CN110132897B - 一种并行光学相干层析成像设备自动对焦系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种并行光学相干层析成像设备自动对焦系统和方法，包括有光源产生光；将光分解为采样光和参考光，采样光照射待测样品后返回第一回光，参考光照射参考镜面后返回第二回光；将第一回光和第二回光合束成第一合成光，检测获得第一合成光的光学相干层析信号强度峰值；将参考镜面共轭至待测样品表面作为参考成像面；将样品臂焦平面定位在参考成像面上，根据光学相干层析信号强度峰值确定样品臂焦平面，完成自动对焦。本发明基于并行光学相干层析成像设备本身作为多通道的弱相位时域光学干涉系统，利用系统本身的自检测量能力，无需额外对焦模块，以微米以下的重复精度实现显微物镜的焦面、参考臂镜面同时对准折射材料下表面的快速对焦过程。

Description

一种并行光学相干层析成像设备自动对焦系统和方法
技术领域
本发明涉及一种成像技术，特别是涉及一种并行光学相干层析成像设备自动对焦系统和方法。
背景技术
对于扫描共焦、双(多)光子、并行光学相干层析等穿透活体组织成像的显微镜，在成像物镜数值孔径较大(＞0.5)时，对焦也就是系统焦平面对准处于一个折射表面(如盖玻片)下的样品表面，是很困难的。
针对扫描共焦、双(多)光子显微镜，人们提出了多种自动对焦系统和方法。比较多的自动对焦方法，是采取图像的频率分析来确定焦面，这种方法依靠迭代优化的方法来寻找焦面，速度较慢。
另外一种对焦技术，采取结构光照明分析的方法，速度明显提高，但是对来自覆盖在样品上的反射表层的镜面反射十分敏感，对焦精度低。
另外，《物理实验》2018年07期，韩荣磊等人公开了一种《时域光学干涉层析成像实验系统的研制》，仅仅公开了一种时域光学干涉层析成像实验系统或共焦显微镜，并不具有自动对焦的能力。
采取弱相位光学干涉实现对焦也是一类重要的对焦系统。最早在US5493109专利被提出，由于采取迈克尔逊(Michelson)干涉仪方式，双干涉臂通过光纤分光，双臂受到热和机械非对称性对光程长度扰动的影响，它的对焦重复精度差。而在WO2012016753A1中，弱相位干涉对焦的方法得到改善，采用了光束分束器在靠近成像物镜的位置分光，减少了双臂相对光程受到环境的影响，但是依然受到较强的来自样品上覆盖的玻璃表面的镜面反射光的影响，降低了系统动态范围，对焦精度受到影响。
弱相位光学干涉对焦系统实质是频域光学相干层析模块，耦合到扫描共焦、双(多)光子成像系统中，根据沿着光轴扫描一维图像判断玻璃的上下表面，将系统焦点对准玻璃下表面即样品表面。
但是，对于并行光学相干层析成像设备，焦面的定义与传统扫描共焦、双(多)光子完全不同。它的系统成像面决定于参考臂镜面在样品臂的共轭位置，而样品臂中显微物镜的焦面位于参考臂决定的成像面上才完成对焦过程。上述对焦系统和方法，仅仅针对显微物镜的焦面的对准，不能解决参考臂中镜面相对于焦面的对准。另外，并行光学相干层析设备，其轴向分辨率决定于弱相干光源的相干长度，通常为1微米以下，而采取的光学物镜，轴向分辨率只有10微米左右，低精度的常规对焦手段大概率的降低了系统图像信噪比和对比度。更进一步，按照现有文献和专利，为了提高精度，在系统中增加弱相位光学时域干涉对焦模块，这样额外增加了成像设备的复杂度和成本。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种并行光学相干层析成像设备自动对焦系统和方法，用于解决现有技术中对焦精度低的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种并行光学相干层析成像设备自动对焦方法，包括有：
一光源产生光；
将所述光分解为采样光和参考光，所述采样光照射待测样品后返回第一回光，所述参考光照射参考镜面后返回第二回光；
将所述第一回光和第二回光合束成第一合成光，检测第一合成光的光学相干层析信号强度，获得第一合成光的光学相干层析信号强度峰值；
将参考镜面共轭至待测样品表面作为参考成像面；
将样品臂焦平面定位在所述参考成像面上，根据光学相干层析信号强度峰值确定样品臂焦平面，完成自动对焦。
进一步，还包括有，完成自动对焦后，迭代调焦提高对焦精度，具体包括：
将样品臂焦平面定位在所述参考成像面上；
在样品臂中的折射介质表面设置标记，根据标记的像面清晰峰值确定样品臂焦平面。
进一步，还包括有设置照明光瞳的回转对称结构与探测光瞳相对光轴不重合而构成的非回转对称光瞳，所述非回转对称光瞳用于阻挡第一回光中覆盖样品表面的折射介质的反射光与第二回光合成第一合成光。
进一步，还包括有在样品臂和/或参考臂扫描时，将电机按照预设扫描方向的反方向退回预定定位位置，并再沿着预设扫描方向进行扫描。
进一步，待测样品上表面与覆盖待测样品的折射介质下表面设置一空腔，在非回转对称光瞳排布下，在空腔处填充浸没介质。
进一步，在非回转对称光瞳排布下，样品臂中的第一照明光瞳偏离光轴或样品臂中的第二照明光瞳覆盖光轴，并相对光轴非旋转对称。
进一步，在非回转对称光瞳排布下，样品臂中的环形第三照明光瞳内径大于探测臂中的圆形第一探测光瞳外径或样品臂中的环形第三照明光瞳外径小于探测臂中的环形第一探测光瞳内径。
进一步，在非回转对称光瞳排布下，样品臂中任意形状的第三照明光瞳和探测臂中任意形状的探测光瞳相对光轴非旋转对称。
本发明还提供一种并行光学相干层析成像设备自动对焦系统，包括有：
光源模块，用于产生光；
光源分解模块，用于将光源模块产生的光分解为采样光和参考光；
光学相干层析信号采集模块，将采样光照射待测样品后返回第一回光，以及参考光照射参考镜面后返回第二回光；将所述第一回光和第二回光合束成第一合成光，检测第一合成光的光学相干层析信号强度，获得第一合成光的光学相干层析信号强度峰值；
对焦模块，将参考镜面共轭至待测样品表面作为参考成像面；将样品臂焦平面定位在所述参考成像面上，根据光学相干层析信号强度峰值确定样品臂焦平面，完成自动对焦。
进一步，所述对焦模块还包括有完成自动对焦后，迭代调焦提高对焦精度，具体包括：
在样品臂中的折射介质表面设置标记，根据标记的像面清晰峰值确定样品臂焦平面。
进一步，所述光学相干层析信号采集模块还包括有设置照明光瞳的回转对称结构与探测光瞳相对光轴不重合而构成的非回转对称光瞳，非回转对称光瞳用于阻挡第一回光中覆盖样品表面的折射介质的反射光与第二回光合成第一合成光。
进一步，所述系统还包括有：待测样品上表面与覆盖待测样品的折射介质下表面设置一空腔，在非回转对称光瞳排布下，在空腔处填充浸没介质。
进一步，在非回转对称光瞳排布下，样品臂中的第一照明光瞳偏离光轴或样品臂中的第二照明光瞳覆盖光轴，并相对光轴非旋转对称。
进一步，在非回转对称光瞳排布下，样品臂中的环形第三照明光瞳内径大于探测臂中的圆形第一探测光瞳外径或样品臂中的环形第三照明光瞳外径小于探测臂中的环形第一探测光瞳内径。
进一步，在非回转对称光瞳排布下，样品臂中任意形状的第三照明光瞳和探测臂中任意形状的探测光瞳相对光轴非旋转对称。
如上所述，本发明的一种并行光学相干层析成像设备自动对焦系统和方法，具有以下有益效果：本发明基于并行光学相干层析成像设备本身作为多通道的弱相位时域光学干涉系统，利用并行相干层析成像设备的自身干涉检测能力，确定参考成像面，无需额外对焦模块，将并行相干层析成像设备中样品臂焦平面定位在所述参考成像面上，根据光学相干层析信号曲线确定光学相干层析信号峰值，从而确定样品臂焦平面，以微米以下的重复精度实现显微物镜焦面和参考臂镜面同时对准折射介质下表面，实现快速对焦过程。
附图说明
图1显示为本发明中并行相干层析设备及其自动对焦系统原理图。
图2显示为本发明未消除镜面反射光获得的信号强度曲线。
图3显示为本发明中平面反射界面对光线的反射示意图。
图4显示为本发明中非平面样品表面对光线的反射示意图。
图5显示为本发明中照明光瞳偏离光轴并相对光轴非旋转对称的结构示意图。
图6显示为本发明中照明光瞳覆盖光轴并相对光轴非旋转对称的结构示意图。
图7显示为本发明中环形照明光瞳与圆形探测光瞳相对光轴旋转对称的结构示意图。
图8显示为本发明中环形照明光瞳与环形探测光瞳相对光轴旋转对称的结构示意图。
图9显示为本发明中任意形状的照明光瞳和任意形状的探测光瞳相对光轴非旋转对称的结构示意图。
图10显示为本发明消除镜面反射光后获得的信号强度曲线。
图11显示为本发明中“同方向扫描消空回”方法消除电机空回的原理示意图。
标号说明
200 照明臂
201 弱相干光源
202 准直光镜
203 扩束中继
300 第四照明光瞳
301 入射光速
302 第三显微物镜
303 照明平面反射面
304 照明非平面表面
305 反射回光
306 与入射光束相对光轴回转对称光束
307 与入射光束同位置的反向反射光束
500 分光镜
600 样品臂
601 第一显微物镜
610 浸没介质
611 盖玻片上表面
612 盖玻片下表面
6110 离焦干涉图案
6120 焦面干涉图案
620 待测样品
621 照明光瞳单元
6201 第一照明光瞳
6202 第二照明光瞳
6203 第三照明光瞳
630 样品臂位移台
700 探测臂
701 聚焦透镜(组)
710 探测器
720 探测光瞳单元
7203 探测光瞳
730 光轴
800 第一参考臂
801 第二显微物镜
802 参考镜面
810 参考臂位移台
901 电机指定方向
902 空回
920 第一位置
921 第二位置
930 第三位置
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图式中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。
如由本领域的技术人员理解的，“光学相干层析信号强度”指的是来自参考臂和采样臂的光束，在探测臂中的探测器表面发生干涉，采取相移算法提取层析图像，探测器所有探测单元的均值(或者整个阵列探测器层析信号值从高到低做排序，排序较高的指定数量的信号值的均值，如针对分别率为1024*768的相机的排序前300的均值)。“光学相干层析信号强度”在本发明中将用于标定样品表面。“光学相干层析信号强度”曲线通常采取相对坐标进行归一化。
“照明光瞳”指的是物理孔径或者物理孔径的空间成像约束在样品臂显微物镜后焦面，对样品的照明光束通过该物理孔径照明样品。
“探测光瞳”指的是物理孔径或者物理孔径的空间成像约束在样品探测臂成像物镜前焦面，从样品的反射或者透射光束，经过该物理孔径到达探测器。
“非回转对称光瞳”指的是相对光轴，照明光瞳的回转对称结构与探测光瞳不重合，样品附近的镜面反射回光无法进入探测光瞳的系统结构排布。
“同方向扫描消空回”方法是指如果电机按照指定方向推动，不存在空回。需要在指定方向的坐标递减位置定位时，将电机反方向退回超过预定定位位置空回量的位置，再次沿着规定的扫描方向进行扫描来实现消除空回的方法。
实施例1，请参阅图1至图11，本发明提供一种并行光学相干层析成像设备自动对焦方法，包括有：
S1：光源产生光；本实施例中的光源为弱相干光源201，弱相干光源201可以为卤钨灯或LED等能实现本方案的光源。
S2：将弱相干光源201产生的光通过分光镜500分解为采样光和参考光，采样光照射待测样品620后返回第一回光，参考光照射参考镜面802后返回第二回光；其中，第一回光包括有样品表面反射回光和覆盖待测样品的折射介质的反射回光；本实施例中，折射介质为玻璃透镜或盖玻片，即第一回光包括样品表面反射光和盖玻片的镜面反射光。
S3：将第一回光和第二回光合束成第一合成光经过探测光瞳单元720进入探测臂700，并到达探测器710，探测器710检测第一合成光的光学相干层析信号强度，获得第一合成光的光学相干层析信号强度峰值，还同时获得第一合成光的光学相干层析信号强度次峰值；
S4：将参考镜面802共轭至反射介质下表面(即待测样品表面)作为参考成像面；
S5：将样品臂焦平面定位在参考成像面上，根据光学相干层析信号强度峰值确定样品臂焦平面；具体过程如下：利用相干层析信号强度曲线定位样品臂焦平面到参考成像面。采取系统干涉测量方法，沿着样品臂光轴扫描焦平面，距离焦点越近，层析信号强度越强，层析信号强度峰值位置则是系统焦面，即样品臂的焦平面。其中，参考成像面位于参考镜面802上。通过并行光学相干层析设备，参考臂800扫描可以获得光学相干层析信号曲线，光学相干层析信号强度的峰值位置可以定位覆盖样品表面的折射介质下表面(即盖玻片下表面或玻璃透镜下表面)，本发明中将压紧待测样品表面的盖玻片下表面612规定为待测样品表面或样品表面；光学相干层析信号强度的次峰值位置可以定位覆盖样品表面的折射介质上表面(即盖玻片上表面或玻璃透镜上表面)。具体地，当样品臂600中的第一显微物镜601焦平面位移至盖玻片下表面612时，参考镜面802共轭到盖玻片下表面612时，将获得焦面干涉图案6120，即完成一次自动对焦。同时，参考镜面802共轭到盖玻片下表面612时，盖玻片上表面611离焦时，将获得离焦干涉图案6110，为完成下一次完成自动对焦做准备。本实施例中，折射介质为盖玻片或玻璃透镜，反射介质为待测样品620。
如图1所示，照明臂200中的弱相干光源201经过准直光镜202进行准直，再经过扩束中继203进行扩束，以分光镜500分解为参考光束和采样光束；参考光束照射参考臂800中的参考镜面802，采样光束照射样品臂600中照明光瞳单元621、盖玻片上表面611、盖玻片下表面612后进入样品620。采样光束从待测样品620、盖玻片上表面611、盖玻片下表面612的反射光以及参考光束从参考镜面802的反射光经过分光镜500合束后经过探测光瞳单元720进入探测臂700，并到达探测器710；参考镜面802共轭到样品臂600中，对应等光程位置处的反射采样光束将会与反射参考光束发生干涉，获得光学相干层析信号峰值和次峰值。
当样品臂600中的第一显微物镜601焦平面位移至盖玻片下表面612时，参考镜面802共轭到盖玻片下表面612时，将获得焦面干涉图案6120，即完成一次自动对焦。同时，参考镜面802共轭到盖玻片下表面612时，盖玻片上表面611离焦时，将获得离焦干涉图案6110，为完成下一次完成自动对焦做准备。
其中，探测臂700中的聚焦透镜或聚焦透镜组701用于聚焦，第二显微物镜801和参考镜面802位于参考臂位移台810上；待测样品620位于样品臂位移台上。
在完成自动对焦后，通过迭代调焦提高对焦精度，具体包括：
将样品臂焦平面定位在参考成像面上，在样品臂中的折射介质表面设置标记，即在盖玻片或玻璃透镜表面设置标记；根据标记的像面清晰峰值确定样品臂焦平面。其中，准直光在相机上成像最锐利的点处即是标记物像面的清晰峰值处。本实施例中，可用于进行设置标记的物质包括：刻线、分划或者灰尘等。
如图2所示，其中，横坐标表示扫描的深度，纵坐标表示光学相干层析信号强度。在没有采取非回转对称光瞳排布消除盖玻片的镜面反射光时，即在通常使用状态下，将参考臂800沿着光轴730扫描，沿着参考臂800连续改变光程长度进行扫描，让样品臂600中的待测样品620保持不变，获得的相干层析信号对应参考臂800位置的相干层析信号曲线，对该曲线采取相对坐标进行归一化。其中，峰值A和B分别对应于参考镜面802共轭到盖玻片上表面611和盖玻片下表面612。将参考镜面802共轭到盖玻片下表面612，沿光轴扫描样品臂600中的样品620，“光学相干层析信号强度”的峰值B的位置对应于样品臂600中的第一显微物镜601的焦平面位于盖玻片下表面612。其中峰值A为盖玻片上表面611形成的峰值，盖玻片上表面611的反射光为镜面反射光，属于虚光或杂光，属于不需要的光，因此需要滤除或排除其影响。
设置照明光瞳的回转对称结构与探测光瞳相对光轴不重合而构成的非回转对称光瞳，非回转对称光瞳用于阻挡第一回光中覆盖样品表面的盖玻片的镜面反射光与第二回光合成第一合成光并进入探测器710；通过非回转对称光瞳来消除盖玻片的镜面反射光。采取非回转对称光瞳光路排布抑制反射面强反射。对焦过程中，并行相干层析显微设备照明光瞳使用孔径光阑遮挡一部分，使得照明光瞳相对光轴的回转对称图像与探测光瞳无交叠区域；对焦完成后，孔径光阑被移出光路。
在一实施例中，如图3所示，从第四照明光瞳300一侧的入射光束301，经过第三显微物镜302聚焦，照明平面反射面(如盖玻片)303时，反射回光305与入射光束301相对光轴730回转对称。在非回转对称光瞳光路排布情形下，可以阻止盖玻片的镜面反射光到达探测臂700中的探测器710。能够隔离来自盖玻片的强镜面反射，大大提高了对焦精度以及系统成像的穿透深度和图像对比度。
在另一实施例中，如图4所示，从第四照明光瞳300一侧的入射光束301，经过第三显微物镜302聚焦，照明非平面表面(如样品表面)304时，反射回光305含有与入射光束301相对光轴730回转对称的光束306，以及与入射光束同位置的反向反射光束307。待测样品上表面与覆盖待测样品的折射介质下表面存在一空腔，在非回转对称光瞳排布下，在空腔处填充浸没介质。在非回转对称光瞳光路排布情形下，阻止了盖玻片的镜面反射光到达探测器，仅接收样品表面612的反射回光，自动对焦依然可以将样品臂600中的第一显微物镜601的焦平面定位到样品表面612上，并将参考镜面802共轭到样品表面612。其中，对于样品表面和盖玻片之间以浸没介质填充，利用相对光轴非回转对称的照明光瞳，排除盖玻片的镜面反射光，使样品臂600中的第一显微物镜601的焦平面精确定位到样品表面612上，精度可以达到亚微米级，由照明臂200中的弱相干光源201相干长度决定。本实施例中，浸没介质610为水浸显微液体，常用的包括水、硅油等。
在一实施例中，如图5所示，在非回转对称光瞳排布下，采取照明光瞳单元621中的第一照明光瞳6201偏离光轴730并相对光轴730非旋转对称的结构，此情形下探测光瞳单元720中的第一探测光瞳7203没有施加特别约束，其回转对称图像与第一照明光瞳6201无交叠区域，第一照明光瞳6201在样品臂中充当了第一探测光瞳7203的作用，二者位置重合，本实施例可以阻止盖玻片的镜面反射光进入探测臂700中的探测器710，能够隔离来自盖玻片的强镜面反射，大大提高了对焦精度以及系统成像的穿透深度和图像对比度。
在另一实施例中，如图6所示，在非回转对称光瞳排布下，采取照明光瞳单元621中的第二照明光瞳6202覆盖光轴730并相对光轴730非旋转对称的结构，此情形下探测光瞳单元720中的第一探测光瞳7203没有施加特别约束，其回转对称图像与第二照明光瞳6202无交叠区域，第二照明光瞳6202在样品臂中充当了第一探测光瞳7203的作用，二者位置重合，本实施例阻挡了盖玻片的镜面反射光进入探测臂700中的探测器710，能够隔离来自盖玻片的强镜面反射，大大提高了对焦精度以及系统成像的穿透深度和图像对比度。
在一实施例中，如图7所示，在非回转对称光瞳排布下，照明光瞳单元621中的第三照明光瞳6203为环形，内径大于探测光瞳7203为圆形的外径，且相对光轴730旋转对称，本实施例可以阻止盖玻片镜面反射光进入探测臂700中的探测器710，能够隔离来自盖玻片的强镜面反射，大大提高了对焦精度以及系统成像的穿透深度和图像对比度。
在另一实施例中，如图8所示，在非回转对称光瞳排布下，照明光瞳单元621中的第三照明光瞳6203为环形，外径小于探测光瞳7203为环形的内径，且相对光轴730旋转对称，本实施例可以阻止盖玻片的镜面反射光进入探测臂700中的探测器710，能够隔离来自盖玻片的强镜面反射，大大提高了对焦精度以及系统成像的穿透深度和图像对比度。
在一实施例中，如图9所示，在非回转对称光瞳排布下，照明光瞳单元621中的第三照明光瞳6203和第一探测光瞳7203为任意形状，且相对光轴730不旋转对称，第三照明光瞳6203回转对称图像与探测光瞳7203无交叠区域。本实施例可以阻止盖玻片的镜面反射光进入探测臂700中的探测器710，能够隔离来自盖玻片的强镜面反射，大大提高了对焦精度以及系统成像的穿透深度和图像对比度。
如图10所示，其中，横坐标表示扫描的深度，纵坐标表示光学相干层析信号强度。以非对称光瞳抑制平面反射，采取非回转对称光瞳排布消除盖玻片的镜面反射光。自动对焦过程扫描参考镜面802进行自动对焦获得的层析信号强度曲线。将参考臂800沿着光轴730扫描，沿着参考臂800连续改变光程长度进行扫描，让样品臂600中待测样品620保持不变，获得的相干层析信号对应参考臂800位置的相干层析信号曲线，对该曲线采取相对坐标进行归一化。其峰值C对应于样品表面612。将参考镜面802共轭到即样品表面612，沿光轴730扫描样品臂600中的待测样品620，光学相干层析信号强度的峰值位置对应于样品臂600中的第一显微物镜601的焦平面位于样品表面612，其中，峰值C为采取非回转对称光瞳排布消除盖玻片的镜面反射光后盖玻片下表面612形成的峰值。
在样品臂单独扫描或样品臂单独扫描或在样品臂和参考臂同时扫描时，是通过电机驱动参考臂位移台810和样品臂位移台630单独或共同完成的。而在电机驱动过程中，会有电机运动的空回，增加了对焦的误差。因此，采取“同方向扫面消空回”的方法扫描样品臂中600和参考臂800，消除电机运动的空回，保证样品臂焦平面定位在参考成像面上的精度高于1微米，减小了对焦的误差。如图11所示，同方向扫描消空回方法的原理如下：在参考臂800以及样品臂600的扫描过程中，规定电机按照预设扫描方向901推动时，不存在空回902。若存在空回需要消除时，需要在指定方向的坐标递减位置定位，例如从第一位置920回到第三位置930时，将电机按照预设扫描方向的反方向退回超过预定定位位置空回量的第二位置921，再次沿着规定的扫描方向901进行扫描消除空回。
综上所述，本发明基于并行光学相干层析成像设备本身作为多通道的弱相位时域光学干涉系统，利用系统本身的自检测量能力，无需额外对焦模块，以微米以下的重复精度实现显微物镜的焦面、参考镜面同时对准折射介质下表面(如盖玻片下表面)的快速对焦过程。并且，本发明采取结构化的照明光瞳和探测光瞳，隔离来自盖玻片的强镜面反射，大大提高了对焦精度以及系统成像的穿透深度和图像对比度。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
实施例2，如图1至图11，本发明还提供一种并行光学相干层析成像设备自动对焦系统，包括有：
光源模块，用于产生光；本实施例中的光源为弱相干光源201，弱相干光源201可以为卤钨灯或LED等能实现本方案的光源。
光源分解模块，用于将弱相干光源201产生的光通过分光镜500分解为采样光和参考光；
光学相干层析信号采集模块，采样光照射待测样品620后返回第一回光，参考光照射参考镜面802后返回第二回光；其中，第一回光包括有样品表面反射回光和覆盖待测样品的折射介质的反射回光；本实施例中，折射介质为玻璃透镜或盖玻片，即第一回光包括样品表面反射光和盖玻片的镜面反射光。将第一回光和第二回光合束成第一合成光经过探测光瞳单元720进入探测臂700，并到达探测器710，探测器710检测第一合成光的光学相干层析信号强度，获得第一合成光的光学相干层析信号强度峰值，还同时获得第一合成光的光学相干层析信号强度次峰值；
对焦模块，将参考镜面802共轭至反射介质下表面(即待测样品表面)作为参考成像面；将样品臂焦平面定位在参考成像面上，根据光学相干层析信号强度峰值确定样品臂焦平面。具体过程如下：利用相干层析信号强度曲线定位样品臂焦平面到参考成像面。采取系统干涉测量方法，沿着样品臂光轴扫描焦平面，距离焦点越近，层析信号强度越强，层析信号强度峰值位置则是系统焦面，即样品臂的焦平面。其中，参考成像面位于参考镜面802上。通过并行光学相干层析设备，参考臂800扫描可以获得光学相干层析信号曲线，光学相干层析信号强度的峰值位置可以定位覆盖样品表面的折射介质下表面(即盖玻片下表面或玻璃透镜下表面)，本发明中将压紧待测样品表面的盖玻片下表面612规定为待测样品表面或样品表面；光学相干层析信号强度的次峰值位置可以定位覆盖样品表面的折射介质上表面(即盖玻片上表面或玻璃透镜上表面)。具体地，当样品臂600中的第一显微物镜601焦平面位移至盖玻片下表面612时，参考镜面802共轭到盖玻片下表面612时，将获得焦面干涉图案6120，即完成一次自动对焦。同时，参考镜面802共轭到盖玻片下表面612时，盖玻片上表面611离焦时，将获得离焦干涉图案6110，为完成下一次完成自动对焦做准备。其中，折射介质为盖玻片或玻璃透镜，反射介质为待测样品620。
如图1所示，照明臂200中的弱相干光源201经过准直光镜202进行准直，再经过扩束中继203进行扩束，以分光镜500分解为参考光束和采样光束；参考光束照射参考臂800中的参考镜面802，采样光束照射样品臂600中照明光瞳单元621、盖玻片上表面611、盖玻片下表面612后进入样品620。采样光束从待测样品620、盖玻片上表面611、盖玻片下表面612的反射光以及参考光束从参考镜面802的反射光经过分光镜500合束后经过探测光瞳单元720进入探测臂700，并到达探测器710；参考镜面802共轭到样品臂600中，对应等光程位置处的反射采样光束将会与反射参考光束发生干涉，获得光学相干层析信号峰值和次峰值。
当样品臂600中的第一显微物镜601焦平面位移至盖玻片下表面612时，参考镜面802共轭到盖玻片下表面612时，将获得焦面干涉图案6120，即完成一次自动对焦。同时，参考镜面802共轭到盖玻片下表面612时，盖玻片上表面611离焦时，将获得离焦干涉图案6110，为完成下一次完成自动对焦做准备。
其中，探测臂700中的聚焦透镜或聚焦透镜组701用于聚焦，第二显微物镜801和参考镜面802位于参考臂位移台810上；待测样品620位于样品臂位移台上。
对焦模块还包括有完成自动对焦后，通过迭代调焦提高对焦精度，具体包括：将样品臂焦平面定位在参考成像面上，在样品臂中的折射介质表面设置标记，即在盖玻片或玻璃透镜表面设置标记；根据标记的像面清晰峰值确定样品臂焦平面。其中，准直光在相机上成像最锐利的点处即是标记物像面的清晰峰值处。本实施例中，可用于进行设置标记的物质包括：刻线、分划或者灰尘等。
如图2所示，其中，横坐标表示扫描的深度，纵坐标表示光学相干层析信号强度。在没有采取非回转对称光瞳排布消除盖玻片的镜面反射光时，即在通常使用状态下，将参考臂800沿着光轴730扫描，沿着参考臂800连续改变光程长度进行扫描，让样品臂600中的待测样品620保持不变，获得的相干层析信号对应参考臂800位置的相干层析信号曲线，对该曲线采取相对坐标进行归一化。其中，峰值A和B分别对应于参考镜面802共轭到盖玻片上表面611和盖玻片下表面612。将参考镜面802共轭到盖玻片下表面612，沿光轴扫描样品臂600中的样品620，“光学相干层析信号强度”的峰值B的位置对应于样品臂600中的第一显微物镜601的焦平面位于盖玻片下表面612。其中峰值A为盖玻片上表面611形成的峰值，盖玻片上表面611的反射光为镜面反射光，属于虚光或杂光，属于不需要的光，因此需要滤除或排除其影响。
光学相干层析信号采集模块还包括有设置照明光瞳的回转对称结构与探测光瞳相对光轴不重合而构成的非回转对称光瞳，非回转对称光瞳用于阻挡第一回光中覆盖样品表面的盖玻片的镜面反射光与第二回光合成第一合成光并进入探测器710；通过非回转对称光瞳来消除盖玻片的镜面反射光。采取非回转对称光瞳光路排布抑制反射面强反射。对焦过程中，并行相干层析显微设备照明光瞳使用孔径光阑遮挡一部分，使得照明光瞳相对光轴的回转对称图像与探测光瞳无交叠区域；对焦完成后，孔径光阑被移出光路。
在一实施例中，如图3所示，从第四照明光瞳300一侧的入射光束301，经过第三显微物镜302聚焦，照明平面反射面(如盖玻片)303时，反射回光305与入射光束301相对光轴730回转对称。在非回转对称光瞳光路排布情形下，可以阻止盖玻片的镜面反射光到达探测臂700中的探测器710。能够隔离来自盖玻片的强镜面反射，大大提高了对焦精度以及系统成像的穿透深度和图像对比度。
在另一实施例中，如图4所示，从第四照明光瞳300一侧的入射光束301，经过第三显微物镜302聚焦，照明非平面表面(如样品表面)304时，反射回光305含有与入射光束301相对光轴730回转对称的光束306，以及与入射光束同位置的反向反射光束307。待测样品上表面与覆盖待测样品的折射介质下表面存在一空腔，在非回转对称光瞳排布下，在空腔处填充浸没介质。在非回转对称光瞳光路排布情形下，阻止了盖玻片的镜面反射光到达探测器，仅接收样品表面612的反射回光，自动对焦依然可以将样品臂600中的第一显微物镜601的焦平面定位到样品表面612上，并将参考镜面802共轭到样品表面612。其中，对于样品表面和盖玻片之间以浸没介质填充，利用相对光轴非回转对称的照明光瞳，排除盖玻片的镜面反射光，使样品臂600中的第一显微物镜601的焦平面精确定位到样品表面612上，精度可以达到亚微米级，由照明臂200中的弱相干光源201相干长度决定。本实施例中，浸没介质610为水浸显微液体，常用的包括水、硅油等。
在一实施例中，如图5所示，在非回转对称光瞳排布下，采取照明光瞳单元621中的第一照明光瞳6201偏离光轴730并相对光轴730非旋转对称的结构，此情形下探测光瞳单元720中的第一探测光瞳7203没有施加特别约束，其回转对称图像与第一照明光瞳6201无交叠区域，第一照明光瞳6201在样品臂中充当了第一探测光瞳7203的作用，二者位置重合，本实施例可以阻止盖玻片的镜面反射光进入探测臂700中的探测器710，能够隔离来自盖玻片的强镜面反射，大大提高了对焦精度以及系统成像的穿透深度和图像对比度。
在另一实施例中，如图6所示，在非回转对称光瞳排布下，采取照明光瞳单元621中的第二照明光瞳6202覆盖光轴730并相对光轴730非旋转对称的结构，此情形下探测光瞳单元720中的第一探测光瞳7203没有施加特别约束，其回转对称图像与第二照明光瞳6202无交叠区域，第二照明光瞳6202在样品臂中充当了第一探测光瞳7203的作用，二者位置重合，本实施例阻挡了盖玻片的镜面反射光进入探测臂700中的探测器710，能够隔离来自盖玻片的强镜面反射，大大提高了对焦精度以及系统成像的穿透深度和图像对比度。
在一实施例中，如图7所示，在非回转对称光瞳排布下，照明光瞳单元621中的第三照明光瞳6203为环形，内径大于探测光瞳7203为圆形的外径，且相对光轴730旋转对称，本实施例可以阻止盖玻片镜面反射光进入探测臂700中的探测器710，能够隔离来自盖玻片的强镜面反射，大大提高了对焦精度以及系统成像的穿透深度和图像对比度。
在另一实施例中，如图8所示，在非回转对称光瞳排布下，照明光瞳单元621中的第三照明光瞳6203为环形，外径小于探测光瞳7203为环形的内径，且相对光轴730旋转对称，本实施例可以阻止盖玻片的镜面反射光进入探测臂700中的探测器710，能够隔离来自盖玻片的强镜面反射，大大提高了对焦精度以及系统成像的穿透深度和图像对比度。
在一实施例中，如图9所示，在非回转对称光瞳排布下，照明光瞳单元621中的第三照明光瞳6203和第一探测光瞳7203为任意形状，且相对光轴730不旋转对称，第三照明光瞳6203回转对称图像与探测光瞳7203无交叠区域。本实施例可以阻止盖玻片的镜面反射光进入探测臂700中的探测器710，能够隔离来自盖玻片的强镜面反射，大大提高了对焦精度以及系统成像的穿透深度和图像对比度。
如图10所示，其中，横坐标表示扫描的深度，纵坐标表示光学相干层析信号强度。以非对称光瞳抑制平面反射，采取非回转对称光瞳排布消除盖玻片的镜面反射光。自动对焦过程扫描参考镜面802进行自动对焦获得的层析信号强度曲线。将参考臂800沿着光轴730扫描，沿着参考臂800连续改变光程长度进行扫描，让样品臂600中待测样品620保持不变，获得的相干层析信号对应参考臂800位置的相干层析信号曲线，对该曲线采取相对坐标进行归一化。其峰值C对应于样品表面612。将参考镜面802共轭到即样品表面612，沿光轴730扫描样品臂600中的待测样品620，光学相干层析信号强度的峰值位置对应于样品臂600中的第一显微物镜601的焦平面位于样品表面612，其中，峰值C为采取非回转对称光瞳排布消除盖玻片的镜面反射光后盖玻片下表面612形成的峰值。
在样品臂单独扫描或样品臂单独扫描或在样品臂和参考臂同时扫描时，是通过电机驱动参考臂位移台810和样品臂位移台630单独或共同完成的。而在电机驱动过程中，会有电机运动的空回，增加了对焦的误差。因此，采取“同方向扫面消空回”的方法扫描样品臂中600和参考臂800，消除电机运动的空回，保证样品臂焦平面定位在参考成像面上的精度高于1微米，减小了对焦的误差。如图11所示，同方向扫描消空回方法的原理如下：在参考臂800以及样品臂600的扫描过程中，规定电机按照预设扫描方向901推动时，不存在空回902。若存在空回需要消除时，需要在指定方向的坐标递减位置定位，例如从第一位置920回到第三位置930时，将电机按照预设扫描方向的反方向退回超过预定定位位置空回量的第二位置921，再次沿着预设扫描方向901进行扫描消除空回。
综上所述，本发明基于并行光学相干层析成像设备本身作为多通道的弱相位时域光学干涉系统，利用系统本身的自检测量能力，无需额外对焦模块，以微米以下的重复精度实现显微物镜的焦面、参考镜面同时对准折射介质下表面(如盖玻片下表面)的快速对焦过程。并且，本发明采取结构化的照明光瞳和探测光瞳，隔离来自盖玻片的强镜面反射，大大提高了对焦精度以及系统成像的穿透深度和图像对比度。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (7)

1.一种并行光学相干层析成像设备自动对焦方法，其特征在于，所述方法包括有：
一光源产生光；
将所述光分解为采样光和参考光，所述采样光照射待测样品后返回第一回光，所述参考光照射参考镜面后返回第二回光；
将所述第一回光和第二回光合束成第一合成光，检测第一合成光的光学相干层析信号强度，获得第一合成光的光学相干层析信号强度峰值；
将参考镜面共轭至待测样品表面作为参考成像面；
将样品臂焦平面定位在所述参考成像面上，根据光学相干层析信号强度峰值确定样品臂焦平面，完成自动对焦；
还包括有：设置照明光瞳的回转对称结构与探测光瞳相对光轴不重合，构成非回转对称光瞳，所述非回转对称光瞳用于阻挡第一回光中覆盖样品表面的折射介质的反射光与第二回光合成第一合成光；
在非回转对称光瞳排布下，样品臂中的照明光瞳偏离光轴或样品臂中的照明光瞳覆盖光轴，并相对光轴非旋转对称；
或者，在非回转对称光瞳排布下，样品臂中环形的照明光瞳的内径大于探测臂中圆形的探测光瞳的外径，或样品臂中环形的照明光瞳的外径小于探测臂中环形的探测光瞳的内径；
或者，在非回转对称光瞳排布下，样品臂中任意形状的照明光瞳和探测臂中任意形状的探测光瞳相对光轴非旋转对称。
2.根据权利要求1所述的并行光学相干层析成像设备自动对焦方法，其特征在于，还包括有，完成自动对焦后，迭代调焦提高对焦精度，具体包括：
将样品臂焦平面定位在所述参考成像面上；
在样品臂中的折射介质表面设置标记，根据标记的像面清晰峰值确定样品臂焦平面。
3.根据权利要求1所述的并行光学相干层析成像设备自动对焦方法，其特征在于：还包括有在样品臂和/或参考臂扫描时，将电机按照预设扫描方向的反方向退回预定定位位置，并再沿着预设扫描方向进行扫描。
4.根据权利要求1所述的并行光学相干层析成像设备自动对焦方法，其特征在于：待测样品上表面与覆盖待测样品的折射介质下表面设置一空腔，在非回转对称光瞳排布下，在空腔处填充浸没介质。
5.一种并行光学相干层析成像设备自动对焦系统，其特征在于，包括有：
光源模块，用于产生光；
光源分解模块，用于将光源模块产生的光分解为采样光和参考光；
光学相干层析信号采集模块，将采样光照射待测样品后返回第一回光，以及参考光照射参考镜面后返回第二回光；将所述第一回光和第二回光合束成第一合成光，检测第一合成光的光学相干层析信号强度，获得第一合成光的光学相干层析信号强度峰值；
对焦模块，将参考镜面共轭至待测样品表面作为参考成像面；将样品臂焦平面定位在所述参考成像面上，根据光学相干层析信号强度峰值确定样品臂焦平面，完成自动对焦；
所述光学相干层析信号采集模块还包括有：设置照明光瞳的回转对称结构与探测光瞳相对光轴不重合而构成的非回转对称光瞳，非回转对称光瞳用于阻挡第一回光中覆盖样品表面的折射介质的反射光与第二回光合成第一合成光；
在非回转对称光瞳排布下，样品臂中的照明光瞳偏离光轴或样品臂中的照明光瞳覆盖光轴，并相对光轴非旋转对称；
或者，在非回转对称光瞳排布下，样品臂中环形的照明光瞳的内径大于探测臂中圆形的探测光瞳的外径，或样品臂中环形的照明光瞳的外径小于探测臂中环形的探测光瞳的内径；
或者，在非回转对称光瞳排布下，样品臂中任意形状的照明光瞳和探测臂中任意形状的探测光瞳相对光轴非旋转对称。
6.根据权利要求5所述的并行光学相干层析成像设备自动对焦系统，其特征在于：所述对焦模块还包括有完成自动对焦后，迭代调焦提高对焦精度，具体包括：
在样品臂中的折射介质表面设置标记，根据标记的像面清晰峰值确定样品臂焦平面。
7.根据权利要求5所述的并行光学相干层析成像设备自动对焦系统，其特征在于：所述系统还包括有：待测样品上表面与覆盖待测样品的折射介质下表面设置一空腔，在非回转对称光瞳排布下，在空腔处填充浸没介质。
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