CN103148800B - 一种基于光场传播的非标记三维显微方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于光场传播的非标记三维显微方法，包括以下几个步骤：1)将激光光束聚焦后投射到待测样品上，并利用显微物镜收集带有样品信息的激光光束；2)将带有样品信息的激光光束分成第一光束和第二光束，并通过第一图像传感器和第二图像传感器分别采集第一光束和第二光束的光强信息图像；3)改变激光光束入射到待测样品上的角度，对待测样品进行扫描，并利用显微镜收集带有样品信息的激光光束，然后重复步骤2)；4)通过计算机对所述的光强信息图像进行计算分析得到相应的相位迟滞分布图，然后采用三维重构算法得到三维图像。本发明还公开了一种基于光场传播的非标记三维显微装置。
Description
技术领域
本发明属于光学超分辨显微领域，尤其涉及一种基于光场传播的非标记三维显微方法和装置。
背景技术
随着科学技术的发展，人们不断追求越来越小的尺寸结构和越来越高的分辨能力，特别是在微电子、航空航天、纳米加工、生命科学和材料工程等领域，对微小尺度结构的要求日益迫。透过式干涉相位显微技术的发展，为非标记条件下的显微成像提供了支持。
由于样品与周围环境的折射率不同，光在透射样品玻片过程中光的相位会受到样品的调制，从而携带样品的折射率和厚度信息，通过与参考光干涉的方法得到样品折射率分布图。2007年，WonshikChoi首次提出层析相位显微镜，即通过改变透射光角度，得到一系列角度相关的折射率分布图，通过适当的算法实现三维重构，实现更高精度的三维样品图。2011年他们对光路进行了修改，在牺牲一定程度分辨率的情况下，实现了。他们在2008年申请了相关专利，为实现生物样品实时测量提供了保证，促进了光学干涉相位成像进入一个崭新的发展阶段。
干涉相位显微术具有较高的高分辨率，在横向方向的分辨率约为0.8μm，纵向方向约为1μm。显微镜的高分辨率不仅仅是由于光的衍射极限限制，样品的不均匀性也是影响分辨率的重要因素。通过改变照明角度的方法，重构三维图像，能够明显的提高干涉相位显微镜的分辨能力，如果采用拍频干涉法的话分辨率可以做到横向0.5μm，纵向0.75μm，采用直接干涉的方法可以得到横向0.6μm，纵向0.8μm的分辨率。很大程度上提高了干涉相位显微镜的分辨能力。
通过角度扫描的方法来实现三维重构，由于要实现大范围角度遍历，成像速度较慢，不适合生物活动样品的观察。而且在已有的层析相位显微镜的光路中参考光路和样品光路的不重合，这样会引入一定的环境误差，不利于分辨率的继续提高，同时，目前的层析相位显微镜仅仅局限于一维扫描，这对分辨率的提高也存在着一定限制。
因此，必须提出一种新的层析相位方法，来实现较高的成像速度和共路测量，并且要实现二维扫描的便宜性。
发明内容
本发明提供了一种基于光场传播的非标记三维显微方法和装置，通过对光场传播技术来实现相位检测，有效提高了系统的成像速率。本发明结构简单，可以实现共路测量，很大程度上减少环境因素的影响，可用于非标记生物样品的高精度检测、测量等领域。
一种基于光场传播的非标记三维显微方法，包括以下几个步骤：
1)将激光光束聚焦后投射到待测样品上，并利用显微物镜收集带有样品信息的激光光束；
2)将带有样品信息的激光光束分成第一光束和第二光束，并通过第一图像传感器和第二图像传感器分别采集第一光束和第二光束的光强信息图像；
3)改变激光光束入射到待测样品上的角度，对待测样品进行扫描，并利用显微物镜收集带有样品信息的激光光束，然后重复步骤2)；
4)通过计算机对所述的光强信息图像进行计算分析得到相应的相位迟滞分布图，然后采用三维重构算法得到三维图像。
所述激光光束经滤波和准直后转换为平面波投射到待测样品上。激光光束经滤波和准直后得到高品质的平面波，能提供整个系统的成像分辨率。
所述显微物镜为数值孔径为1.4的浸油式显微物镜。待测样品需要滴油浸没以提高横向分辨率，显微物镜同样采用浸没式高数值孔径的型号，同时搭配与显微物镜配套的场镜。
所述第一光束和第二光束的光路相互垂直。
本发明还提供了一种基于光场传播的非标记三维显微装置，包括用于产生激光光束的光源，还包括：
沿所述激光光束光路依次布置扫描器、样品台、显微物镜和分光镜；
用于采集所述分光镜出射光束的光强信息图像的第一图像传感器和第二图像传感器；
以及与所述扫描器、第一图像传感器和第二图像传感器连接的计算机。
本发明所采用的扫描器为二维扫描振镜。
所述光源和扫描器之间设有沿所述激光光束光路依次布置的小孔光阑和准直透镜。小孔光阑用于对激光光束进行滤波，准直透镜用于对激光光束进行准直，激光光束经滤波、准直后能提高激光质量，得到高品质的平面波，能提升整个系统的分辨率。
所述扫描器和样品台之间设有沿所述激光光束光路依次布置的扫描透镜和会聚透镜。为了保证光线在角度变化时光线入射到待测样品上的位置不变，必须保证二维扫描振镜的反射中心在扫描透镜的前焦点处，待测样品放置在会聚透镜的后焦点处，且扫描透镜的后焦面与会聚透镜的前焦面重合。
所述的第一图像传感器和第二图像传感器分别为第一CCD和第二CCD，通过第一CCD和第二CCD分别采集第一光束和第二光束的光强信息图像。
本发明的样品台为三维移动平台，便于待测样品的放置，以及在观察前调整待测样品的位置。
本发明的工作原理如下：
激光器产生的激光经过小孔光阑和准直透镜最后得到面型平整的平面波，然后经过二维扫描振镜，扫描透镜，会聚透镜，然后以不同角度入射到待测样品上，透过样品的平面波经过显微物镜和场镜放大，照射到分光镜上，经过分光镜分光分别用两个位置固定的CCD垂直拍摄。
在角度α入射的情况下，假设A、B两个CCD得到的两个光强信息分别是IA＝I1(x，y)，IB＝I2(x，y)，其中x，y为图像中点的横竖坐标。对于光场传播就光波平面整体来看，属于一个低频信息，在整个光场传播中能够平行传递，但由于经过待测样品调制后的波面会有不同的相位延时，在波面上会包涵带有待测样品信息的高频信息，在光电传递过程中会有发散或会聚，由于A、B两个CCD的间距为Δz，IB＝f(IA，Δz)，通过IA＝I1(x，y)，IB＝I2(x，y)，dI＝IB-IA，其中IA、IB是两个CCD上的光强图信息，中其为梯度算子，I为波面光强分布，为波面相位分布，k为比例系数，dI和dz分别为两个CCD所成像的强度差和距离分光镜分光面的距离差。最后通过f函数得到图像的波前相位信息，由于照射到待测样品上的光是经过平整处理的平面波，所以波前相位信息可以量化反应待测样品的折射率分布，由于照明属于宽场照明，通过整个面上的相对比较可以得到待测样品折射率分布图该折射率分布图与入射角α相匹配，在正负60度锥角范围入射，每一度采样一次时，就可以得到的若干幅与角度相匹配的干涉图，通过拉东反变换得到对横向或者纵向分辨率有所侧重的3D图像。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
(1)实现了共路层析相位成像，能够更好的避免环境对成像效果的影响。
(2)横向分辨率显著提高，横向分辨率可以达到1μm以下；
(3)装置结构简洁，方便快速高精度调整，且不会产生相互干扰；
(4)降低了对CCD摄像速率的要求，能够更随意的根据样品选择成像速度。
附图说明
图1为本发明基于光场传播的非标记三维显微装置的结构示意图。
图2为本发明的水平方向扫描和垂直方向扫描时随着振镜从-α转动到+α过程中会聚透镜前焦面的光线入射点图。
图3为本发明的螺旋扫描时随着扫描振镜角度变化聚透镜前焦面上的光线入射点图。
具体实施方式
如图1所示，一种基于光场传播的非标记三维显微装置，包括光源1，聚焦镜2，小孔光阑3，准直透镜4，反射镜5，二维扫描振镜6，扫描透镜7，会聚透镜8，样品台9，显微物镜10，场镜11，分光镜12，CCD-A13，CCD-B14，计算机15。
其中，光源1发出激光光束，本实施例中的光源为氦氖激光器，聚焦镜2、小孔光阑3、准直透镜4、反射镜5，二维扫描振镜6，扫描透镜7，会聚透镜8，样品台9，显微物镜10，场镜11，分光镜12，依次设置在激光光束光路的光轴上。
CCD-A13、CCD-B14分别对应第一CCD和第二CCD，且CCD-A13、CCD-B14分别放在分光镜分出的两束激光的光轴上。小孔光阑3位于聚焦镜2的后焦点处，小孔光阑3位于准直透镜4的前焦点处，反射镜5调节俯仰角，使激光恰好打到二维扫描振镜6的反射中心，调整反射镜5角度，保证激光经反射后恰好能入射到二维扫描振镜7的反射中心。
二维扫描振镜6的反射中心位于扫描透镜7的前焦点处，会聚透镜8的前焦面与扫描透镜7的后焦面重合，为了保证激光光束在角度变化时入射到样品上的位置不变，必须保证二维扫描振镜6的反射中心在扫描透镜7的前焦点处，待测样品在会聚透镜8的后焦点处，扫描透镜7的后焦面与会聚透镜8的前焦面重合。同时为了实现角度的放大作用，扫描透镜7的焦距应该适当长一点，会聚透镜8应采用1.4数值孔径的会聚透镜。
会聚透镜8后焦点就是待测样品观察的中心，由于会聚透镜8的工作距离非常短，待测样品会夹在会聚透镜8和显微物镜10之间进行观察，同时需要滴油浸没以提高横向分辨率，显微物镜10同样采用浸没式高数值孔径的型号，同时搭配与显微物镜配套的场镜。样品台9距离会聚透镜的距离为工距离，显微物镜10通过浸油的方式直接与样品台9接触，场镜11放置在显微物镜10的适当距离。CCD-A13距离分光镜12分光面的距离固定，CCD-B14可通过滑动导轨调节，使CCD-B14与CCD-A13的距离接近，并精确可调。二维扫描振镜6和CCD-A13和CCD-B14分别与主控计算机相连，计算机15根据图像的获取情况决定二维扫描振镜6的扫描速度，并逐步完成待测样品扫描。
由于待测样品浸没在一种与待测样品折射率非常接近的介质内，所以待测样品对波前的调制，不会太剧烈。我们采用光场传播的方式测量波前相位，通过分光镜将光束分成两束分别用两个CCD对其进行成像，两个CCD必须正对光线入射方向，同时距离分光镜分光点的距离尽量近同时其差值必须恒定准确。
在光路搭建完成之后，通过计算机控制二维扫描振镜在水平方向上进行扫描，根据观察的精度和速度要求选择扫描范围和扫描频率，两个CCD同步拍摄，计算机获取图像后根据两个CCD上图像的强度变化，计算出波前信息，继而得出相位信息。对上述得到的相位信息进行相位展开，进而得出在该角度照明情况下相对应的折射率分布图，将一个扫描周期里所有的折射率分布图综合起来，通过三维重构算法得到三维图像。如果进行连续扫描可以通过局部替换的方式，即不需要每次成像的图都是当次扫描的图像，可以在上一轮扫描过程中取部分图像，与本次扫描的部分图像共同组成重构算法需要的所有角度图像，在计算机计算速度允许的情况下，克服振镜扫描速率限制，实现视频图像显示。
采用图1所示的装置实现在一维扫描条件下实现基于光场传播的非标记三维显微方法，其工作过程如下：
(1)光源1发射出光束，经过聚焦镜2聚焦到小孔光阑3上进行滤波，调节准直透镜4的位置，使小孔光阑3恰好在准直透镜4的前焦点处，透过小孔光阑3的光经过准直透镜4准直成为平面波照射到反射镜5上，调节反射镜5的俯仰角使激光光束照射到二维扫描振镜6的反射中心，调整二维扫描振镜6的位置角度，在扫描振镜处于初始状态时恰好能够将入射光线在水平方向偏折90°出射。出射的激光光束正入射到扫描透镜7上，调整扫描透镜7与二维扫描振镜6之间的距离，使二维扫描振镜6的反射中心恰好在扫描透镜7的前焦点处，且在扫描振镜6处于初始状态时，入射到扫描透镜7上的光束是沿光轴垂直入射。经过扫描透镜7的激光正入射到会聚透镜8上，调整会聚透镜8的位置，使会聚透镜8的前焦面和扫描透镜7的后焦面重合1经过会聚透镜8的激光照射到待测样品上。
(2)待测样品放置在三维控制的样品台9上，通过显微物镜10观察透过待测样品的激光光束，透过显微物镜10的激光透过场镜11上，然后再经分光镜12分成相互垂直的两束光A、B，然后分别用CCD-A13和CCD-B14垂直接收，调整两个CCD的位置，保证其距离分光镜分光点的距离差恒定。
(3)计算机15控制二维扫描振镜6，水平方向调整角度到-α我们优选-60°，此时入射到会聚透镜后焦面的位置，如图2中最左边的点。然后通过CCD-A13和CCD-B14采集该角度下的光强信息图像，计算机读入CCD-A13和CCD-B14的光强信息图像，计算机15发出信息控制二维扫描振镜6水平转动1°或者其他采样角度。然后再进行采集图像，不断重复，遍历到水平方向+α，优选+60°，此时会聚透镜后焦面的入射点如图2中最右边点。得到240幅或者其他要求数量的与角度相关的图像，通过光场传播计算得到120幅或者其他要求数量的相位迟滞分布图。通过三维重构算法得到水平扫描高精度三维图像。
在上述的步骤(3)中，还可以用计算机15控制二维扫描振镜6，使垂直方向调整角度到-α我们优选-60°，此时入射到会聚透镜后焦面的位置，如图2中最下边的点。用CCD-A13和CCD-B14采集该角度下的光强信息图像，计算机读入CCD-A13和CCD-B14的光强信息图像，计算机15发出信息控制二维扫描振镜6垂直转动1°或者其他采样角度。然后再进行采集图像，不断重复，遍历到垂直方向+α，优选+60°，此时会聚透镜后焦面光线入射点如图2中最上边的点。得到240幅或者其他要求数量的与角度相关的图像，通过光场传播计算得到120幅或者其他要求数量的相位迟滞分布图。通过三维重构算法得到垂直扫描高精度三维图像。
在步骤(3)中，还可以用计算机15控制二维扫描振镜6，调整扫描振镜角度，进行螺旋扫描，此操作过程中会聚透镜前焦面的光线入射点如图3所示。具体实施方法是，首先通过计算机15调整二维扫描振镜7使光线恰好0°入射，然后CCD-A13与CCD-B14分别拍摄图像，计算机15读入图像后发出命令使二维扫描振镜7在水平和垂直两个方向同时转动，使会聚透镜8的入射光线按照预设的曲率轨迹和空间间隔入射，当整个螺旋扫描结束后会得到整个三维锥角角度遍历的相位迟滞图，根据需要观察的部位和图像分布，进行角度筛选和三维重构得到分辨率局部侧重的高分辨三维重构图。
Claims (8)
1.一种基于光场传播的非标记三维显微方法，其特征在于，包括以下几个步骤：
1)将激光光束聚焦后投射到待测样品上，并利用显微物镜收集带有样品信息的激光光束；
所述激光光束经滤波和准直后转换为平面波投射到待测样品上；
2)将带有样品信息的激光光束分成第一光束和第二光束，并通过第一图像传感器和第二图像传感器分别采集第一光束和第二光束的光强信息图像；
所述第一图像传感器和第二图像传感器的位置可调；
3)改变激光光束入射到待测样品上的角度，对待测样品进行扫描，并利用显微物镜接收带有样品信息的激光光束，然后重复步骤2)；
4)通过计算机对所述的光强信息图像进行计算分析得到相应的相位迟滞分布图，然后采用三维重构算法得到三维图像。
2.如权利要求1所述的基于光场传播的非标记三维显微方法，其特征在于，所述显微物镜为数值孔径为1.4的浸油式显微物镜。
3.如权利要求2所述的基于光场传播的非标记三维显微方法，其特征在于，所述第一光束和第二光束的光路相互垂直。
4.一种基于权利要求1～3任一项所述非标记三维显微方法的非标记三维显微装置，包括用于产生激光光束的光源，其特征在于，还包括：
沿所述激光光束光路依次布置扫描器、样品台、显微物镜和分光镜；
所述光源和扫描器之间设有沿所述激光光束光路依次布置的小孔光阑和准直透镜；
用于采集所述分光镜出射光束的光强信息图像的第一图像传感器和第二图像传感器；
以及与所述扫描器、第一图像传感器和第二图像传感器连接的计算机；
所述第一图像传感器和第二图像传感器滑动配合在相应的导轨上。
5.如权利要求4所述的非标记三维显微装置，其特征在于，所述扫描器为二维扫描振镜。
6.如权利要求4所述的非标记三维显微装置，其特征在于，所述扫描器和样品台之间设有沿所述激光光束光路依次布置的扫描透镜和会聚透镜。
7.如权利要求4所述的非标记三维显微装置，其特征在于，所述的第一图像传感器和第二图像传感器分别为第一CCD和第二CCD。
8.如权利要求7所述的非标记三维显微装置，其特征在于，所述样品台为三维移动平台。
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Legal Events
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20160420 Termination date: 20200128 |
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