CN110161008A - 共光轴度和放大倍数可自校准的荧光颗粒示踪方法与装置 - Google Patents

Abstract

共光轴度和放大倍数可自校准的荧光颗粒示踪方法与装置属于荧光颗粒超分辨显微测量领域，本发明的测量系统中双光斑光束向量测量单元首先确定输出光束的方向向量，该输出光束透射所有测量组成部分的姿态平面镜块，在已知姿态平面镜块条件下，通过折射定理，可得姿态平面镜块的偏摆和俯仰姿态角，回位补偿偏摆和俯仰姿态角，便实现了显微光路共光轴姿态，另外，因该输出光束入射进显微成像光路中，其放大后的平移量可由测量系统获得，而实际平移量可由双光斑光束向量测量单元获得，由此可确定测量系统的放大倍数，该具有共光轴度和放大倍数自校准功能的测量系统为保证荧光单颗粒示踪的测量准确性提供必要技术手段。

Description

共光轴度和放大倍数可自校准的荧光颗粒示踪方法与装置

技术领域

本发明属于荧光颗粒超分辨显微测量领域，主要涉及一种实现荧光颗粒探针轨迹准确示踪的方法与装置。

背景技术

荧光单颗粒示踪是一种通过显微技术实时测量观察颗粒探针运动轨迹的方法，它是荧光超分辨技术中的一个重要的分支。当显微镜的物镜视野下仅有荧光单颗粒的时候，通过拟合算法，此荧光单颗粒位置精度可很容易地超过光学分辨率极限——瑞利限度，达到纳米量级。荧光单颗粒示踪所获得的数据为颗粒探针的运动位移轨迹，该轨迹体现了微环境的力学特性，将探针轨迹转换为平均平方位移，可以实时获取被测介质的时间依赖性黏弹性模量和蠕变柔量等参数。因此，荧光单颗粒示踪成为了生物学领域、生物力学领域以及流变学中一种非常重要的显微测量方法。单颗粒示踪方法在诞生之初只是获取样品中颗粒探针的平面二维位移或三维位移投影在二维平面上的轨迹信息，欠缺颗粒探针在纵轴方向上的位移信息，无法实现颗粒探针轨迹的真正完整分析。在所有荧光单颗粒的三维示踪方法中，从光学系统实现难易程度以及荧光颗粒轨迹测量准确性角度综合考虑，基于像散成像的荧光单颗粒示踪是一种具有较为良好整体性能的荧光单颗粒的三维示踪方法。

在使用一般显微放大镜实现单颗粒示踪时，根据离焦弥散效应，探针颗粒成像光斑离焦程度越大，光斑弥散半径越大，根据此效应通过建立成像光斑弥散半径与颗粒探针纵向位置的函数关系，实现颗粒探针包含纵向位移测量的三维轨迹示踪。但是该方法的纵向位移测量误差较大，特别是在焦点附近的纵向位移测量误差较大。为此，研究人员在物镜后面间加上一个散光的柱面透镜 （见SCI期刊：Tracking of Single FluorescentParticles in Three Dimensions: Use of Cylindrical Optics to Encode ParticlePosition [J], Biophysical Journal, 1994, 67: 1291–1300;Nanometric three-dimensional tracking of individual quantum dots in cells [J], Applied PhysicsLetters, 2007, 90(5): 053902-053902-3），通过像散原理，使光斑椭圆化，增大纵向位移时光斑变化的差异性，改善纵向位移测量误差，从而实现了基于像散成像的荧光单颗粒示踪方法。

对于基于像散成像的荧光单颗粒示踪，因为所要测量的样品不同，所以需要选用不同种类或粒径的荧光颗粒探针，为实现荧光颗粒准确示踪，因此需要根据所选用荧光颗粒确定不同的显微放大倍数以达到所选用荧光颗粒最佳显微成像的目的；除了放大倍数因素影响荧光颗粒准确示踪外，另一个影响荧光单颗粒准确示踪的因素是显微成像元件的共光轴度，只有保证显微成像光学元件的共光轴才能得到准确的光斑成像，从而实现荧光颗粒的准确示踪。

发明内容

针对上述基于像散成像的荧光单颗粒示踪中显微放大倍数如何确定和显微成像光学元件共光轴度如何实现的问题，本发明提出和研发具有共光轴度和放大倍数可自校准功能的像散成像式荧光单颗粒变倍示踪方法与装置，该发明实现了像散成像的荧光单颗粒示踪中显微放大倍数和显微成像光学元件共光轴度的确定和校准。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种共光轴度和放大倍数可自校准的荧光颗粒示踪方法，该方法步骤如下：

（1）激光扩束器将光纤准直头出射的输出光束调节为一极细光束，并且使该输出光束不与任何元件发生光学作用，直接入射进双光斑光束向量测量单元中，通过该输出光束在双光斑光束向量测量单元中两个光斑位置探测器上被检测得到的光斑，得到输出光束在双光斑光束向量测量单元所决定坐标系中的方向向量 (见SCI期刊： Compensation oferrors due to incident beam drift in a 3 DOF measurement system for linearguide motion. Optics Express, 2015, 23(22): 28389-28401;Parameter correctionmethod for dual position sensitive detector based unit. Applied Optics, 2016,55(15): 4073-4078.)；

（2）在显微光路纵向位移平台上纵向移动CCD水平位移台到达某纵向位置后，再在CCD水平位移台上水平位移CCD姿态调节架，使输出光束透射CCD姿态平面镜块，因为CCD姿态平面镜块的平面法线与的感光接收面法线平行，所以，如果输出光束与CCD姿态平面镜块的平面法线不平行，即如果输出光束与CCD的感光接收面不垂直，输出光束将发生平移变化，即输出光束在双光斑光束向量测量单元中两个光斑位置探测器上被检测得到的光斑发生平移变化Δ_CCD，在已知CCD姿态平面镜块厚度d_CCD条件下，根据光束经平面镜块透射后入射光束与出射光束的空间平移关系，可得输出光束与CCD姿态平面镜块平面法线俯仰夹角或偏摆夹角θ_CCD与Δ_CCD的关系式为Δ_CCD = sin(θ_CCD – θ) ×( d_CCD/ cosθ)，其中，n_a和n分别为空气折射率和平面镜块折射率，θ为θ_CCD对应的折射角，再根据折射率公式sinθ_CCD×n_a =sinθ×n ，得关于sinθ_CCD一元三次方程2×d_CCD×Δ_CCD× n_a ² ×sin³θ_CCD + sin²θ_CCD×(d² _CCD×n² - n_a ²×Δ² _CCD - d² _CCD×n_a ²) - 2×d_CCD×θ_CCD× n² ×sinθ_CCD +Δ² _CCD× n² = 0，解此方程，并通过θ_CCD为锐角这一条件舍去不符合实际的方程解后从而得到θ_CCD值，根据θ_CCD值用CCD姿态调节架调节CCD姿态，回位产生的光斑平移量Δ_CCD，即使输出光束与CCD的感光接收面垂直；

（3）在显微光路纵向位移平台上纵向移动柱面透镜水平位移台到达CCD下方某位置处，再在柱面透镜水平位移台上水平位移柱面透镜姿态调节架，使透射过CCD姿态平面镜块的输出光束透射柱面透镜姿态平面镜块，如果输出光束不与柱面透镜姿态平面镜块垂直，输出光束在双光斑光束向量测量单元中测量得到的光斑平移量为Δ_柱面，根据折射率公式，在已知柱面透镜姿态平面镜块厚度d_柱面 条件下，将步骤（2）的一元三次方程中Δ_CCD替换为Δ_柱面，d_CCD替换为d_柱面，θ_CCD替换为输出光束相对柱面透镜姿态平面镜块平面法线俯仰夹角或偏摆夹角θ_柱面，然后对其求解θ_柱面 值，根据θ_柱面 值用柱面透镜姿态调节架调节柱面透镜姿态，回位光斑平移量Δ_柱面，使输出光束与柱面透镜姿态平面镜块垂直，即使输出光束与柱面透镜底部平面垂直；

（4）在显微物镜水平位移台上水平平移显微物镜姿态调节架，使显微物镜处于柱面透镜下方，并使透射过柱面透镜姿态平面镜块的输出光束透射显微物镜姿态平面镜块，如果输出光束不与显微物镜姿态平面镜块垂直，输出光束在双光斑光束向量测量单元中测量得到的光斑平移量为Δ_物镜，根据折射率公式，在已知显微物镜姿态平面镜块厚度d_物镜 条件下，将步骤（2）的一元三次方程中Δ_CCD替换为Δ_物镜，d_CCD替换为d_物镜，θ_CCD替换为输出光束相对显微物镜姿态平面镜块平面法线俯仰夹角或偏摆夹角θ_物镜，然后对其求解θ_物镜 值，根据θ_物镜值用显微物镜姿态调节架调节显微物镜姿态，回位产生的光斑平移量Δ_物镜，使输出光束与显微物镜姿态平面镜块垂直，即使输出光束与显微物镜的光轴平行；

（5）通过六维精密位移台平移载物板，使其处于显微物镜下方，并使透射过显微物镜姿态平面镜块的输出光束透射载物板姿态平面镜块，如果输出光束不与载物板姿态平面镜块垂直，输出光束在双光斑光束向量测量单元中测量得到的光斑平移量为Δ_载物，根据折射率公式，在已知载物板姿态平面镜块厚度d_载物条件下，将步骤（2）的一元三次方程中Δ_CCD替换为Δ_载物，d_CCD替换为d_载物，θ_CCD替换为输出光束相对载物板姿态平面镜块平面法线俯仰夹角或偏摆夹角θ_载物，然后对其求解θ_载物 值，根据θ_载物 值用六维精密位移台调节载物板姿态，回位产生的光斑平移量Δ_载物，使输出光束与载物板姿态平面镜块垂直，即使输出光束与载物板平面法线平行；

（6）通过六维精密位移台使载物板姿态平面镜块绕其Y坐标轴偏摆微小角度α和绕其X坐标轴俯仰微小角度β，分别使输出光束产生方向向量不变的空间平移，输出光束在双光斑光束向量测量单元中分别可测量得到沿X坐标轴和Y坐标轴方向光斑平移量为Δ_{微小_α}和Δ_{微小_β}，输出光束经双光斑光束向量测量单元反射分光后的透射光束经载物板的光通孔、显微物镜和柱面透镜后，入射到CCD的感光接收面，因为通过上述（2）至（4）步骤后柱面透镜与显微物镜实现了显微成像共光轴，并且该光轴与CCD的感光接收面垂直，所以由CCD可以测得光斑平移量Δ_{微小_α}和Δ_{微小_β}分别对应的平移放大值为Δ_{微小_α_放大}和Δ_{微小_β_放大}，所以可得所搭建的光学系统装置沿X坐标轴和Y坐标轴方向显微放大倍数分别为Δ_{微小_α_放大}/ Δ_{微小_α}和Δ_{微小_β_放大} /Δ_{微小_β}；

（7）通过六维精密位移台回位载物板姿态平面镜块在步骤（6）中产生的偏摆微小角度α和俯仰微小角度β，使输出光束与载物板平面法线重新平行，通过激光扩束器将输出光束调节为光斑较大的光束，使之可容易实现荧光颗粒的荧光激发；

（8）在载物板上平面光通孔位置放置含有荧光颗粒样品，并放置折光镜组使输出光束经双光斑光束向量测量单元反射分光后的透射光束侧方入射荧光颗粒样品，激发荧光颗粒发出荧光，输出光束不与显微物镜、柱面透镜和CCD发生光学作用，至此可在所搭建的光学系统装置上进行X坐标轴和Y坐标轴方向显微放大倍数分别为Δ_{微小_α_放大}/ Δ_{微小_α}和Δ_{微小_β_放大}/Δ_{微小_β}的共光轴显微荧光颗粒轨迹测量；

（9）柱面透镜和CCD可移动至显微光路纵向位移平台上不同的纵向位置，在显微物镜支架上固定的显微物镜也可为不同放大倍数，重复上述（1）至（8）步骤，便可实现不同放大倍数下的共光轴显微荧光颗粒轨迹测量。

一种共光轴度和放大倍数可自校准的荧光颗粒示踪装置，激光光源的激发光束经光纤传导由光纤准直头输出，其输出光束经过激光扩束器，并由激光扩束器输出；该输出光束从上到下依次透射CCD姿态平面镜块、柱面透镜姿态平面镜块、显微物镜姿态平面镜块、和载物板姿态平面镜块后入射进双光斑光束向量测量单元；CCD姿态平面镜块平面法线与CCD的感光接收面的法线平行，并且CCD姿态平面镜块与CCD组成位置固定的整体，CCD固定在CCD姿态调节架上，CCD姿态调节架可调节CCD的俯仰和偏摆姿态，CCD姿态调节架固定在CCD水平位移台上；柱面透镜姿态平面镜块平面法线与柱面透镜底部平面法线平行，并且柱面透镜姿态平面镜块与柱面透镜组成位置固定的整体，柱面透镜固定在柱面透镜姿态调节架上，柱面透镜姿态调节架可调节柱面透镜的俯仰和偏摆姿态，柱面透镜姿态调节架固定在柱面透镜水平位移台上；CCD水平位移台和柱面透镜水平位移台都固定在显微光路纵向位移平台上；显微物镜姿态平面镜块平面法线与显微物镜支架上所固定的显微物镜的光轴平行，并且显微物镜姿态平面镜块与显微物镜支架组成位置固定的整体，显微物镜支架固定在显微物镜姿态调节架上，显微物镜姿态调节架可调节显微物镜俯仰和偏摆姿态，显微物镜姿态调节架固定在显微物镜水平位移台上；载物板姿态平面镜块平面法线与载物板平面法线平行，并且载物板姿态平面镜块与载物板组成位置固定的整体，载物板固定在六维精密位移台上；双光斑光束向量测量单元中的两个光斑位置探测器可检测到输出光束在其中反射分光后反射光束的光斑；输出光束经双光斑光束向量测量单元反射分光后的透射光束入射进载物板的光通孔，并依次透射显微物镜和柱面透镜后，入射到CCD的感光接收面；在测量含有荧光颗粒样品时，在含有荧光颗粒样品旁固定折光镜组使输出光束经双光斑光束向量测量单元反射分光后的透射光束侧方入射荧光颗粒样品。

本发明具有以下特点及良好效果：

该发明实现了基于像散成像的荧光单颗粒示踪中显微放大倍数和显微成像光学元件共光轴度的确定和校准，为保证荧光单颗粒示踪的测量准确性提供必要技术手段，并为研究不同放大倍数和共光轴度情况对像散成像式荧光单颗粒示踪的影响做出必要的技术铺垫。

附图说明

图1为共光轴度和放大倍数可自校准的荧光颗粒示踪装置结构图；

图2为光束经平面镜块透射后入射光束与出射光束的空间平移关系示意图；

图中：1激光光源、2光纤、3光纤准直头、4输出光束、5激光扩束器、6 CCD姿态平面镜块、7柱面透镜姿态平面镜块、8显微物镜姿态平面镜块、9载物板姿态平面镜块、10双光斑光束向量测量单元、11 CCD、12 CCD姿态调节架、13 CCD水平位移台、14 柱面透镜、15柱面透镜姿态调节架、16柱面透镜水平位移台、17显微光路纵向位移平台、18显微物镜支架、19显微物镜、20显微物镜姿态调节架、21显微物镜水平位移台、22载物板、23六维精密位移台、24光通孔、25荧光颗粒样品、26折光镜组。

具体实施方式

下面结合附图对本发明具体实施例作进一步详细描述。

一种共光轴度和放大倍数可自校准的荧光颗粒示踪装置，激光光源1的激发光束经光纤2传导由光纤准直头3输出，其输出光束4经过激光扩束器5，并由激光扩束器5输出；该输出光束4从上到下依次透射CCD姿态平面镜块6、柱面透镜姿态平面镜块7、显微物镜姿态平面镜块8、和载物板姿态平面镜块9后入射进双光斑光束向量测量单元10；CCD姿态平面镜块6平面法线与CCD11的感光接收面的法线平行，并且CCD姿态平面镜块6与CCD11组成位置固定的整体，CCD11固定在CCD姿态调节架12上，CCD姿态调节架12可调节CCD11的俯仰和偏摆姿态，CCD姿态调节架12固定在CCD水平位移台13上；柱面透镜姿态平面镜块7平面法线与柱面透镜14底部平面法线平行，并且柱面透镜姿态平面镜块7与柱面透镜14组成位置固定的整体，柱面透镜14固定在柱面透镜姿态调节架15上，柱面透镜姿态调节架15可调节柱面透镜14的俯仰和偏摆姿态，柱面透镜姿态调节架15固定在柱面透镜水平位移台16上；CCD水平位移台13和柱面透镜水平位移台16都固定在显微光路纵向位移平台17上；显微物镜姿态平面镜块8平面法线与显微物镜支架18上所固定的显微物镜19的光轴平行，并且显微物镜姿态平面镜块8与显微物镜支架18组成位置固定的整体，显微物镜支架18固定在显微物镜姿态调节架20上，显微物镜姿态调节架20可调节显微物镜19俯仰和偏摆姿态，显微物镜姿态调节架20固定在显微物镜水平位移台21上；载物板姿态平面镜块9平面法线与载物板22平面法线平行，并且载物板姿态平面镜块9与载物板22组成位置固定的整体，载物板22固定在六维精密位移台23上；双光斑光束向量测量单元10中的两个光斑位置探测器可检测到输出光束4在其中反射分光后反射光束的光斑；输出光束4经双光斑光束向量测量单元12反射分光后的透射光束入射进载物板22的光通孔24，并依次透射显微物镜19和柱面透镜14后，入射到CCD11的感光接收面；在测量含有荧光颗粒样品25时，在含有荧光颗粒样品25旁固定折光镜组26使输出光束4经双光斑光束向量测量单元12反射分光后的透射光束侧方入射荧光颗粒样品25。

所述的显微物镜19可以为任意放大倍数或结构的显微物镜。

所述的折光镜组26可以为任意光学元件构成的折光镜组。

一种共光轴度和放大倍数可自校准的荧光颗粒示踪方法，该方法步骤如下：

（1）激光扩束器5将光纤准直头3出射的输出光束4调节为一极细光束，并且使该输出光束4不与任何元件发生光学作用，直接入射进双光斑光束向量测量单元10中，通过该输出光束4在双光斑光束向量测量单元10中两个光斑位置探测器上被检测得到的光斑，得到输出光束4在双光斑光束向量测量单元10所决定坐标系中的方向向量 (见SCI期刊：Compensation of errors due to incident beam drift in a 3 DOF measurementsystem for linear guide motion. Optics Express, 2015, 23(22): 28389-28401;Parameter correction method for dual position sensitive detector based unit.Applied Optics, 2016, 55(15): 4073-4078.) ；

（2）在显微光路纵向位移平台17上纵向移动CCD水平位移台13到达某纵向位置后，再在CCD水平位移台13上水平位移CCD姿态调节架12，使输出光束4透射CCD姿态平面镜块6，因为CCD姿态平面镜块6的平面法线与CCD11的感光接收面法线平行，所以，如果输出光束4与CCD姿态平面镜块6的平面法线不平行，即如果输出光束4与CCD11的感光接收面不垂直，输出光束4将发生平移变化，即输出光束4在双光斑光束向量测量单元10中两个光斑位置探测器上被检测得到的光斑将发生平移变化量Δ_CCD，在已知CCD姿态平面镜块6厚度d_CCD条件下，根据光束经平面镜块透射后入射光束与出射光束的空间平移关系（附图2所示），可得输出光束4与CCD姿态平面镜块6平面法线俯仰夹角或偏摆夹角θ_CCD与Δ_CCD关系式为Δ_CCD = sin(θ_CCD –θ) ×( d_CCD/ cosθ),其中n_a和n分别为空气折射率和平面镜块折射率，θ为θ_CCD对应折射角，再根据折射率公式sinθ_CCD×n_a = sinθ×n ，得关于sinθCCD一元三次方程2×d_CCD×Δ_CCD×n_a ² ×sin³θ_CCD + sin²θ_CCD×(d² _CCD×n² - n_a ²×Δ² _CCD - d² _CCD×n_a ²) - 2×d_CCD×θ_CCD× n²×sinθ_CCD +Δ² _CCD× n² = 0，解此方程，并通过θ_CCD为锐角这一条件舍去不符合实际的方程解后从而得到θ_CCD值，根据θ_CCD值用CCD姿态调节架12调节CCD 11姿态，回位产生的光斑平移量Δ_CCD，即使输出光束4与CCD11的感光接收面垂直；

（3）在显微光路纵向位移平台17上纵向移动柱面透镜水平位移台16到达CCD11下方某位置处，再在柱面透镜水平位移台6上水平位移柱面透镜姿态调节架15，使透射过CCD姿态平面镜块6的输出光束4透射柱面透镜姿态平面镜块7，如果输出光束4不与柱面透镜姿态平面镜块7垂直，输出光束4在双光斑光束向量测量单元10中测量得到的光斑平移量为Δ_柱面，根据折射率公式，在已知柱面透镜姿态平面镜块7厚度d_柱面 条件下，将步骤（2）的一元三次方程中Δ_CCD替换为Δ_柱面，d_CCD替换为d_柱面，θ_CCD 替换为输出光束4相对柱面透镜姿态平面镜块7平面法线俯仰夹角或偏摆夹角θ_柱面，然后对其求解θ_柱面 值，根据θ_柱面 值用柱面透镜姿态调节架15调节柱面透镜14姿态，回位光斑平移量Δ_柱面，使输出光束4与柱面透镜姿态平面镜块7垂直，即使输出光束4与柱面透镜14底部平面垂直；

（4）在显微物镜水平位移台21上水平平移显微物镜姿态调节架20，使显微物镜19处于柱面透镜14下方，并使透射过柱面透镜姿态平面镜块7的输出光束4透射显微物镜姿态平面镜块8，如果输出光束4不与显微物镜姿态平面镜块8垂直，输出光束4在双光斑光束向量测量单元10中测量得到的光斑平移量为Δ_物镜，根据折射率公式，在已知显微物镜姿态平面镜块8厚度d_物镜条件下，将步骤（2）的一元三次方程中Δ_CCD替换为Δ_物镜，d_CCD替换为d_物镜，θ_CCD替换为输出光束4相对显微物镜姿态平面镜块8平面法线俯仰夹角或偏摆夹角θ_物镜，然后对其求解θ_物镜 值，根据θ_物镜 值用显微物镜姿态调节架20调节显微物镜19姿态，回位产生的光斑平移量Δ_物镜，使输出光束4与显微物镜姿态平面镜块8垂直，即使输出光束4与显微物镜19的光轴平行；

（5）通过六维精密位移台23平移载物板22，使其处于显微物镜19下方，并使透射过显微物镜姿态平面镜块8的输出光束4透射载物板姿态平面镜块9，如果输出光束4不与载物板姿态平面镜块9垂直，输出光束4在双光斑光束向量测量单元10中测量得到的光斑平移量为Δ_载物，根据折射率公式，在已知载物板姿态平面镜块9厚度d_载物 条件下，将步骤（2） 的一元三次方程中Δ_CCD替换为Δ_载物，d_CCD替换为d_载物，θ_CCD替换为输出光束4相对载物板姿态平面镜块9平面法线俯仰夹角或偏摆夹角θ_载物，便可解得θ_载物 值，根据θ_载物 值用六维精密位移台23调节载物板22姿态，回位产生的光斑平移量Δ_载物，使输出光束4与载物板姿态平面镜块9垂直，即使输出光束4与载物板22平面法线平行；

（6）通过六维精密位移台23使载物板姿态平面镜块9绕其Y坐标轴偏摆微小角度α和绕其X坐标轴俯仰微小角度β，分别使输出光束4产生方向向量不变的空间平移，输出光束4在双光斑光束向量测量单元中分别可测量得到沿X坐标轴和Y坐标轴方向光斑平移量为Δ_{微小_α}和Δ_{微小_β}，输出光束4经双光斑光束向量测量单元10反射分光后的透射光束经载物板22的光通孔24、显微物镜19和柱面透镜14后，入射到CCD11的感光接收面，因为通过上述（2）至（4）步骤后柱面透镜14与显微物镜19实现了显微成像共光轴，并且该光轴与CCD11的感光接收面垂直，所以由CCD11可以测得光斑平移量Δ_{微小_α}和Δ_{微小_β}分别对应的平移放大值为Δ_{微小_α_放大}和Δ_{微小_β_放大}，所以可得所搭建的光学系统装置沿X坐标轴和Y坐标轴方向显微放大倍数分别为Δ_{微小_α_放大}/ Δ_{微小_α}和Δ_{微小_β_放大} /Δ_{微小_β}；

（7）通过六维精密位移台23回位载物板姿态平面镜块9在步骤（6）中产生的偏摆微小角度α和俯仰微小角度β，使输出光束4与载物板22平面法线重新平行，通过激光扩束器5将输出光束4调节为光斑较大的光束，使之可容易实现荧光颗粒的荧光激发；

（8）在载物板22上平面光通孔24位置放置含有荧光颗粒样品25，并放置折光镜组26使输出光束4经双光斑光束向量测量单元10反射分光后的透射光束侧方入射荧光颗粒样品25，激发荧光颗粒发出荧光，输出光束4不与显微物镜19、柱面透镜14和CCD11发生光学作用，至此可在所搭建的光学系统装置上进行X坐标轴和Y坐标轴方向显微放大倍数分别为Δ_{微小_α_放大}/ Δ_{微小_α}和Δ_{微小_β_放大} /Δ_{微小_β}的共光轴显微荧光颗粒轨迹测量；

（9）柱面透镜14和CCD11可移动至显微光路纵向位移平台17上不同的纵向位置，在显微物镜支架18上固定的显微物镜19也可为不同放大倍数，重复上述（1）至（8）步骤，便可实现不同放大倍数下的共光轴显微荧光颗粒轨迹测量。

Claims (4)

1.一种共光轴度和放大倍数可自校准的荧光颗粒示踪方法，其特征在于该方法步骤如下：

（1）激光扩束器将光纤准直头出射的输出光束调节为一极细光束，并且使该输出光束不与任何元件发生光学作用，直接入射进双光斑光束向量测量单元中，通过该输出光束在双光斑光束向量测量单元中两个光斑位置探测器上被检测得到的光斑，得到输出光束在双光斑光束向量测量单元所决定坐标系中的方向向量；

（2）在显微光路纵向位移平台上纵向移动CCD水平位移台到达某纵向位置后，再在CCD水平位移台上水平位移CCD姿态调节架，使输出光束透射CCD姿态平面镜块，因为CCD姿态平面镜块的平面法线与的感光接收面法线平行，所以，如果输出光束与CCD姿态平面镜块的平面法线不平行，即如果输出光束与CCD的感光接收面不垂直，输出光束将发生平移变化，即输出光束在双光斑光束向量测量单元中两个光斑位置探测器上被检测得到的光斑发生平移变化Δ_CCD，在已知CCD姿态平面镜块厚度d_CCD条件下，根据光束经平面镜块透射后入射光束与出射光束的空间平移关系，可得输出光束与CCD姿态平面镜块平面法线俯仰夹角或偏摆夹角θ_CCD与Δ_CCD的关系式为Δ_CCD = sin(θ_CCD – θ) ×( d_CCD/ cosθ)，其中，n_a和n分别为空气折射率和平面镜块折射率，θ为θ_CCD对应的折射角，再根据折射率公式sinθ_CCD×n_a =sinθ×n ，得关于sinθ_CCD一元三次方程2×d_CCD×Δ_CCD× n_a ² ×sin³θ_CCD + sin²θ_CCD×(d² _CCD×n² - n_a ²×Δ² _CCD - d² _CCD×n_a ²) - 2×d_CCD×θ_CCD× n² ×sinθ_CCD +Δ² _CCD× n² = 0，解此方程，并通过θ_CCD为锐角这一条件舍去不符合实际的方程解后从而得到θ_CCD值，根据θ_CCD值用CCD姿态调节架调节CCD姿态，回位产生的光斑平移量Δ_CCD，即使输出光束与CCD的感光接收面垂直；

（3）在显微光路纵向位移平台上纵向移动柱面透镜水平位移台到达CCD下方某位置处，再在柱面透镜水平位移台上水平位移柱面透镜姿态调节架，使透射过CCD姿态平面镜块的输出光束透射柱面透镜姿态平面镜块，如果输出光束不与柱面透镜姿态平面镜块垂直，输出光束在双光斑光束向量测量单元中测量得到的光斑平移量为Δ_柱面，根据折射率公式，在已知柱面透镜姿态平面镜块厚度d_柱面 条件下，将步骤（2）的一元三次方程中Δ_CCD替换为Δ_柱面，d_CCD替换为d_柱面，θ_CCD替换为输出光束相对柱面透镜姿态平面镜块平面法线俯仰夹角或偏摆夹角θ_柱面，然后对其求解θ_柱面 值，根据θ_柱面 值用柱面透镜姿态调节架调节柱面透镜姿态，回位光斑平移量Δ_柱面，使输出光束与柱面透镜姿态平面镜块垂直，即使输出光束与柱面透镜底部平面垂直；

（4）在显微物镜水平位移台上水平平移显微物镜姿态调节架，使显微物镜处于柱面透镜下方，并使透射过柱面透镜姿态平面镜块的输出光束透射显微物镜姿态平面镜块，如果输出光束不与显微物镜姿态平面镜块垂直，输出光束在双光斑光束向量测量单元中测量得到的光斑平移量为Δ_物镜，根据折射率公式，在已知显微物镜姿态平面镜块厚度d_物镜 条件下，将步骤（2）的一元三次方程中Δ_CCD替换为Δ_物镜，d_CCD替换为d_物镜，θ_CCD替换为输出光束相对显微物镜姿态平面镜块平面法线俯仰夹角或偏摆夹角θ_物镜，然后对其求解θ_物镜 值，根据θ_物镜值用显微物镜姿态调节架调节显微物镜姿态，回位产生的光斑平移量Δ_物镜，使输出光束与显微物镜姿态平面镜块垂直，即使输出光束与显微物镜的光轴平行；

（5）通过六维精密位移台平移载物板，使其处于显微物镜下方，并使透射过显微物镜姿态平面镜块的输出光束透射载物板姿态平面镜块，如果输出光束不与载物板姿态平面镜块垂直，输出光束在双光斑光束向量测量单元中测量得到的光斑平移量为Δ_载物，根据折射率公式，在已知载物板姿态平面镜块厚度d_载物 条件下，将步骤（2）的一元三次方程中Δ_CCD替换为Δ_载物，d_CCD替换为d_载物，θ_CCD替换为输出光束相对载物板姿态平面镜块平面法线俯仰夹角或偏摆夹角θ_载物，然后对其求解θ_载物 值，根据θ_载物 值用六维精密位移台调节载物板姿态，回位产生的光斑平移量Δ_载物，使输出光束与载物板姿态平面镜块垂直，即使输出光束与载物板平面法线平行；

（6）通过六维精密位移台使载物板姿态平面镜块绕其Y坐标轴偏摆微小角度α和绕其X坐标轴俯仰微小角度β，分别使输出光束产生方向向量不变的空间平移，输出光束在双光斑光束向量测量单元中分别可测量得到沿X坐标轴和Y坐标轴方向光斑平移量为Δ_{微小_α}和Δ_{微小_β}，输出光束经双光斑光束向量测量单元反射分光后的透射光束经载物板的光通孔、显微物镜和柱面透镜后，入射到CCD的感光接收面，因为通过上述（2）至（4）步骤后柱面透镜与显微物镜实现了显微成像共光轴，并且该光轴与CCD的感光接收面垂直，所以由CCD可以测得光斑平移量Δ_{微小_α}和Δ_{微小_β}分别对应的平移放大值为Δ_{微小_α_放大}和Δ_{微小_β_放大}，所以可得所搭建的光学系统装置沿X坐标轴和Y坐标轴方向显微放大倍数分别为Δ_{微小_α_放大} / Δ_{微小_α}和Δ_{微小_β_放大} /Δ_{微小_β}；

（7）通过六维精密位移台回位载物板姿态平面镜块在步骤（6）中产生的偏摆微小角度α和俯仰微小角度β，使输出光束与载物板平面法线重新平行，通过激光扩束器将输出光束调节为光斑较大的光束，使之可容易实现荧光颗粒的荧光激发；

（8）在载物板上平面光通孔位置放置含有荧光颗粒样品，并放置折光镜组使输出光束经双光斑光束向量测量单元反射分光后的透射光束侧方入射荧光颗粒样品，激发荧光颗粒发出荧光，输出光束不与显微物镜、柱面透镜和CCD发生光学作用，至此可在所搭建的光学系统装置上进行X坐标轴和Y坐标轴方向显微放大倍数分别为Δ_{微小_α_放大}/ Δ_{微小_α}和Δ_{微小_β_放大}/Δ_{微小_β}的共光轴显微荧光颗粒轨迹测量；

（9）柱面透镜和CCD可移动至显微光路纵向位移平台上不同的纵向位置，在显微物镜支架上固定的显微物镜也可为不同放大倍数，重复上述（1）至（8）步骤，便可实现不同放大倍数下的共光轴显微荧光颗粒轨迹测量。

2.一种共光轴度和放大倍数可自校准的荧光颗粒示踪装置，激光光源（1）的激发光束经光纤（2）传导由光纤准直头（3）输出，其输出光束（4）经过激光扩束器（5），并由激光扩束器（5）输出；其特征在于该输出光束（4）从上到下依次透射CCD姿态平面镜块（6）、柱面透镜姿态平面镜块（7）、显微物镜姿态平面镜块（8）、和载物板姿态平面镜块（9）后入射进双光斑光束向量测量单元（10）；CCD姿态平面镜块（6）平面法线与CCD（11）的感光接收面的法线平行，并且CCD姿态平面镜块（6）与CCD（11）组成位置固定的整体，CCD（11）固定在CCD姿态调节架（12）上，CCD姿态调节架（12）可调节CCD（11）的俯仰和偏摆姿态，CCD姿态调节架（12）固定在CCD水平位移台（13）上；柱面透镜姿态平面镜块（7）平面法线与柱面透镜（14）底部平面法线平行，并且柱面透镜姿态平面镜块（7）与柱面透镜（14）组成位置固定的整体，柱面透镜（14）固定在柱面透镜姿态调节架（15）上，柱面透镜姿态调节架（15）可调节柱面透镜（14）的俯仰和偏摆姿态，柱面透镜姿态调节架（15）固定在柱面透镜水平位移台（16）上；CCD水平位移台（13）和柱面透镜水平位移台（16）都固定在显微光路纵向位移平台（17）上；显微物镜姿态平面镜块（8）平面法线与显微物镜支架（18）上所固定的显微物镜（19）的光轴平行，并且显微物镜姿态平面镜块（8）与显微物镜支架（18）组成位置固定的整体，显微物镜支架（18）固定在显微物镜姿态调节架（20）上，显微物镜姿态调节架（20）可调节显微物镜（19）俯仰和偏摆姿态，显微物镜姿态调节架（20）固定在显微物镜水平位移台（21）上；载物板姿态平面镜块（9）平面法线与载物板（22）平面法线平行，并且载物板姿态平面镜块（9）与载物板（22）组成位置固定的整体，载物板（22）固定在六维精密位移台（23）上；双光斑光束向量测量单元（10）中的两个光斑位置探测器可检测到输出光束（4）在其中反射分光后反射光束的光斑；输出光束（4）经双光斑光束向量测量单元（12）反射分光后的透射光束入射进载物板（22）的光通孔（24），并依次透射显微物镜（19）和柱面透镜（14）后，入射到CCD（11）的感光接收面；在测量含有荧光颗粒样品（25）时，在含有荧光颗粒样品（25）旁固定折光镜组（26）使输出光束（4）经双光斑光束向量测量单元（12）反射分光后的透射光束侧方入射荧光颗粒样品（25）。

3.根据权利要求2所述的共光轴度和放大倍数可自校准的荧光颗粒示踪装置，其特征在于所述的显微物镜（19）可以为任意放大倍数或结构的显微物镜。

4.根据权利要求2所述的共光轴度和放大倍数可自校准的荧光颗粒示踪装置，其特征在于所述的折光镜组（26）可以为任意光学元件构成的折光镜组。