CN110157730A - 一种解除miRNA抑制功能促进靶基因表达的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种解除miRNA抑制功能促进靶基因表达的策略，并提供了基于基因组编辑技术的具体实施方法。利用基因编辑技术对miRNA靶基因的识别序列进行编辑，筛选靶基因功能正常的碱基替换突变和氨基酸缺失突变，且识别序列破坏未能被上游miRNA抑制的突变体，该发明为促进靶基因功能研究和功能应用提供一种简单高效的方式。

Description

一种解除miRNA抑制功能促进靶基因表达的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种解除miRNA抑制功能促进靶基因表达的方法。

背景技术

MiRNA是一类单链RNA，通常为20-24nt，在植物和动物中起着重要的转录后调节作用。已经证明，小RNA参与了许多生物过程，包括植物生长、发育、应激反应以及激素信号传导的过程。通过高度特异性的互补碱基配对机制与靶向mRNAs结合，并介导转录后基因沉默。先前的研究表明，靶基因上被miRNA识别的靶序列如果有snp就会破坏miRNA的识别和对靶基因的抑制功能，从而影响相应的表型。可见，对干扰miRNA与其靶基因的调节功能可能是miRNA功能研究以及靶基因功能应用的一种有效的手段。

传统的干扰方法主要通过MIM技术（人工模拟靶序列技术）和STTM技术来实现。miRNA的人工模拟靶序列(artificialtargetmimiry)，是根据miRNA的核酸序列人工设计与miRNA互补的一段20-24nt寡聚核苷酸链。该模拟靶序列可以被miRNA识别并互作却不被切割。通过设计的模拟靶序列，并将其整合入植物基因组，利用植物编码的miRNA与模拟靶序列的结合，来抑制miRNA的活性，达到促进靶基因的表达的作用。

短序列组成的短串联靶模拟技术（STTM）是在MIM技术理论基础上改良出一种更加高效的miRNA沉默新方法。STTM由一段48nt的特定序列将两个MIM桥连起来，在这两个MIM的miRNA切割位点处都具有一个3个碱基的凸起结构，这一结构使miRNA能与之结合但无法对其进行切割。研究表明STTM构建的突变体相比MIM，对miRNA的抑制程度更深，表型更加明显。这些结果表明，MIM和STTM技术为抑制小RNA的活性、干扰小RNA的分裂和增加靶基因的表达提供了有效的手段。

上述手段需要通过转基因手段在受体细胞里头稳定表达的外源短链小核苷酸片段，印制能力有限，设计表型较难观察。特别是涉及表达调控的育种应用研究，由于不能去除外源基因而应用潜力受到限制。自CRISPR/CAS9问世以来，基因组编辑技术已经发展成为加速植物基础研究的强大工具，它是利用位点特异性核酸酶在植物基因组DNA序列上造成双链断，激发细胞自身同源重组和非同源末端接合的修复机制，通过随机的添加或删除靶序列的碱基个数来完成对植物基因组的靶向修饰，因此可以实现对目标DNA序列的定点编辑。然而，利用CRISPR-CAS9编辑靶基因的miRNA互补位点以解除miRNA的抑制功能抗性突变体的研究很少。

发明内容

基于以上背景，本发明巧妙的利用基因组编辑技术对miRNA识别和抑制靶基因的识别序列进行有效编辑。通过破坏了miRNA结合靶基因的互补序列来干扰miRNA对靶基因的抑制功能，同时增加靶基因表达。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种解除miRNA抑制功能促进靶基因表达的方法，利用含有gRNA的基因编辑载体编辑靶基因序列以解除miRNA的抑制功能。

一种解除miRNA抑制功能促进靶基因表达的方法，包括如下步骤：

（1）拟改良品种miRNA的靶基因序列分析，确定miRNA的识别序列，选择识别序列进行基因编辑靶点设计；

（2）构建打靶载体，将拟改良品种作为遗传转化的受体材料，用转基因技术将打靶载体导入受体细胞；

（3）靶基因编辑体的突变类型检测并选取氨基酸缺失突变的转基因克隆，检测靶基因表达水平及相应表型考察。

所述miRNA包括所有生物已知及未知功能的具有抑制靶基因表达功能的miRNA。

所述靶基因包括所有受miRNA识别并抑制表达的已知或未知功能基因。

靶基因的序列编辑必须设在靶基因的miRNA识别序列上及两冀任何能破坏miRNA识别的位置区域。

所述的碱基序列编辑方法可以由锌指蛋白ZFN、TALEN蛋白、CAS系列蛋白、CPF蛋白等具有碱基编辑功能蛋白及其变体改良蛋白介导的任何基因编辑技术利用上述策略在miRNA识别靶序列上的编辑。

所述的基因编辑获得的突变体类型是miRNA靶识别序列出碱基的替换、氨基酸缺失或其他不影响靶基因正常功能的突变类型。

具体地，一种解除miRNA抑制功能促进靶基因表达的方法，包括如下步骤：

（1）水稻OsGRF4基因的上游miRNA识别序列分析及基因编辑靶点设计：设计引物扩增水稻的OsGRF4基因，通过特异性引物测序获得序列全长；通过序列分析确定靶识别序列，根据靶识别序列设计Cas9识别位点；

（2）打靶载体构建及水稻遗传转化：选择线性pCXUN-Cas9为骨架载体，构建带有gRNA的重组载体pCXUN-Cas9-gRNA；将pCXUN-Cas9-gRNA载体通过农杆菌转化法，转化至水稻愈伤组织中，经抗性愈伤的筛选、分化和生根，获得转基因阳性植株；

（3）OsGRF4基因编辑体的基因型检测：用通用引物和特异性引物对转化子进行鉴定；

（4）OsGRF4基因编辑体的表达水平和表型考察。

进一步地，将上述方法应用于解除miRNA抑制功能促进靶基因表达。

与现在技术相比，本发明的有益成果在于：

本发明提出了一种基因编辑技术的运用，利用其定向打靶功能来实现对miRNA抑制功能的解除，相比其他miRNA功能抑制技术，该方法直接破坏miRNA识别序列，操作简单易行、运行成本更低、效率高。

本发明提供的一种破坏miRNA抑制功能的方法，可快速实现所有miRNA功能的调控。该发明为促进靶基因功能研究和功能应用，特别针对有利靶基因的表达调控和功能应用，提供一种精确简单高效的方式。

附图说明

图1为OsGRF4 基因结构图和miR396识别位点序列。黑色方框表示外显子，黑色线条表示内含子，Cas9 / sgRNA设靶位点位于在识别位点的侧翼序列被灰色字体表示。

图2为基因编辑介导的OsGRF4 基因miRNA识别序列的破坏。WT为野生型序列，阿拉伯数字表示发生缺失或增加的碱基数（数字前面加“-”表碱基缺失，数字前面加“+”表碱基增加）。

图3为野生型和不同OsGRF4突变类型的基因表达水平差异。第2,3为氨基酸缺失株系，第4,5为移码突变株系。Scale bar: 1 cm

图4为野生型和不同OsGRF4突变类型的粒型差异。第2,3为氨基酸缺失株系，第4,5为移码突变株系。

图5为野生型和不同OsGRF4突变类型的粒长，粒宽，单株产量考察。第2,3为氨基酸缺失株系，第4,5为移码突变株系。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中所使用的实验验方法如没有特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的的实验材料如无特别说明均为市售购买产品。

实施例1：利用CRISPR/Cas9系统编辑OsGRF4受miRNA396识别抑制的靶序列来提高水稻的粒型

水稻(Oryza sativa L.)是最重要的主要粮食作物之一，几乎养活了世界一半的人口。水稻粒型的大小决定水稻的单产，也是影响粮食产量的主要因素之一。OsGRF4是调控水稻粒型的关键基因，该基因的表达可以促进水稻粒型的增加从而促进水稻增产。已有研究表明，miR396可以结合并抑制OsGRF 4的转录调控，从而使水稻的粒子变小影响水稻产量。基于以上背景，利用本发明提供策略，我们利用基因编辑破坏miR396的靶序列并筛选不影响OsGRF4蛋白功能的突变体。如此破坏了miR396对OsGRF 4的抑制作用，我们可以获得表达量提高的功能正常的OsGRF4蛋白，最终使谷物增加和水稻产量增加。鉴于CRISPR/Cas9基因组编辑技术可以有效的获得多种类型的突变体，我们在这以此技术为工具验证我们的方法。主要分以下几个部分。

A）水稻OsGRF4基因的上游miRNA识别序列分析及基因编辑靶点设计

本发明所实验一优良的常规稻品种蜀恢143。该品种水稻的OsGRF4基因通过特异性引物扩增测序。如序列1所示。该基因含有5个外显子，分别为序列表中第1-110（第一外显子）、第208-437（第二外显子）、第1041-1452（第三外显子）、第2850-3274（第四外显子）、第3379-3386（第五外显子），靶识别序列位于第三个外显子第1184-1204，序列为：cgttcaagaaagcctgtggaa。

根据发明方法，我们选取该识别序列处设计了一个cas9识别位点，如图1。识别靶序列为：CAACCGTTCAAGAAAGCCTGTGG。

B）打靶载体构建及水稻遗传转化

本实验采用基因编辑技术为第三代基因编辑技术CRISPR/cas9，所使用的骨架载体pCXUN-Cas9为市面上订购的常见线性载体 (购于北京唯尚立德生物科技有限公司)。cas9蛋白序列全长4206个碱基对，编码1401个氨基酸。其表达由Ubiquitin启动子驱动，gRNA由U6启动子驱动。gRNA片段由引物合成公司合成后通过DNA连接酶连接在U6启动子之后形成重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA（环形载体）。

本发明中，将所述载体pCXUN-Cas9-gRNA转化蜀恢143的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，用农杆菌介导法实现遗传转化，并经抗性愈伤的筛选、分化和生根，获得转基因阳性植株。具体步骤无特别处理，与常用的步骤无异，在这不重复描述。

C）OsGRF4基因编辑体的基因型检测

提取转化植株基因组DNA，用引物CZTF-F（5'-GGGAGATCCAGCTAGAGGTC-3'）和CZTF-F（5'-GGAAGGAGGAAGACAAGG-3'）进行PCR扩增鉴定转基因植株。进一步用基因特异性引物grf-F:5'CATTTTTGAGCGATTGCTAAG-3'；grf-R:5' GGGTAAAGAGAGTGGTTTTGG-3'，PCR扩增上述鉴定的转基因植株基因组DNA，获得带有靶序列的osgrf4基因片段，并送往公司测序。对测序结果进行分析，获得了47株独立的T0转基因植株。在T0系中，47个株系中有34个被鉴定为突变体，其中半数以上(58.82%)为杂合子，纯合子和双等位基因占突变体总数的20.59%。所有的T0突变体都破坏了OsGRF 4的miRNA 396识别序列，如图2列出部分缺失类型。

本发明的目的是筛选插入或缺失3n个碱基的具有正常表达框架的突变植物，在34个T0突变体中，我们筛选出有4个含有3n个碱基的具有正常表达框架的突变植物(grf 4-#7、grf 4-#46、grf 4-#47、grf 4-#50)。分别缺失36、27、9、6个碱基，与野生型OsGRF 4蛋白相比，基因突变体(grf 4-#7、grf 4-#46、grf 4-#47、grf 4-#50)缺失较小。突变类型分别为缺失12、9、3、2氨基酸的氨基酸缺失突变，而这些缺失处在蛋白非重要结构域上。

D）OsGRF4基因编辑体的表达水平和表型考察

选取碱基缺失无移码突变体grf 4-#7（+1/-36）、grf 4-#46（-27/+6）和移码突变体grf4-#28（+1）、grf 4-#41（+1/-2）进一步考察OsGRF4基因编辑体的表达水平。如图3，氨基酸缺失突变体grf 4-#7（+1/-36）、grf 4-#46（-27/+6）的OsGRF4表达水平相比野生型增强了4-5倍，缺失该编辑体粒长粒宽显著增加，同时粒型比野生型显得更大，水稻单产提高（如图4，5），这表明OsGRF4基因的功能受到MIR396的抑制的保护，成功地增加了表达。然而，移码突变株系grf 4-#28（+1）、grf 4-#41（+1/-2）由于OsGRF 4功能蛋白的移码而散失粒型的调控功能，从而表型出小粒表型，如图5。这些结果表明，通过CRISPR/Cas9系统，我们成功破坏了miRNA 396对靶基因OSGRF4的识别和抑制，获得了OsGRF 4功能基因高表达的突变体材料，达到预期改良水稻粒型，提高水稻单产的目的。

该实例证明，本发明提供了一种解除miRNA抑制功能促进靶基因表达的策略，并提供了基于基因组编辑技术的具体实施方法。但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院生物技术研究所

<120> 一种解除miRNA抑制功能促进靶基因表达的方法

<130> 8

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3386

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcgatgc cgtatgcctc cctgtctccg gcggtggccg accaccgctc gtccccggca 60

gccgcgaccg cctccctcct ccccttctgc cgctccaccc cgctctccgc gtaagcaacg 120

cgaacccgcg gctacaaccc attttcttgg ctccagtggt gcatgtgaca acacggtgag 180

acgttgtgtg tgggtgggtg ggtgcagggg cggtggtggc gtcgcgatgg gggaggacgc 240

gccgatgacc gcgaggtggc cgccggcggc ggcggcgagg ctgccgccgt tcaccgcggc 300

gcagtacgag gagctggagc agcaggcgct catatacaag tacctggtgg caggcgtgcc 360

cgtcccgccg gatctcgtgc tccccatccg ccgcggactc gactccctcg ccgcccgctt 420

ctacaaccat cccgcccgta cgtcgtgttc ctatttcttg cctctcctct accatcgctg 480

cattgctttt ggatgcttgt ttagtgtcgg cttctttgtt tattccgatc aggcgtactt 540

tgcttccatt tgttaattgg ctccgggtca tttgttaatc cgggttacgc gattcaagaa 600

acatgcgtgt gtgtttttat gctatcctcc ggatttggta ataaaaaggc ttgtttttaa 660

atccaaaact cgtgctcgct tcacgattag cgcatcattt tttttttttg gggggggggg 720

gggggaagtt tgcccatcat tctgtctctg tttgatctga tagaggacgt gcacacgctc 780

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gaaccaacac cctggcaaac tgtttttttg ctcgccattt ttgagcgatt gctaagaaca 900

gataactatg ccctgcatat ggatcggata tggacttctc aaatattcaa atgccattct 960

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gccagggcgg tgccggcgta cggacggcaa gaaatggcgg tgctcgaagg aggccgcgcc 1140

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ggaaacgcag ctggtcgccc agtcccaacc gccctcatct gttgtcggtt ctgcggcggc 1260

gccccttgct gctgcctcca atggcagcag cttccaaaac cactctcttt accctgctat 1320

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caaagatctc aggtgattgt tcatttcttt ttttttaatc aaacgccata tttacttgtt 1500

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aataactgtg tcccatttgt ttgcattggt ggcaatcgaa tcagctgtcc atgctcagta 1680

gtactacttc gatttggtgc tgcaatcact gaaagtctga aactttactc tctgcactgc 1740

aaaaatttgt gttatgttta ggtttccaga gtgctgcctc tttgcccttc ccatactttc 1800

tggtatcagt tttcagcccc agaagccggg gacagtctcc ataagagatt tctgctcagg 1860

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tgtttctgtc tctgctcttc aggggcagtc aattatttgg cccttgcaaa atactgtctc 2100

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caactctttg atttatcttc cctacaaaaa aaaaggaact ctttgattta tcttcggtga 2280

atctcagtct gaccttagta cctagcctca ttatttactt caccaaatgt ataactctac 2340

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gctgcaacta aactgtcttc tggttttact gcaaaataga atgtttcttg ggccatgatc 2520

tgctgctata tatgattagt taaaccatgg ttctatgttt tcttatatga attcatgaca 2580

agaatactaa cttttggaaa aggtaatttt attttttttg tatgataata atgctttgga 2640

ttctttctag tttatctgtc ggacttaggt taactacatt tcctccggta catggattta 2700

tttcattctt acaattgagc ccttatgaat attttcttcc taattctgtt ctaaaaagtt 2760

agaattgaca tattttcgat aggtacatgc ctagcacttg cattcgtgtt tcctactaat 2820

tcccaatcac tgtatcttct caaattcagg tatactgctt atggcacaag atctttggcg 2880

gatgagcaga gtcaactcat tactgaagct atcaacacat ctattgaaaa tccatggcgg 2940

ctgctgccat ctcagaactc gccatttccc ctttcaagct attctcagct gggggcacta 3000

agtgaccttg gtcagaacac ccccagctca ctttcaaagg ttcagaggca gccactttcg 3060

ttctttggga acgactatgc ggctgtcgat tctgtgaagc aagagaacca gacgctgcgt 3120

cccttctttg atgagtggcc aaagggaagg gattcatggt cagacctcgc tgatgagaat 3180

gctaatcttt cgtcattctc aggcacccaa ctgtcgatct ccataccaat ggcatcctct 3240

gacttctcgg cggccagttc tcgatcaact aatggtacga ctacttgatc tccccccaat 3300

tacttcgtgc gtgtttatgt ctgtatcctg caatgtctga agatttctta ctgaaaacgt 3360

catctggtct gtgtgcaggt gactga 3386

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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gcaaguucuu ucggacaccu u 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caaccgttca agaaagcctg tgg 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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gggagatcca gctagaggtc 20

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<213> 人工序列

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catttttgag cgattgctaa g 21

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cgttcaagaa agcctgtgga a 21

Claims (3)

1.一种解除miRNA抑制功能促进靶基因表达的方法，其特征在于，利用基因编辑技术编辑靶基因序列以解除miRNA的抑制功能；所述靶基因的序列编辑设在靶基因的miRNA识别序列上及两冀能破坏miRNA识别的位置区域；所述靶基因的序列编辑包括碱基的替换、氨基酸的缺失。

2.根据权利要求1所述的一种解除miRNA抑制功能促进靶基因表达的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）拟改良品种miRNA的靶基因序列分析，确定miRNA的识别序列，选择识别序列进行基因编辑靶点设计；

（2）构建打靶载体，将拟改良品种作为遗传转化的受体材料，用转基因技术将打靶载体导入受体细胞；

（3）靶基因编辑体的突变类型检测并选取氨基酸缺失突变的转基因克隆，检测靶基因表达水平及相应表型考察。

3.一种如权利要求1-2任一所述的方法在解除miRNA抑制功能促进靶基因表达中的应用。