CN110129203B - 一种厌氧氨氧化菌种的保藏及恢复方法 - Google Patents

一种厌氧氨氧化菌种的保藏及恢复方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种厌氧氨氧化菌种的保藏方法，包括：将含有厌氧氨氧化菌种的污泥用无机盐溶液冲洗后保存在保藏容器中；向保藏容器中加入保护剂混合均匀，去除混合液中的溶解氧后置于4～25℃下保藏；所述保护剂为水和厌氧氨氧化菌的胞外聚合物的混合物。本发明所使用的保护剂为生物的内源物质，规避了生物排异性；对不同温度条件下的厌氧氨氧化菌种保藏均具有一定的指导意义。本发明还公开了一种厌氧氨氧化菌种的恢复方法，从保藏容器中取出厌氧氨氧化菌种，用水和所述的无机盐溶液分别冲洗后置于反应器内进行恢复。本发明可有效对厌氧氨氧化菌种进行保藏，并能够短时间恢复保藏污泥的脱氮性能。

Description

一种厌氧氨氧化菌种的保藏及恢复方法
技术领域
本发明涉及厌氧氨氧化菌种保藏技术领域，具体涉及一种厌氧氨氧化菌种的保藏及恢复方法。
背景技术
水体氮素污染成为威胁生态系统和人类健康的重要问题之一，实现对氮素污染物的有效控制亟待解决。厌氧氨氧化因其高效率、低能耗、无二次污染等优点在废水处理领域具有巨大的开发价值。但由于厌氧氨氧化菌生长极为缓慢，导致该工艺应用于实际废水处理的启动周期过长。世界上第一个工业化厌氧氨氧化工艺处理氨氮废水装置用时长达3.5年。
因此，长期保藏厌氧氨氧化菌，建立菌种库，为污水处理应用提供充足种源成为工业化规模应用的关键，而建立简单、快速、有效、经济的厌氧氨氧化菌种保藏技术是前提。
目前，厌氧氨氧化菌种(anammox菌种)保藏的方法多是基于冷藏法、冷冻法及冻干法，同时添加低温保护剂(如二甲亚砜、海藻糖、甘油、葡萄糖、聚乙烯醇、海藻酸钠等)、保藏基质(NH4 +-N、NO2 --N等)或缓冲液(钼酸盐、NO3 --N等)。但冷藏法保藏效果较差，菌体死亡率较高；冷冻法和冻干法设备成本高且操作繁琐，同时不利于大规模的工业化应用；低温保护剂价格昂贵，不能大规模的使用的同时可能会导致anammox菌种产生生物排异性或是对anammox菌种活性造成不可逆的破坏。
胞外聚合物(Extracellular polymeric substance，EPS)是活性污泥絮体中的重要组成部分，主要包括多糖、蛋白质、核酸和腐殖酸等。EPS在微生物的粘附和聚集，以及微生物群落结构的稳定性方面起着关键作用。在快速启动厌氧氨氧化的过程中，EPS可以增加厌氧氨氧化菌的抗逆性。并且EPS为厌氧氨氧化污泥自身所具有的内源物质，因而能够降低成本并且规避了生物排异性。
发明内容
针对本领域存在的不足之处，本发明提供了一种厌氧氨氧化菌种的保藏方法，可对厌氧氨氧化菌种的保藏提出指导意见，同时推动了厌氧氨氧化工艺的产业化应用。
一种厌氧氨氧化菌种的保藏方法，包括：
(1)将含有厌氧氨氧化菌种的污泥用无机盐溶液冲洗后保存在保藏容器中；
(2)向保藏容器中加入保护剂混合均匀，去除混合液中的溶解氧后置于4～25℃下保藏；所述保护剂为水和厌氧氨氧化菌的胞外聚合物的混合物。
步骤(1)中，所述无机盐溶液的组成包括：KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·2H2O和KHCO3。
所述污泥的体积与保藏容器的容积之比为1:1.5～3。在此比例下，可保证保藏容器内有足够的空间使污泥与保护剂充分混合，使胞外聚合物更能发挥对污泥的保护作用。
步骤(2)中，所述污泥的体积与保护剂的体积之比为1:0.5～2。
优选地，所述污泥的体积与保护剂的体积之比为1:1.5～2。此比例下，保护剂可对待保藏污泥起到充分保护的作用，最大程度的保证保藏后污泥活性的留存，易于恢复。
所述厌氧氨氧化菌的胞外聚合物与保护剂的体积比为1:5～10。在此比例下，厌氧氨氧化菌的胞外聚合物对污泥活性的保护效果最好，并且可使污泥活性提高5～10倍，从而保证保藏后的污泥快速恢复活性。
所述厌氧氨氧化菌的胞外聚合物可通过蒸汽法提取。
所述蒸汽法的步骤包括：
(I)将厌氧氨氧化污泥清洗后加入水中，离心得到污泥沉淀物；
(II)将污泥沉淀物加入0.9％生理盐水中，在0.6～1.0MPa、100～110℃下高压蒸汽灭菌0.5～1.5h后，离心得到的上清液即为厌氧氨氧化菌的胞外聚合物。
步骤(2)中，所述去除混合液中的溶解氧的具体方法为向混合液中通入稀有气体或氮气，曝气15～30min。
本发明还提供了一种厌氧氨氧化菌种的恢复方法，包括：
(a)从所述的保藏有厌氧氨氧化菌种的保藏容器中取出污泥，用水和所述的无机盐溶液分别冲洗后置于反应器内，反应器运行条件如下：避光且温度为30～36℃、水力停留时间为1.5～2h，进水中氨氮和亚硝氮的浓度相同且不大于70mg L-1；
(b)分阶段提升进水中氨氮和亚硝氮的浓度，且每一阶段的进水中氨氮和亚硝氮的浓度相同，直至进水中氨氮与亚硝氮的浓度均不小于280mg L-1，且反应器的总氮去除效率不低于88％，完成厌氧氨氧化菌种的恢复。
步骤(a)中，所述进水中还含有KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·2H2O、KHCO3、微量元素浓缩液I和微量元素浓缩液II。其中，微量元素浓缩液I的组分包括EDTA和FeSO4·7H2O；微量元素浓缩液II的组分包括EDTA、H3BO4、MnCl2·4H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、NiCl2·6H2O、NaMoO4·2H2O和CoCl2·6H2O。
所述污泥的体积与反应器的体积之比为1/4～1/2。
本发明与现有技术相比，主要优点包括：本发明设备占地面积小，操作简单；所使用的保护剂为EPS与水的混合物，其中EPS为生物的内源物质，较其他方法而言成本较低，且规避了生物排异性；对不同温度条件下的厌氧氨氧化菌种保藏均具有一定的指导意义；该方法可有效的对厌氧氨氧化菌种进行保藏，并能够短时间恢复保藏污泥的脱氮性能。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
将含有需保藏的厌氧氨氧化菌种的污泥用无机盐溶液清洗3次，放入1L有机塑料制的保藏容器中，以0.5L污泥为单位进行保藏。而后向保藏容器中加入0.5L保护剂，保护剂组成为437.5mL蒸馏水和62.5mL厌氧氨氧化菌EPS，而后氩气曝气20min并置于4℃下进行密封保藏。
有机塑料制的保藏容器为干净密闭的塑料瓶。需保藏的厌氧氨氧化菌种的活性为138.72mg N·(g VSS·d)-1。
本实施例的厌氧氨氧化菌EPS通过蒸汽法提取得到，具体步骤为：
取0.5mL污泥使用纯净水清洗3次后，加入纯净水10mL，在3200rpm条件下离心30min后弃去上清液，向剩余的污泥沉淀物中加入0.9％生理盐水25mL，并在0.8MPa、105℃下高压蒸汽灭菌60min，再次在3200rpm下进行离心30min，上清液即为厌氧氨氧化菌的胞外聚合物。
保藏三个月后，厌氧氨氧化菌种的活性为92.67mg N·(g VSS·d)-1，活性保留率为66.8％，说明该方法可以对厌氧氨氧化菌种进行有效保藏。
而后将含有厌氧氨氧化菌种的污泥从保藏容器中取出，并用自来水和无机盐溶液各清洗3次，然后将所保藏的0.5L污泥放入总体积为1.5L的上流式厌氧污泥床反应器中进行恢复。反应器在35±1℃、水力停留时间为2h，以模拟废水作为进水的条件下进行运行，进水氨氮与亚硝氮浓度均按照70mg·L-1、140mg·L-1、210mg·L-1、280mg·L-1的顺序逐逐级增加。根据监测反应器出水中氨氮与亚硝氮的浓度变化情况，当出水氨氮与亚硝氮浓度均低于15mg·L-1时，提高进水中氨氮与亚硝氮的浓度。其中，恢复阶段第1天，进水氨氮与亚硝氮浓度为70mg·L-1，第2～3天进水氨氮与亚硝氮浓度升高到140mg·L-1，第4～5天进水氨氮与亚硝氮浓度升高到210mg·L-1，第6～24天进水氨氮与亚硝氮浓度升高并维持在280mg·L-1。
上述的无机盐溶液的组分为：10mg·L-1KH2PO4、7.4mg·L-1CaCl2·2H2O、58.6mg·L-1MgSO4·2H2O、1250mg·L-1KHCO3。
上述的模拟废水的组分为：NaNO2和(NH4)2SO4以分别提供亚硝氮和氨氮，氨盐与亚硝酸盐的摩尔比为1:1、10mg·L-1KH2PO4、5.6mg·L-1CaCl2·2H2O、300mg·L-1MgSO4·2H2O、1250mg·L-1KHCO3以及浓度均为1.25mL·L-1的微量元素浓缩液I、II。其中，微量元素浓缩液I的具体组分为5g·L-1EDTA和9.14g·L-1FeSO4·7H2O；微量元素浓缩液II的具体组分为15g·L-1EDTA、0.014g·L-1H3BO4、0.99g·L-1MnCl2·4H2O、0.25g·L-1CuSO4·5H2O、0.43g·L-1ZnSO4·7H2O、0.21g·L-1NiCl2·6H2O、0.22g·L-1NaMoO4·2H2O、0.24g·L-1CoCl2·6H2O。
反应器运行至第13天，NO2 --N转化量/NH4 +-N消耗量的比值达到1.25，NO3 --N的生成量/NH4 +-N消耗量的比值为0.23，接近于厌氧氨氧化反应稳定时的理论值，表明此时已成功启动厌氧氨氧化反应。继续运行至第17天，反应器进水中氨氮及亚硝氮的浓度已恢复至280mg·L-1，总氮去除率已恢复至90.91％，总氮去除负荷达到5.03kg N·m-3·d-1。而后将水力停留时间缩短至1.5h，运行至第24天，总氮去除率仍然可达到90.56％，总氮去除负荷达到9.10kg N·m-3·d-1。经过24天的恢复处理后，保藏三个月的菌种的活性达到366.56mgN·(g VSS·d)-1，远高于保藏前的菌种活性(138.72mg N·(g VSS·d)-1)。
实施例2
将含有需保藏的厌氧氨氧化菌种的污泥用无机盐溶液清洗3次，放入1L的有机塑料制的保藏容器中，以0.5L污泥为单位进行保藏。而后向保藏容器中加入0.5L保护剂，保护剂组成为437.5mL蒸馏水和62.5mL厌氧氨氧化菌EPS，而后氩气曝气20min并置于室温(15-25℃)下进行保藏。
有机塑料制的保藏容器为干净密闭的塑料瓶。需保藏的厌氧氨氧化菌种的活性为138.72mg N·(g VSS·d)-1。
保藏三个月后，厌氧氨氧化菌种的活性为71.22mg N·(g VSS·d)-1，活性保留率为51.34％，说明该方法可以有效对厌氧氨氧化菌种进行保藏。
而后将含有厌氧氨氧化菌种的污泥从保藏容器中取出，并用自来水和无机盐溶液各清洗3次，然后将所保藏的0.5L污泥放入总体积为1.5L的上流式厌氧污泥床反应器中进行恢复。反应器在35±1℃、水力停留时间为2h，以模拟废水作为进水的条件下进行运行，进水氨氮与亚硝氮浓度均按照70mg·L-1、140mg·L-1、210mg·L-1、280mg·L-1的顺序逐逐级增加。根据监测反应器出水中氨氮与亚硝氮的浓度变化情况，当出水氨氮与亚硝氮浓度均低于15mg·L-1时，提高进水中氨氮与亚硝氮的浓度。其中，恢复阶段第1天，进水氨氮与亚硝氮浓度为70mg·L-1，第2～3天进水氨氮与亚硝氮浓度升高到140mg·L-1，第4～5天进水氨氮与亚硝氮浓度升高到210mg·L-1，第6～24天进水氨氮与亚硝氮浓度升高并维持在280mg·L-1。
上述的无机盐溶液的组分为：10mg·L-1KH2PO4、7.4mg·L-1CaCl2·2H2O、58.6mg·L-1MgSO4·2H2O、1250mg·L-1KHCO3。
上述的模拟废水的组分为：NaNO2和(NH4)2SO4以分别提供亚硝氮和氨氮，氨盐与亚硝酸盐的摩尔比为1:1、10mg·L-1KH2PO4、5.6mg·L-1CaCl2·2H2O、300mg·L-1MgSO4·2H2O、1250mg·L-1KHCO3以及浓度均为1.25mL·L-1的微量元素浓缩液I、II。其中，微量元素浓缩液I的具体组分为5g·L-1EDTA和9.14g·L-1FeSO4·7H2O；微量元素浓缩液II的具体组分为15g·L-1EDTA、0.014g·L-1H3BO4、0.99g·L-1MnCl2·4H2O、0.25g·L-1CuSO4·5H2O、0.43g·L-1ZnSO4·7H2O、0.21g·L-1NiCl2·6H2O、0.22g·L-1NaMoO4·2H2O、0.24g·L-1CoCl2·6H2O。
反应器运行至第7天，NO2 --N转化量/NH4 +-N消耗量的比值达到1.33，NO3 --N的生成量/NH4 +-N消耗量的比值为0.25，接近于厌氧氨氧化反应稳定时的理论值，表明此时已成功启动厌氧氨氧化反应。继续运行至第17天，反应器进水中氨氮及亚硝氮的浓度已恢复至280mg·L-1，总氮去除率已恢复至90.31％，总氮去除负荷达到5kg N·m-3·d-1。而后将水力停留时间缩短至1.5h，运行至第24天，总氮去除率仍然可达到90.77％，总氮去除负荷达到9.12kg N·m-3·d-1。经过24天的恢复处理后，保藏三个月的菌种的活性达到306.6mg N·(g VSS·d)-1，远高于保藏前的菌种活性(138.72mg N·(g VSS·d)-1)。
此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种厌氧氨氧化菌种的保藏方法，包括：
(1)将含有厌氧氨氧化菌种的污泥用无机盐溶液冲洗后保存在保藏容器中；
(2)向保藏容器中加入保护剂混合均匀，去除混合液中的溶解氧后置于4～25℃下保藏；所述保护剂为水和厌氧氨氧化菌的胞外聚合物的混合物，所述厌氧氨氧化菌的胞外聚合物通过蒸汽法提取；
所述蒸汽法的步骤包括：
(I)将厌氧氨氧化污泥清洗后加入水中，离心得到污泥沉淀物；
(II)将污泥沉淀物加入0.9％生理盐水中，在0.6～1.0MPa、100～110℃下高压蒸汽灭菌0.5～1.5h后，离心得到的上清液即为厌氧氨氧化菌的胞外聚合物。
2.根据权利要求1所述的厌氧氨氧化菌种的保藏方法，其特征在于，所述无机盐溶液的组成包括：KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·2H2O和KHCO3。
3.根据权利要求1所述的厌氧氨氧化菌种的保藏方法，其特征在于，所述污泥的体积与保藏容器的容积之比为1:1.5～3。
4.根据权利要求1所述的厌氧氨氧化菌种的保藏方法，其特征在于，所述污泥的体积与保护剂的体积之比为1:0.5～2。
5.根据权利要求1所述的厌氧氨氧化菌种的保藏方法，其特征在于，所述厌氧氨氧化菌的胞外聚合物与保护剂的体积比为1:5～10。
6.根据权利要求1所述的厌氧氨氧化菌种的保藏方法，其特征在于，所述去除混合液中的溶解氧的具体方法为向混合液中通入稀有气体或氮气，曝气15～30min。
7.一种厌氧氨氧化菌种的恢复方法，包括：
(a)从权利要求1～6任一权利要求所述的保藏有厌氧氨氧化菌种的保藏容器中取出污泥，用水和所述的无机盐溶液分别冲洗后置于反应器内，反应器运行条件如下：避光且温度为30～36℃、水力停留时间为1.5～2h，进水中氨氮和亚硝氮的浓度相同且不大于70mg L-1；
(b)分阶段提升进水中氨氮和亚硝氮的浓度，且每一阶段的进水中氨氮和亚硝氮的浓度相同，直至进水中氨氮与亚硝氮的浓度均不小于280mg L-1，且反应器的总氮去除效率不低于88％，完成厌氧氨氧化菌种的恢复。
8.根据权利要求7所述的厌氧氨氧化菌种的恢复方法，其特征在于，所述进水中还含有KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·2H2O、KHCO3、微量元素浓缩液I和微量元素浓缩液II；
所述微量元素浓缩液I的组分包括EDTA和FeSO4·7H2O；
所述微量元素浓缩液II的组分包括EDTA、H3BO4、MnCl2·4H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、NiCl2·6H2O、NaMoO4·2H2O和CoCl2·6H2O。
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