胞弹性在细胞生理学和细胞病理学研究中具有重要作用。为了测量细胞弹性，科学家们研发了多种测量细胞弹性的方法，例如微流道法、原子力显微镜法、光镊法、磁镊法以及微管吸持法。其中，微管吸持法因为其低设备要求、吸持压范围广和对细胞伤害小的原因，成为了最广泛被应用的测弹性方法。传统的微管吸持法测弹性，因为细胞通常随机分布在培养皿中，所以每次测弹性之前都需要在培养皿内搜寻细胞，极大的降低了操作效率，增加了操作时间。因此有人引入了传输微管，在测弹性之前将所有细胞吸入传输微管中，每次需要时再吐出，这样即可消除每次测弹性之前的细胞搜寻时间。然而因为传输微管内流体之间的非线性，在吐出细胞的过程中，细胞之间经常会发生黏连，使得通常吐出来的细胞常常不止一个。因此，设计一个利用传输微针存储、传递细胞，且每次只传递一个细胞的机器人化测细胞弹性的方法很有必要。

发明内容

本发明的目的是实现细胞弹性的机器人化测量，该方法利用一个传输微管进行存储和传输细胞，利用测量微管插入传输微管拾取目标细胞，在传输微管内施加负压拉开黏连的多余细胞以确保显微视野范围内只有一个待测细胞，然后用测量微管测量细胞弹性，实现了机器人化的测细胞弹性。实验结果表明，该方法的操作速度是现有方法的4倍。

本发明的技术方案是：

一种机器人化测细胞弹性的方法，包括以下步骤：

(1)传输微管和测量微管的水平度检测，确定当测量微管插入传输微管的距离为L_insert时，二者允许的最大倾斜角度；

(2)自动化细胞传输和细胞黏连检测，在传输微管中施加正压，将传输微管中的细胞传输至显微视野，并自动检测细胞是否出现在显微视野中以及是否有细胞黏连在目标细胞上；

(3)用测量微管施加负压固定住待测细胞，在传输微管内施加负压，计算破坏细胞间黏连所需要的压强，拉开黏连上待测细胞的多余细胞；

(4)移开传输微管，使显微视野范围内只留下测量微管，测量微管内施加负压，利用Shell模型计算待测细胞弹性。

所述步骤(1)中的最大倾斜角度测量方法是，当传输微管内没有细胞时，测量微管能插入传输微管距离为L_insert时的最大倾斜角度由以下公式得到：

L_insert＝(R_t-R_m)cot2θ

其中L_insert表示测量微管要插入的深度，R_t表示传输微管的内半径，R_m表示测量微管的外半径，θ表示此时测量微管和传输微管允许的最大倾斜角度。

当传输微管内有细胞时，测量微管能插入传输微管距离为L_insert’时的最大倾斜角度由以下公式得到：

其中L_insert’表示细胞中心与传输微管开口处的距离，R_O表示细胞半径，R_m表示测量微管的外半径，R_t表示传输微管的内半径，θ’表示此时测量微管和传输微管允许的最大倾斜角度。

所述步骤(2)中的检测出细胞是否出现在显微视野中的方法是，通过取感兴趣区域(ROI)，并对该区域进行形态学处理，二值化，判断显微视野内黑色像素个数来判断细胞是否出现。

判断是否有细胞黏连在目标细胞上的方法是，通过霍夫检测判断显微视野中出现几个细胞，并计算相邻细胞之间的距离来判断是否有细胞黏连。

所述步骤(3)中的破坏细胞间黏连所需要的压强由以下公式求得：

其中μ表示操作液的表面张力系数；l表示传输微管打弯前的长度；R_t表示传输微管的内半径；ρ_L表示操作液的密度；C_D表示细胞的拉力系数；Fs表示细胞间的黏力，通过实验标定得到，标定结果由以下公式给出：

其中R_H表示标定微管的针口内半径；ΔP_C表示标定过程中的压强；R_O表示细胞半径；g表示重力加速度；ρ_O表示细胞密度；ρ_L表示操作液密度；α表示支撑力与水平面的夹角，由公式给出：

则最后的破坏细胞间黏连所需要的压强由以下公式给出：

所述步骤(4)中的自动化测量细胞弹性使用的Shell模型为：

其中，v表示不可压缩性，h*表示无量纲厚度，由细胞透明带厚度h与测量微管半径R_P的比求得；△P表示吸细胞所用的压强；△L表示细胞边缘在测量微管内的长度变化；C(h*)表示h*的函数，由以下公式给出：

其中a＝1.070275412,b＝0.592405186,c＝-0.44373788,d＝0.126723221,e＝0.721290633,f＝0.074985305,x＝-0.14390482,h＝0.027220129,i＝0.040156098,j＝0.00132358。

本发明的优点和有益效果

本发明实现了一种机器人化的测细胞弹性方法。该方法较传统方法，利用一个传输微管进行存储和传输细胞，利用测量微管插入传输微管拾取目标细胞，在传输微管内施加负压拉开黏连的多余细胞以确保显微视野范围内只有一个待测细胞，然后用测量微管测量细胞弹性，实现了机器人化的测细胞弹性。实验结果表明，该方法的操作速度是现有方法的4倍(传统方法：2min/cell,新方法：0.5min/cell)。

附图说明

图1是本发明方法的流程图。

图2是本发明中没有细胞(a)和有细胞(b)时，测量微管能插入传输微管的距离为L_insert(a)和L_insert’(b)的最大倾斜角度的示意图。

图3是本发明中水平度检测的图像，其中(a)为传输微管图片；(b)为测量微管图片；(c)为不同倾斜角度下的传输微管宽度；(d)为不同倾斜角度下的测量微管宽度。

图4是本发明中细胞是否出现的检测图像，其中(a)为ROI选取图片；(b)为形态学变换后的ROI图片；(c)为二值化后的ROI图片；(d)为细胞传输过程中二值化的ROI内的黑色像素点个数，用以检测细胞是否出现。

图5是本发明中细胞是否黏连的检测图像。

图6是本发明中破坏细胞间黏连的受力分析示意图。

图7为本发明中标定细胞间黏连力大小的受力分析示意图。

图8为Shell模型(a)及实验对比图(b)。

图9为细胞自动测弹性(a)以及边缘检测(b)的图片。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，描述的实施例仅仅是本发明的一个具体的实施例，不是全部的实施例。下述实施例是说明性的，不是限制性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

实施例1

本发明所述机器人化测细胞弹性的方法流程如图1所示。

(1)家猪卵母细胞获取；

本实施例所用的卵母细胞是从当地屠宰场所取的家猪卵母细胞，家猪卵巢从屠宰场取出后，在两个小时之内用装有35°到37°的生理盐水的保温瓶运送到实验室。然后立刻用37°的含有100IU/L的盘尼西林和50mg/L的链霉素的无菌生理盐水清洗两次。从卵巢上的2-6mm直径的卵泡中抽取卵母细胞，将抽出的细胞用TL-Hepes-PVA冲洗三次后，在39°、二氧化碳浓度5％的培养箱内进行体外成熟培养(IVM)42小时。经过IVM后，将细胞用0.1％的透明质酸酶进行脱卵。最后用M199将细胞清洗三次，得到所用的卵母细胞。

(2)传输微管和测量微管的水平度检测实验，如图2、图3所示；

本实施例中，传输微管的内半径R_t约为100μm，测量微管的外半径R_m约为20μm，细胞半径R_O尺寸约为75-80μm，细胞中心距离传输微管开口的长度L_insert’约为120微米，因为当传输微管内有细胞时，所能实现的最大倾角θ’要更小一些，所以我们计算该值时根据如下公式计算：

结果为针管的最大倾角为17.54°～18.73°，为了确保实验中测量微管能插入到传输微管内，我们将最大倾角设为17°。

图3是水平度检测的图像，实验结果表明当微管倾角越大时，传输微管和测量微管的斜率也越大。因为水平时，传输微管的斜率为0.011，测量微管的斜率为0.028，倾斜17°时，传输微管和测量微管的斜率分别为0.131和0.106，所以我们认为传输微管的斜率在0.011～0.131，测量微管的斜率在0.029～0.106时，水平度能够满足测量微管插入传输微管内。

(3)细胞传输与检测，如图4、图5所示；

在将测量微管插入传输微管后，在传输微管内施加10kPa的正压，将细胞传输到视野范围内。图4为传输过程中，细胞是否出现的检测图像。图4(a)感兴趣区域(ROI)选择图像，图4(b)为经过形态学变换后的图像，图4(c)为经过二值化后的图像，图4(d)为传输过程中，ROI内的黑色像素点个数变化。结果表明为当细胞传输到感兴趣区域(ROI)内的时候，ROI内的黑色像素点数会骤然增加，因此我们设定当像素点数超过3.5×10⁴的时候，判定细胞已经出现在显微视野范围内。

图5为细胞黏连的检测图像。我们利用霍夫检测的算法，检测视野范围内细胞的个数，如果显微视野范围内有两个细胞，且两个细胞的中心距离在传输微管内持续增加正压的情况下保持不变，则说明二者已经黏连。

(4)破坏细胞间黏连所需压强的计算，如图6、图7所示；

图6为破坏细胞间黏连的受力分析示意图，通过受力分析可知，破坏细胞间黏连所需压强为：

由该公式可知，其中μ表示操作液的表面张力系数，为79.30±0.63mN/m；l表示传输微管打弯前的长度，为1597.043μm；R_t表示传输微管的内半径，为95.3μm；ρ_L表示操作液的密度，为1008.2kg/m³；C_D表示细胞的拉力系数，为0.47；Fs表示细胞间的黏力，该力未知，需要通过实验标定。

图7为标定细胞间黏连力大小的受力分析示意图，通过受力分析可知，细胞间的黏连力大小为：

其中R_H表示标定微管的针口内半径，为14.375μm；ΔP_C表示标定过程中的压强，为7344Pa～7598Pa；R_O表示细胞半径,为75-80μm；g表示重力加速度，为9.8N/kg；ρ_O表示细胞密度，为1150.6±39.2kg/m³。

则，可以算得破坏细胞间黏连所需压强为9181.03～9506.91Pa，为了确保细胞能被拉开，本发明中将该压强设为9600Pa。

(5)自动化测量细胞弹性，如图8、图9所示；

图8为本实验所用Shell模型，图9为测弹性过程中，因细胞吸持而产生的形变的检测结果。我们分别用该方法和传统方法测量了22个细胞的弹性，实验结果表明，该方法(新)测得结果与传统方法(旧)测量结果一致(新：19.41±4.33kPa；旧：19.20±5.43kPa)，且该方法的速度比传统方法提升了4倍(新：0.5min/cell；旧：2min/cell)。

以上通过实施例对本发明进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的示例性实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。本发明的保护范围由权利要求书限定。凡利用本发明所述的技术方案，或本领域的技术人员在本发明技术方案的启发下，在本发明的实质和保护范围内，设计出类似的技术方案而达到上述技术效果的，或者对申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖保护范围之内。应当注意，为了清楚的进行表述，本发明的说明中省略了部分与本发明的保护范围无直接明显的关联但本领域技术人员已知的处理表述。

Claims (5)

1.一种机器人化测细胞弹性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)传输微管和测量微管的水平度检测，确定当测量微管插入传输微管的距离为L_insert时，二者允许的最大倾斜角度；

(2)自动化细胞传输和细胞黏连检测，在传输微管中施加正压，将传输微管中的细胞传输至显微视野，并自动检测细胞是否出现在显微视野中以及是否有细胞黏连在目标细胞上；

(3)用测量微管施加负压固定住待测细胞，在传输微管内施加负压，计算破坏细胞间黏连所需要的压强，拉开黏连上待测细胞的多余细胞；

(4)移开传输微管，使显微视野范围内只留下测量微管，测量微管内施加负压，利用Shell模型计算待测细胞弹性。

2.按照权利要求1所述的机器人化测细胞弹性的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的最大倾斜角度计算方法是，当传输微管内没有细胞时，测量微管能插入传输微管距离为L_insert时的最大倾斜角度由以下公式得到：

L_insert＝(R_t-R_m)cot2θ

其中L_insert表示测量微管要插入的深度，R_t表示传输微管的内半径，R_m表示测量微管的外半径，θ表示此时测量微管和传输微管允许的最大倾斜角度；

当传输微管内有细胞时，测量微管能插入传输微管距离为L_insert’时的最大倾斜角度由以下公式得到：

其中L_insert’表示细胞中心与传输微管开口处的距离，R_O表示细胞半径，R_m表示测量微管的外半径，R_t表示传输微管的内半径，θ’表示此时测量微管和传输微管允许的最大倾斜角度。

3.按照权利要求1所述的机器人化测细胞弹性的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的检测出细胞是否出现在显微视野中的方法是，通过取感兴趣区域(ROI)，并对该区域进行形态学处理，二值化，判断显微视野内黑色像素个数来判断细胞是否出现；

判断是否有细胞黏连在目标细胞上的方法是，通过霍夫检测判断显微视野中出现几个细胞，并计算相邻细胞之间的距离来判断是否有细胞黏连。

4.按照权利要求1所述的机器人化测细胞弹性的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的破坏细胞间黏连所需要的压强由以下公式得到：

其中μ表示操作液的表面张力系数；l表示传输微管打弯前的长度；R_t表示传输微管的内半径；ρ_L表示操作液的密度；C_D表示细胞的拉力系数；Fs表示细胞间的黏力，通过实验标定得到，标定结果由以下公式给出：

其中R_H表示标定微管的针口内半径；ΔP_C表示标定过程中的压强；R_O表示细胞半径；g表示重力加速度；ρ_O表示细胞密度；ρ_L表示操作液的密度；α表示支撑力与水平面的夹角，由公式给出：

则最后的破坏细胞间黏连所需要的压强由以下公式给出：

5.按照权利要求1所述的机器人化测细胞弹性的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的自动化测量细胞弹性使用的Shell模型为：

其中，v表示不可压缩性，h*表示无量纲厚度，由细胞透明带厚度h与测量微管半径R_P的比求得；△P表示吸细胞所用的压强；△L表示细胞边缘在测量微管内的长度变化；C(h*)表示h*的函数，由以下公式给出：

其中a＝1.070275412,b＝0.592405186,c＝-0.44373788,d＝0.126723221,e＝0.721290633,f＝0.074985305,x＝-0.14390482,h＝0.027220129,i＝0.040156098,j＝0.00132358。