CN1101473C - 工业循环冷却水中硝酸细菌的测定方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用硝酸细菌生化反应对工业循环冷却水中硝酸细菌进行测定的方法，用适量的亚硝酸钠、碳酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、硫酸镁与蒸馏水配置成液体培养基；取冰醋酸50ml与900ml水混合，加入对氨基苯磺酸5.0克摇均，加入盐酸萘乙二胺0.05克溶解，用水稀释到1000ml制成比色试剂液；采用多管发酵技术，在28℃～30℃恒温培养3～14天；再用比色法测定试管培养基中被测试样是否为阳性反应；最后采用MPN法，对被测试样中的硝酸细菌进行定量。
Description
技术领域：
本发明涉及一种工业循环冷却水中硝酸细菌的测定方法，属于生物细菌的定量检测方法。
背景技术：
工业循环冷却水系统本身就是一个良好的细菌生长的生态环境，为细菌的生长提供了空气、水分、温度和适宜的酸碱度。在密闭的循环冷却水系统中，一般均使用亚硝酸类的缓蚀剂，其亚硝酸根的浓度要保持在300～400mg/L。这为硝酸菌(NItrobacter)的生长提供了充分的无机盐养料。硝酸菌大量的繁殖，将形成生物污泥堆积在管道内，从而降低设备传热效率，并堵塞管道。同时由于细菌的生化作用，水中的亚硝酸根迅速地转化为硝酸根，不仅使缓蚀剂的浓度大大降低，而生成的大量硝酸为强酸物质，腐蚀设备。现有技术中因没有测定方法，只能用测定水中异氧菌数来代表细菌的总数，来评定水的质量。如中国专利ZL97112019.6公开的《快速测定循环水中含菌量的方法》，以TTC为染色剂，与由蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、蒸馏水配制成的染色培养基液，经组装试管后灭菌备用；再将定量的被测水移入备好的试管中封闭摇均后，置入恒温培养箱内培养，至试管内液体变为浅粉红色，按所培养时间得出单位容积被测水中含菌数。该方法操作简便、测定快速，但所测出的仍是水中异氧菌的总数。而硝酸细菌是一类化能自氧细菌，是与异氧菌生理代谢类型不同的细菌。因此只测定水中异氧菌数量，是无法正确判定有亚硝酸和氨类物质存在的水系统中细菌的总量，从而确定水的好坏程度的。在实际生产中，往往造成水系统中的药剂浓度反复波动，有时几天内亚硝酸根从正常的300～400mg/L降到检不出，而硝酸根从十几个mg/L上升到上千个mg/L，严重影响生产的正常进行。
发明内容：
本发明的目的是提供一种能够简单、方便地对硝酸细菌进行定量检测的工业循环冷却水中硝酸细菌的测定方法，以便科学地进行水质管理，合理指导水中杀菌剂的投加，有效地控制细菌的生长，保证生产正常进行，同时也使得对杀菌剂的杀菌效率能够作出正确评价。
本发明的目的是通过以下措施实现的。
一种工业循环冷却水中硝酸细菌的测定方法，采用最大可能菌数计数法(MPN法)，其检测步骤如下：
1)制备培养基：用适量的亚硝酸钠、碳酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、硫酸镁与蒸馏水配置成液体培养基，并用酸或碱调pH值至中性，定量分装于试管中灭菌后备用；
2)制备比色试剂：取冰醋酸50ml与900ml水混合，加入对氨基苯磺酸5.0克，盖塞摇均，加入盐酸萘乙二胺0.05克溶解后，用水稀释到1000ml制成比色试剂原液，再取3～5份比色剂原液和1份水混合均匀制成比色试剂；
3)水样采集与稀释：用无菌采样瓶采集被测水样，在无菌箱内以10倍稀释法做至少3个稀释度，应使最后一个稀释度接种培养后没有硝酸细菌生长；
4)接种：在前述装有培养基的灭过菌的试管中分别加入等量的不同稀释度的水样，每个稀释度做4～6个重复组，其中一组作为对照组，其余为检测组；
5)恒温培养：将上述检测组试管置于28～30℃恒温培养3～14天，同时将对照组试管置于4℃冰箱内保存相同的时间；
6)结果检查计数：从培养后的每个稀释度的每支检测组试管及对照组试管中分别取适量的培养液于比色管中，加入适量比例的比色试剂，10～20分钟后，将检测组发出的红色与对照组目测比较，红色较淡的比色管为阳性(+)，表示有硝酸细菌生长，与对照组红色一致的为阴性(-)，表示没有硝酸细菌生长，根据检查结果，得出阳性组合指数，用MPN法查表求出每毫升水样中硝酸细菌数。
制备培养基是按亚硝酸钠0.5克、碳酸钠1.0克、磷酸二氢钠0.25克、磷酸氢二钾0.75、硫酸镁0.03与蒸馏水1000毫升的比例配置成液体培养基，并用盐酸[1∶1]调pH值至7.0±0.2。
恒温培养中的检测组水样在培养至少3天后进行预检测，从一组每个稀释度的每支检测组试管及对照组试管中分别取适量的培养液于比色管中，加入适量比例的比色试剂，10～20分钟后，将检测组发出的红色与对照组目测比较，当目测结果具有为阳性(+)的检测组试管时，即可进行结果检查记数。
本发明利用硝酸细菌生化反应测定水中的硝酸细菌。硝酸细菌的生化反应为： 为证实以上反应，进行了如下实验。在含有NaNO2浓度为500mg/L培养液中，加入有硝酸菌的水样，在30℃培养后测定培养液中亚硝酸根和硝酸根的浓度变化，表1为实验结果(以下所述对硝酸根和亚硝酸根的测定均采用离子色谱法)。表1
从以上实验的结果可以看出，由于硝酸菌的生理活动，使培养液中的亚硝酸根离子的浓度很快降低，而硝酸根离子的浓度迅速升高。因此，从理论上分析，判断水样中是否有硝酸细菌，可以采用两种方法：一是测定培养液中硝酸根离子浓度的增加，二是测定培养液中亚硝酸根离子浓度的降低。测定硝酸根离子的增加，可利用其与二苯胺试剂的颜色反映。但被测定的水样中，通常本身就含有硝酸根，甚至有大量的硝酸根，使其水样未进行培养就会呈阳性反应；另外，该反应又受亚硝酸根离子的严重干扰，两种因素使得用测定硝酸根浓度增加的方法，对水样中有无硝酸菌无法进行正确的判定。用培养液中亚硝酸根离子的减少来判定水样中是否有硝酸细菌生长，从理论分析和上述试验都可以看出是可行的。
| 培养时间(天) | 培养前 | 2 | 4 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 14 |
| 30℃培养 | 培养液中测定的浓度(mg/L) | ||||||||
| NO2 - | 166 | 169 | 162 | 154 | 29.2 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 |
| NO3 - | 6.7 | 8.1 | 17.0 | 56.2 | 229 | 281 | 412 | 403 | 435 |
本发明采用的显色剂中含有对氨基苯磺酸和盐酸萘乙二胺，利用亚硝酸根与对氨基苯磺酸的重氮化反应，生成的对重氮苯磺酸再与盐酸萘乙二胺反应，生成红色的偶氮化合物。该反应灵敏，不受硝酸根离子和其他离子干扰，为亚硝酸根的特征反应，亚硝酸根含量的多少以红色深浅来指示非常明显，适用于细菌检验。该反应的化学反应式如下：
对氨基苯磺酸 对重氮苯磺酸
红色的偶氮化合物
本发明将对照组培养液置于冰箱内4℃保存，在保存期内亚硝酸根的浓度基本保持不变。为证明这一结论，比较在4℃和30℃下培养含硝酸菌水样，对亚硝酸根的转化实验。表2所示为实验结果。表2
从以上实验结果可以看出，以放置在4℃的一组水样培养液为对照组是可行的。
| 培养温度(℃) | 培养时间(天) | 培养前 | 2 | 3 | 4 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 14 |
| 培养液中测定的浓度(mg/L) | |||||||||||
| 4℃ | NO2 - | 117 | 124 | 118 | 114 | 105 | 105 | 96.6 | 95.1 | 96.0 | 108 |
| NO3 - | 66.4 | 56.4 | 50.0 | 50.7 | 66.0 | 65.1 | 62.4 | 57.5 | 58.4 | 56.1 | |
| 30℃ | NO2 - | 117 | 123 | 98.8 | 71.9 | 40.2 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 |
| NO3 - | 66.4 | 64.5 | 85.1 | 122 | 188 | 408 | 433 | 456 | 456 | 461 | |
硝酸菌的培养时间，经多次实验证明，如果水系统中硝酸菌含量高(可从测定未培养前接种培养液中硝酸根离子浓度高来确定)，则只需培养3天，接种培养液中亚硝酸根浓度就从100mg/L以上降到未检出。一般情况在培养8、9天后亚硝酸根浓度就有明显的减少，甚至下降到检不出。因此以一般对细菌检测周期14天进行培养，硝酸菌对亚硝酸根的转换已经完成。对未含有硝酸菌的水样在30℃进行培养，测试培养液中硝酸根及亚硝酸根的浓度，在14天后仍无明显的变化。在培养43天后亚硝酸根浓度有一些变化。表3所示为未含有硝酸菌水样的实验结果，培养液中加入500mg/L浓度的亚硝酸钠。
表3
以上试验结果表明，水样在30℃培养14天，如果未含有硝酸菌，则培养液中硝酸根浓度无明显变化；如果水样中含有硝酸菌，则硝酸菌的生理活动以完全能够将培养液中的亚硝酸根浓度明显降低，从而可用MPN计数法定量检测出硝酸菌的浓度。
| 培养温度 | 培养时间(天) | 培养前 | 1 | 7 | 8 | 9 | 10 | 13 | 14 | 43 | |
| (℃) | 培养液中测定的浓度(mg/L) | ||||||||||
| 无菌水样 | NO2 - | 217 | 221 | 202 | 194 | 195 | 208 | 199 | 194 | 147 | |
| NO3 - | 11.1 | 9.4 | 9.6 | 8.8 | 8.7 | 9.1 | 9.3 | 9.0 | 10.7 | ||
根据水样中硝酸菌浓度的不同，硝酸菌的生理活动对亚硝酸根的转换完成的时间从3天到14天不等，采用预检测步骤能够有效地减少检测所需要的时间。
培养液中亚硝酸根的浓度在500～1000mg/L的范围内，对硝酸菌的生理活动影响不大，因此在这个浓度内配制都可以。表4为硝酸菌浓度为500mg/L和1000mg/L两种培养基的对比试验结果。表4
考虑到用相对低的浓度培养更利于细菌生长，并在比色测定时色差更为明显，故采用500mg/L的亚硝酸钠培养液效果更加。
| 培养时间(天) | 培养前 | 1 | 2 | 3 | 4 | 7 | |
| NaNO2(mg/L) | 培养液中测定的浓度(mg/L)(30℃培养) | ||||||
| 500 | NO2 - | 106 | 61.0 | 39.5 | 未检出 | 未检出 | 未检出 |
| NO3 - | 129 | 202 | 267 | 399 | 427 | 456 | |
| 1000 | NO2 - | 258 | 205 | 83.6 | 106 | 未检出 | 未检出 |
| NO3 - | 130 | 211 | 419 | 382 | 697 | 720 | |
本发明方法与现有技术相比所具有的优点在于：能够简单、方便地对工业循环冷却水中的硝酸细菌进行定量检测，而不是用测定水中的异氧菌来替代，使得能够科学地对水质进行管理，合理指导水中杀菌剂的投加，有效地控制细菌的生长，保证生产正常进行，同时也使得对杀菌剂的杀菌效率能够作出正确评价。由于该方法简单、易行、容易学习、原料容易取得，因此可以很方便地用于冶金、化工、及各大化肥厂等工业循环冷却水系统中，对硝酸细菌的测定、防治。
具体实施方案：
下面对本发明的实施例进行详述。
一种工业循环冷却水中硝酸细菌的测定方法，采用最大可能菌数计数法(MPN法)，其检测步骤如下：
1)制备培养基：用亚硝酸钠0.5克、碳酸钠1.0克、磷酸二氢钠0.25克、磷酸氢二钾0.75、硫酸镁0.03与蒸馏水1000毫升的比例配置成液体培养基，并用盐酸[1∶1]调pH值至7.0±0.2，分装于15×150毫米的试管中，每管准确装入培养基5ml，管口塞上棉塞，于121±1℃高压灭菌至少15分钟后备用；
2)制备比色试剂：取冰醋酸50ml与900ml水混合，加入对氨基苯磺酸5.0克，盖塞摇均，加入盐酸萘乙二胺0.05克溶解后，用水稀释到1000ml制成比色试剂原液，再取4份比色剂原液和1份水混合均匀制成比色试剂；
3)水样采集与稀释：采用在140℃高温下干热灭菌至少2小时的无菌采样瓶采集被测水样，在无菌箱内以10倍稀释法做5个稀释度，使最后一个稀释度接种培养后没有硝酸细菌生长；
4)接种：在前述装有培养基的灭过菌的试管中分别加入1毫升不同稀释度的水样，每个稀释度做5个重复组，其中一组作为对照组，其余为检测组；
5)恒温培养：将上述检测组试管置于28～30℃恒温培养，同时将对照组试管置于4℃冰箱内保存相同的时间；
6)预检测：恒温培养中的检测组水样在培养至少3天后进行预检测，从一组每个稀释度的每支检测组试管及对照组试管中分别取适量的培养液于比色管中，加入适量比例的比色试剂，10～20分钟后，将检测组发出的红色与对照组目测比较，当目测结果具有为阳性(+)的检测组试管时，即可进行下一步的结果检查记数。
7)结果检查计数：从培养后的每个稀释度的每支检测组试管及对照组试管中分别取0.05毫升的培养液于10毫升比色管中，再于比色管中加入5毫升比色试剂，15分钟后，将检测组发出的红色与对照组目测比较，红色较淡的比色管为阳性(+)，表示有硝酸细菌生长，与对照组红色一致的为阴性(-)，表示没有硝酸细菌生长。根据检查结果，采用GB/T14643.6-93《工业循环冷却水中铁细菌的测定—MPN法》，得出阳性组合指数，查表求出每毫升水样中硝酸细菌数。
本发明方法中，制备培养基中所给出的液体培养基的各成分的含量和制备比色剂中比色剂原液的各成分含量，实际是比例关系，而不限于其所给出的具体量。另外比色剂原液可随时制备，贮于棕色瓶内密闭置于冰箱中，可保存一个月。
Claims (2)
1.一种工业循环冷却水中硝酸细菌的测定方法，采用最大可能菌数计数法(MPN法)，其特征在于：
1)制备培养基：用适量的亚硝酸钠、碳酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、硫酸镁与蒸馏水配置成液体培养基，并用酸或碱调pH值至中性，定量分装于试管中灭菌后备用；
2)制备比色试剂：取冰醋酸50ml与900ml水混合，加入对氨基苯磺酸5.0克，盖塞摇均，加入盐酸萘乙二胺0.05克溶解后，用水稀释到1000ml制成比色试剂原液，再取3～5份比色剂原液和1份水混合均匀制成比色试剂；
3)水样采集与稀释：用无菌采样瓶采集被测水样，在无菌箱内以10倍稀释法做至少3个稀释度，应使最后一个稀释度接种培养后没有硝酸细菌生长；
4)接种：在前述装有培养基的灭过菌的试管中分别加入等量的不同稀释度的水样，每个稀释度做4～6个重复组，其中一组作为对照组，其余为检测组；
5)恒温培养：将上述检测组试管置于28～30℃恒温培养3～14天，同时将对照组试管置于4℃冰箱内保存相同的时间；
6)结果检查计数：从培养后的每个稀释度的每支检测组试管及对照组试管中分别取适量的培养液于比色管中，加入适量比例的比色试剂，10～20分钟后，将检测组发出的红色与对照组目测比较，红色较淡的比色管为阳性(+)，表示有硝酸细菌生长，与对照组红色一致的为阴性(-)，表示没有硝酸细菌生长，根据检查结果，得出阳性组合指数，用MPN法查表求出每毫升水样中硝酸细菌数；
所述的制备培养基是按亚硝酸钠0.5克、碳酸钠1.0克、磷酸二氢钠0.25克、磷酸氢二钾0.75、硫酸镁0.03与蒸馏水1000毫升的比例配置成液体培养基，并用盐酸[1∶1]调pH值至7.0±0.2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的恒温培养中的检测组水样在培养至少3天后进行预检测，从一组每个稀释度的每支检测组试管及对照组试管中分别取适量的培养液于比色管中，加入适量比例的比色试剂，10～20分钟后，将检测组发出的红色与对照组目测比较，当目测结果具有为阳性(+)的检测组试管时，即可进行结果检查记数。
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