CN110114366A - 双膦酸喹诺酮缀合物及其用途 - Google Patents

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CN110114366A CN201780048088.6A CN201780048088A CN110114366A CN 110114366 A CN110114366 A CN 110114366A CN 201780048088 A CN201780048088 A CN 201780048088A CN 110114366 A CN110114366 A CN 110114366A
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舒廷·孙
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帕里什·塞吉扎德
凯万·萨德拉菲
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Baiaowei Bone Co Ltd
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Baiaowei Bone Co Ltd
University of Southern California USC
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Abstract

本文描述了双膦酸喹诺酮缀合物及其药物制剂，其可以包括双膦酸和喹诺酮，其中喹诺酮可以与双膦酸可释放地偶联。本文还提供了双膦酸喹诺酮缀合物及其药物制剂的制备方法和使用方法。

Description

双膦酸喹诺酮缀合物及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年6月3日提交的题为“BONE TARGETED THERAPEUTICS ANDDIAGNOSTICS(骨靶向治疗和诊断)”的共同未决的美国临时专利申请No.62/345,370的权益和优先权，其全部内容通过引用并入本文。
本申请还要求于2016年7月1日提交的题为“Bisphosphonate quinolonebioconjugates and uses thereof(双膦酸喹诺酮生物缀合物及其用途)”的共同未决的美国临时专利申请No.62/357,727的权益和优先权，其全部内容通过引用并入本文。
本申请还要求于2017年1月19日提交的题为“Bisphosphonate quinolonebioconjugates and uses thereof(双膦酸喹诺酮生物缀合物及其用途)”的共同未决的美国临时专利申请No.62/448,060的权益和优先权，其全部内容通过引用并入本文。
关于联邦资助研究或开发的声明
本发明是在由NIH/NIDCR颁发的授权号1R41DE025789-01的政府支助下进行的。政府在本发明中拥有某些权利。
背景技术
感染性骨疾病，也被称为骨髓炎、颌骨感染和其他骨感染，是人类和动物健康中的重大问题，并可能会导致截肢甚至死亡的灾难性后果。由于骨所呈现的固有困难，骨髓炎和其他骨感染的治疗通常是长期且难治的，并经常需要手术干预。因此，对于用于骨髓炎的所有形式或临床亚型和其他骨感染的改善治疗，存在着长期以来未得到满足的需要。
发明内容
本文在一些方面提供了可以包含可与喹诺酮(诸如环丙沙星)可释放地缀合的双膦酸(BP)的BP喹诺酮缀合物。在实施方式中，BP喹诺酮缀合物可以选择性地将喹诺酮递送至受试者的骨、骨移植物和或骨移植替代物(即可以靶向骨、骨移植物或骨移植替代物)。在一些实施方式中，BP喹诺酮缀合物可以释放喹诺酮。本文还提供了合成BP喹诺酮缀合物的方法以及用本文所提供的一种或多种BP喹诺酮缀合物治疗或预防骨髓炎或其他骨感染的方法。
在一些方面，缀合物可以是根据式(6)的化合物
本文还提供了包含根据式(6)的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
本文还提供了治疗有需要的受试者中的骨感染的方法，其可以包括向有需要的受试者给药一定量的根据式(6)的化合物或包含根据式(6)的化合物的药物制剂的步骤。
本文还提供了包含双膦酸(BP)和喹诺酮化合物的化合物，其中喹诺酮化合物通过接头与双膦酸可释放地偶联。BP可以选自以下的组：羟基苯基烷基或芳基双膦酸、羟基苯基(或芳基)烷基羟基双膦酸、氨基苯基(或芳基)烷基双膦酸、氨基苯基(或芳基)烷基羟基双膦酸、羟基烷基双膦酸、羟基烷基羟基双膦酸、羟基烷基苯基(或芳基)烷基双膦酸、羟基苯基(或芳基)烷基羟基双膦酸、氨基苯基(或芳基)烷基双膦酸、氨基苯基(或芳基)烷基羟基双膦酸、羟基烷基双膦酸、羟基烷基羟基双膦酸、羟基吡啶基烷基双膦酸、吡啶基烷基双膦酸、羟基咪唑基烷基双膦酸、咪唑基烷基双膦酸、依替膦酸(etidronate)、帕米膦酸(pamidronate)、奈立膦酸(neridronate)、奥帕膦酸(olpadronate)、阿仑膦酸(alendronate)、伊班膦酸(ibandronate)、利塞膦酸(risedronate)、唑来膦酸(zoledronate)、米诺膦酸(minodronate)和其组合，其中所有化合物可以是任选地进一步取代的或未取代的。喹诺酮化合物可以是氟喹诺酮。喹诺酮化合物可以选自以下的组：阿拉曲沙星(alatrofloxacin)、氨氟沙星(amifloxacin)、巴洛沙星(balofloxacin)、贝西沙星(besifloxacin)、卡达唑胺(cadazolid)、环丙沙星(ciprofloxacin)、克林沙星(clinafloxacin)、达氟沙星(danofloxacin)、德拉沙星(delafloxacin)、二氟沙星(difloxacin)、依诺沙星(enoxacin)、恩诺沙星(enrofloxacin)、非那沙星(finafloxacin)、氟罗沙星(flerofloxacin)、氟甲喹(flumequine)、加替沙星(gatifloxacin)、吉米沙星(gemifloxacin)、格帕沙星(grepafloxacin)、依巴沙星(ibafloxacin)、JNJ-Q2、左氧氟沙星(levofloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、马波沙星(marbofloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、那氟沙星(nadifloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、奥比沙星(orbifloxacin)、帕珠沙星(pazufloxacin)、培氟沙星(pefloxacin)、普拉沙星(pradofloxacin)、普卢利沙星(prulifloxacin)、芦氟沙星(rufloxacin)、沙氟沙星(sarafloxacin)、西他沙星(sitafloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)、替马沙星(temafloxacin)、妥舒沙星(tosufloxacin)、曲伐沙星(trvafloxacin)、扎博沙星(zabofloxacin)、奈诺沙星(nemonoxacin)和其组合。
喹诺酮化合物可以具有根据式A的结构，
其中，R1可以是包括烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、苯基、取代的苯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤素、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基、芳氧基、取代的芳氧基、烷硫基、取代的烷硫基、苯硫基、取代的苯硫基、芳硫基、取代的芳硫基、氰基、异氰基、取代的异氰基、羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰氨基、取代的酰氨基、磺酰基、取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、取代的磷酰基、膦酰基、取代的膦酰基、聚芳基、取代的聚芳基、C3-C20环、取代的C3-C20环、杂环、取代的杂环、氨基酸、肽和多肽基团的取代基，
其中，R2可以是包括烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、苯基、取代的苯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤素、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基、芳氧基、取代的芳氧基、烷硫基、取代的烷硫基、苯硫基、取代的苯硫基、芳硫基、取代的芳硫基、氰基、异氰基、取代的异氰基、羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰氨基、取代的酰氨基、磺酰基、取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、取代的磷酰基、膦酰基、取代的膦酰基、聚芳基、取代的聚芳基、C3-C20环、取代的C3-C20环、杂环、取代的杂环、氨基酸、肽和多肽基团的取代基，
其中，R3可以是包括烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、苯基、取代的苯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤素、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基、芳氧基、取代的芳氧基、烷硫基、取代的烷硫基、苯硫基、取代的苯硫基、芳硫基、取代的芳硫基、氰基、异氰基、取代的异氰基、羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰氨基、取代的酰氨基、磺酰基、取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、取代的磷酰基、膦酰基、取代的膦酰基、聚芳基、取代的聚芳基、C3-C20环、取代的C3-C20环、杂环、取代的杂环、氨基酸、肽和多肽基团的取代基，以及
其中，R4可以是包括烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、苯基、取代的苯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤素、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基、芳氧基、取代的芳氧基、烷硫基、取代的烷硫基、苯硫基、取代的苯硫基、芳硫基、取代的芳硫基、氰基、异氰基、取代的异氰基、羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰氨基、取代的酰氨基、磺酰基、取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、取代的磷酰基、膦酰基、取代的膦酰基、聚芳基、取代的聚芳基、C3-C20环、取代的C3-C20环、杂环、取代的杂环、氨基酸、肽和多肽基团的取代基。
在任何一个或多个方面，接头可以是氨基甲酸酯接头。接头可以是氨基甲酸芳酯接头。接头可以是硫代氨基甲酸-O-芳酯接头。接头可以是硫代氨基甲酸-S-芳酯接头。接头可以是氨基甲酸苯酯接头。接头可以是硫代氨基甲酸酯接头。接头可以是O-硫代氨基甲酸酯接头。接头可以是S-硫代氨基甲酸酯接头。接头可以连接到式A的R1基团。
在任何一个或多个方面，乙叉基双膦酸(ethylidenebisphosphonate)的α位置可以被羟基、氟、氯、溴或碘取代。在一些方面，双膦酸可以包括对羟基苯基乙叉基(para-hydroxyphenylethylidene)基团或其衍生物。在一些方面，乙叉基双膦酸在α位置不包含α-羟基。
在一些方面，化合物具有根据式(12)的式：
在一些方面，化合物具有根据式(13)的式，
在一些方面，化合物具有根据式(15)的式，
本文还提供了可以包含双膦酸和喹诺酮化合物以及药学上可接受的载体的药物制剂，其中喹诺酮化合物通过接头与双膦酸可释放地偶联。双膦酸可以选自以下的组：羟基苯基烷基或芳基双膦酸、羟基苯基(或芳基)烷基羟基双膦酸、氨基苯基(或芳基)烷基双膦酸、氨基苯基(或芳基)烷基羟基双膦酸、羟基烷基双膦酸、羟基烷基羟基双膦酸、羟基烷基苯基(或芳基)烷基双膦酸、羟基苯基(或芳基)烷基羟基双膦酸、氨基苯基(或芳基)烷基双膦酸、氨基苯基(或芳基)烷基羟基双膦酸、羟基烷基双膦酸、羟基烷基羟基双膦酸、羟基吡啶基烷基双膦酸、吡啶基烷基双膦酸、羟基咪唑基烷基双膦酸、咪唑基烷基双膦酸、依替膦酸、帕米膦酸、奈立膦酸、奥帕膦酸、阿仑膦酸、伊班膦酸、利塞膦酸、唑来膦酸、米诺膦酸和其组合，其中所有化合物可以是任选地进一步取代的或未取代的。喹诺酮化合物可以是氟喹诺酮。喹诺酮化合物可以选自以下的组：阿拉曲沙星、氨氟沙星、巴洛沙星、贝西沙星、卡达唑胺、环丙沙星、克林沙星、达氟沙星、德拉沙星、二氟沙星、依诺沙星、恩诺沙星、非那沙星、氟罗沙星、氟甲喹、加替沙星、吉米沙星、格帕沙星、依巴沙星、JNJ-Q2、左氧氟沙星、洛美沙星、马波沙星、莫西沙星、那氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、奥比沙星、帕珠沙星、培氟沙星、普拉沙星、普卢利沙星、芦氟沙星、沙氟沙星、西他沙星、司帕沙星、替马沙星、妥舒沙星、曲伐沙星、扎博沙星、奈诺沙星和其组合。
喹诺酮化合物可以具有根据式A的结构，
其中，R1可以是包括烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、苯基、取代的苯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤素、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基、芳氧基、取代的芳氧基、烷硫基、取代的烷硫基、苯硫基、取代的苯硫基、芳硫基、取代的芳硫基、氰基、异氰基、取代的异氰基、羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰氨基、取代的酰氨基、磺酰基、取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、取代的磷酰基、膦酰基、取代的膦酰基、聚芳基、取代的聚芳基、C3-C20环、取代的C3-C20环、杂环、取代的杂环、氨基酸、肽和多肽基团的取代基，
其中，R2可以是包括烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、苯基、取代的苯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤素、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基、芳氧基、取代的芳氧基、烷硫基、取代的烷硫基、苯硫基、取代的苯硫基、芳硫基、取代的芳硫基、氰基、异氰基、取代的异氰基、羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰氨基、取代的酰氨基、磺酰基、取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、取代的磷酰基、膦酰基、取代的膦酰基、聚芳基、取代的聚芳基、C3-C20环、取代的C3-C20环、杂环、取代的杂环、氨基酸、肽和多肽基团的取代基，
其中，R3可以是包括烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、苯基、取代的苯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤素、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基、芳氧基、取代的芳氧基、烷硫基、取代的烷硫基、苯硫基、取代的苯硫基、芳硫基、取代的芳硫基、氰基、异氰基、取代的异氰基、羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰氨基、取代的酰氨基、磺酰基、取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、取代的磷酰基、膦酰基、取代的膦酰基、聚芳基、取代的聚芳基、C3-C20环、取代的C3-C20环、杂环、取代的杂环、氨基酸、肽和多肽基团的取代基，并且
其中，R4可以是包括烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、苯基、取代的苯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤素、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基、芳氧基、取代的芳氧基、烷硫基、取代的烷硫基、苯硫基、取代的苯硫基、芳硫基、取代的芳硫基、氰基、异氰基、取代的异氰基、羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰氨基、取代的酰氨基、磺酰基、取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、取代的磷酰基、膦酰基、取代的膦酰基、聚芳基、取代的聚芳基、C3-C20环、取代的C3-C20环、杂环、取代的杂环、氨基酸、肽和多肽基团的取代基。
在任何一个或多个方面，接头可以是氨基甲酸酯接头。接头可以是氨基甲酸芳酯接头。接头可以是硫代氨基甲酸-O-芳酯接头。接头可以是硫代氨基甲酸-S-芳酯接头。接头可以是氨基甲酸苯酯接头。接头可以是硫代氨基甲酸酯接头。接头可以是O-硫代氨基甲酸酯接头。接头可以是S-硫代氨基甲酸酯接头。接头可以连接到式A的R1基团。
在一些方面，乙叉基双膦酸的α位置可以被羟基、氟、氯、溴或碘取代。在一些方面，双膦酸可以包括对羟基苯基乙叉基基团或其衍生物。在一些方面，乙叉基双膦酸在α位置不包含α-羟基。
在一些方面，化合物具有根据式(12)的化学式：
在一些方面，化合物具有根据式(13)的化学式，
在一些方面，化合物具有根据式(15)的化学式，
药物制剂中化合物的量可以是杀灭或抑制细菌的有效量。药物制剂中化合物的量可以是治疗或预防骨髓炎、骨坏死、种植体周围炎和牙周炎的有效量。
本文还提供了治疗有需要的受试者中的骨髓炎的方法，其可以包括向有需要的受试者给药一定量的如本文所提供的化合物或其药物制剂的步骤。
本文还提供了治疗有需要的受试者中的种植体周围炎或牙周炎的方法，该方法包括向有需要的受试者给药一定量的如本文所提供的化合物或其药物制剂。
本文还提供了治疗有需要的受试者中的糖尿病足的方法，该方法包括向有需要的受试者给药一定量的如本文所提供的化合物或其药物制剂。
本文还提供了可以包括骨移植材料和如本文所述的化合物或其药物制剂的骨移植组合物，其中化合物或其药物制剂与骨移植材料相附连、结合、化学吸附或混合。骨移植材料可以是自体移植骨材料、同种异体移植骨材料、异种移植骨材料、合成骨移植材料或其任意组合。
本文还提供了可以包括在有需要的受试者中植入如本文所述的骨移植组合物的步骤的方法。
本文还提供了预防在骨或植入手术部位或在进行骨移植的手术部位生物膜感染的方法，其中该方法可以包括向有需要的受试者给药如本文所述的化合物的步骤。
本文还提供了预防在骨或植入手术部位或在进行骨移植的手术部位的生物膜感染的方法，其中该方法可以包括向有需要的受试者植入如本文所述的骨移植组合物的步骤。
对于本领域技术人员，本发明的用于纳米线模板合成的制造系统的其他化合物、组合物、制剂、方法、特征和优势将在审阅以下附图和详细描述之后显而易见或变得显而易见。旨在将所有这样的额外的系统、方法、特征和优势都包括在本说明书中，都在本公开的范围内，并由所附权利要求所保护。
附图说明
当结合附图阅读下文所述的本公开的各种实施方式的详细描述之后，本公开的其他方面将更容易理解。
图1示出了来自慢性骨髓炎患者的手术标本的扫描电镜图(SEM；放大倍率100×)，显示出骨内外表面定殖的特征性多层且基质封闭的生物膜；右上角的插图示出了致病的葡萄球菌生物膜病原体的高倍率视图(放大倍率5000×)。[处理样本以用于SEM，溅射涂覆铂并用以5kv在二次电子模式下操作的XL 30S SEM(FEG，FEI Co.，Hillsboro，OR)成像]。
图2A-2B示出了氨基甲酸苯酯BP-环丙沙星缀合物的一般性合成方案。
图3示出了展示环丙沙星和BP-环丙沙星抗一组临床金黄色葡萄球菌(S.Aureus)骨髓炎病原体的AST和MIC结果的表。
图4示出了展示对于体外抗微生物剂敏感性测试的不同浓度，BP-环丙沙星缀合物在胰酶解酪蛋白大豆肉汤(trypticase soy broth)微生物培养基中0hr和24hrs时缀合物的光谱分析结果的图；24hrs(这是体外抗微生物测试的实验周期的典型长度)后未见降解，表明抗微生物剂有良好的稳定性。[*0.24-3.9mcg/mL(红色条)的结果是不确定的，因为“空白”的测量值很高]
图5示出了展示在添加了HA小球的胰酶解酪蛋白大豆肉汤微生物培养基中一种BP-环丙沙星缀合物(BP-氨基甲酸酯-环丙沙星，BCC，化合物6)的光谱分析结果的图；由于仅测量了不存在吸附有缀合物的HA小球的上清液，因此从0hr至24hrs的显著降低证实了缀合物吸附至HA。[1.95-250mcg/mL的结果均有统计学意义：p<0.05，ANOVA；一式三份；*0.12-0.48mcg/mL(红色条)的结果是不确定的，因为“空白”的测量值很高]。
图6示出了展示BP-环丙沙星抗金黄色葡萄球菌菌株ATCC-6538的浮游培养物的抗微生物剂敏感性测试结果的图，显示出在酸性(右图)对比碱性(左图)pH下改善的杀菌谱。
图7示出了展示BP-环丙沙星(缀合物)抗金黄色葡萄球菌菌株ATCC-6538(右图)和MRSA菌株MR4-CIPS(左图)的时间-杀灭(time-kill)结果的图，并以1x(红线)和1/2x(黑线)建立的MICs在1hr和最高至24hr显示出很强的杀菌活性。
图8示出了展示BP-环丙沙星抗金黄色葡萄球菌菌株ATCC-6538(上图)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株ATCC-15442(下图)在作为基底的聚苯乙烯上形成的生物膜的抗微生物剂敏感性测试结果的图。
图9示出了展示BP-环丙沙星抗金黄色葡萄球菌菌株ATCC-6538(左图)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株ATCC-15442(右图)在作为基底的HA盘上形成的生物膜的抗微生物剂敏感性测试结果的图。所有测试的缀合物浓度(橙色条)都得出对金黄色葡萄球菌有统计学意义的杀菌活性，包括仅环丙沙星(红色条)。[*p<0.05，克鲁斯卡沃利斯测试(Kruskal-Wallis test)；一式三份]。
图10示出了展示预防性实验结果的图，其中用BP-环丙沙星预先包被HA小球，并然后接种金黄色葡萄球菌。对照(C：红色条)代表没有HA且未用缀合物处理的培养菌，并在24hrs之后当测量上清液时观察到浮游生长如预期显著增加。对照+HA(C+HA条)代表有HA但仍未经处理的培养菌，并在24hrs之后观察到一些细菌生长，但不如HA阴性对照(红色条)那么多，因为细菌与HA结合并形成生物膜，而其未在HA游离上清液中被测量。将这些对照组与处理组进行比较，我们可以看到在7.8至250mcg/mL的缀合物中，24h之后细菌完全受到抑制。在从0.12至3.9mcg/mL的较低浓度范围下，细菌略有生长但仍然受到强烈抑制。
图11示出了展示在包被了BP-环丙沙星的HA盘的存在下温育24hr后生物膜细菌的存活情况的图。
图12示出了展示体内动物测试的抗微生物结果的图，显示出所测试化合物用于降低细菌负荷的有效性。缀合物在以多剂量总共给予0.9mg/kg时显示出最大有效性，没有可回收的细菌。接下来，与阴性对照相比单剂量10mg/kg的缀合物显示出2log的降低(99％杀菌活性)，且与单独环丙沙星的多剂量方案(其显示为1log的减少)相比，显示出增加了近1log的杀菌活性。
图13展示了一般性BP喹诺酮缀合物靶向策略。
图14展示了能够靶向和释放的BP喹诺酮缀合物的一般性策略。
图15示出了BP-FQ缀合物的实施方式。
图16示出了BP-FQ缀合物的合成方案。
图17示出了测试环丙沙星、BCC(化合物6)和BP-酰胺-环丙沙星(BAC，化合物11)抗一组临床相关金黄色葡萄球菌骨髓炎病原体的抗微生物剂敏感性测试结果。(MSSA＝甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌；MRSA＝耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)。
图18示出了展示在添加了HA微球粒的微生物培养基中BCC(化合物6)的光谱分析结果的图，由于仅测量了不存在吸附有缀合物的HA小球的上清液，因此如通过从0hr至24hrs的显著降低所证明，证实了缀合物吸附至HA。[1.95-250mcg/mL的结果均有统计学意义：p<0.05，ANOVA；一式三份；*0.12-0.48mcg/mL(红色条)的结果是不确定的，因为“空白”的测量值很高。
图19示出了展示BCC(化合物6)用于降低细菌负荷或平均CFU/克组织的有效性的图。与对照相比，再次在缀合物的单次高剂量(10mg/kg)处观察到最大有效性[*p＝0.0005；非配对t检验，误差条表示标准误差]。
图20示出了额外的BP-Ab缀合物设计。
图21示出了用于合成有O-硫代氨基甲酸酯接头的BP-Ab缀合物的合成方案的实施方式。
图22示出了用于合成-OH保护的BP酯的方案的实施方式。
图23示出了用于合成BP 3-接头3-环丙沙星的方案的实施方式。
图24示出了展示O-硫代氨基甲酸酯BP缀合物抗浮游金黄色葡萄球菌菌株ATCC6538的MIC评估结果的图和图像：阴性对照＝培养基+无缀合物处理的微生物；阳性对照＝无微生物的无菌培养基。
图25示出了展示硫代氨基甲酸酯缀合物抗金黄色葡萄球菌菌株ATCC 6538在作为基底的聚苯乙烯上形成的生物膜的抗微生物活性或细菌负荷降低的评估结果的图：阴性对照＝无缀合物处理的微生物稀释液；阳性对照＝无微生物的无菌稀释液。
图26示出了展示所测试的O-硫代氨基甲酸酯BP缀合物抗金黄色葡萄球菌ATCC6538在作为基底的羟基磷灰石上预先形成的生物膜的抗微生物活性的评估结果的图；阴性对照＝无缀合物处理的微生物稀释液。(*p<0.05，克鲁斯卡沃利斯测试；一式三份；比较物＝对照)。
图27示出了展示对使用O-硫代氨基甲酸酯BP缀合物处理的羟基磷灰石盘评估防止金黄色葡萄球菌ATCC 6538的生物膜形成的能力的研究结果的图；阴性对照＝无缀合物处理的微生物稀释液。(*p<0.05，克鲁斯卡沃利斯测试；一式三份；比较物＝对照)。
图28示出了展示对使用O-硫代氨基甲酸酯BP缀合物处理的羟基磷灰石粉末评估防止金黄色葡萄球菌ATCC 6538的生物膜形成的能力的研究结果的图；阴性对照＝无缀合物处理的微生物稀释液。(*p<0.05，克鲁斯卡沃利斯测试；一式三份；比较物＝对照)。
图29示出了α-羟基修饰的利塞膦酸和唑来膦酸。
图30示出了1)通过取代或去除α-羟基基团来修饰的BP(p-PyrEBP)；2)通过在吡啶环(p-RIS)的对位取代来修饰的BP。圈出的H与双膦酸取代的碳链的α碳相连。
图31示出了具有酰胺键而不是氨基甲酸酯键的BP-环丙沙星缀合物(BAC，化合物11)的合成方案。
图32示出了展示使用微量稀释法，6和11对八株金黄色葡萄球菌菌株的最小抑制浓度(MIC)测定的结果的图。
图33示出了展示6抗金黄色葡萄球菌菌株ATCC-6538(上图)和铜绿假单胞菌菌株ATCC-15442(下图)在作为基底的HA盘上形成的生物膜的抗微生物剂敏感性测试的图。所有测试的6的浓度(上图点状条)和母体抗生素环丙沙星的结果为抗金黄色葡萄球菌的杀菌活性有统计学意义；c＝阴性对照比较物。在抗铜绿假单胞菌方面，与对照相比，6在生理pH下在8μg/mL是最有效，且在酸性pH下以此浓度也是有效的，但环丙沙星在酸性或生理条件下均是非活性的[*p<0.05，克鲁斯卡沃利斯测试；一式三份]。
图34示出了展示浓度增加的11抗金黄色葡萄球菌菌株ATCC-6538在作为基底的HA上形成的生物膜的抗微生物剂敏感性测试(上图)的结果的图。与对照C+相比，在任何浓度下均未观察到显著的活性[p＞0.05，克鲁斯卡沃利斯测试；一式三份]。下图示出了预防性实验的结果，其中用11或母体抗生素环丙沙星预处理HA，并然后接种金黄色葡萄球菌，且同样未观察到11的抗微生物活性；唯一显著的降低出现在母体药物以400μg/mL的相对高剂量时[*p<0.05，克鲁斯卡沃利斯测试；一式三份]。
图35示出了展示6抗伴放线凝聚杆菌(Aggregatibacteractinomycetemcomitans)菌株D7S-5在HA上生长的生物膜的抗微生物剂敏感性的图，缀合物6在＞15μg/mL时显示出有效的抗微生物谱。
图36示出了展示体内动物测试的抗微生物结果的图。数据示出了测试的化合物对于降低细菌负荷的有效性。与阴性对照相比，在6的单次高剂量(10mg/kg)下观察到最大有效性，其中观察到2log的降低(99％杀菌活性)。
图37示出了展示第二动物实验的抗微生物结果的图。数据示出了6对于降低细菌负荷或平均CFU/克组织(y轴)的有效性。与对照和多次低剂量组(0.3mg/kg×3)相比，在缀合物的单次高剂量(10mg/kg)中观察到最大有效性[*p＝0.0005；非配对t检验，误差条表示标准误差]。
图38示出了BP-氨基甲酸酯-莫西沙星BP缀合物及合成方案。
图39示出了BP-氨基甲酸酯-加替沙星BP缀合物及合成方案。
图40示出了BP-p-羟苯基乙酸-环丙沙星BP缀合物及合成方案。
图41示出了BP-OH-环丙沙星BP缀合物及合成方案。
图42示出了BP-O-硫代氨基甲酸酯-环丙沙星BP缀合物及合成方案。
图43示出了BP-S-硫代氨基甲酸酯-环丙沙星BP缀合物及合成方案。
图44示出了BP-间苯二酚-环丙沙星BP缀合物及合成方案。
图45示出了BP-对苯二酚-环丙沙星BP缀合物及合成方案。
图46示出了BP-氟喹诺酮类的通用结构的一种实施方式。
图47示出了各种BP-氟喹诺酮缀合物。
图48示出了包含芳基基团的膦酸类的通用结构的一种实施方式。
图49示出了各种BP，其中X可以是F、Cl、Br或I。
图50示出了有末端一级胺的各种BP。
图51示出了与包含末端羟基和胺官能团的接头偶联的各种BP，其中R可以是利塞膦酸、唑来膦酸、米诺膦酸、帕米膦酸或阿仑膦酸。
图52示出了各种BP-帕米膦酸-环丙沙星缀合物。
图53示出了各种BP-阿仑膦酸-环丙沙星缀合物。
具体实施方式
在更详细地描述本公开之前，应当理解，本公开不限于所描述的特定实施方式，且因此当然是可以变化的。还应当理解，本文所用术语的目的仅是描述特定实施方式，而不旨在限制。
在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确指明，否则在该范围的上下限与在所述范围内的任何其他所述或插入值之间的每个插入值，至下限的单位的十分之一，都包含在本公开之内。这些较小范围的上下限可以独立地包括在该较小范围内，且也包含在本公开之内，受所述范围内任何明确地排除的限值的约束。当所述范围包括限值中的一个或两个时，排除所述包括的限值的任一或两者的范围也包括在本公开内。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语当与本公开所属的领域中普通技术人员所通常理解的含义相同。尽管类似或等同于本文所述的那些的任何方法和材料均可以用于本公开的实践或测试，但现在描述优选的方法和材料。
本说明书中引用的所有出版物和专利通过引用并入本文，就像每个单独的出版物或专利是具体地和单独地表示为通过引用并入的，且通过引用并入本文以公开并描述与出版物所引用的地方相关联的方法和/或材料。任何出版物的引用为其申请日之前的公开，且不应理解为承认由于先前公开而使本公开不享受早于这些出版物的权利。此外，所提供的出版日期可能不同于实际出版日期，其可能需要单独确认。
对于本领域技术人员来说在阅读本公开之后显而易见的是，本文描述并说明的每个单独的实施方式具有分立的部分和特征，其可以容易地与任何其他一些实施方式的特征分离或与任何其他一些实施方式的特征组合，而不脱离本公开的范围或精神。任何所列方法都可以按照所列事件的顺序或逻辑上可行的任何其他顺序来进行。
除非另外指明，否则本公开的实施方式将使用分子生物学、微生物学、纳米技术、药理学、有机化学、生物化学、植物学等本领域内的技术。这些技术在文献中有全面阐述。
定义
除非本文另外说明，否则提供以下定义。
如本文所用，“约”、“大约”等等，当与数值变量结合使用时，通常是指变量的值以及所有在实验误差(例如，在均值的95％置信区间之内)或在指定值的±10％之内(以较大者为准)的变量的值。
如本文可替换使用的，“受试者”、“个体”或“患者”是指脊椎动物，优选地是哺乳动物，更优选地是人类。哺乳动物包括但不限于鼠类、猿类、人类、家畜、竞技动物和宠物。术语“宠物”包括狗、猫、豚鼠、小鼠、大鼠、兔、雪貂等等。术语“家畜”包括马、绵羊、山羊、鸡、猪、牛、驴、美洲驼、羊驼、火鸡等等。
如本文所用，“对照”可以指出于比较目的而在实验中使用的可替代受试者或样本，并将其包括在内以最小化或区分除独立变量之外的变量的影响。
如本文所用，“类似物”，诸如本文所述的双膦酸的类似物，可以指与母体分子结构相近的成员或附加的母体分子，诸如双膦酸。
如本文所用，“缀合”可以指两个或多个化合物通过一个或多个共价键或非共价键直接地相互连接。如本文所用的术语“缀合”也可以指两个或多个化合物通过中间化合物(诸如接头)间接地相互连接。
如本文所用，“药物制剂”是指活性剂、化合物或成分与药学上可接受的载体或赋形剂的组合，使该组合物适于在体外、体内或离体诊断、治疗性或预防使用。
如本文所用，“药学上可接受的载体或赋形剂”是指通常安全、无毒且不是生物学上或其他不良的可用于制备药物制剂的载体或赋形剂，并包括对于兽用及人类药物使用可接受的载体或赋形剂。如说明书和权利要求书中所用的“药学上可接受的载体或赋形剂”包括一种和多于一种的这样的载体或赋形剂两者。
如本文所用，“药学上可接受的盐”是指任何酸或碱加成盐，其反离子对于以该盐的药物剂量给药的受试者是无毒的。
如本文所用，“活性剂”或“活性成分”是指组合物的一种或多种组分，组合物的全部或部分效果归因于该组分。
如本文所用，“剂量”、“单位剂量”或“用量”是指适合用于受试者的身体上的离散单位，每个单位包含预定量的BP缀合物，诸如本文所述的BP喹诺酮缀合物、组合物或制剂，其经过计算以产生所需响应或与其给药相关联的响应。
如本文所用，“衍生物”是指与该化合物具有相同或相似的核心结构但具有至少一种结构差异的任何化合物，包括取代、缺失和/或添加一种或多种原子或官能团。术语“衍生物”并不意味着该衍生物是由母体化合物作为起始材料或中间体合成的，尽管可能是这种情况。术语“衍生物”可以包括母体化合物的前药或代谢物。衍生物包括其中母体化合物中的游离氨基基团已被衍生化形成胺盐酸盐类、对甲苯磺酰胺类、苯甲氧基甲酰胺类、叔丁氧基甲酰胺类、硫代氨基甲酸乙酯类衍生物、三氟乙酰胺类、氯乙酰胺类或甲酰胺类的化合物。衍生物包括其中母体化合物中的羧基基团已被衍生化形成甲酯和乙酯或其他类型的酯、酰胺、异羟肟酸或酰肼的化合物。衍生物包括其中母体化合物中的羟基基团已被衍生化形成O-酰基、O-氨基甲酰基或O-烷基衍生物的化合物。衍生物包括其中母体化合物中的氢键供体基团被另一个氢键供体基团(诸如OH、NH或SH)取代的化合物。衍生物包括用另一氢键受体基团(诸如酯、醚、酮、碳酸盐/酯、叔胺、亚胺、硫酮、砜、叔酰胺、硫化物)取代母体化合物中的氢键受体基团。“衍生物”还包括例如用饱和或不饱和环己烷或其他更复杂的例如含氮环替代环戊烷环的扩展，以及具有各种基团的这些环的扩展。
如本文所用，“给药”是指口服、局部、静脉、皮下、经皮、透皮、肌肉内、关节内、肠胃外、小动脉内、皮内、心室内、颅内、腹腔内、病灶内、鼻内、直肠、阴道、通过吸入或通过植入型药库给药。术语“肠胃外”包括皮下、静脉、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。
如本文所用的术语“取代”是指本文所述化合物的所有允许的取代基。从广义上讲，允许的取代基包括有机化合物的非环状和环状、支化和非支化、碳环和杂环、芳香和非芳香取代基。例示性取代基包括但不限于卤素、羟基基团或任何其他包含任意数目的碳原子(例如1-14个碳原子)的有机基团，还任选地包括一种或多种杂原子，诸如以线性、支化或环状结构格式分组的氧、硫或氮。代表性取代基包括烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、苯基、取代的苯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤素、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基、芳氧基、取代的芳氧基、烷硫基、取代的烷硫基、苯硫基、取代的苯硫基、芳硫基、取代的芳硫基、氰基、异氰基、取代的异氰基、羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰氨基、取代的酰氨基、磺酰基、取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、取代的磷酰基、膦酰基、取代的膦酰基、聚芳基、取代的聚芳基、C3-C20环、取代的C3-C20环、杂环、取代的杂环、氨基酸、肽和多肽基团。
如本文所用，“合适的取代基”意为化学上和药学上可接受的基团，即不会显著干扰发明化合物的制备或使其有效性失效的部分。这样的合适的取代基可以常规地由本领域技术人员选择。合适的取代基包括但不限于以下：卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基、C2-C6炔基、C3-C8环烯基、(C3-C8环烷基)C1-C6烷基、(C3-C8环烷基)C2-C6烯基、(C3-C8环烷基)C1-C6烷氧基、C3-C7杂环烷基、(C3-C7杂环烷基)C1-C6烷基、(C3-C7杂环烷基)C2-C6烯基、(C3-C7杂环烷基)C1-C6烷氧基、羟基、羧基、氧代、磺酰基、C1-C6烷基磺酰基、芳基、杂芳基、芳氧基、杂芳氧基、芳烷基、杂芳烷基、芳烷氧基、杂芳烷氧基、硝基、氰基、氨基、C1-C6烷基氨基、二(C1-C6烷基)氨基、氨基甲酰基、(C1-C6烷基)羰基、(C1-C6烷氧基)羰基、(C1-C6烷基)氨基羰基、二(C1-C6烷基)氨基羰基、芳基羰基、芳氧基羰基、(C1-C6烷基)磺酰基和芳基磺酰基。除了合适的取代基可能不会被进一步任选地取代之外，以上所列作为合适的取代基的基团如下文中所定义。
术语“烷基”是指饱和脂肪族基团的基(即去除了一个氢原子的烷烃)，包括直链烷基基团、支链烷基基团、环烷基(脂环族)基团、烷基取代的环烷基基团和环烷基取代的烷基基团。
在一些实施方式中，直链或支链烷基在其主链中可以具有30个或更少的碳原子(例如，对于直链为C1-C30，对于支链为C3-C30)。在其他实施方式中，直链或支链烷基在其主链中可以包含20个或更少、15个或更少或者10个或更少的碳原子。同样地，在一些实施方式中，环烷基在其环结构中可以具有3-10个碳原子。在这些实施方式的一些中，环烷基的环结构可以具有5、6或7个碳。
如本文所用的术语“烷基”(或“低级烷基”)旨在包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”两者，其后者是指有取代了烃主链上的一个或多个碳上的氢的一个或多个取代基的烷基部分。这样的取代基包括但不限于卤素、羟基、羰基(诸如羧基、烷氧羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(诸如硫代酸酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸基、膦酸基、亚膦酸基、氨基、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸基、磺酸基、氨磺酰基、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、芳烷基或芳香族或杂芳族部分。
除非碳的数目另有规定，否则如本文所用的“低级烷基”意为如上所定义的烷基基团，但在其主链结构中具有一至十个碳。同样地，“低级烯基”和“低级炔基”具有相似的链长度。
本领域技术人员将会理解，如果合适的话，在烃链上取代的部分其自身也可以被取代。例如，取代的烷基的取代基可以包括卤素、羟基、硝基、硫醇、氨基、叠氮基、亚氨基、酰氨基、磷酰基(包括膦酸基和亚膦酸基)、磺酰基(包括硫酸基、磺酰氨基、氨磺酰基和磺酸基)和甲硅烷基基团，以及醚、烷硫基、羰基(包括酮、醛、羧酸基和酯)、-CF3、-CN等等。环烷基可以以同样的方式被取代。
如本文所用的术语“杂烷基”是指包含至少一个杂原子的直链或支链或环状含碳基或其组合。合适的杂原子包括但不限于O、N、Si、P、Se、B和S，其中磷原子和硫原子任选地被氧化，且氮杂原子任选地被季铵化。杂烷基可以如上述对烷基基团限定的被取代。
术语“烷硫基”是指具有与其相连的硫基的如上限定的烷基基团。在优选的实施方式中，“烷硫基”部分用-S-烷基、-S-烯基和-S-炔基之一来表示。代表性的烷硫基基团包括甲硫基、乙硫基等等。术语“烷硫基”还包括环烷基基团、烯烃和环烯烃基团，以及炔烃基团。“芳硫基”是指芳基或杂芳基基团。芳硫基基团可以如上述对烷基基团限定的被取代。
术语“烯基”和“炔基”是指长度且与上述烷基可能取代类似，但各自包含至少一个双键或三键的不饱和脂肪族基团。
如本文所用的术语“烷氧基”或“烷氧基”是指具有与其相连的氧基的如上限定的烷基基团。代表性烷氧基基团包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等等。“醚”是通过氧共价连接的两个烃。因此，使得烷基变成醚或类似于烷氧基的烷基的取代基，诸如可以用-O-烷基、-O-烯基和-O-炔基之一来表示。如本文可替换使用的术语“芳氧基”和“芳氧基”可以用-O-芳基或O-杂芳基来表示，其中芳基和杂芳基的定义如下。烷氧基和芳氧基基团可以如上文对烷基的描述被取代。
术语“胺”和“氨基”(及其质子化形式)是本领域公知的，且是指未取代的和取代的胺两者，例如，可以用以下通式表示的部分：
其中，R、R'和R”各自独立地表示氢、烷基、烯烃、-(CH2)m-RC，或R和R’与和它们相连的N原子一起构成环结构中有4至8个原子的杂环；RC表示芳基、环烷基、环烯烃、杂环或多环；且m是零或1至8范围内的整数。在一些实施方式中，R或R’中只有一个可以是羰基，例如，R、R'和氮一起不形成酰亚胺。在其他实施方式中，术语“胺”不包括酰胺，例如，其中R和R’中的一个代表羰基。在其他实施方式中，R和R’(和任选的R”)各自独立地表示氢、烷基或环烷基、烯基或环烯基或炔基。因此，如本文所用的术语“烷基胺”意为具有与其连接的取代的(如上述对烷基的定义)或未取代的烷基的如上限定的胺基团，即R和R’中至少一个是烷基基团。
术语“酰氨基”在本领域公知为氨基取代的羰基，并包括可以用以下通式表示的部分：
其中，R和R’如上文所限定。
如本文所用，“芳基”是指C5-C10-元芳香族、杂环、稠合芳香族、稠杂环、双芳香族或双杂环体系。广义上，如本文所用的“芳基”包括可以包括零至四个杂原子的5-、6-、7-、8-、8-、9-和10-元单环芳香族基团，例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪、嘧啶等等。那些环结构中具有杂原子的芳基基团也可以称为“芳基杂环”或“杂芳族”。芳环可以在一个或多个环位置被一个或多个取代基取代，取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基(或季铵化氨基)、硝基、巯基、亚氨基、酰氨基、膦酸基、亚膦酸基、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、磺酰氨基、酮、醛、酯、杂环、芳香族或杂芳族部分、-CF3、-CN及其组合。术语“芳基”包括苯基。
术语“芳基”还包括具有两个或多个环的多环体系，其中两个相邻的环共用两个或多个碳(即“稠环”)，其中至少一个环是芳香族的，例如，其他一个或多个环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基和/或杂环。杂环的实例包括但不限于苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并硫代呋喃基、苯并硫代苯基、苯并噁唑基、苯并噁唑啉基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并四唑基、苯并异噁唑基、苯并异噻唑基、苯并咪唑啉基、咔唑基、4aH咔唑基、咔啉基、苯并二氢吡喃基、苯并吡喃基、噌啉基、十氢喹啉基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、二氢呋喃并[2,3b]四氢呋喃、呋喃基、呋咱基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、假吲哚基(indolenyl)、二氢吲哚基、吲嗪基、吲哚基、3H-吲哚基、靛红酰基(isatinoyl)、异苯并呋喃基、异苯并二氢吡喃基、异吲唑基、异二氢吲哚基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、亚甲基二氧苯基、吗啉基、萘啶基、八氢异喹啉基、噁二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、噁唑烷基、噁唑基、羟吲哚基、嘧啶基、菲啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁噻(phenoxathinyl)、吩噁嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、胡椒基、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并噁唑、吡啶并咪唑、吡啶并噻唑、吡啶基(pyridinyl)、吡啶基(pyridyl)、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、2H-吡咯基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹喔啉基、奎宁环基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、四唑基、6H-1,2,5-噻二嗪基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、噻吩基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基、噻吩基和呫吨基。一个或多个环可以如上述对“芳基”限定的被取代。
如本文所用的术语“芳烷基”是指用芳基基团(例如芳香族或杂芳族基团)取代的烷基基团。
术语“芳烷氧基”可以用-O-芳烷基表示，其中芳烷基如上所限定。
如本文所用的术语“碳环”是指其中(一个或多个)环上的每个原子都是碳的芳香族或非芳香族环。
如本文所用，“杂环”或“杂环的”是指包含3-10个环原子(并在一些实施方式中包含5-6个环原子)的其中环原子是碳和一至四个各自选择以下组的杂原子的单环或双环结构：非过氧化的氧、硫和N(Y)，其中Y不存在或者是H、O、(C1-C10)烷基、苯基或苄基，并任选地包含1-3个双键，以及任选地被一个或多个取代基取代。杂环的实例包括但不限于苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并硫代呋喃基、苯并硫代苯基、苯并噁唑基、苯并噁唑啉基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并四唑基、苯并异噁唑基、苯并异噻唑基、苯并咪唑啉基、咔唑基、4aH咔唑基、咔啉基、苯并二氢吡喃基、苯并吡喃基、噌啉基、十氢喹啉基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、二氢呋喃并[2,3b]四氢呋喃、呋喃基、呋咱基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、假吲哚基(indolenyl)、二氢吲哚基、吲嗪基、吲哚基、3H-吲哚基、靛红酰基(isatinoyl)、异苯并呋喃基、异苯并二氢吡喃基、异吲唑基、异二氢吲哚基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、亚甲基二氧苯基、吗啉基、萘啶基、八氢异喹啉基、噁二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、噁唑烷基、噁唑基、氧杂环庚烷基、氧杂环丁烷基、羟吲哚基、嘧啶基、菲啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁噻(phenoxathinyl)、吩噁嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基(piperidonyl)、4-哌啶酮基、胡椒基、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并噁唑、吡啶并咪唑、吡啶并噻唑、吡啶基(pyridinyl)、吡啶基(pyridyl)、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、2H-吡咯基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹喔啉基、奎宁环基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢吡喃基、四氢喹啉基、四唑基、6H-1,2,5-噻二嗪基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、噻吩基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基、噻吩基和呫吨基。杂环基团可以任选地如上文对烷基和芳基限定的在一个或多个位置被一个或多个取代基取代，例如，卤素、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰氨基、磷酸基、膦酸基、亚膦酸基、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、酮、醛、酯、杂环、芳香族或杂芳族部分、-CF3、-CN等等。术语“杂环”或“杂环的”可以用于描述可包括杂环或杂环的环的化合物。
术语“羰基”是本领域公知的，并包括可以用以下通式表示的这样的部分：
其中，X为键或代表氧或硫，且R和R'如上所定义。当X是氧且R或R'不是氢时，该化学式表示“酯”。当X是氧且R如上所定义时，该部分在本文中被称为羧基基团，且特别地当R是氢时，该化学式表示“羧酸”。当X是氧且R'是氢时，该化学式表示“甲酸基”。通常，当上式中的氧原子被硫取代时，该化学式表示“硫代羰基”基团。当X是硫且R或R'不是氢时，该化学式表示“硫酯”。当X是硫且R是氢时，该化学式表示“硫代羧酸”。当X是硫且R’是氢时，该化学式表示“硫代甲酸基”。另一方面，当X是键且R不是氢时，上式表示“酮”基团。当X是键且R是氢时，上式表示“醛”基团。
如本文所用的术语“杂原子”意为除碳或氢以外的任何元素的原子。示例性杂原子包括但不限于硼、氮、氧、磷、硫、硅、砷和硒。杂原子，诸如氮，可以具有氢取代基和/或满足杂原子价态的如本文所述有机化合物的任何允许的取代基。应理解的是，“取代”或“被取代”包括的隐含条件是这样的取代符合被取代的原子和取代基的允许价态，并且该取代产生的是稳定的化合物，即不会自发地进行诸如重排、环化、消除等转变的化合物。
如本文所用，术语“硝基”是指-NO2；术语“卤素”指-F、-Cl、-Br或-I；术语“巯基”是指-SH；术语“羟基”是指-OH；并且术语“磺酰基”是指-SO2-。
如本文所用，“氨基甲酸酯”可用于指从氨基甲酸(NH2COOH)衍生的化合物，并可以包括氨基甲酸酯类。“氨基甲酸酯”可具有以下的一般结构：
其中R1、R2和R3可以是任何允许的取代基。
如本文所用，“有效量”可以指本文所述的组合物或本文所述的药物制剂的量，其将引起研究者、兽医、医师或其他临床医生正在寻求的组织、系统、动物、植物、原生动物、细菌、酵母或人类的期望的生物学或医学响应。期望的生物学响应可以是对骨形成和/或重塑的调节，包括但不限于对骨吸收和/或BP缀合物(诸如本文所述的BP喹诺酮缀合物)的摄取的调节。有效量将因组合物或药物制剂的确切化学结构、正被治疗或预防的病原体和/或其感染、疾病、疾患、综合征或症状的严重程度、给药途径、给药时间、排泄率、药物组合、治疗医师的判断、剂型以及待治疗的受试者的年龄、体重、健康状况、性别和/或饮食的不同而变化。“有效量”可以指有效抑制微生物(包括但不限于细菌或其种群)的生长或繁殖的本文所述的组合物的量。“有效量”可以指杀灭微生物(包括但不限于细菌或其种群)的本文所述的组合物的量。“有效量”可以指有效治疗和/或预防有需要的受试者中的骨髓炎的本文所述的组合物的量。
如本文所用，“治疗性”通常可以指治疗、治愈和/或改善疾病、疾患、病症或副作用，或降低疾病、疾患、病症或副作用的进展速度。该术语还包括在其范围内增强正常的生理功能、姑息治疗和对其疾病、疾患、病症、副作用或症状的部分补救。
如本文所用，术语“治疗”和“治疗”可以指获得期望的药理和/或生理效果。在预防或部分预防其疾病、症状或病症方面，该效果可以是预防性的。
如本文所用，“协同效应”、“协同作用”或“协同”是指两个或多个分子、化合物、物质、因素或组合物之间产生的大于或不同于其各自效应加和的效应。
如本文所用，“累加效应”是指两个或多个分子、化合物、物质、因素或组合物之间产生的等于或同于其各自效应加和的效应。
如本文所用，术语“生物相容性”是指材料连同其任何代谢物或降解产物对接受者是通常无毒的，且不会对接受者造成任何显著不利的影响。一般来说，生物相容性材料是指当向患者给药时不会引起显著的炎症或免疫响应的材料。
如本文所用，术语骨髓炎可以指急性或慢性骨髓炎，和/或糖尿病足骨髓炎、糖尿病慢性骨髓炎、假体关节感染、牙周炎、种植体周围炎、骨坏死，和/或血源性骨髓炎和/或其他骨感染。
讨论
感染性骨疾病，或骨髓炎，是世界范围内人类和兽医医学的主要问题，并由于潜在的威胁肢体的后遗症和死亡而可能是灾难性的。骨髓炎的治疗方法主要是抗微生物，且通常是长期的，并在许多情况下通过手术干预来控制感染。在大多数长骨骨髓炎病例中，致病病原体是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的生物膜，与它们的浮游(自由漂浮)对应物不同生物膜是与骨结合的。已知其他骨感染是由广泛的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌引起的。
骨髓炎的生物膜介导的性质在临床和实验环境中是重要的，因为许多生物膜病原体是无法培养的，并且在生长速度和抗微生物耐药性方面表现出改变的表型(与它们的浮游对应物相比)。用常规的抗生素难以消灭生物膜，这部分解释了为什么通常成功率较高的抗微生物疗法在骨科感染中却伴随着耐药生物膜病原体的发展、抗微生物药剂在骨中差的渗透以及全身毒性相关的不良事件而无法成功。
为了克服与骨髓炎治疗相关的许多挑战，人们对使用骨靶向缀合物的药物递送方法的兴趣日益增加，以实现更高或更持久的局部抗生素治疗浓度，同时最小化全身暴露。与双膦酸(BP)(例如骨吸附的BP)缀合的氟喹诺酮和非氟喹诺酮抗生素代表了一种有前景的方法，因为每种成分的安全性的临床追踪记录都很长，而且它们的生化特性也很优越。在此背景下的氟喹诺酮家族的早期研究中，环丙沙星在与BP结合时表现出最好的结合和微生物学特性。环丙沙星在此背景下的再利用(新用途)有几个优点：它可以口服或静脉给药，有相对生物等效性，它具有对包括最常见的骨髓炎病原体在内的广谱抗微生物活性，它在临床上可实现的剂量下显示有杀菌活性，且它是氟喹诺酮家族中最便宜的药物。
BP家族的特异性骨靶向特性使它们成为在骨髓炎药物治疗中将抗生素引入至骨的理想载体。BP与钙形成牢固的双齿和三齿键，并因此聚集在羟基磷灰石(HA)中，特别是在活跃的新陈代谢或感染和炎症部位。BP对化学和生物降解两者也表现出优异的稳定性。多年以来，通过与BP缀合将环丙沙星靶向骨的概念在许多报道中都有讨论。
尽管BP和氟喹诺酮药物(诸如环丙沙星)具有这些正面特性，但目前对生成包含BP和氟喹诺酮(诸如环丙沙星)的前体药物的尝试均尚未成功。大多数尝试的结果为全身性不稳定的前体药物或不可裂解的缀合物，发现其大部分由于干扰药效需求，使得缀合物的任一组分均失去活性。
认识到目前BP喹诺酮缀合物的缺陷后，本文描述了可以包含可与喹诺酮(诸如环丙沙星)可释放地缀合的BP的BP喹诺酮缀合物。在实施方式中，BP喹诺酮缀合物可以选择性地将喹诺酮递送至受试者的骨、骨移植物和或骨移植替代物(即可以靶向骨、骨移植物或骨移植替代物)。在一些实施方式中，BP喹诺酮缀合物可以释放喹诺酮。本文还提供了合成BP喹诺酮缀合物的方法以及用本文所提供的一种或多种BP喹诺酮缀合物治疗或预防骨髓炎或其他骨感染的方法。
本公开的其他组合物、化合物、方法、特征和优点，将在审阅以下附图、详细描述和实施例之后对本领域普通技术人员变得显而易见。旨在将所有这样的额外的组合物、化合物、方法、特征和优势都包括在本说明书中，且都在本公开的范围内。
双膦酸(BP)喹诺酮缀合物及其制剂
BP喹诺酮缀合物
本文提供了BP喹诺酮缀合物及其制剂。BP可以通过接头与喹诺酮缀合。在实施方式中，接头是可释放的接头。喹诺酮可以通过接头可释放地连接到BP上。因此，在一些实施方式中，BP喹诺酮缀合物可以在骨、骨移植物或骨移植替代物处或附近选择性地递送并释放喹诺酮(图13)。换句话说，BP氟喹诺酮缀合物可以提供将氟喹诺酮靶向至骨和/或接近骨的区域的靶向的递送。本文提供的BP喹诺酮缀合物的BP可以是任何BP，包括但不限于，羟基苯基烷基或芳基双膦酸、羟基苯基(或芳基)烷基羟基双膦酸、氨基苯基(或芳基)烷基双膦酸、氨基苯基(或芳基)烷基羟基双膦酸、羟基烷基双膦酸、羟基烷基羟基双膦酸、羟基烷基苯基(或芳基)烷基双膦酸、羟基苯基(或芳基)烷基羟基双膦酸、氨基苯基(或芳基)烷基双膦酸、氨基苯基(或芳基)烷基羟基双膦酸、羟基烷基双膦酸、羟基烷基羟基双膦酸(所有前者被进一步取代或未取代)、依替膦酸、帕米膦酸、奈立膦酸、奥帕膦酸、阿仑膦酸、伊班膦酸、利塞膦酸、唑来膦酸、羟基亚甲基双膦酸和其组合。双膦酸也可以被膦酰基次膦酸或膦酰基羧酸替代。在实施方式中，BP可以是帕米膦酸、阿仑膦酸、利塞膦酸、唑来膦酸、米诺膦酸、奈立膦酸、依替膦酸，其可以如本文所述被修饰或不修饰。
BP可以被修饰为包含α-羟基基团(例如，α-羟基修饰的利塞膦酸和唑来膦酸，图29)。其他BP可以以同样的方式被修饰。在一些实施方式中，可以通过取代或去除α-羟基基团来修饰BP。(图30，例如，p-PyrEBP)。与未修饰的等同物BP相比，去除或取代α-羟基基团可以降低或消除BP的抗吸收作用。因此，在一些实施方式中，本文提供的BP缀合物可以包含缺乏α-羟基基团或α-羟基基团被取代的BP。α-羟基基团的合适的取代可以包括但不限于H、烷基、芳基、烷基芳基。此外与BP缀合的额外的分子也可以影响抗吸收作用。例如，当喹诺酮和/或接头与对位取代侧改变的BP偶联时，抗吸收作用可被显著降低或消除。在一些实施方式中，可以修饰BP以同时包括α-羟基删除或取代和对位取代的侧链。
在包含芳基或苯基的BP中，芳基或苯基可以在环上的任何位置处被合适的取代基取代。在一些实施方式中，BP的芳基或苯基环被一个或多个给电子物类(例如F、N和Cl)取代。
非药理活性的BP变体也可以用于无BP作用的氟喹诺酮递送的目的。
喹诺酮可以是任何喹诺酮，包括但不限于阿拉曲沙星、氨氟沙星、巴洛沙星、贝西沙星、卡达唑胺、环丙沙星、克林沙星、达氟沙星、德拉沙星、二氟沙星、依诺沙星、恩诺沙星、非那沙星、氟罗沙星、氟甲喹、加替沙星、吉米沙星、格帕沙星、依巴沙星、JNJ-Q2、左氧氟沙星、洛美沙星、马波沙星、莫西沙星、那氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、奥比沙星、帕珠沙星、培氟沙星、普拉沙星、普卢利沙星、芦氟沙星、沙氟沙星、西他沙星、司帕沙星、替马沙星、妥舒沙星、曲伐沙星、扎博沙星、奈诺沙星和其任意组合。喹诺酮可以是氟喹诺酮。
喹诺酮可以具有根据式1的结构通式，其中，R1可以是包括烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、苯基、取代的苯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤素、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基、芳氧基、取代的芳氧基、烷硫基、取代的烷硫基、苯硫基、取代的苯硫基、芳硫基、取代的芳硫基、氰基、异氰基、取代的异氰基、羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰氨基、取代的酰氨基、磺酰基、取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、取代的磷酰基、膦酰基、取代的膦酰基、聚芳基、取代的聚芳基、C3-C20环、取代的C3-C20环、杂环、取代的杂环、氨基酸、肽和多肽基团的取代基，其中，R2可以是包括烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、苯基、取代的苯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤素、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基、芳氧基、取代的芳氧基、烷硫基、取代的烷硫基、苯硫基、取代的苯硫基、芳硫基、取代的芳硫基、氰基、异氰基、取代的异氰基、羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰氨基、取代的酰氨基、磺酰基、取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、取代的磷酰基、膦酰基、取代的膦酰基、聚芳基、取代的聚芳基、C3-C20环、取代的C3-C20环、杂环、取代的杂环、氨基酸、肽和多肽基团的取代基，其中，R3可以是包括烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、苯基、取代的苯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤素、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基、芳氧基、取代的芳氧基、烷硫基、取代的烷硫基、苯硫基、取代的苯硫基、芳硫基、取代的芳硫基、氰基、异氰基、取代的异氰基、羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰氨基、取代的酰氨基、磺酰基、取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、取代的磷酰基、膦酰基、取代的膦酰基、聚芳基、取代的聚芳基、C3-C20环、取代的C3-C20环、杂环、取代的杂环、氨基酸、肽和多肽基团的取代基，以及其中，R4可以是包括烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、苯基、取代的苯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤素、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基、芳氧基、取代的芳氧基、烷硫基、取代的烷硫基、苯硫基、取代的苯硫基、芳硫基、取代的芳硫基、氰基、异氰基、取代的异氰基、羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰氨基、取代的酰氨基、磺酰基、取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、取代的磷酰基、膦酰基、取代的膦酰基、聚芳基、取代的聚芳基、C3-C20环、取代的C3-C20环、杂环、取代的杂环、氨基酸、肽和多肽基团的取代基。
BP可以通过可释放的接头与氟喹诺酮缀合。在一些实施方式中，可释放的接头可以是氨基甲酸苯酯接头。可释放的接头可以是氨基甲酸芳酯接头。在一些实施方式中，接头可以是硫代氨基甲酸芳酯接头。在一些实施方式中，接头可以是硫代氨基甲酸苯酯接头。在一些实施方式中，硫代氨基甲酸酯接头可以是O-硫代氨基甲酸酯接头。在一些实施方式中，硫代氨基甲酸酯接头可以是S-硫代氨基甲酸酯接头。在一些实施方式中，接头可以是碳酸酯接头。在一些实施方式中，接头可以是脲接头。在一些实施方式中，接头可以是二硫代氨基甲酸芳酯接头。
BP喹诺酮缀合物药物制剂
本文还描述了制剂，包括药物制剂，其可以包含一定量的本文别处所述的BP喹诺酮缀合物。该量可以是有效量。该量可以有效抑制细菌的生长和/或繁殖。该量可以有效地杀灭细菌。制剂，包括药物制剂，可以配制成通过各种途径用于递送，并可以包含药学上可接受的载体。技术和制剂通常可以在Remmington's Pharmaceutical Sciences,MeadePublishing Co.,Easton,Pa.(20thEd.,2000)中找到，其全部公开通过引入并入本文。对于全身给药，注射是可用的，包括肌肉内注射、静脉内注射、腹膜内注射和皮下注射。对于注射，本发明的治疗性组合物可以配制在液体溶液中，例如在生理学相容的缓冲液中，诸如汉克氏(Hank's)溶液或林格氏(Ringer's)溶液。此外，BP喹诺酮缀合物和/或其组分可以配制以固体形式，并在使用前立即被再溶解或悬浮。冻干形式也包括在内。BP喹诺酮缀合物的制剂，包括药物制剂，可以特征为是至少无菌且无热原的。这些制剂包括供人类使用和兽用的制剂。
合适的药学上可接受的载体包括但不限于水、盐溶液、醇、阿拉伯胶、植物油、苄醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物诸如乳糖、直链淀粉或淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮，其不与BP喹诺酮缀合物发生有害反应。
药物制剂可以是已灭菌的，且如果需要，可以与助剂诸如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂、调味剂和/或芳香物质混合，其不与BP喹诺酮缀合物发生有害反应。
另一制剂包括向骨移植材料或骨隙填充物中添加BP喹诺酮缀合物，用于预防或治疗骨髓炎、种植体周围炎或假体周围感染，以及用于拔牙后的牙槽保护(socketpreservation)。
药物制剂可以配制为与其预期的给药途径相容。给药途径的实例包括肠胃外例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如吸入)、经皮(局部)、经粘膜和直肠给药。用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水、不挥发性油、聚乙二醇类、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，诸如苄醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲液，诸如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的剂，诸如氯化钠或葡萄糖。pH的调节可以用酸或碱，诸如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制剂可以封装在玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适合注射用的制剂，包括药物制剂，可以包括无菌水溶液(在为水溶性的情况下)或分散剂以及用于即时制备无菌可注射溶液或分散剂的无菌粉末。对于静脉给药，合适的载体可以包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EMTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在实现容易注射的程度上，可注射药物制剂可以是无菌的且可以是流体。可注射药物制剂在制造和储存条件下可以是稳定的，且必须在防止诸如细菌和真菌的微生物的污染作用下保存。载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇的药学上可接受的多元醇以及其合适的混合物。可以例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣，通过在分散情况下维持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。对微生物作用的预防可以通过各种抗细菌和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等等。在一些实施方式中，在组合物中包括等渗剂(例如糖、多元醇诸如甘露醇、山梨醇和氯化钠)可能是有用的。
无菌注射溶液的制备可以通过将一定量的本文所述的任何BP喹诺酮缀合物加入到根据需要具有本文列举的一种或几种成分的组合的合适的溶剂中，然后过滤灭菌来进行。一般来说，分散液的制备可以通过将BP喹诺酮缀合物加入包含基础分散介质和本文列举的那些中的所需的其他成分的无菌媒介物中来进行。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况，可用的制备方法的实例为真空干燥和冷冻干燥，其可得到活性成分以及其先前经过无菌过滤的溶液中的任何额外的所需成分的粉末。
全身给药也可以通过经粘膜或经皮的方式。对于经粘膜或经皮给药，可以在制剂中使用适合待渗透屏障的渗透剂。这样的渗透剂在本领域中是通常已知的，并包括，例如对于经粘膜给药有表面活性剂(detergents)、胆盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药可以通过使用鼻用喷雾或栓剂来完成。对于经皮给药，BP喹诺酮缀合物可以配制成如本领域通常已知的膏、软膏、凝胶或霜乳。在一些实施方式中，BP喹诺酮缀合物可以通过经皮递送系统施用，其可以缓慢释放BP喹诺酮缀合物用于透皮吸收。渗透促进剂可以用于促进条件培养基中的活性因子的经皮渗透。透皮贴片在例如美国专利No.5,407,713；美国专利No.5,352,456；美国专利No.5,332,213；美国专利No.5,336,168；美国专利No.5,290,561；美国专利No.5,254,346；美国专利No.5,164,189；美国专利No.5,163,899；美国专利No.5,088,977；美国专利No.5,087,240；美国专利No.5,008,110；和美国专利No.4,921,475中有描述。
对于口服给药，本文所述的制剂可以作为胶囊、片剂、粉末、颗粒或作为悬浮液或溶液呈现。制剂可以包含常规的添加剂，诸如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉、粘结剂、结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶、崩解剂、马铃薯淀粉、羧甲基纤维素钠、磷酸氢钙、无水或淀粉甘醇酸钠、润滑剂和/或硬脂酸镁。
对于肠胃外给药(即通过消化道以外的途径给药)，本文所述的制剂可以和与受试者血液等渗的无菌水溶液结合。这样的制剂可以通过将活性成分(例如BP喹诺酮缀合物)溶解在包含诸如氯化钠、甘氨酸等的生理学相容的物质并具有与生理条件相容的缓冲pH值的水中以便产生水溶液，然后使溶液无菌来制备。制剂可以呈现在单位或多剂量容器中，诸如密封的安瓿瓶或小瓶。制剂可以通过本领域已知的注射、输注或其他方式来递送。
对于经皮给药，本文所述的制剂可以与皮肤渗透促进剂组合，诸如丙二醇、聚乙二醇、异丙醇、乙醇、油酸、N-甲基吡咯烷酮等等，其增加了皮肤对本发明的核酸载体(vectors)的渗透性，并允许核酸载体通过皮肤渗透进血液中。本文所述的制剂和/或组合物可以进一步与高分子物质结合，诸如乙基纤维素、羟丙基纤维素、乙烯/醋酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮等等，以提供凝胶形式的组合物，其可以溶解于诸如二氯甲烷的溶剂中，蒸发至所需的粘度并然后施加至基底材料以提供贴片。
为了包括在骨移植替代物或骨隙填充物中以预防局部术后感染或手术后移植失败，并提供抗生素在移植部位持续局部释放，本文所述的制剂可以与任何异种移植(牛)、自体移植(自身)或同种异体移植(尸体)材料或合成骨替代物组合。例如，治疗外科医生或临床医生可以在床边/诊疗椅边将粉末制剂与任何市场上现有的骨移植替代物或与自体移植物预混合。此制剂可以进一步与任何先前描述的制剂组合，并且可以与包含羟基磷灰石类、磷酸三钙类、胶原、脂肪族聚酯、聚乳酸类(PLA)、聚羟基乙酸类(PGA)、聚己酸内酯(PCL)、聚羟基丁酸酯(PHB)、甲基丙烯酸酯类、聚甲基丙烯酸甲酯类、树脂、单体、聚合物、松质骨同种异体移植物、人纤维蛋白、富血小板血浆、富血小板纤维蛋白、熟石膏、磷灰石、合成羟基磷灰石、珊瑚羟基磷灰石、硅灰石(硅酸钙)、硫酸钙、生物活性玻璃、陶瓷、钛、灭活骨基质、非胶原蛋白、胶原和自溶性去抗原同种异体骨的产品组合。在此实施方式中，与BP喹诺酮缀合物组合的骨移植材料可以在糊、粉末、胶泥、凝胶、水凝胶、基质、粒剂(granules)、颗粒(particles)、冷冻干燥粉、冷冻干燥骨、脱钙冷冻干燥骨、新鲜或新鲜冷冻骨、皮髓质混合物、球粒、条、栓塞剂(plugs)、膜、重构以形成湿糊的冻干粉、小球、海绵、块、小块(morsels)、棒、楔、水泥/水门汀(cements)或无定形颗粒的制剂中；这些之中，许多也可以在注射制剂中或作为两种或更多上述制剂的组合(例如海绵的可注射糊)。
在另一实施方式中，BP-喹诺酮缀合物可以与包含天然或重组生长因子诸如转化生长因子-β(TGF-β)、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和/或骨形态生成蛋白(BMP)的基于因子的骨移植物组合。在另一实施方式中，BP喹诺酮缀合物可以与包括胚胎干细胞和/或成体干细胞、组织特异性干细胞、造血干细胞、表皮干细胞、上皮干细胞、牙龈干细胞、牙周膜干细胞、脂肪干细胞、骨髓干细胞和血干细胞的用于再生医学和牙医学的基于细胞的骨移植物组合。因此，具有骨传导、骨诱导、骨促进、骨生成或其任意组合的特性的骨移植物可以与BP喹诺酮缀合物组合用于临床或治疗性用途。
剂型
本文所述的BP喹诺酮缀合物及其制剂可以以单位剂量形式提供，诸如片剂、胶囊、单剂量注射或输注小瓶，或作为如上述制剂中的预定剂量用于与骨移植材料混合。在合适的情况下，本文所述的剂型可以是微胶囊化的。剂型还可以制备成延长或维持任何成分的释放。在一些实施方式中，复合活性剂可以是被延迟释放的成分。在其他实施方式中，辅助成分的释放被延迟。用于延迟释放成分的合适的方法包括但不限于将成分包衣或包埋在聚合物、蜡、凝胶等材料中。延迟释放剂量制剂可以按标准参考文献中所述来制备，诸如“Pharmaceutical dosage form tablets,”eds.Liberman et.al.(New York,MarcelDekker,Inc.,1989)，“Remington–The science and practice of pharmacy”,20th ed.,Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2000，和“Pharmaceutical dosage formsand drug delivery systems”,6th Edition,Ansel et al.,(Media,PA:Williams andWilkins,1995)。这些参考文献提供了用于制备片剂和胶囊以及片剂和球粒、胶囊和颗粒的延迟释放剂型的赋形剂、材料、设备和工艺。延迟释放可为从约一小时至约3个月或更长的任何时间。
包衣可以由不同比例的水溶性聚合物、不溶于水的聚合物和/或pH依赖性聚合物、有或没有不溶于水的/水溶性非聚合赋形剂来形成，以产生所需的释放曲线。包衣可以或应用于剂型(矩阵或简单)上，其包括但不限于片剂(压缩有或没有包被后的珠)、胶囊(有或没有包被后的珠)、珠、颗粒组合物，配制为(但不限于)悬浮液形式或喷撒剂型的成分本身。
合适的包衣材料的实例包括但不限于纤维素聚合物，诸如乙酸邻苯二甲酸纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素和醋酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素；聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、丙烯酸聚合物和共聚物，以及可商购的商品名为(Roth Pharma，Westerstadt，德国)的甲基丙酸烯树脂、玉米醇溶蛋白、虫胶和多糖。
有效量
制剂可以包含有效量的本文所述的BP喹诺酮缀合物(有效抑制和/或杀灭细菌)。在一些实施方式中，本文所述的BP喹诺酮缀合物的有效量的范围为从约0.001pg至约1,000g或更多。在一些实施方式中，本文所述的BP喹诺酮缀合物的有效量的范围可以为从约0.001mg/kg体重至约1000mg/kg体重。在其他实施方式中，BP喹诺酮缀合物的有效量的范围可以为从总制剂的约1％w/w至约99％或更多w/w、w/v或v/v。在一些实施方式中，BP喹诺酮缀合物的有效量可有效杀灭作为骨髓炎及其全部亚型(例如糖尿病足骨髓炎)、颌骨坏死和牙周炎的致病物的细菌，包括但不限于葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、凝聚杆菌属(Aggregatibacter)、放线菌属(Actinomyces)、链球菌属(Streptococcus)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、肠杆菌属(Enterobacter)、梭杆菌属(Fusobacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、普氏菌属(Prevotella)、韦永氏球菌属(Veillonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、艾肯菌属(Eikenella)、密螺旋体属(Treponema)、戴阿利斯特杆菌属(Dialister)、微单胞菌属(Micromonas)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、坦纳菌属(Tannerella)和埃希氏杆菌属(Escherichia)的任何菌株或菌种。
使用BP喹诺酮缀合物的方法
可以向有需要的受试者给药一定量(包括有效量)的本文所述的BP喹诺酮缀合物及其制剂。在一些实施方式中，有需要的受试者可能有骨感染、疾病、疾患或其症状。在一些实施方式中，有需要的受试者可能疑似患有或容易患上骨感染、疾病、疾患或其症状。在一些实施方式中，有需要的受试者可能有发展为骨髓炎、骨坏死、假体周围感染和/或种植体周围炎的风险。在实施方式中，疾病或疾患可以为骨髓炎及其所有亚型、骨坏死、种植体周围炎或牙周炎。在一些实施方式中，有需要的受试者具有被微生物(诸如细菌)感染的骨。在一些实施方式中，细菌可以是葡萄球菌、假单胞菌、凝聚杆菌属、放线菌属、链球菌属、嗜血杆菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、肠杆菌属、梭杆菌属、拟杆菌属、卟啉单胞菌属、普氏菌属、韦永氏球菌属、弯曲杆菌属、消化链球菌属、艾肯菌属、密螺旋体属、戴阿利斯特杆菌属、微单胞菌属、耶尔森氏菌属、坦纳菌属和埃希氏杆菌属的任何菌株或菌种。在一些实施方式中，细菌可以形成生物膜。在一些实施方式中，可以通过向有需要的受试者给药一定量(诸如有效量)的本文所述的BP喹诺酮缀合物或其制剂来治疗有需要的受试者中的骨髓炎。在一些实施方式中，本文所提供的组合物和化合物可以用于骨坏死治疗和/或预防、牵张成骨、裂隙修复、关键性上牙槽缺损的修复、颌骨重建以及骨和/或关节的任何其他重建或修复。
BP喹诺酮缀合物的给药不限于单一途径，而可以包括通过多种途径给药。例如，除其他之外，示例性通过多种途径的给药包括皮内和肌肉内给药的组合，或皮内和皮下给药的组合。多种给药可以是顺序的或同时的。通过多种途径施用的其他模式对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
药物制剂可以通过允许药剂在体内对受试者发挥作用的任何合适的方法向受试者给药。例如，本文所述的制剂和其他组合物可以通过已知的程序向受试者给药，包括但不限于通过口服给药、舌下或口含给药、肠胃外给药、经皮给药、通过吸入、通过鼻腔递送、经阴道、经直肠和肌肉内。本文所述的制剂或其他组合物可以经肠胃外给药，通过筋膜外、囊内、皮内(intracutaneous)、皮下、真皮内、鞘内、肌肉内、腹腔内、胸骨内、血管内、静脉内、薄壁组织和/或舌下递送。递送可以为通过注射、输注、导管递送或其他一些方式，诸如通过片剂或喷雾。在手术部位处抗感染骨移植材料的情况下，也可以通过诸如羟基磷灰石或骨的载体进行递送。可以通过与骨移植材料附接或其他结合进行递送。
实施例
现已描述了本公开的实施方式，一般来说，以下实施例描述了本公开的一些额外的实施方式。虽然结合以下实施例和相应的文本及附图对本公开的实施方式进行了描述，但不旨在将本公开的实施方式限制于此说明。相反，是意图是覆盖包括在本公开的实施方式的精神和范围内的所有可替代方案、修改和等同物。
实施例1：
引言
感染性骨疾病，或骨髓炎，是世界范围内人类和兽医医学的主要问题，并由于潜在的威胁肢体的后遗症和死亡而可能是灾难性的(Lew,et al.,Osteomyelitis.Lancet2004；364:369-79；Desrochers,et al,Limb amputation and prosthesis.Vet ClinNorth Am Food Anim Pract 2014；30:143-55；Stoodley,et al.,Orthopaedic biofilminfections.Curr Orthop Pract 2011；22:558-63；Huang,et al.,Chronicosteomyelitis increases long-term mortality risk in the elderly:a nationwidepopulation-based cohort study.BMC Geriatr 2016；16:72)。骨髓炎的治疗方法主要是抗微生物，且通常是长期的，并在许多情况下通过手术干预来控制感染。在大多数长骨骨髓炎病例中，致病病原体是金黄色葡萄球菌的生物膜；与它们的浮游(自由漂浮)对应物不同，按照定义这些微生物是与骨结合的(图1)。(Wolcott,et al.,Biofilms and chronicinfections.J Am Med Assoc 2008；299:2682–2684)。
骨髓炎的生物膜介导的性质在临床和实验环境中是重要的，因为许多生物膜病原体是无法培养的，并且在生长速度和抗微生物耐药性方面表现出改变的表型(与它们的浮游对应物相比)(Junka,et al.,Microbial biofilms are able to destroyhydroxyapatite in the absence of host immunity in vitro.J Oral MaxillofacSurg 2015；73:451-64；Herczegh,et al.,Osteoadsorptive bisphosphonatederivatives of fluoroquinolone antibacterials.J Med Chem 2002；45:2338-41)。用常规的抗生素难以消灭生物膜，这部分解释了为什么通常成功率较高的抗微生物疗法在骨科感染中却伴随着耐药生物膜病原体的发展、抗微生物药剂在骨中差的渗透以及全身毒性相关的不良事件而无法成功(Buxton,et al.,Bisphosphonate-ciprofloxacin bound toSkelite is a prototype for enhancing experimental local antibiotic deliveryto injured bone.Br J Surg 2004；91:1192-6)。
为了克服与骨髓炎治疗相关的许多挑战，人们对使用骨靶向缀合物的药物递送方法的兴趣日益增加，以实现更高或更持久的局部抗生素治疗性浓度，同时最小化全身暴露(Panagopoulos,et al.,Local Antibiotic Delivery Systems in Diabetic FootOsteomyelitis:Time for One Step Beyond？Int J Low Extrem Wounds 2015；14:87-91；Puga,et al.,Hot melt poly-epsilon-caprolactone/poloxamine implantablematrices for sustained delivery of ciprofloxacin.Acta biomaterialia 2012；8:1507-18)。与骨吸附的双膦酸(BP)缀合的氟喹诺酮抗生素代表了一种有前景的方法，因为每种成分的安全性的临床追踪记录都很长，而且它们的生化特性也很优越(Buxton,etal.,Bisphosphonate-ciprofloxacin bound to Skelite is a prototype forenhancing experimental local antibiotic delivery to injured bone.Br J Surg2004；91:1192-6)。在此背景下的氟喹诺酮家族的早期研究中，环丙沙星在与BP结合时表现出最好的结合和微生物学特性(Herczegh,et al.,Osteoadsorptive bisphosphonatederivatives of fluoroquinolone antibacterials.J Med Chem 2002；45:2338-41)。环丙沙星在此背景下的再利用(新用途)有几个优点：它可以有相对生物等效性口服或静脉给药，它具有对包括最常见的骨髓炎病原体在内的广谱抗微生物活性，它在临床上可实现的剂量下显示有杀菌活性，且它是氟喹诺酮家族中最便宜的药物(Houghton,et al.,Linkingbisphosphonates to the free amino groups in fluoroquinolones:preparation ofosteotropic prodrugs for the prevention of osteomyelitis.J Med Chem 2008；51:6955-69)。
BP家族的特异性骨靶向特性使它们成为在骨髓炎药物治疗中将抗生素引入至骨的理想载体(Zhang S,et al.,'Magic bullets'for bone diseases:progress inrational design of bone-seeking medicinal agents.Chem Soc Rev 2007；36:507-31)。BP与钙形成牢固的双齿和三齿键，并因此聚集在羟基磷灰石(HA)中，特别是在活跃的新陈代谢或感染和炎症部位(Cheong,et al.,Bisphosphonate uptake in areas oftooth extraction or periapical disease.J Oral Maxillofac Surg 2014；72:2461-8)。BP对化学和生物降解两者也表现出优异的稳定性(Russell,et al.,Mechanisms ofaction of bisphosphonates:similarities and differences and their potentialinfluence on clinical efficacy.Osteoporos Int 2008；19:733-59)。多年以来，通过与BP缀合将环丙沙星靶向骨的概念在许多报道中都有讨论(David,et al.,Methylene-bis[(aminomethyl)phosphinic acids]:synthesis,acid-base and coordinationproperties.Dalton Trans 2013；42:2414-22；Fardeau,et al.,Synthesis andantibacterial activity of catecholate-ciprofloxacin conjugates.Bioorg MedChem 2014；22:4049-60；EUCAST:European Committee on AntimicrobialSusceptibility Testing breakpoint tables for interpretation of MICs and zonediameters.2015.http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUC；CLSI.M100-S25 performance standards for antimicrobial susceptibility testing,Twenty-fifth informational supplement,2015；Tanaka,et al.,Bisphosphonatedfluoroquinolone esters as osteotropic prodrugs for the prevention ofosteomyelitis.Bioorg Med Chem 2008；16:9217-29；McPherson,et al.,Synthesis ofosteotropic hydroxybisphosphonate derivatives of fluoroquinoloneantibacterials.Eur J Med Chem 2012；47:615-8)。然而，早期尝试的结果为全身性不稳定的前体药物或不可裂解的缀合物，发现其大部分通过干扰药效需求而使缀合物的任一组分均失去活性。在氟喹诺酮领域，Herczegh等人描述了一个突出的实例，其中环丙沙星成分显著的革兰氏阳性抗菌特性在与稳定的BP连接的同源物缀合后丢失了(Herczegh,et al.,Osteoadsorptive bisphosphonate derivatives of fluoroquinoloneantibacterials.J.Med.Chem 2002；45:2338-41)。在此领域的后续研究表明，没有母体抗生素的裂解，这些缀合物单独不能发挥显著的抗微生物作用(Herczegh,et al.,Osteoadsorptive bisphosphonate derivatives of fluoroquinoloneantibacterials.J.Med.Chem 2002；45:2338-41；Houghton,et al.,Linkingbisphosphonates to the free amino groups in fluoroquinolones:preparation ofosteotropic prodrugs for the prevention of osteomyelitis.J.Med.Chem 2008；51:6955-69)。例如，Houghton等人合成并测试了各种BP-氟喹诺酮缀合物，且发现苯丙酮和酰氧基烷基氨基甲酸酯加替沙星前体药物一旦与骨结合则可能能够再生母体药物，并因此展示出比简单缀合物(诸如不能释放抗生素的双膦酰乙基、双磷酰丙酰基和酰胺衍生物)更大的抗微生物活性(Houghton,et al.,Linking bisphosphonates to the free aminogroups in fluoroquinolones:preparation of osteotropic prodrugs for theprevention of osteomyelitis.J.Med.Chem 2008；51:6955-69)。
综上，迄今为止此领域中的研究成果表明，BP-氟喹诺酮抗微生物活性是复杂的，且与所测试的病原体的特定菌株、抗生素和共价结合的BP部分的选择、这两种成分之间的系链长度、BP的骨结合亲和性、BP的吸附-脱附平衡以及用于缀合的连接方案的稳定性/不稳性和动力学有关(Herczegh,et al.,Osteoadsorptive bisphosphonate derivativesof fluoroquinolone antibacterials.J.Med.Chem 2002；45:2338-41；Houghton,et al.,Linking bisphosphonates to the free amino groups in fluoroquinolones:preparation of osteotropic prodrugs for the prevention ofosteomyelitis.J.Med.Chem 2008；51:6955-69；Tanaka,et al.,Bisphosphonatedfluoroquinolone esters as osteotropic prodrugs for the prevention ofosteomyelitis.Bioorg Med Chem 2008；16:9217-29；McPherson,et al.,Synthesis ofosteotropic hydroxybiphosphonate derivatives of fluoroquinoloneantibacterials.Eur J.Med Chem 2012:47:615-8)。因此，越来越多的证据表明，在此背景下“靶向并释放”接头策略可以为优化和成功提供更多的机会。因此，我们推测通过可代谢水解的氨基甲酸酯接头将环丙沙星与苯基BP部分缀合，应该会减轻骨髓炎药物治疗中抗生素骨给药遇到的问题。可裂解的氨基甲酸酯键和结构基序是为在特定组织中靶向并释放而设计的许多药物中的关键功能性，并赋予了药代动力学优势，诸如在血清中稳定而在存在酸和酶的环境下在感染的骨表面的不稳定(Ossipov,et al.,Bisphosphonate-modifiedbiomaterials for drug delivery and bone tissue engineering.Expert Opin DrugDeliv 2015；12:1443-58；Guo,et al.,pH-triggered intracellular release fromactively targeting polymer micelles.Biomaterials 2013；34:4544-54；Ghosh,etal.,Organic carbamates in drug design and medicinal chemistry.J Med Chem2015；58:2895-940)。
最近利用骨靶向并释放策略观察到明显成功的是，Morioka等人使用更稳定的酰胺肽键的可裂解的变体(氨基甲酸酯)设计了靶向骨并在骨处释放的雌二醇类似物(Morioka,et al.,Design,synthesis,and biological evaluation of novelestradiol-bisphosphonate conjugates as bone-specific estrogens.Bioorg MedChem 2010；18:1143-8)。在鉴定出药理活性变体(氨基甲酸苯酯)之前，他们尝试了数种此连接的版本。重要的是，他们证明了1000×更低的单剂量的类似连接的BP-雌二醇缀合物对骨产生的作用与单独给予雌二醇的作用相似(Morioka,et al.,Design,synthesis,andbiological evaluation of novel estradiol-bisphosphonate conjugates as bone-specific estrogens.Bioorg Med Chem 2010；18:1143-8)。缀合物还提供了更大的治疗指数或改善的安全性，因为在子宫组织中有最小的影响。Arns等人完成的药代动力学研究与用氨基甲酸苯酯连接的BP-前列腺素引起的这种效力的显著增强一致(Arns,et al.,Design and synthesis of novel bone-targeting dual-action pro-drugs for thetreatment and reversal of osteoporosis.Bioorg Med Chem 2012；20:2131-40)。报道了大环内酯类在抗微生物领域中这种方法的综合实例；然而，仅对烷基氨基甲酸酯进行了探究且缺乏进一步的成功，表明靶向并释放策略很可能是化学类别依赖性的(考虑到每种组分的官能团的相容性)以及生化靶点依赖性的，且对任何特定化学类别的设计必须针对其用途定制(Tanaka,et al.,Synthesis and in vitro evaluation of bisphosphonatedglycopeptide prodrugs for the treatment of osteomyelitis.Bioorg Med Chem Lett2010；20:1355-9)。
本实施例展示了氨基甲酸苯酯BP-环丙沙星缀合物及其在体外对常见的骨髓炎病原体的抗微生物活性的系统评价，并在种植体周围骨髓炎的动物模型中评估了体内安全性和有效性。重要的是，本文提出的体外和体内研究除了浮游培养之外还以生物膜模型和方法为基础，这是此领域中迄今为止未曾进行过的，并应提供更大的临床相关性。本研究特别针对感染性骨疾病的治疗中尚未满足的医疗需求，并因此旨在具有转化意义。
结果与讨论
化学：一种BP-环丙沙星缀合物(BCC，化合物6)的总体合成路线如图2A-2B中的方案所示。一开始我们的项目团队确定了惰性4-羟基苯乙叉基BP用于本缀合。BP设计的基本原理是保持BP部分的趋骨性能力，同时抑制其不需要的抗吸收活性，使我们能够最小化混杂因素，并专注于评估由于母体环丙沙星化合物而产生的抗微生物作用。如果需要提供对骨组织保护的双效作用，则BP配体可以设计成除了具有在感染的解剖部位的抗微生物作用之外还具有(不同效力的)抗吸收功能性。我们选择此苯基BP还出于对骨结合亲和性和系链长度的考虑，正如先前研究已经表明的，弱的结合亲和性会降低靶向效率，以及延长氟喹诺酮与BP官能团之间的距离会降低母体化合物的水解及再生速率(Houghton,et al.,Linking bisphosphonates to the free amino groups in fluoroquinolones:preparation of osteotropic prodrugs for the prevention ofosteomyelitis.J.Med.Chem.2008；51:6955-69；Tanaka,et al.,Bisphosphonatedfluoroquinolone esters as osteotropic prodrugs for the prevention ofosteomyelitis,Bioorg Med Chem 2008,16:9217-29；McPherson,et al.,Synthesis ofosteotropic hydroxybisphosphonate derivatives of fluoroquinoloneantibacterials,Eur J Med Chem 2012,47:615-8)。最重要的是，相对于之前的BP-F喹诺酮缀合物，我们认为使用氨基甲酸芳酯作为接头或许可以针对此生化靶点在血浆中提供最优化的稳定性并在骨上提供足够的释放。因此，按照先前所述制备了4-羟基苯基乙叉基BP(4)的四乙基酯(David,et al.,Methylene-bis[(aminomethyl)phosphinic acids]:synthesis,acid-base and coordination properties.Dalton Trans 2013；42:2414-22)。然后，用氯甲酸对硝基苯酯活化BP(4)的苯酚基团，以形成化合物(5)用于与保护的环丙沙星(7)缀合(Fardeau,et al.,Synthesis and antibacterial activity ofcatecholate-ciprofloxacin conjugates.Bioorg Med Chem 2014；22:4049-60)。通过二碳酸二叔丁酯(Boc2O)反应用苄基(Bn)基团保护环丙沙星(6)。最后，用氢解和溴三甲基硅烷(TMSBr)将缀合物(8)脱保护，得到我们第一个氟喹诺酮氨基甲酸苯酯BP-环丙沙星前体药物(9)，准备好用于生化和抗微生物评估。
微生物学：我们进行的第一组研究旨在评估标准实验室浮游培养系统中该缀合物对与骨感染相关的一组14种金黄色葡萄球菌临床菌株(甲氧西林敏感的：MSSA和耐甲氧西林的：MRSA)的抗微生物活性。遵循EUCAST(抗微生物剂敏感性测试欧洲委员会)指南，盘扩散抑制区测定的结果显示直径范围为25-40mm(平均31.5，SD±5)，且根据EUCAST折点证明每种菌株均有抗微生物敏感性(EUCAST:European Committee on AntimicrobialSusceptibility Testing breakpoint tables for interpretation of MICs and zonediameters.2015.http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUC)。使用微量稀释方法测试的BP-环丙沙星对所有14种菌株的MIC结果如图3所示。同时确定了母体化合物环丙沙星单独的MIC以供参考(其示于表1)，并发现与已建立的临床折点一致。26已经证实此类别中的前体药物其自身缺乏显著的抗微生物活性，并且任何BP相关的抗微生物作用均为可忽略不计的，因此母体药物的释放是观察到诸如这里报道的任何可观的抗微生物活性的先决条件(Houghton,et al.,Linking bisphosphonates to the free amino groups influoroquinolones:preparation of osteotropic prodrugs for the prevention ofosteomyelitis.J.Med.Chem.2008,51:6955-69)。
AST和MIC数据表明，缀合物和环丙沙星两者均对浮游金黄色葡萄球菌病原体具有杀菌活性，且缀合影响了环丙沙星体外抗微生物活性，达到MIC所需的缀合物浓度略高于单独的环丙沙星。这是符合预期的，因为已经证实缀合是基于对必须递送到骨的抗生素和BP两者的化学修饰；结果是，母体药物的性质包括其治疗性作用可以被这样的修饰改变。我们的结果也与该领域先前的文献一致，表明成功的功能性缀合物保留了母体化合物的抗微生物活性，尽管是以略低的水平(Herczegh,et al.,Osteoadsorptive bisphosphonatederivatives of fluoroquinolone antibacterials.J.Med.Chem 2002,45:2338-41；Houghton,et al.,Linking bisphosphonates to the free amino groups influoroquinolones:preparation of osteotropic prodrugs for the prevention ofosteomyelitis.J.Med.Chem 2008,51:6955-69；Zhang,et al.,‘Magic Bullets’for bonediseases:progress in rational design of bone-seeking medicinal agents)。重要的是，在骨髓炎的治疗性背景下，病原体不是浮游的(如这些标准测定中的)而是生物膜，并作为基质与骨结合，所以BP-环丙沙星缀合物的增强的骨靶向性质应提供多于足够浓度的抗生素的在骨处抗微生物作用，以及因此提供更大的有效性(如即将得到的生物膜相关的体外和体内数据支持)。
由于用于体外抗微生物测试的微生物培养基具有蛋白质、碳水化合物、酶和盐/金属，因此在抗微生物测试期间可能存在BP-环丙沙星的降解、变性或螯合。这可能会对抗生素活性产生不良影响，且与化学缀合本身无关。基于我们对缀合物的AST和MIC结果以及可证实的抗微生物有效性，这在很大程度上是非常不可能的。尽管如此，我们试图通过将缀合物引入胰酶解酪蛋白大豆肉汤微生物培养基中并进行定量光谱分析来客观地评估BP-环丙沙星的稳定性，如图4所示。结果表明了优异的抗微生物稳定性，在24hrs后微生物培养基中没有降解或变性的迹象。因此，微生物培养基看来对缀合物活性和有效性无不良影响。
在确定了缀合物的抗微生物有效性和化学稳定性之后，我们接下来试图评估HA结合能力。当我们向微生物培养基中加入HA小球，并然后以与我们的抗微生物测试中使用的浓度相似的各种浓度引入BP-环丙沙星时，上清液(无HA小球)的定量光谱分析证实HA对缀合物有显著的吸附和保留(图5)。这些结果与先前报道的包含有相似骨亲和性的BP部分的此类别中的类似物一致(Tanaka,et al.,Bisphosphonated fluoroquinolone esters asosteotropic prodrugs for the prevention of osteomyelitis.Bioorg Med Chem2008；16:9217-29；McPherson,et al.,Synthesis of osteotropic hydroxybisphosphonatederivatives of fluoroquinolone antibacterials.Eur J Med Chem 2012；47:615-8)。骨吸附似乎也是浓度依赖性现象。
然后我们选择金黄色葡萄球菌菌株ATCC-6538用于进一步测试，因为与其他测试菌株相比，它对环丙沙星和缀合物两者均表现出最少的敏感性和最差的MIC谱(图3)。与其他测试菌株相比，此菌株也是众所周知的稳固的生物膜形成病原体。因此，我们可以测试并优化我们的缀合物对抗最强毒的病原体，以限制偏见和高估的结果，同时也促进对在基于生物膜和临床相关模型中的抗微生物活性的测试。因此，我们在酸性和碱性两种条件下对有BP-环丙沙星的浮游金黄色葡萄球菌菌株ATCC-6538进行AST，以评估pH对缀合物活性的影响。标准微量稀释方法学的定量结果表明，在酸性条件下抗微生物活性整体得到改善，且在相当于碱性条件下达到MIC50所需的缀合物浓度的一半时达到MIC50(图6)。这对于临床骨髓炎应用可能是有用的，其中生物膜病原体以及宿主炎症和破骨细胞生成都会产生酸性的局部环境。然而，其他研究已经表明，尽管由感染生物体和炎症造成的局部酸性可能与一些药物在骨处的释放相关，但这样的过程在提供足够浓度的抗微生物剂上的效率是令人怀疑的，因而前体药物设计和缀合方案很可能发挥更大的作用。(Houghton,et al.,Linkingbisphosphonates to the free amino groups in fluoroquinolones:preparation ofosteotropic prodrugs for the prevention of osteomyelitis.J.Med.Chem 2008；51:6955-69)。最后，AST数据也表明环丙沙星和缀合物的MIC各自等同于它们的平均杀菌浓度(MBC)。
接下来，按照CLSI(临床实验室标准协会)的方法对缀合物进行时间-杀灭测定，且结果表明，该缀合物以先前确定的MIC在1hr和长达24hrs内对于金黄色葡萄球菌的甲氧西林敏感(ATCC-6538)和耐甲氧西林(MR4-CIPS)分离株是有杀菌性的，防止了100％的增长；这些动力学研究表明，与对照相比，以一半的MIC在1hr内是有杀菌性的，并也在长达24hr内抑制生长(50％)(图7)(CLSI.M100-S25 performance standards for antimicrobialsusceptibility testing；Twenty-fifth informational supplement；2015)。动力学结果表明了缀合物对所测试细菌的时间有效性和超过24hrs的持续的杀菌活性，支持了在所测试细菌的存在下有裂解活性。
接下来，我们在两种不同的基底(聚苯乙烯和HA盘)上测试了缀合物对抗预形成的细菌生物膜，以第一次在此背景下评估对生物膜的抗微生物有效性，并也确定基底特异性是否起作用。用BP-环丙沙星处理金黄色葡萄球菌(ATCC-6538)的生物膜以及额外的铜绿假单胞菌(ATCC-15442)的生物膜，并评估抗微生物活性。我们在这里也测试了铜绿假单胞菌，因为它是骨髓炎中第二常见的临床病原体，尽管患病率远低于金黄色葡萄球菌病例。图8示出了聚苯乙烯作为基底用于生物膜生长的结果，且BP-环丙沙星对于金黄色葡萄球菌ATCC-6538的最小生物膜抑制浓度(MBIC50)为15.6-31.2mcg/mL，其与浮游培养中的此菌株的MIC相当；在测试浓度范围内，对于铜绿假单胞菌ATCC-15442未观察到MBIC50。
然而，当使用HA盘作为生物膜基底时，如图9所示观察到明显提高的杀菌活性，且所有测试的缀合物浓度均导致了有统计学意义的杀菌活性和菌落形成单位(CFUs)的减少。缀合物对于金黄色葡萄球菌菌株ATCC-6538的MBIC50为8mcg/mL且MBIC90为50mcg/mL；母体药物环丙沙星对于此病原体的MBIC90为8mcg/mL。然而，对抗铜绿假单胞菌菌株ATCC-15442，环丙沙星无抑制性或杀菌活性，而缀合物以50mcg/mL在酸性和碱性条件下有杀菌性，且在碱性条件下表现出提高的杀菌活性，与之相比，对金黄色葡萄球菌是在酸性条件下观察到提高的抗微生物活性。总的来说，这些结果表明，相比于聚苯乙烯作为基底，在存在HA作为基底的情况下缀合物对抗生物膜病原体更有效，而且除了像所测试病原体的菌株和细菌生长的模式(浮游对比生物膜)等因素之外，基底特异性在抗微生物活性中也起作用。这是以前未被证明过的，并增加了对这些化合物的抗微生物潜力用于临床应用对抗生物膜病原体的理解。
最后，我们在浮游和生物膜培养的预防型的实验环境中对缀合物进行了抗微生物测试，这在骨髓炎的抗生素预防性方案中也具有临床相关性。这里将HA小球引入不同浓度的BP-环丙沙星中，然后接种金黄色葡萄球菌24hrs，且如图10所示，定量评估表明当缀合物的浓度低至7.8mcg/mL并最高至250mcg/mL时没有细菌生长，以及当缀合物的浓度范围为从0.12至3.9mcg/mL时有强列抑制下的最低限度的细菌生长。
然后，我们再次使用HA盘作为基底用于金黄色葡萄球菌生物膜的生长，但是这次在BP-环丙沙星或环丙沙星的温育之后，接种和生物膜生长之前，先用培养基冲洗盘。图11示出了生长24hrs后定量化生物膜培养和CFU的结果，且在100mcg/mL时环丙沙星抑制所有生物膜生长，而在10mcg/mL时BP-环丙沙星抑制所有生长。由于环丙沙星的分子质量大约为缀合物的分子质量的一半，所以与单独的环丙沙星相比，缀合物在实现完全杀菌作用方面的活性是其20×。这些发现支持了母体药物环丙沙星随时间从前体药物中酶裂解并释放的有效机制。与HA的有效结合以及母体抗生素的裂解或再生，对于此类别中的缀合物展示出与单独的母体抗生素相当或更好的实质性抗微生物有效性来说是必要的(Houghton,etal.,Linking bisphosphonates to the free amino groups in fluoroquinolones:preparation of osteotropic prodrugs for the prevention ofosteomyelitis.J.Med.Chem 2008；51:6955-69；Tanaka,et al.,Bisphosphonatedfluoroquinolone esters as osteotropic prodrugs for the prevention ofosteomyelitis.Bioorg Med Chem 2008；16:9217-29；McPherson,et al.,Synthesis ofosteotropic hydroxybiphosphonate derivatives of fluoroquinoloneantibacterials)。
体内安全性和有效性：
由于这种BP-环丙沙星缀合物是新颖的且尚未在体内测试过，因此我们在种植体周围骨髓炎的动物模型中进行了初步的安全性和有效性研究。此模型是出于转化价值专为研究生物膜介导的疾病和体内宿主反应而开发的独特的内部颌骨种植体周围骨髓炎模型(Freire,et al,Development of animal model for Aggregatibacteractinomycetemcomitans biofilm-mediated oral osteolytic infection:apreliminary study.J Periodontol 2011；82:778-89)。简单来说，将非大鼠正常菌群所固有的颌骨骨髓炎病原体伴放线凝聚杆菌(Aa；野生型粗糙株D7S-1；血清型a)的生物膜以109CFU预先接种在微型钛种植体上。为了在我们的动物研究之前确认Aa对母体药物环丙沙星的敏感性，我们进行了AST和MIC测定，如先前描述的对长骨骨髓炎病原体所进行的那样。盘扩散抑制区测定显示直径＞40mm，且MIC90为2mcg/mL，表明此微生物对母体药物环丙沙星有很强的敏感性。先前还测试过Aa对pH敏感性生物素化环丙沙星前体药物的敏感性，并发现其对母体抗生素敏感(Manrique,et al.,Perturbation of the indigenous rat oralmicrobiome by ciprofloxacin dosing.Mol Oral Microbiol 2013；28:404-14)。当在体外将生物膜建立在种植体上之后，通过手术将生物膜转移到每只大鼠的颌骨。将动物麻醉，缩回双颊，并进行经粘膜截骨术，从而可以将种植体人工插入到截骨中并固定。在每只大鼠的双侧腭骨中放入两个接种了生物膜的种植体(n＝12只大鼠和24个种植体)。此模型允许标准化的和可复制的数量的细菌活菌在每个种植体上作为完好建立的生物膜形成，对此我们之前已经展示了放置后在体内持续数周并导致局部感染、炎症和骨破坏(Freire,et al,Development of animal model for Aggregatibacter actinomycetemcomitansbiofilm-mediated oral osteolytic infection:a preliminary study.J Periodontol2011；82:778-89)。
术后种植体周围感染建立1周时，以实验部分中规定的给药方案向动物给药BP-环丙沙星、作为阳性对照的单独的环丙沙星以及作为阴性对照的无菌无内毒素的盐水。为了确定合适的给药浓度，我们根据先前的研究和药代动力学数据，使用相似的靶向和释放策略并也用啮齿类动物计算了缀合物的大约初始剂量。(Houghton,et al.,Linkingbisphosphonates to the free amino groups in fluoroquinolones:preparation ofosteotropic prodrugs for the prevention of osteomyelitis.J Med Chem 2008；51:6955-69；Morioka,et al.,Design,synthesis,and biological evaluation of novelestradiol-bisphosphonate conjugates as bone-specific estrogens.Bioorg MedChem 2010；18:1143-8)。我们预期，0.1、1和10mg/kg的递增剂量的BP-环丙沙星摩尔当量将允许我们基于关于动物模型的样本量估计和以往的经验在每组2个测试动物中确定抗微生物活性(Freire,et al,Development of animal model for Aggregatibacteractinomycetemcomitans biofilm-mediated oral osteolytic infection:apreliminary study.J Periodontol 2011；82:778-89)。将动物在全身麻醉下经腹膜内注射给药，且所有化合物均构成在适当pH下的注射用无菌生理盐水中。药物治疗一周后，处死所有动物并进行种植体周围组织的切除术，且将组织立即均质化并处理，用于定量评估微生物负荷。在整个研究期间对动物药物治疗的局部或全身不良作用进行监测。
所有动物均对药物治疗表现出良好的耐受性，在整个研究期间，无皮肤注射部位反应或炎症且无全身性不良事件被管理兽医报告。依据细菌活菌量的对数(每克组织平均log CFU)对治疗有效性进行定量测量，如图12所示。
在体内，在一周的过程中以0.3mg/kg多剂量(×3)给药的动物表现为无Aa回收或100％杀灭。10mg/kg的单剂量的BP-环丙沙星也显示出高的有效性，有2log的降低或杀灭99％细菌，且活性比相同总浓度但多剂量的单独的环丙沙星的活性高出一个量级。单独的环丙沙星在多剂量方案中导致1log的降低或杀灭90％细菌，考虑到我们已知这种化合物的有效性、它的抗微生物活性以及它代表缀合物的母体药物的事实，这是符合预期的，且也是我们选择它作为阳性对照的原因。0.1和1mg/kg的缀合物浓度具有很小的作用，表明在此背景下进一步优化是可能的。尽管如此，考虑到前体药物的靶向和释放能力，考虑到成分化合物的安全性谱以及口服或静脉给药的能力，有效剂量可以在临床环境中合理实现。有趣的是，在缀合物多剂量组中，我们的培养物显示出酵母形态的迹象且无可回收的Aa。对此现象的一种解释可能是污染，但这是非常不可能的，因为方法是相似的并同时进行的，在我们的实验室中没有培养酵母，仅有的没有回收Aa的动物样本在此同一多剂量组中和两个单独的动物中。因此，更有可能的解释是，Aa的杀灭和分解发生在体内，且另一种对母体药物环丙沙星敏感性较低的生物体(诸如酵母)在我们的培养物中生长。事实上，大鼠被用作口腔念珠菌病的完善的模型，且对于它们来说与正常人类口腔菌群酵母菌等同的是品脱洛佩斯假丝酵母(Candida pintolopessi)，其可以在经抗生素治疗或免疫缺陷的啮齿类动物中引起意想不到的疾病。(Junqueira.Models hosts for the study of oral candidiasis.AdvExp Med Biol.2012；710:95-105)。这在接受抗生素治疗的人类患者中也是众所周知的现象，即由于在体内通常与酵母菌竞争的细菌菌群受到抑制而导致的酵母菌过度生长或念珠菌病。
与阴性对照相比，并也与阳性对照母体药物相比，缀合物在体内使感染随时间消除进一步支持了缀合物与骨有效结合并释放出母体抗微生物剂。在此模型中缺乏有效性将表明前体药物没有结合上或没有释放出母体药物。这提供了至少间接的方式来了解前体药物在体内的药代动力学(Houghton,et al.,Linking bisphosphonates to the freeamino groups in fluoroquinolones:preparation of osteotropic prodrugs for theprevention of osteomyelitis.J.Med.Chem.2008；51:6955-69)。类似的研究在大鼠胫骨骨髓炎模型中测试了BP-氟喹诺酮的活性，并发现了所测试缀合物有类似的有效性以及大大增强的抗微生物活性的证据，但是是在预防性背景下，其中在骨感染前1-2天单次静脉内注射来给药前体药物(Houghton,et al.,Linking bisphosphonates to the free aminogroups in fluoroquinolones:preparation of osteotropic prodrugs for theprevention of osteomyelitis.J.Med.Chem.2008；51:6955-69)。此模型中的感染是通过在手术暴露的胫骨中注射一团浮游细菌生成的，并在感染后24hr将动物处死。此研究不是生物膜介导的骨髓炎治疗研究，但与本文所呈现的体外数据一致，证明生物膜生长可以用BP-环丙沙星的预处理来预防(Houghton,et al.,Linking bisphosphonates to the freeamino groups in fluoroquinolones:preparation of osteotropic prodrugs for theprevention of osteomyelitis.J.Med.Chem.2008；51:6955-69)。我们的实验证实了BP-环丙沙星前体药物在安全且充足的单剂量下产生足够浓度的母体药物的能力，维持对所建立的生物膜的杀菌活性，而这时单独母体抗生素的活性已经降低。将进一步对缀合物在动物模型中治疗长骨骨髓炎的能力进行评估，并也将在体内进行综合的药代动力学和药效动力学研究；这些测试的结果将在适当时候发布。
讨论
本实施例展示了利用靶向和释放策略成功进行的氨基甲酸苯酯BP-环丙沙星缀合物的设计与合成，并系统地评估了该化合物(以及整体的缀合物)的每个成分在体外和体内的功能性。对所测试BP-环丙沙星对常见的骨髓炎病原体的体外抗微生物研究显示出强的杀菌谱，并在假体周围骨髓炎的动物模型中体内证明了安全性和有效性。在体内，在一周的过程中以0.3mg/kg多剂量(总共0.9mg/kg)给药的动物表现出无可回收细菌的最佳有效性。单剂量的10mg/kg的缀合物(5mg环丙沙星，考虑到缀合物的分子质量是母体药物的分子质量的两倍)也显示出强的抗微生物活性，并导致杀灭99％细菌。多剂量给药缀合物和以最高单剂量给药缀合物均优于以30mg/kg多剂量给药母体抗生素环丙沙星。较低单剂量浓度(0.1和1mg/kg)的缀合物不是有效的。
这些发现表明，当以单剂量给予时，对于缀合物在体内的有效性最小剂量是必要的，但当定期给药时，浓度低得多的缀合物可以提供最大的有效性并且＜1/10母体抗生素的浓度。对于转化以实践此靶向策略，可以通过降低用于患者的剂量浓度和提高治疗指数，以及也可通过限制全身性暴露来证明其可用性。重要的是，这些结果以及该领域的其他研究正在表明，由于缀合物具有独特的药物计量学参数，所以这些前体药物和它们的母体化合物之间的直接比较有些武断。此类别中的缀合物的任何未来的药代动力学建模都必须包括数学上分布的骨骼分区，其在抗生素药代动力学研究中通常不进行。这将提供新的药理学数据，并在体内具有意义。
在这里也首次测试了BP-环丙沙星对抗临床相关的生物膜，并当生物膜作为基质附着在骨上时在体外和体内BP-环丙沙星均表现出强的抗微生物活性。缀合物的抗微生物活性似乎与许多参数有关，包括所测试的病原体的种类和菌株、其生长模式(生物膜对比浮游的)、用于生物膜定植的基底、pH、浓度、骨结合亲和性和释放动力学。对使用BP作为生化载体通过靶向和释放策略将抗微生物剂递送到骨(生物膜病原体驻留的地方)的此类别的缀合物的优化，应代表治疗骨髓炎的有利的方法，并提供改进的药代动力学，同时最小化全身毒性。
材料和方法
化学：
1-(苄氧基)-4-(溴甲基)苯(1)
在氮气保护下，在烘干的烧瓶中，将4-苄氧基苄醇(1.00g，4.67mmol)溶解于无水二乙醚(25ml)中。将烧瓶在冰浴中冷却。用注射器加入溴三甲基硅烷(BTMS，1.26ml，9.52mmol)。允许烧瓶慢慢温热至室温。搅拌17h之后，将反应混合物倒入水(50ml)中，并分离出有机相。用二乙醚(2×20ml)清洗水相，然后用盐水(2×20ml)清洗合并的有机相，并用硫酸钠干燥。蒸发醚得到为白色结晶固体的产品(1.23g，95％收率)1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.47-7.28(m,7H),6.98-6.90(m,2H),5.07(s,2H),4.50(s,2H)。
(2-(4-(苄氧基)苯基)乙烷-1,1-二基)双(膦酸)四异丙酯(2)
在氮气保护下，将无水THF(2ml)加入到氢化钠在矿物油中的57-63％分散液中。在室温下搅拌的同时逐滴加入亚甲基双膦酸四异丙酯(0.57ml，1.8mmol)。产生气体且灰色的悬浮固体被消耗，留下大致澄清的溶液。再搅拌混合物10min。在氮气逆流下一次性加入固体1。溶液在保持澄清1min后变得混浊。维持搅拌2h，然后用TLC(100％EtOAc，通过UV或钼酸铈铵(CAM)染色来可视化)检查反应，在RF＝0.37和0.58处出现两个新斑点。剩余一些1(RF＞0.9)，将反应加热至50℃，持续30min，通过TLC显示进程很小。将反应混合物倒入5％柠檬酸水溶液中并用醚(2×30ml)萃取，用盐水清洗并蒸发。使用230-400目的硅胶，使用10％EtOAc递增至100％EtOAc的己烷溶液作为洗脱剂，通过快速色谱对残余物进行纯化。获得了为无色油状的期望的化合物(0.508g，收率52％)
(2-(4-羟基苯基)乙烷-1,1-二基)双(膦酸)四异丙酯(3)
将化合物2(0.508g，0.925mmol)溶解于13ml的甲醇中，并加入70mg的10％碳载钯。用氮气吹扫烧瓶，然后用氢气吹扫，并在合适位置有氢气气囊下搅拌过夜。TLC(10％MeOH在EtOAc中，vis.w/UV或CAM染色)示出了起始材料(RF＝0.63)的消失和RF＝0.49的新斑点的出现。将反应混合物用100ml的甲醇通过硅藻土(celite)过滤。蒸发滤液得到淡黄色油状期望的化合物(0.368g，收率88％)，其无需进一步纯化即可使用。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.07(d,J＝8.2Hz,2H),6.69(d,J＝8.2Hz,2H),4.71(m,4H),3.11(td,J＝16.9,6.0Hz,2H),2.47(tt,J＝24.4,6.0Hz,1H),1.32-1.21(m,24H)。31P NMR(162MHz,氯仿-d)δ21.06。
碳酸4-(2,2-双(二异丙氧基磷酰基)乙基)苯酯(4-硝基苯基)酯(4)
将化合物3(0.171g，0.380mmol)溶解于8ml的二氯甲烷中，然后加入三乙胺(159μl，1.14mmol)，之后一次性加入氯甲酸对硝基苯基酯(0.086g，0.418mmol)。溶液立即从无色变成黄色。搅拌2.5h之后，TLC(5％MeOH在EtOAc中，UV可视化)示出仅痕量的起始材料(RF＝0.31)以及在RF＝0.59处出现强斑点。使用1:1乙酸乙酯:己烷作为洗脱剂以去除一种杂质(RF＝0.88)，然后用纯乙酸乙酯洗脱产物，来通过快速色谱对化合物进行纯化。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.29(d,J＝9.1Hz,2H),7.46(d,J＝9.1Hz,2H),7.33(d,J＝8.5Hz,2H),7.15(d,J＝8.6Hz,2H),4.84–4.58(m,4H),3.22(td,J＝16.5,6.2Hz,2H),2.47(tt,J＝24.1,6.2Hz,1H),1.33–1.14(m,24H)。
7-(4-((4-(2,2-双(二异丙氧基磷酰基)乙基)苯氧基)羰基)哌嗪-1-基)-1-环丙基-6-氟-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(5)
将环丙沙星(46.5mg，0.140mmol)悬浮在塑料小瓶中的1.4ml水中。加入151μl的1MHCl，并涡旋小瓶以溶解环丙沙星得到无色澄清的溶液。加入Na2CO3以调节pH至8.5，并形成厚的白色沉淀物。将小瓶置于冰浴中，并在约5min内将溶解于1.4ml的THF的化合物4(71.9mg，0.117mmol)逐滴加入。然后将小瓶从冰浴中取出，避光在室温下搅拌过夜。反应混合物变为亮黄色，有悬浮固体。TLC(5％MeOH，在EtOAc中)示出了起始材料4的消失，以及荧光蓝色斑点(RF＝0.51)和归属于对硝基苯酚副产物的可见的黄色斑点(RF＝0.816)的出现。用10ml水稀释反应混合物，并通过细玻璃熔块(frit)过滤。用水清洗留下的固体直到没有黄色残留。然后将固体溶解并用DCM从熔块中洗出，且将溶液加载到快速硅胶柱上，并用MeOH浓度递增至5％的DCM洗脱以洗脱有淡蓝色荧光的带。蒸发合并的级分得到标题化合物为白色固体。1H NMR(400Mhz,甲醇-d4)1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.79(s,1H),7.93(d,J＝13.3Hz,1H),7.54(s,1H),7.30(d,J＝8.4Hz,2H),7.05(d,J＝8.5Hz,2H),4.70(dpd,J＝7.4,6.2,1.3Hz,4H),3.90(s,5H),3.75(s,3H),3.39(s,4H),3.18(td,J＝16.6,6.4Hz,2H),2.65(tt,J＝24.3,6.3Hz,1H),1.43–1.34(m,1H),1.34–1.19(m,24H),1.18–1.10(m,2H)。
1-环丙基-7-(4-((4-(2,2-二膦酰基乙基)苯氧基)羰基)哌嗪-1-基)-6-氟-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(6)，在本文中也被称为式2。
将化合物5(10.0mg，0.0124mmol)溶解于1.5ml小瓶中的DCM(0.2ml)中，并加入溴三甲基硅烷(BTMS)(0.2ml)，且立刻给小瓶加盖并浸于35℃油浴中。搅拌24hr后，通过蒸发去除溶剂和BTMS，然后加入1ml的MeOH，并搅拌小瓶过夜。溶剂蒸发后余下6.82mg(0.107mmol有绿色荧光的浅黄色固体)。取样本～0.2mg进行HPLC分析。悬浮在水中，测量pH值为2.5，然后调整至6.7，以得到有蓝色荧光的淡黄色溶液。HPLC分析(Luna C18，缓冲系统0.1M NH4OAc缓冲液pH 7.1；A：20％乙腈，B：70％乙腈。0-7min：100％A，7-25min梯度0-100％B)示出了主峰在RT＝14.8min，且次峰在5.76min(归属于环丙沙星)和18.8min。环丙沙星标准品(饱和溶液在缓冲液A中被稀释2×，5μl注射)的RT为5.68min。
微生物学：
实验菌株：测试了十二种甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌临床骨髓炎菌株和一种临床耐甲氧西林菌株(MR-CIPS)。这些病原体是波兰弗罗茨瓦夫医科大学制药微生物学和寄生虫学系(Department of Pharmaceutical Microbiology and Parasitology WroclawMedical University,Poland.)的菌株保藏的一部分。此外，选择以下ATCC保藏菌株用于实验目的：金黄色葡萄球菌6538和铜绿假单胞菌15442。
HA盘：使用可商购的HA粉末用于定制盘的制造。在没有粘结剂的情况下压制直径为9.6mm的粉末球粒。在900℃下进行烧结。使用用于静态拉伸、压缩和弯曲测试的通用测试系统(Instron model 3384；Instron，Norwood，MA)对片剂进行压缩。分别使用LEXTOLS4000显微镜(Olympus，Center Valley，PA)和Metrotom 1500显微断层摄影仪(CarlZeiss，Oberkochen，德国)通过共聚焦显微镜和微计算机断层成像(显微CT)检查所制造的HA盘的质量。
评估所测菌株对环丙沙星的敏感性的盘扩散测试：本程序是按照EUCAST指南进行的。简单来说，将0.5McFarland(MF)的细菌稀释液涂布到Mueller-Hinton(MH)琼脂板上。引入包含5mg环丙沙星的盘，并对板进行温育于37℃/24h。接下来，用尺子记录抑制区。将得到的值(mm)与EUCAST表中抑制区的适当值进行比较。
所测试化合物对浮游形式的所分析临床葡萄球菌菌株的MIC的评估：为了评估BP-环丙沙星和环丙沙星对微生物生长的影响，将100μl密度为1×105cfu/ml的微生物溶液与适当浓度的所测试化合物一起置于96-孔测试板上。其后立即使用光谱仪(ThermoScientific Multiscan GO)在580nm波长下测量溶液的吸光度。随后，将板在振动器中温育24h/37℃以获得微生物生长并防止细菌形成生物膜的最佳条件。温育之后，再一次测量吸光度。建立以下对照样本：阴性对照样本一：无微生物的无菌培养基；阴性对照样本二：无微生物的无菌培养基，用最终浓度为1％(v/v)的DMSO(二甲基亚砜，Sigma-Aldritch)来实现；阳性对照样本一：培养基+微生物，没有所测试化合物；阳性对照样本二：培养基+微生物，没有所测试化合物，但用最终浓度为1％(v/v)的DMSO来实现。使用1％DMSO的基本原理是环丙沙星能有效地溶解于此溶剂中，然而，DMSO＞1％的浓度可能对微生物细胞有害。为了评估细胞的相对数量，进行了以下计算。对照样本(在BP-环丙沙星的情况下为培养基+微生物，对于环丙沙星为培养基+微生物+DMSO)的吸光度值估计为100％。接下来，与所测试化合物进行温育的细胞的相对数量如下计算：对照样本吸光度值/所测试样本的值*100％。
用于测试稳定性的对胰酶解酪蛋白大豆肉汤(TSB)微生物培养基中BP-环丙沙星缀合物的光谱分析：将在TSB微生物培养基中的最终浓度为0.24-250mg/L的BP-环丙沙星引入96-孔板的孔中。其后立即使用光谱仪(Thermo Scientific Multiscan GO)在275nm波长下测量溶液的吸光度。接下来，将溶液置于24h/37℃/振动。温育之后，再一次测量吸光度。为了评估缀合物的降解，对在0hr和24hr时测取的吸光度值进行比较。
在添加有HA小球的胰酶解酪蛋白大豆肉汤微生物培养基中的BP-环丙沙星缀合物的光谱分析：将不同的BP-环丙沙星浓度引入悬浮于TSB微生物培养基中的HA粉末(小球)中。将包含BP-环丙沙星和HA小球的溶液引入24-孔板的孔中。粉末的最终浓度为10mg/1mL，而缀合物的最终浓度为0.24-250mg/L。其后立即使用光谱仪(Thermo ScientificMultiscan GO)在275nm波长下测量溶液的吸光度。在评估之前，使板在光谱仪中自动振动。接下来，将板置于24h/37℃/振动。24小时之后，再一次测量吸光度。为了评估在0hr和24hrs时缀合物的相对浓度，对在实验开始和结束时测取的吸光度值进行比较。
在酸性对比碱性pH下，BP-环丙沙星对金黄色葡萄球菌菌株ATCC-6538的浮游培养的抗微生物剂敏感性测试：本实验环境按照与先前描述的用于盘扩散测试的相同的方式进行，但使用KOH或HCL溶液调整微生物培养基至pH 7.4和pH 5，并使用通用pH指示剂(Merck，波兰)测量。
BP-环丙沙星缀合物对金黄色葡萄球菌菌株ATCC-6538(MSSA)和临床MRSA菌株MR4-CIPS的时间-杀灭测定：本实验按照与先前描述的小标题为“所测试化合物对浮游形式的所分析临床葡萄球菌菌株的MIC的评估”的相同的方式进行,但在0、1、2、4、8、16、24小时时进行吸光度测定(在580nm波长下)。
BP-环丙沙星对金黄色葡萄球菌菌株ATCC-6538和铜绿假单胞菌菌株ATCC-15442的预形成生物膜的抗微生物剂敏感性测试：将在适当的琼脂板(Columbia琼脂板用于金黄色葡萄球菌；MacConkey琼脂板用于铜绿假单胞菌)上培养的菌株转移至液体微生物培养基并在好氧条件下温育24h/37℃。温育之后，将菌株稀释至1MF的密度。将微生物稀释液引入包含HA盘作为基底的24-孔板的孔中，或者简单地引入聚苯乙烯孔中，其中孔的底表面作为生物膜发展的基底。将菌株在37℃下温育4hrs。接下来，将包含微生物的溶液从孔中移除。轻轻冲洗表面、HA盘和聚苯乙烯板，以留下附着的细胞并去除浮游或松散结合的微生物。将以这种方法制备的表面浸泡在包含0.24-125mg/L的BP-环丙沙星缀合物的新鲜TSB培养基中。在于37℃下温育24hrs之后，使用生理盐水溶液冲洗表面并转移至1mL的0.5％皂苷(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)。将表面剧烈地涡旋混合1分钟以分离细胞。随后，将所有的微生物悬浮液稀释10至109倍。在适当的稳定的培养基(MacConkey、Columbia分别用于铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌)上对每个稀释液(100mL)进行培养，并在37℃下温育24小时。之后，对微生物菌落进行计数，并评估形成生物膜的细胞数目。结果表示为每平方毫米表面CFU的平均数±平均值的标准误差。为了评估HA盘的准确的表面积，应用x射线断层摄影分析。为了评估测试板底部的面积，应用圆面积公式：πr2。
BP-环丙沙星缀合物抑制金黄色葡萄球菌6538附着至HA小球的预防能力：将不同的BP-环丙沙星浓度引入悬浮于TSB微生物培养基中的HA粉末(小球)中。将包含缀合物和HA小球的溶液引入24-孔板的孔中。粉末的最终浓度为10mg/1mL，而缀合物的最终浓度为0.12-250mg/L。将悬浮液置于24h/37℃/振动。24h之后，将悬浮液从孔中移出并进行脉冲离心以沉淀HA粉末。接下来，将上清液轻轻丢弃，并将新鲜的1mL密度为105cfu/mL的金黄色葡萄球菌引入HA小球。随后，振动该溶液，使用580nm波长测量吸光度，并置于24h/37℃/振动。温育之后再次测量吸光度，并对0hr和24hrs的值进行比较以评估相对于对照样本一(没有小球的细菌悬浮液)和对照样本二(细菌悬浮液+小球但没有添加缀合物)的细菌生长的减少。此外，对溶液进行脉冲离心，轻轻丢弃上清液，而对包含细菌的HA小球像之前一样进行平板培养和定量评估。
金黄色葡萄球菌在缀合物包被的HA盘的存在下温育24hrs之后的存活率：将HA盘浸泡在2mL包含各种浓度的BP-环丙沙星或单独的环丙沙星的溶液中，并放置24h/37℃。在DMSO或磷酸盐缓冲液中温育的HA盘作为对照样本。接下来，用无菌水冲洗盘3次。冲洗之后，将2mL的0.5MF的金黄色葡萄球菌ATCC6538引入包含HA盘作为基底的孔中用于生物膜发展，并像之前一样形成生物膜。
动物研究：所有的动物实验方法和程序都是按照南加利福尼亚大学(USC)的动物护理和使用委员会(IACUC)以及按照美国兽医协会组安乐死委员会批准和执行的。USC在美国农业部(USDA)注册，在国立卫生研究院(NIH)存档有完全批准的保证书(#A3518-01)，并被美国实验动物管理认证协会(AAALAC)认可。USC的动物福利保障号是A3518-01。我们IACUC批准的协议的标题是：“Bone targeted antimicrobials for biofilm-mediatedosteolytic infection treatment(骨靶向的抗微生物剂用于生物膜介导的溶骨性感染治疗)”，协议号为20474。对于这项研究，在研究中使用了12只五月龄、未交配过的雌性Sprague-Dawley大鼠，体重大约为每只200g。每个笼子中安置两只动物，在动物饲养所中于22℃下12-h光亮/12-h黑暗循环，并用软食(Purina Laboratory Rodent Chow)随意喂养。按照USC关于使用和护理动物的指导和条例来处理所有动物。动物处于24hrs/天随时候召的全职兽医的监督下，他们每天亲自对动物进行评估。所有的动物实验都使用用于报告动物研究的ARRIVE指南来描述，以确保结果的质量、信度、效度和重现性(Kilkenny,et al.,Improving bioscience research reporting:the ARRIVE guidelines for reportinganimal research.Vet Clin Pathol 2012；41:27-31)。
此动物模型是专为研究生物膜介导的疾病和体内宿主反应而设计的内部颌骨种植体周围骨髓炎模型(Freire,et al,Development of animal model forAggregatibacter actinomycetemcomitans biofilm-mediated oral osteolyticinfection:a preliminary study.J Periodontol 2011；82:778-89)。颌骨骨髓炎病原体Aa的生物膜以109CFU在微型钛种植体上预形成。为了在我们的动物研究之前确认Aa对母体药物环丙沙星的敏感性，我们进行了AST和MIC测定，如先前描述的对长骨骨髓炎病原体所进行的那样。当在体外将生物膜建立在种植体上之后，通过手术将生物膜转移到每只大鼠的颌骨。为进行手术，首先用4％异氟醚吸入剂然后腹膜内注射氯胺酮(80-90mg/kg)和甲苯噻嗪(5-10mg/kg)来麻醉动物。然后，通过在手术部位浸润注射0.25％布比卡因(bupivicaine)来给予局部麻醉。在割开初始切口之前，皮下给予丁丙诺啡缓释(1.0-1.2mg/kg)作为预镇痛。麻醉之后，缩回每只大鼠的颊粘膜，并用导向钻钻入前腭的自然牙间隙中的牙槽嵴来进行经粘膜截骨术。然后将种植体人工插入截骨中，并固定在骨中直到齿台处于粘膜水平。在每只大鼠的双侧腭骨中放入两个接种了生物膜的种植体。
术后一周再次给予4％异氟醚以对大鼠进行短暂麻醉，并检查种植体稳定性，以及记录种植体处和感染部位的临床发现。然后，通过腹膜内注射向动物给药BP-环丙沙星(0.1mg/kg、1mg/kg或10mg/kg作为单剂量，和0.3mg/kg 3×/周用于多剂量组)或单独的环丙沙星(10mg/kg 3×/周也作为多剂量组)作为阳性对照，以及无菌无内毒素盐水作为阴性对照。通过随机化过程将动物分配到治疗组和对照组。多剂量组动物在该周中的每次额外注射之前都被麻醉。所有化合物均为药理级的，并以合适的pH值构成于注射用无菌生理盐水中。药物治疗一周后，将所有动物置于CO2室(60-70％浓度)内5分钟，然后颈椎脱位来安乐死。对种植体周围组织(1cm2)进行整块切除并取出种植体。立即对种植体周围组织进行均质化和处理，用于定量评估微生物负荷。将分配到治疗组和对照组的大鼠进行去识别，并对随后分析微生物数据的研究人员隐瞒。对于微生物分析，将种植体周围软组织和骨放置于1ml的0.5％皂苷中进行处理并涡旋1分钟，然后直接转移至琼脂板并培养。用于培养Aa的培养基由改性TSB组成，且冷冻储备液在-80℃下保持于20％甘油、80％改性TSB中。所有的培养均在37℃下5％CO2中进行。通过将等份的连续稀释的匀浆涂布在TSA板上来确定匀浆中CFU的数目(每克CFU的数目)。记录了随治疗而变化的每克CFU的平均log10数目的减少。
统计分析：用SigmaStat程序包2.0版本(SPSS，Chicago，IL)进行统计计算。在使用G Power 3软件实验之前，进行功效分析以确定用于体外和体内研究的样本量估计(FaulF,Erdfelder E,Buchner A,Lang AG.Statistical power analyses using G*Power 3.1:tests for correlation and regression analyses.Behav Res Meth 2009；41:1149-60)。使用Kruskall-Wallis检验或单因素ANOVA对实验结果的定量数据进行分析，并当将治疗与对照进行比较时p＜0.05则存在统计学意义。
实施例2：
4-(2,2-双(二异丙氧基磷酰基)乙基)苯甲酸甲酯(7)
在氮气气氛下，在50mL 2-颈圆底烧瓶中，将THF(3mL)加入NaH在矿物油中的60％分散液(0.122g，3.05mmol)。将悬浮液冷却至0℃，同时搅拌，并逐渐加入亚甲基双膦酸四异丙酯(0.69mL，2.18mmol)。允许反应达到环境温度，且一旦停止从反应混合物中冒出氢气气泡，就将溶液再次冷却至0℃。将4-(溴甲基)苯甲酸甲酯(0.5g，2.18mmol)溶解于THF(2mL)，并逐滴加入到反应中。允许得到的溶液搅拌过夜，同时缓慢地达到环境温度。然后，将反应混合物冷却至0℃并用H2O(1mL)淬灭。加入柠檬酸在水(30mL)中的5％水溶液并用Et2O(3×30mL)萃取，将合并的有机物用盐水(50mL)清洗，在Na2SO4上干燥，过滤，减压下浓缩并通过使用EtOAc：Hex梯度(10-100％)的硅胶柱色谱纯化，以得到淡黄色油状的7(0.323g，收率30％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.93(d,J＝8.0Hz,2H),7.33(d,J＝8.4,6.0Hz,2H),4.79-4.683(m,4H),3.88(s,3H),3.24(td,J＝16.0,6.4Hz,2H),2.50(tt,J＝24.0,6.2Hz,1H),1.34-1.24(m,24H)。31P NMR(162MHz,氯仿-d)δ20.57。
4-(2,2-双(二异丙氧基磷酰基)乙基)苯甲酸(8)
向8Dr玻璃小瓶中的7(0.278g，0.583mmol)在MeOH(3mL)中的溶液加入LiOH·H2O(0.122g，2.914mmol)，并将得到的溶液在室温下搅拌过夜。蒸发反应混合物至干燥，将残留物溶解于水(30ml)中，并缓慢加入HCl(aq)(1M)达到pH值为3。用CHCl3(3×30mL)萃取得到的混合物。将合并的有机物在MgSO4上干燥，并在减压下浓缩以得到透明的浓稠油。收率：定量。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.96(d,J 6.4,2H),7.36(d,J 6.4,2H),4.78(sex,J 5.0,4H),3.27(td,J 14.0,4.8,2H),2.60(tt,J20.0,4.8,1H),1.43-1.26(m,24H)。31P NMR(162MHz,氯仿-d)δ20.57。
(2-(4-(氯甲酰基)苯基)乙烷-1,1-二基)双(膦酸)四异丙酯(9)
在氮气气氛下，将化合物8(0.162g，0.339mmol)溶解在氯仿(1ml)中，并加入催化量的DMF(1.3μL，0.017mmol)。缓慢加入二氯亚砜(49.2μL，0.678mmol)，并允许反应在室温下搅拌2小时。在真空下去除溶剂以得到透明的油。该产物立即在下一步中使用而无进一步操作。收率：定量化。
7-(4-(4-(2,2-双(二异丙氧基磷酰基)乙基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)-1-环丙基-6-氟-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(10)
将环丙沙星(0.112g，0.339mmol)悬浮于氯仿(1ml)中，并加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(354.3μL，2.034mmol)。将新制备的化合物9溶解于氯仿(1mL)中，并逐渐加入到环丙沙星:DIPEA悬浮液中。用箔覆盖反应混合物，并允许在室温下搅拌过夜。第二天，在真空下移除溶剂，并将得到的粗产物溶解在DCM(5mL)中，然后通过中等玻璃熔块漏斗过滤，并用更多的DCM(3×5mL)清洗。将滤液在真空下浓缩并通过使用MeOH:DCM梯度(0-10％)的硅胶柱色谱进一步纯化，以得到逐渐固化的粘性油状的10(0.226g，收率84％，1.8当量DIPEA盐)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝8.79(s,1H),8.06(d,J 12.8,1H),7.38(m,5H),4.80-4.73(m,4H),4.00(s,br,4H),3.56-3.53(m,1H),3.33-3.20(m,6H)2.50(m,1H),1.45-1.38(m,2H),1.32-1.25(m,24H),1.23-1.19(m,2H)。31P NMR(162MHz,氯仿-d)δ20.77。
1-环丙基-7-(4-(4-(2,2-二膦酰基乙基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)-6-氟-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(11)
在8Dr玻璃小瓶中，将化合物10(0.108g，0.136mmol)溶解在DCM(700μL)中，并加入BTMS(686.0μL，5.200mmol)。将小瓶加盖并在35℃下加热过夜，同时用箔覆盖并搅拌。第二天，在真空下去除溶剂，并用MeOH(2ml)淬灭粗产物。在室温下搅拌得到的溶液30分钟。在真空下去除溶剂以得到橙色油。加入几滴水以沉淀黄色固体。加入更多的MeOH(2mL)，并使用中等熔块玻璃漏斗过滤得到的悬浮液。用MeOH进一步清洗得到的固体，以得到黄色粉末(0.070g，产率82％)。1H NMR(400MHz,D2O,pH 7.5):δ＝8.54(s,br,1H),7.89(m,1H),7.64(m,1H),7.54(d,J 8.0,2H),7.44(d,J 8.0,2H),4.79(m,与D2O重叠,4H),4.00(s,br,2H),3.79(s,br,2H),3.47(s,br,2H),3.34(s,br,2H),3.21(td,J 14.0,6.4,2H),2.30(tt,J22.0,6.6,1H)。31P NMR(162MHz,氯仿-d)δ19.12。ESI-MS m/z(-):622.24[M-H]。
实施例3：
可以包括在BP缀合物中的喹诺酮的非限制性实例。
氟喹诺酮
下面是非氟喹诺酮的一个实例。
实施例4：
下面是本文所述的BP-喹诺酮缀合物的非限制性实例。
实施例5：
感染性骨疾病，或骨髓炎，是世界范围内人类1和兽医2医学的主要问题，并由于潜在的威胁肢体的后遗症3和死亡4而可能是灾难性的。目前治疗骨髓炎的方法主要是抗微生物，且通常是静脉内的和长期的，并在许多情况下通过手术干预来控制感染。在大多数长骨骨髓炎病例中，致病病原体是金黄色葡萄球菌的生物膜；与它们的浮游(自由漂浮)对应物不同，这些微生物是与骨结合的(图1)5。
骨髓炎的生物膜介导的性质在临床和实验环境中是重要的，因为许多生物膜病原体是无法培养的，并且在生长速度和抗微生物耐药性方面表现出改变的表型5,6。用常规的抗生素难以消灭生物膜，这部分解释了为什么通常成功率高的抗微生物疗法在骨科感染中却伴随着耐药生物膜病原体的发展、抗微生物药剂在骨中差的渗透以及全身毒性相关的不良事件而无法成功3。
为了克服与骨髓炎治疗相关的许多挑战7，人们对使用骨靶向缀合物的药物递送方法的兴趣日益增加，以实现更高或更持久的局部抗生素治疗性浓度，同时最小化全身暴露8。氟喹诺酮抗生素与骨吸附的双膦酸(BP)的缀合物(图13)代表了一种有前景的方法，因为每种成分的安全性的临床追踪记录都很长，而且它们的生化特性也很优越9,10。环丙沙星(图13)在此背景下有几个优点：1)它可以口服或静脉给药，有相对生物等效性，2)它已被FDA批准并适用于由铜绿假单胞菌和其他一些病原体引起的骨和关节感染，3)它具有对包括最常见的骨髓炎病原体(如引起长骨骨髓炎的金黄色葡萄球菌(甲氧西林敏感的)、铜绿假单胞菌11，和引起颌骨骨髓炎的伴放线凝聚杆菌12)在内的广谱抗微生物活性，4)它在临床上可实现的剂量下显示有杀菌活性13，以及5)它是氟喹诺酮家族中最便宜的药物。
然而，与大多数抗生素一样，氟喹诺酮对生物膜的活性相比于对浮游形式下的相同细菌有所降低；除了许多其他细菌菌株和抗生素类之外，已经证明特别是环丙沙星对金黄色葡萄球菌会显示这种结果。14-17这样的研究已表明，生物膜对抗微生物剂的耐药性可以比它们的浮游对应物对同一种抗微生物剂的耐药性高出一个至数个数量级。这突出了骨靶向方法用于治疗骨髓炎的重要性，以实现抗致病生物膜的抗生素的更高的局部浓度并克服潜在的耐药性。
BP家族的特异性骨靶向特性使这些药物成为在骨髓炎药物治疗中将抗生素靶向至骨的理想载体18-20。BP与磷酸钙矿物质形成强烈的双齿或三齿键，并因此聚集在羟基磷灰石(HA)中，特别是在新陈代谢活跃的骨骼部位，包括感染和炎症部位21。BP对化学和生物降解两者也表现出优异的稳定性22。BP-氟喹诺酮抗微生物活性是复杂的，且与所测试的病原体的特定菌株、抗生素和共价结合的BP部分的选择、这两种成分之间的系链长度、BP的骨结合亲和性、BP的吸附-脱附平衡、以及用于缀合的连接部分的稳定性/不稳性和动力学有关18-20。因此，越来越多的证据表明，“靶向并释放”接头策略(图13)，其中缀合物在循环中是稳定的但在骨表面是不稳定的，可能为此背景下的优化和成功提供更多的机会。因此，我们推测通过可代谢水解的氨基甲酸酯接头将环丙沙星与苯基BP部分缀合，应该会减轻骨髓炎药物治疗中抗生素给药遇到的问题。可裂解的氨基甲酸酯键是为在特定组织中靶向并释放而设计的许多药物中的关键功能23,24，并赋予了药代动力学优势，诸如在血清中的稳定性和在存在酸和酶的环境(例如炎症或感染)下在感染的骨表面的不稳性25。
Morioka等人26最近利用骨靶向并释放策略取得了明显成功，他们使用更稳定的酰胺肽键的可裂解的变体(氨基甲酸酯)设计了雌二醇类似物缀合物。在鉴定出药理活性变体(氨基甲酸芳酯)之前，他们尝试了数种此连接的版本。重要的是，他们证明了单剂量的类似连接的BP-雌二醇缀合物(以单独雌二醇的总剂量将近5600分之1的剂量)对骨产生的作用与单独给药雌二醇的作用相似26。该缀合物还提供了甚至更大的治疗指数，因为与单独的雌二醇相比，其在全身和子宫组织中的作用极小。Arns等人27完成的药代动力学研究与在基于用更不稳定的接头的BP-前列腺素的研究中这种效力的显著增强一致。报道了大环内酯类在抗微生物领域中这种方法的其他综合实例28；然而，仅对氨基甲酸烷基酯进行了探究且缺乏进一步的成功，表明靶向并释放策略很可能是化学类别依赖性的(考虑到每种组分的官能团的相容性)以及生化靶点依赖性的，且对任何特定化学类别的设计必须针对其用途定制。
在本实施例中，描述了氨基甲酸芳酯BP-氨基甲酸酯-环丙沙星缀合物6(BV600022)，并评估了其对常见的骨髓炎病原体的抗微生物活性，以及其在假体周围骨髓炎的动物模型中的体内安全性和有效性。本实施例中的研究除浮游培养之外还利用生物膜模型和方法，以提供更大的临床或转化相关性。
本文中有时会将这种化合物简单地称为“化合物6”、“缀合物6”或简称“6”。同样地，也可将其他化合物或缀合物类似地称为“化合物例如11”、“缀合物例如11”或简单地使用化合物数字标号(例如11)。
结果
化学
图16示出了6的总体合成方案，从相对药理学惰性的4-羟基苯基乙叉基BP(3)开始。用于图16所示方案的试剂如下：α试剂和条件：(a)BTMS(2当量)，Et2O，0℃-室温(rt)，17h，收率95％。(b)i)亚甲基双膦酸四异丙酯(1当量)，NaH(1当量)，THF，室温，10min；ii)1(1当量)，室温，2h，收率52％。(c)Pd/C(催化剂)(0.07当量)，H2，MeOH，室温，过夜，收率88％。(d)氯甲酸4-硝基苯酯(1.1当量)，Et3N(3当量)，DCM，室温，2.5h，收率44％。(e)环丙沙星(1.2当量)，水(pH值8.5)，THF，0℃-室温，过夜，收率52％。(f)i)BTMS(过量)，DCM，35℃，24h，ii)MeOH，室温，过夜，收率86％。
BP设计的基本原理是保持BP部分的趋骨性能力，同时抑制其不需要的抗吸收活性，最小化混杂因素以专注于评估由于母体环丙沙星化合物而产生的抗微生物作用。如果需要提供对骨组织保护的双效作用，则BP配体也可以设计成除了具有在感染的解剖部位的抗微生物作用之外还具有(不同效力的)抗吸收功能性。选择此苯基BP是出于对骨结合亲和性和系链长度的考虑，正如先前研究已经表明的，弱的结合亲和性会降低靶向效率13,14。相对于之前衍生的BP-氟喹诺酮缀合物，研究人员认为使用氨基甲酸芳酯作为接头或许可以针对此生化靶点在血浆中提供最优化的稳定性并在骨上提供足够的释放。
此外，合成了具有酰胺接头而不是氨基甲酸酯接头的类似的BP-环丙沙星缀合物，如图31示出的方案中所列，作为对照缀合物11(BV600026)。用于图31所示方案的试剂如下：b试剂和条件：(a)i)NaH(1.4当量)，THF，0℃-室温，1h；ii)4-(溴甲基)苯甲酸甲酯(0.7当量)，THF，0℃-室温，过夜，收率37％。(b)LiOH·H2O(5当量)，MeOH，室温，过夜，收率91％。(c)SOCl2(2当量)，DMF(0.05当量)，DCM，室温，2h，收率定量。(d)环丙沙星(1当量)，DIPEA(6当量)，CHCl3，室温，过夜，收率65％。(e)i)BTMS(过量)，DCM，35℃，过夜，ii)MeOH，室温，30min，收率82％。先前的研究已经表明，酰胺缀合物不能释放母体抗生素，并因此在体外和体内的作用较小，11在此例子中试图核实这一点。
BP-环丙沙星缀合物的抗微生物特性
最小抑制浓度(MIC)测定：在标准实验室浮游培养系统中，评估了缀合物(6和11)和母体抗生素环丙沙星两者对与骨感染相关的一组金黄色葡萄球菌临床菌株(包括甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)和耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA))的抗微生物活性。遵循EUCAST(抗微生物剂敏感性测试欧洲委员会)指南，盘扩散抑制区测定的结果显示直径范围为25-40mm(平均31.5，SD±5)，且根据EUCAST临床折点证明每种菌株对母体抗生素环丙沙星都有抗微生物剂敏感性。使用微量稀释方法得到的6和11对8种金黄色葡萄球菌菌株的最小抑制浓度(MIC)结果如图32所示。同时确定母体化合物环丙沙星的MIC用于参考(参见图32)，并发现与已建立的临床折点29一致。
羟基磷灰石(HA)结合测定：在确定了6的抗微生物有效性之后，接下来试图评估HA结合能力。将HA小球加入微生物培养基中，并然后以与抗微生物测试中所用的浓度类似的各种浓度引入6。上清液(无HA小球)的定量光谱分析证实HA对缀合物有显著的吸附和保留(图18和5)。
pH在对浮游金黄色葡萄球菌菌株ATCC-6538的抗微生物剂敏感性测试(AST)中的影响：选择金黄色葡萄球菌菌株ATCC-6538用于进一步研究是因为它与其他所测试菌株相比对于环丙沙星和6两者都显示出最差的MIC谱(参见图32)。ATCC菌株也是众所周知的稳固的生物膜形成病原体。因此，测试缀合物对抗具有挑战性的病原体，以限制偏见和高估的结果，同时也促进对在基于生物膜和临床相关模型中的抗微生物活性的评估。在酸性和生理pH两种条件下对6情况下的浮游金黄色葡萄球菌菌株ATCC-6538进行抗微生物剂敏感性测试(AST)，以评估pH对缀合物活性的影响。标准微量稀释方法学的定量结果表明，在酸性条件(pH 5)下6的抗微生物活性整体得到改善，在相当于生理条件下达到MIC50所需的缀合物浓度的一半时达到MIC50(图6和4)。这些结果和展示的结果在本文其他地方得到证实，最小抑制浓度术语MIC50或MIC90分别是指减少50％或90％的细菌负荷；且与生物膜相关的术语最小生物膜抑制浓度(MBIC50或MBIC90)是指生物膜细菌负荷的类似的减少(50％或90％)。
化合物6的时间-杀灭测定：接下来，按照CLSI(临床实验室标准协会)的方法对6进行动力学测定30。结果表明，该缀合物以先前确定的MIC在1hr和长达24hrs内对于金黄色葡萄球菌的甲氧西林敏感(ATCC-6538)和耐甲氧西林(MR4-CIPS)分离株是有杀菌性的，防止了100％的细菌增长；这些动力学研究还表明以一半的MIC值，在2hr后阻止细菌生长变得明显，且24hr后抑制为对照的50％(例如图7)。
6对生物膜的抗微生物有效性的评估：然后，测试化合物6在两种不同的基底(聚苯乙烯和HA盘)上对抗预形成的细菌生物膜，以评估对生物膜的抗微生物有效性，并也确定底物结合特异性是否对所观察的抗微生物有效性起任何作用。使金黄色葡萄球菌(ATCC-6538)的生物膜以及额外的铜绿假单胞菌(ATCC-15442)的生物膜在作为基底的聚苯乙烯或HA上生长，并用不同浓度的6处理用于抗微生物活性的评估。在这里使用铜绿假单胞菌是因为它是革兰氏阴性病原体以及骨髓炎中第二常见的临床病原体，尽管患病率低于革兰氏阳性金黄色葡萄球菌。例如，图8示出了聚苯乙烯作为基底用于生物膜生长的结果，且6对于金黄色葡萄球菌ATCC-6538的最小生物膜抑制浓度(MBIC50)为15.6-31.2μg/mL，其与浮游培养中的此菌株的MIC相当。在测试浓度范围内，对于铜绿假单胞菌ATCC-15442未观察到MBIC50，且对于两种病原体均未观察到MBIC90。
然而，当使用HA盘作为生物膜基底时，观察到6有明显的杀菌活性。如图33所示，所有测试的该缀合物的浓度均导致了有统计学意义(p＜0.05，克鲁斯卡沃利斯测试)的杀菌活性和菌落形成单位(CFU)的减少。6对于金黄色葡萄球菌菌株ATCC-6538的MBIC50为16μg/mL且MBIC90为100μg/mL；母体药物环丙沙星对于此病原体的MBIC90为8μg/mL。然而，对抗铜绿假单胞菌菌株ATCC-15442，环丙沙星在此背景下无抑制性或杀菌活性，而缀合物以50μg/mL在酸性和生理条件下有杀菌性，且在生理条件下表现出提高的杀菌活性，与之相比，对金黄色葡萄球菌是在酸性条件下观察到提高的抗微生物活性。
预防性抗微生物测定：接下来，在浮游和生物膜培养的预防型的实验环境中对6进行了抗微生物测试，这在骨髓炎药物治疗的抗生素预防性方案中也具有临床相关性。这里将HA小球引入不同浓度的6中，然后接种金黄色葡萄球菌24hrs，且如例如图10所示，定量评估表明当6的浓度低至15.6μg/mL并最高至250μg/mL时没有细菌生长，以及当缀合物的浓度范围为从0.24至7.8μg/mL时有强列抑制下的最低限度的细菌生长。
接下来，在与用于测试氨基甲酸酯缀合物6的实验条件相似的实验条件下，测试酰胺缀合物(11)处理金黄色葡萄球菌菌株ATCC-6538生物膜的能力。当评估11对所建立的在HA上生长的金黄色葡萄球菌生物膜的活性时，并在生物膜生长之前，在预防性实验模式中，用11预处理HA，如图34所示，即使在比用于测试6的剂量更高的剂量下，11的抗微生物活性在两种情况下也均是不显著的。
当测试6对于阻止金黄色葡萄球菌ATCC-6538生物膜在预处理过的HA上形成的能力时，与显示无显著抗微生物活性的11不同，并且与母体抗生素相比缀合物显示出优越的抗微生物活性。图11示出了生长24hrs后定量化生物膜培养和CFU计数的结果，且在100μg/mL时母体药物环丙沙星抑制所有生物膜生长，而在10μg/mL时6抑制所有生长。由于环丙沙星的分子质量大约为6的分子质量的一半，所以与单独的环丙沙星相比，6在实现完全杀菌作用方面的活性是其20倍。
体内安全性和有效性：由于6在体外展示出有前景的活性，因此我们试图在假体周围骨髓炎的动物模型中评估在体内的药物安全性和有效性。此模型是出于转化价值专为研究生物膜介导的疾病和体内宿主反应而开发的独特的内部颌骨种植体周围骨髓炎模型31。因为利用了全身治疗方案，所以本测定也适用于任何感染的骨表面模型，由于所涉及的产生的骨溶解是高浓度BP缀合物吸引至(靶向)如骨上任何转换高的部位，以及随后在此患病的骨表面释放缀合物的活性环丙沙星组分的关键。简单来说，将非大鼠正常菌群所固有的且对颌骨感染有特异性的颌骨骨髓炎病原体伴放线凝聚杆菌(Aa；野生型粗糙菌株D7S-1；血清型a)的生物膜以109CFU预先接种在微型钛种植体上。为了在我们的动物研究之前确认Aa对母体药物环丙沙星的敏感性，进行了AST和MIC测定，如先前描述的对长骨骨髓炎病原体所进行的那样。盘扩散抑制区测定显示直径＞40mm，且MIC90为2μg/mL，表明此微生物对母体药物环丙沙星有很强的敏感性。先前还测试过Aa对pH敏感性生物素化环丙沙星前体药物的敏感性，并发现其对母体抗生素敏感32。与本研究之前的病原体一样，测试了HA上生长的Aa生物膜病原体对6的敏感性，并发现我们的缀合物表现出有效的抗微生物活性，如图35所示。
当在体外将Aa生物膜建立在种植体上之后，通过手术将生物膜转移到每只大鼠的颌骨。将动物麻醉，缩回双颊，并进行经粘膜截骨术，从而可以将种植体人工插入到截骨中并固定。在每只大鼠的双侧腭骨中放入两个接种了生物膜的种植体(n＝12只大鼠，总共24个种植体)。此模型允许标准化的和可复制的数量的细菌活菌在每个种植体上作为完好建立的生物膜形成，我们之前已经证明，其在放置后在体内持续数周并导致局部感染、炎症和骨破坏31。
一旦术后种植体周围感染建立1周，就以实验部分中规定的给药方案向动物给药6、作为阳性对照的单独的环丙沙星以及作为阴性对照的无菌无内毒素的盐水。为了确定合适的给药浓度，根据先前的研究和药代动力学数据，使用相似的靶向和释放策略并也在啮齿类动物中计算了缀合物的大约初始剂量。13,260.1、1和10mg/kg摩尔当量的递增剂量的6将允许基于动物模型的样本量估计和的以往的经验在每组2个测试动物中确定抗微生物活性32。将动物在全身麻醉下经腹膜内注射给药，且所有化合物均构成在适当pH下的注射用无菌生理盐水中。使用腹膜内注射是因为其与其他肠胃外方法如尾静脉注射相比在小啮齿类动物中给药的容易性，以及因为胃肠道给药之后环丙沙星的药代动力学示出了极好的生物利用度；这样给药之后达到的血清药物水平略低，但与用静脉给药的血清药物水平相当，且首过代谢之后无实质性损失33。药物治疗一周后，处死所有动物并对种植体周围硬组织和软组织进行整体切除，并均质化用于定量评估微生物负荷。
所有动物均对药物治疗有良好的耐受性，无皮肤注射部位反应或炎症。在治疗期间没有严重耐受性问题的迹象。依据细菌活菌量的对数减少(平均log10CFU/克组织)对治疗有效性进行定量化测量，如图36所示。
在体内，10mg/kg的单剂量的6显示出最高的有效性，在细菌计数上有2log的降低(杀灭99％细菌)，且与10mg/kg的每剂量浓度(mg/kg)但以多剂量(总剂量30mg/kg)给予的单独的环丙沙星的活性几乎高出一个量级。因此，考虑到6较大的分子量(～2×的环丙沙星)，以10mg/kg单剂量给药6可以递送大约5mg/kg的有效环丙沙星(假设全部释放)，其是对照环丙沙星组的环丙沙星摩尔剂量(总共30mg/kg)的1/6。多剂量方案中单独的环丙沙星导致了在细菌计数上1log的减少(杀灭90％细菌)。当6的浓度为0.1和1mg/kg时作用很小，表明对于临床作用最小剂量是必须的，且在此情况下可以进行进一步的化学优化。
为了验证动物研究结果，并为了向统计分析提供更大的功效和更大的样本量，我们进行了除剂量方案的分配之外几乎与第一动物实验相同的第二动物实验。基于上述我们第一动物研究中的剂量数据和抗微生物结果，我们将此第二动物研究专注于三个治疗组：阴性对照(n＝5只大鼠)，10mg/kg的单次高剂量的6(n＝5只大鼠)和0.3mg/kg 3×/周的多次低剂量方案的6(n＝2只大鼠)。0.1和1mg/kg的给药组被排除，因为它们之前表现为无有效性，且单独的母体抗生素也被排除，因为存在环丙沙星有效性的可靠的历史数据，其在我们最初的动物研究中也得到了证实。再次利用多剂量方案以确定可回收细菌的缺乏是否可归因于治疗作用还是由于实验及取样误差。所有其他实验参数都与第一动物实验相同，且每只动物如之前一样放置有两个种植体，允许每只动物有两个结果，并提供足够的功效用于由样本量估计确定的统计分析。
所有动物再次对治疗和药物治疗表现出良好的耐受性，且在治疗期间没有严重耐受性问题的迹象。在临床上安乐死和手术切除期间，观察到对照组中的大多数动物显示出局部假体周围炎症的证据，与之相比，治疗组中的大多数动物具有非炎症种植体周围组织，且种植体保留为23/24种植体(96％)，其保留率高并为后续分析提供了稳健的功效。此第二动物实验的定量抗微生物结果如图37所示。比较治疗组之间的CFU的单因素ANOVA分析(α＝0.05)得出的组之间显著性的p值＝0.006，以及利用未配对t检验(p＝0.0005；df＝20)和Dunnett’s多重比较检验(p＜0.05)的事后(post-hoc)分析显示6的单次高剂量治疗与对照相比有显著性，但多次低剂量组(p＞0.05)当与对照或单次高剂量治疗组相比时无显著性。
讨论
通过与BP部分缀合(通过可释放的氨基甲酸酯接头)而将抗生素靶向到骨是治疗骨髓炎生物膜的有前景的方法。本文提供的AST测试和MIC数据的结果表明，环丙沙星和6对浮游金黄色葡萄球菌均具有有效的杀菌活性，且如11(图32)的较弱活性所证明，缀合连接影响母体药物的抗微生物活性。达到MIC需要更高浓度的6，这是符合预期的，因为缀合是一种化学修饰，其可以改变在从缀合物释放之前抗生素的生化相互作用。因此，母体药物的特性包括其药效动力学作用可以被这样的修饰改变。6的MIC结果与之前的文献一致，表明此类别的缀合物可以保留母体化合物的抗微生物活性，尽管水平略低9,10。
令人感兴趣的是，两种缀合物对所测试的几种金黄色葡萄球菌菌株的MIC值分布很广，与之相比，单独的环丙沙星对相同的几种菌株的抗微生物有效性差异很小(图17)。对于这些结果有几种可能的解释。已知同一种内细菌的不同菌株在对抗生素的毒力和抗微生物剂敏感性/耐药性方面表现出显著的差异。已经证实，菌株特异性变化存在于抗生素转运和外排机制、细菌细胞壁密度、酶活性水平、耐药机制和改变环境pH的能力34。环丙沙星杀菌活性是DNA复制所需的酶——拓扑异构酶II和IV的细胞内抑制的结果35。
已经证实，此类别中完好的缀合物通常缺乏显著的内在抗微生物活性18, 19，且任何BP相关的抗微生物作用是可忽略不计的；因此，至少部分释放母体药物是显著抗微生物活性的先决条件，如6情况下所观察到的。这与11的低抗微生物活性一致，11的不同之处在于其较稳定的酰胺连接，导致在分析中需要更不稳定的氨基甲酸酯连接的缀合物6的浓度的2-64×来实现相同的抗微生物作用。
在评估了6的抗微生物有效性之后，试图评估BP部分的骨结合功能性，并发现缀合物以浓度依赖的方式有效吸附并保留在HA小球上。这些结果与先前报道的包含有相似骨亲和性的BP部分的此类别中的类似物一致13, 19。然后测试了6的活性是否会在不同pH条件下变化，并发现在酸性条件下有略微改善的谱，其可以至少部分地解释为接头在pH 5下比在pH 7.4下更不稳定，从而在较低pH下释放更多的环丙沙星。这对于临床骨髓炎应用可能是有用的，其中生物膜病原体以及宿主炎症和破骨细胞生成都会产生酸性的局部环境。然而，其他研究者已经表明，尽管由感染生物体和炎症造成的酸性pH可以导致一些药物在骨处释放，但这样的过程在提供显著浓度的抗微生物剂上的有效性是令人怀疑的，因而前体药物设计、缀合方案和对局部酶水解的敏感性很可能对接头裂解性和有效性有更大的影响13。本实施例中的数据也支持这样的结论。
对6的时间-杀灭动力学的研究证明了对所测试细菌的杀菌活性的有效率，具有持续杀菌活性超过24hrs，支持了具有随时间稳定持续的释放曲线的母体抗生素的裂解活性。这里观察到的抗生素释放动力学可能不同于当前使用的用于骨髓炎治疗的可生物降解和不可生物降解的递送系统所观察到的抗生素释放动力学，后者通常展示为在该部位初始时高剂量团的抗生素释放，而较小百分比的剩余抗生素在延长的时间段内消散36,37。
此实施例提供了在用于骨髓炎治疗的体外和体内生物膜相关的模型中，诸如6的缀合物的抗微生物有效性的证据。当骨髓炎生物膜(金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌)在诸如聚苯乙烯或HA的不同基底上在体外生长并然后用6处理时，在HA存在的情况下该缀合物比在聚苯乙烯存在的情况下更有效的对抗生物膜。这说明除了如所测试病原体的菌株和细菌生长的模式(浮游对比生物膜)的因素之外，基底结合特异性也在抗微生物活性中起作用。6在HA上时对骨髓炎病原体有效，但在聚苯乙烯作为基底上时对相同菌株无效，这表明为了有效治疗骨髓炎生物膜，有必要与基底(例如HA)结合并直接在生物膜下面或生物膜之内释放抗生素，而不是仅让抗生素沿生物膜表面流动(如使用单独的母体抗生素或6在聚苯乙烯上时的情况，其中没有发生基底结合且没有观察到对建立的表面生物膜的活性)。与使用聚苯乙烯作为基底的实验环境相比，在使用HA盘的环境中发现6的活性提高，这很可能是由于缀合物的BP部分与HA结构具有高亲和性，并因此由于6定位到盘使得附着在HA上的细菌很可能遭受到相对更高浓度的母体抗生素。另外，6在生物膜细菌细胞下在骨处的裂解可能与如之前所示的氨基甲酸酯在破骨细胞下的裂解22相似，表明局部环境在此背景下起作用，并进一步表明同样导致骨溶解的细菌下的环境与骨上破骨细胞下的环境有相似性，因为可能是由于pH和酶水解的组合，这两种环境似乎都能断裂氨基甲酸芳酯键以释放活性环丙沙星。Arns等人27对BP(放射性标记的)前列腺素缀合物的先前工作表明，与大多数BP38一样，该缀合物在血流中的半衰期少于15分钟。因此，在那段时间中，缀合物或与骨结合或被排泄。此研究还表明，在骨表面，活性药物(此例中为前列腺素)从具有与我们的氨基甲酸酯相关的键的BP释放的半衰期为5和28天之间。本文所展示的键必须具有接近5天的释放半衰期，才能实现这里报告的令人兴奋的体内结果。Arns等人和其他人27已推测该裂解机制最可能是骨细胞下的酶促的。在矿物表面存在细菌的情况下，也可能是基于酶的裂解。如本文中已经指出，在没有破骨细胞的体外抗微生物研究期间，我们基于氨基甲酸酯的缀合物是有活性的，但我们不可裂解的基于酰胺的缀合物的活性要小很多。
还在骨髓炎预防性实验中测试了缀合物对抗金黄色葡萄球菌，并发现在实现完全的杀菌作用方面，6具有相比于单独的环丙沙星20倍高的活性(图11)，然而未检测到11的任何抗微生物活性(图34)。这些发现支持了相对于11母体抗生素随时间从6中裂解并释放的有效机制。与HA的有效结合以及母体抗生素的释放，对于此类别中的缀合物展示出实质性抗微生物有效性来说是必要的。
最后，试图在使用模型颌骨病原体Aa的颌骨种植体周围骨髓炎大鼠模型中测试6的体内安全性和有效性。为了在我们的动物研究之前确认Aa对母体药物环丙沙星的敏感性，我们进行了AST和MIC测定，如本研究中对长骨骨髓炎病原体所进行的那样。Aa对母体药物环丙沙星展示出强敏感性。还测试了HA上生长的Aa生物膜(类似于金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌)对6的敏感性，并发现我们的缀合物显示出有效的抗微生物活性(图35)。因此，利用种植体周围颌骨骨髓炎模型进行了两个连续的动物实验。在第一个体内研究中，10mg/kg的单剂量的6显示出最高的有效性，有2log的CFU降低或杀灭99％细菌，且比以10mg/kg的每次剂量浓度(mg/kg)但以多剂量给予的单独的环丙沙星的活性高将近一个数量级(图36)，与单独的母体抗生素相当或更好18-20，如用较不稳定的6所观察到的，但用较稳定的11即使在高剂量的暴露下也未观察到，证实了裂解有助于抗微生物有效性，且在一些情况下对于抗微生物有效性是必要的。在此实验中浓度较低的6是无效的。为了验证这些结果，我们进行了第二个更大且更有统计学功效的体内实验，专注于与对照和6的多剂量方案相比的6的有效的给药方案(10mg/kg)。再一次在缀合物的单次高剂量(10mg/kg)情况下观察到最大的CFU降低和有效性。
体内实验证实了安全且足够的单剂量下的6靶向感染的种植体周围骨，并产生足够浓度的母体抗生素用于对建立的Aa生物膜的杀菌活性(而此时单独的母体抗生素的活性已经减弱)的能力。由于微生物定量涉及整体切除的组织匀浆，甚至在3维骨结构的小管内的生物膜细菌也被纳入分析，而不仅仅是表面病原体(因为该方法学不涉及用于涂布和评估的表面刮擦)。这表明了BP到假体周围骨的有效吸收/吸附，以及有效的抗生素释放，如生物膜细菌的CFU的相当大的降低所证明。
这些结果以及该领域的其他研究也正表明，因为缀合物具有独特的药物计量学参数并由于BP部分而主要地定位到骨，所以这些缀合物和它们的母体化合物之间的直接比较有些武断。这与母体抗生素(通常为氟喹诺酮)形成对比，其在人体中表现为肌肉和肌腱的吸收大于骨39，并因此与不良事件相关，诸如易感群体中的跟腱断裂。此类别中的缀合物的任何未来的药代动力学模型和测试都应该包括数学上分布的骨骼分区，其在环丙沙星和大多数其他抗生素药代动力学研究中通常不进行。已经确立了这样的方法在人类群体中用于准确地确定BP药物的骨药代动力学的重要性40。这样的方法将在此背景下提供更准确和必要的药理学数据，并为临床给药方法提供信息。
材料和方法
除非另有说明，否则所有操作均在氮气气氛下进行。无水乙醚、无水四氢呋喃、无水柠檬酸、氯仿和硫酸镁购自EMD。4-苄氧基苄醇、溴三甲基硅烷、氯甲酸4-硝基苯基酯、盐酸(37％)、无水乙醇、无水N,N-二甲基甲酰胺和二氯亚砜购自Sigma Aldrich。硫酸钠购自Amresco。氢化钠(57-63％油分散液)、亚甲基双膦酸四异丙酯、10％活性炭载钯、4-(溴甲基)苯甲酸酯/盐、一水合氢氧化锂和N-乙基二异丙基胺购自Alfa Aesar。乙酸乙酯、己烷和二氯甲烷购自VWR。无水甲醇、三甲胺和碳酸钠购自Macron。氢气购自Airgas。环丙沙星购自Enzo Life Sciences。乙腈(HPLC级)购自Spectrum。除非另有说明，否则所有试剂均按收到的原样使用。所有溶剂均使用分子筛(20％m/v)干燥41。硅胶购自Silicycle(SilicaFlash P60，40-63μm，230-400目)。
核磁共振波谱在Varian 400-MR 2-Channel NMR上记录。
分光仪带有96-旋式取样变换器(96-spinner sampler changer)并使用TopSpin和MestReNova分析。1H的化学位移(δ,ppm)以残留溶剂峰为参照。质谱在配备有正离子和/或负离子模式下的ESI源的Thermo-Finnigan LCQ Deca XP Max质谱仪上获得，使用TunePlus 2.0版本软件进行数据采集，以及2.0.7进行数据处理并以m/z报告。有机元素分析通过Thermo Fisher Scientific在Flash 2000元素分析仪上进行。
最终化合物6和11以及商业环丙沙星的纯度≥95％，并使用1H,31P NMR谱法、HPLC和元素分析仪测定。最终化合物的分析型HPLC在配备有二极管阵列检测器的SHIMADZUHPLC系统上进行。使用LabSolution软件进行数据收集和分析。HPLC方法A:使用在1.0mL/min的流速下操作的Phenomenex Luna 5μC18(2)分析柱(250×4.6mm)。使用以下溶剂梯度：(缓冲液A＝在0.1M NH4OAc中的20％ACN(pH 7.53)，缓冲液B＝在0.1M NH4OAc中的70％CAN(pH 7.16))0-7min 0％B，7-25min 100％B，25-100min 100％B。
合成。1-(苄氧基)-4-(溴甲基)苯(1)。在氮气保护下，在烘干的烧瓶中，将4-苄氧基苄醇(1.00g，4.67mmol)溶解于无水二乙醚(25mL)中。将烧瓶在冰浴中冷却。用注射器加入溴三甲基硅烷(BTMS)(1.26mL，9.52mmol，2当量)。允许烧瓶慢慢温热至室温。搅拌17hrs之后，将反应混合物倒入水(50mL)中，并分离出有机相。用二乙醚(2×20mL)清洗水相，并然后用盐水(2×20mL)清洗合并的有机相，并用硫酸钠干燥。蒸发溶剂得到化合物1，为白色结晶固体(1.23g，收率95％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.47-7.28(m,7H),6.98-6.90(m,2H),5.07(s,2H),4.50(s,2H)。
(2-(4-(苄氧基)苯基)乙烷-1,1-二基)双(膦酸)四异丙酯(2)。在氮气保护下，将无水THF(2mL)加入到氢化钠(矿物油中的57-63％分散液)(75mg，1.80mmol，1当量)中。在室温下搅拌的同时逐滴加入亚甲基双膦酸四异丙酯(570μL，1.80mmol，1当量)。气体被释放且灰色的悬浮固体被消耗，留下澄清的溶液。再搅拌混合物10min。在氮气逆流下一次性加入化合物1(500mg，1.80mmol，1当量)。溶液在保持澄清1min后变得混浊。维持搅拌2hrs，并通过TLC监测反应进程(100％EtOAc，通过UV或钼酸铈铵(CAM)染色来可视化)。将反应混合物倒入5％的柠檬酸水溶液(30mL)中，并用醚(2×30mL)萃取，用盐水(30mL)清洗并蒸发。通过使用EtOAc:己烷梯度(10-100％)的快速色谱来纯化残余物，以得到无色油状物2(0.508g，收率52％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.44–7.27(m,5H),7.18(d,J＝8.6Hz,2H),6.87(d,J＝8.7Hz,2H),5.04(s,2H),4.86–4.63(m,4H),3.15(tdJ＝16.6,6.1Hz,2H),2.44(tt,J＝24.2,6.1Hz,1H),1.48–1.01(m,24H)。31P NMR(162MHz,氯仿-d)δ21.11。
(2-(4-羟基苯基)乙烷-1,1-二基)双(膦酸)四异丙酯(3)。将化合物2(0.508g，0.925mmol)溶解于13mL的甲醇中，并加入10％活性炭载钯(70mg，0.066mmol，0.07当量)。先用氮气然后用氢气吹扫烧瓶，并在合适位置有氢气气囊下搅拌过夜。将反应混合物用100mL的甲醇通过celite过滤。蒸发滤液得到期望的化合物3，为淡黄色油(0.368g，收率88％)，其无需进一步纯化即可使用。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.07(d,J＝8.2Hz,2H),6.69(d,J＝8.2Hz,2H),4.71(m,4H),3.11(td,J＝16.9,6.0Hz,2H),2.47(tt,J＝24.4,6.0Hz,1H),1.32-1.21(m,24H)。31P NMR(162MHz,氯仿-d)δ21.06。
碳酸4-(2,2-双(二异丙氧基磷酰基)乙基)苯酯(4-硝基苯)酯(4)。将化合物3(7.91g，15.9mmol)溶解于150mL的二氯甲烷中，然后加入三乙胺(6.70mL，47.9mmol，3当量)，之后一次性加入氯甲酸对硝基苯酯(3.54g，17.6mmol，1.1当量)。搅拌反应混合物2.5hrs，同时用TLC进行监测(5％MeOH在EtOAc中，UV可视化)。在起始材料消失后停止反应，并通过快速色谱(1:1乙酸乙酯:己烷)纯化目标化合物以得到化合物4(4.33g，收率44％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.29(d,J＝9.1Hz,2H),7.46(d,J＝9.1Hz,2H),7.33(d,J＝8.5Hz,2H),7.15(d,J＝8.6Hz,2H),4.84–4.58(m,4H),3.22(td,J＝16.5,6.2Hz,2H),2.47(tt,J＝24.1,6.2Hz,1H),1.33–1.14(m,24H)。
7-(4-((4-(2,2-双(二异丙氧基磷酰基)乙基)苯氧基)羰基)哌嗪-1-基)-1-环丙基-6-氟-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(5)。在烧瓶中将环丙沙星(2.76g，8.34mmol，1.2当量)悬浮于74.7mL的水中。加入8.30mL的1M HCl，并搅拌烧瓶以溶解环丙沙星得到无色澄清的溶液。加入Na2CO3以调节pH至8.5，并形成厚的白色沉淀物。将烧瓶置于冰浴中，并在约5min内将溶解于83mL的THF的化合物4(4.28g，6.95mmol，1当量)缓慢加入。然后将烧瓶从冰浴中取出，避光在室温下搅拌过夜。在真空下将反应混合物浓缩至大约原始体积的一半，然后通过细玻璃熔块漏斗过滤。用水清洗留下的固体直到没有黄色残留。然后将固体溶解并用DCM从熔块中洗出，且将溶液负载到快速硅胶柱上，并用MeOH:DCM梯度(2-5％)洗脱以得到化合物5(3.47g，收率51.5％)，为白色固体。1H NMR(400Mhz,甲醇-d4)δ8.79(s,1H),7.93(d,J＝13.3Hz,1H),7.54(s,1H),7.30(d,J＝8.4Hz,2H),7.05(d,J＝8.5Hz,2H),4.70(dpd,J＝7.4,6.2,1.3Hz,4H),3.90(m,4H),3.65(s,br,1H),3.39(s,br,4H),3.18(td,J＝16.6,6.4Hz,2H),2.65(tt,J＝24.3,6.3Hz,1H),1.43–1.34(m,2H),1.34–1.19(m,24H),1.18–1.10(m,2H)。31P NMR(162Mhz,甲醇-d4)δ20.71。MS(ESI+)m/z：808.2(M+H),830.2(M+Na)calc.for C38H53FN3O11P2+：808.3。
1-环丙基-7-(4-((4-(2,2-二膦酰基乙基)苯氧基)羰基)哌嗪-1-基)-6-氟-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(6)42,43。将化合物5(10.0mg，1.24μmol)溶解于1.5ml玻璃小瓶中的DCM(200μL)中，并加入BTMS(200μL，1.52mmol，122当量)，且立刻给小瓶加盖并浸于35℃油浴中。搅拌24hrs后，在真空下去除溶剂和BTMS，然后加入1mL的MeOH，并搅拌小瓶过夜。在真空下去除溶剂以得到纯化合物6，为有绿色荧光的淡黄色固体(6.82mg，收率86.1％)。1HNMR(400MHz,氧化氘)δ8.51(s,1H),7.92(d,J＝12.2Hz,1H),7.67(s,1H),7.47(d,J＝8.3Hz,2H),7.10(d,J＝8.3Hz,2H),3.98(s,2H),3.79(s,2H),3.67(s,1H),3.42(s,4H),3.16(td,J＝15.5,6.8Hz,2H),2.21(tt,J＝6.9,21.6Hz,1H),1.37(d,J＝6.9Hz,2H),1.15(s,2H)。31P NMR(162MHz,氧化氘)δ19.16MS(ESI-)m/z：638.06(M-H)calc.forC26H27FN3O11P2-：638.1。HPLC(Method A，UV 190，274，330nm)：tr＝11.62min。
4-(2,2-双(二异丙氧基磷酰基)乙基)苯甲酸甲酯(7)44。在氮气气氛下，在25mL圆底烧瓶中，将THF(5mL)加入氢化钠在矿物油中的57-63％分散液(0.163g，4.07mmol，1.4当量)。将悬浮液冷却至0℃，同时搅拌，并逐渐加入亚甲基双膦酸四异丙酯(0.926mL，2.90mmol，1当量)。允许反应达到环境温度，且一旦停止从反应混合物中冒出氢气气泡，就将溶液再次冷却至0℃。将4-(溴甲基)苯甲酸甲酯(0.465g，2.03mmol，0.7当量)溶解于THF(2mL)，并逐滴加入到反应中。将得到的溶液搅拌过夜，同时缓慢地达到环境温度。然后，将反应混合物冷却至0℃并用EtOH(1mL)淬灭。加入柠檬酸在水(30mL)中的5％水溶液并用Et2O(3×30mL)萃取混合物，将合并的有机物用盐水(50mL)清洗，用Na2SO4干燥，过滤，减压下浓缩并通过使用EtOAc：Hex梯度(10-100％)的硅胶柱色谱纯化，以得到淡黄色油状物7(0.371g，收率37.0％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.93(d,J＝8.0Hz,2H),7.33(d,J＝8.4,2H),4.79-4.68(m,4H),3.88(s,3H),3.24(td,J＝16.0,6.4Hz,2H),2.50(tt,J＝24.0,6.2Hz,1H),1.34-1.24(m,24H)。31P NMR(162MHz,氯仿-d)δ20.57。
4-(2,2-双(二异丙氧基磷酰基)乙基)苯甲酸(8)44。向8Dram玻璃小瓶中的7(0.131g，0.278mmol)在MeOH(1.5mL)中的溶液加入LiOH·H2O(0.058g，1.39mmol，5当量)，并将得到的溶液在室温下搅拌过夜。蒸发反应混合物至干燥，将残留物溶解于水(30mL)中，并缓慢加入HCl(aq)(1M)达到pH值为3。用CHCl3(3×30mL)萃取得到的混合物。将合并的有机物在MgSO4上干燥，并在减压下浓缩以得到透明的浓稠油状物8(0.115g，收率90.6％)。1HNMR(400MHz,氯仿-d):δ＝7.96(d,J＝8.0,2H),7.37(d,J＝8.0,2H),4.82-4.74(m,4H),3.28(td,J＝16.6,6.1,2H),2.60(tt,J＝24.2,6.2,1H),1.33-1.26(m,24H)。31P NMR(162MHz,氯仿-d)δ20.57。
(2-(4-(氯甲酰基)苯基)乙烷-1,1-二基)双(膦酸)四异丙酯(9)。在氮气气氛下，将化合物8(0.162g，0.339mmol)溶解在氯仿(1mL)中，加入催化量的DMF(1.30μL，0.017mmol，0.05当量)。缓慢加入二氯亚砜(49.2μL，0.678mmol，2当量)，并允许反应在室温下搅拌2hrs。在真空下去除溶剂以得到透明的油状物9。该产物立即在下一步中使用而无进一步操作(定量收率)。
7-(4-(4-(2,2-双(二异丙氧基磷酰基)乙基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)-1-环丙基-6-氟-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(10)。将环丙沙星(0.112g，0.339mmol，1当量)悬浮于氯仿(1mL)中，并加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(354μL，2.03mmol，6当量)。将新制备的化合物9(168mg，0.338mmol，1当量)溶解于氯仿(1mL)中，并逐渐加入到环丙沙星:DIPEA悬浮液中。用箔覆盖反应混合物，并在室温下搅拌过夜。第二天，在真空下移除溶剂，并将得到的粗产物溶解在DCM(5mL)中，然后通过中等级玻璃熔块漏斗过滤，并用更多的DCM(3×5mL)清洗。将滤液在真空下浓缩并通过使用MeOH:DCM梯度(0-10％)的硅胶柱色谱进一步纯化，以得到逐渐固化的粘性油状物10(0.226g，收率65.1％，1.8当量DIPEA盐)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ＝8.79(s,1H),8.06(d,J＝12.8,1H),7.38(m,5H),4.80-4.73(m,4H),4.00(s,br,4H),3.56-3.53(m,1H),3.33-3.20(m,6H)2.50(m,1H),1.45-1.38(m,2H),1.32-1.25(m,24H),1.23-1.19(m,2H)。31P NMR(162MHz,氯仿-d)δ20.77。
1-环丙基-7-(4-(4-(2,2-二膦酰基乙基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)-6-氟-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(11)42,43。在8Dram玻璃小瓶中，将化合物10(0.108g，0.136mmol)溶解在DCM(700μL)中，并加入BTMS(686μL，5.20mmol，38当量)。将小瓶加盖并在35℃下加热过夜，同时用箔覆盖并搅拌。第二天，在真空下去除溶剂，并用MeOH(2ml)淬灭粗产物。在室温下搅拌得到的溶液30min。在真空下去除溶剂以得到橙色油状物。加入几滴水以产生黄色固体。加入更多的MeOH(2mL)，并使用中等级熔块玻璃漏斗过滤得到的悬浮液。用MeOH进一步清洗得到的固体，以得到黄色粉末11(0.070g，产率82.0％)。1H NMR(400MHz,氧化氘,pH 7.5):δ＝8.54(s,br,1H),7.90-7.87(m,1H),7.65-7.63(m,1H),7.54(d,J＝8.0,2H),7.44(d,J＝8.0,2H),4.79(m,overlap with D2O,4H),4.00(s,br,2H),3.79(s,br,2H),3.47(s,br,3H),3.34(s,br,2H),3.21(td,J＝14.0,6.4,2H),2.30(tt,J＝22.0,6.6,1H),1.38-1.33(m,2H),1.15(s,br,2H)。31P NMR(162MHz,氧化氘,pH 7.5)δ19.12。MS(ESI-)m/z：622.24(M-H)calc.forC26H27FN3O10P2-：622.12。HPLC(Method A，UV 190，274，330nm)：tr＝4.43min。
双膦酸-环丙沙星缀合物的抗微生物特性
实验菌株：测试了七株甲氧西林敏感谱的金黄色葡萄球菌临床骨髓炎菌株和一株甲氧西林抗性谱的菌株。这些病原体是波兰弗罗茨瓦夫医科大学制药微生物学和寄生虫学系的菌株保藏的一部分。此外，选择以下美国典型培养物保藏中心(ATCC)菌株用于实验目的：金黄色葡萄球菌6538和铜绿假单胞菌15442。
HA盘：使用可商购的HA粉末用于定制盘的制造。在没有粘结剂的情况下压制直径为9.6mm的粉末球粒。在900℃下进行烧结。使用用于静态拉伸、压缩和弯曲测试的通用测试系统(Instron model 3384；Instron，Norwood，MA)对片剂进行压缩。分别使用LEXTOLS4000显微镜(Olympus，Center Valley，PA)和Metrotom 1500显微断层摄影仪(CarlZeiss，Oberkochen，德国)通过共聚焦显微镜和微计算机断层成像(显微CT)检查所制造的HA盘的质量。
评估所测菌株对环丙沙星的敏感性的盘扩散测试：本程序是按照EUCAST指南29进行的。简单来说，将0.5McFarland(MF)的细菌稀释液涂布到Mueller-Hinton(MH)琼脂板上。引入包含5mg环丙沙星的盘，并将板温育于37℃/24hrs。接下来，用尺子记录抑制区。将得到的值(mm)与EUCAST表中抑制区的适当值进行比较29。
所测试化合物对浮游形式的所分析临床葡萄球菌菌株的MIC的评估：为了评估母体抗生素和缀合物对微生物生长的影响，将100μl密度为1×105CFU/ml的微生物溶液与适当浓度的所测试化合物一起置于96孔测试板上。其后立即使用光谱仪(Thermo ScientificMultiscan GO)在580nm波长下测量溶液的吸光度。随后，将板在振动器中温育24hrs/37℃以获得微生物生长并防止细菌形成生物膜的最佳条件。温育之后，再一次测量吸光度。建立以下对照样本：阴性对照样本一：无微生物的无菌培养基；阴性对照样本二：无菌培养基，无微生物，用最终浓度为1％(v/v)的DMSO(二甲基亚砜，Sigma-Aldrich)来实现；阳性对照样本一：没有所测试化合物的培养基+微生物；阳性对照样本二：培养基+微生物，没有所测试化合物，但由最终浓度为1％(v/v)的DMSO来实现。使用1％DMSO的基本原理是环丙沙星能有效地溶解于此溶剂中，然而，DMSO＞1％的浓度可能对微生物细胞有害。为了评估细胞的相对数量，进行了以下计算。对照样本(用于缀合物的培养基+微生物，用于环丙沙星的培养基+微生物+DMSO)的吸光度值估计为100％。接下来，与所测试化合物进行温育的细胞的相对数量如下计算：对照样本吸光度值/所测试样本的值*100％。
为了确认由分光光度法评估得到的结果，将处理过的细菌溶液转移到10mL的新鲜培养基中，并在37℃下放置48hrs。培养基产生混浊或不存在混浊分别是病原体生长或没有生长的证据。此外，在适当的稳定培养基上培养细菌溶液。细菌菌落的生长或缺乏生长与上述液体培养的结果一起作为对采用分光光度法获得的结果的确认。
在添加有HA小球的胰酶解酪蛋白大豆肉汤(TSB)微生物培养基中的6和11的光谱分析：将各种的缀合物浓度引入悬浮于TSB微生物培养基中的HA粉末(小球)中。将包含BP-环丙沙星和HA小球的溶液引入24-孔板的孔中。粉末的最终浓度为10mg/1mL，而缀合物的最终浓度为0.24-250mg/L。其后立即使用光谱仪(Thermo Scientific Multisca GO)在275nm波长下测量溶液的吸光度。在评估之前，使板在光谱仪中自动振动。接下来，将板置于24hrs/37℃/振动。24hrs之后，再一次测量吸光度。为了评估在0hr和24hrs时缀合物的相对浓度，对在实验开始和结束时测取的吸光度值进行比较。基于样本的浓度优化激发狭缝、发射狭缝、积分时间和增量。
在酸性对比生理pH下，6对金黄色葡萄球菌菌株ATCC-6538的浮游培养的抗微生物剂敏感性测试：本实验环境按照与先前描述的用于盘扩散测试的相同的方式进行，但使用KOH或HCL溶液调整微生物培养基至pH 7.4和pH 5，并使用通用pH指示剂(Merck，波兰)测量。
6对金黄色葡萄球菌菌株ATCC-6538(MSSA)和临床MRSA菌株(MR4-CIPS)的时间-杀灭测定：本实验按照与先前描述的小标题为“所测试化合物对浮游形式的所分析临床葡萄球菌菌株的MIC的评估”的相同的方式进行，但在0、1、2、4、8、16和24小时时进行吸光度测定(在580nm波长下)。
6对金黄色葡萄球菌菌株ATCC-6538和铜绿假单胞菌菌株ATCC-15442的预形成生物膜的抗微生物剂敏感性测试：将在适当的琼脂板(Columbia琼脂板用于金黄色葡萄球菌；MacConkey琼脂板用于铜绿假单胞菌)上培养的菌株转移至液体微生物培养基并在好氧条件下温育24hrs/37℃。温育之后，将菌株稀释至1MF的密度。将微生物稀释液引入包含HA盘作为基底的24孔板的孔中，或者简单地引入聚苯乙烯孔中，其中孔的底表面作为生物膜发展的基底。将菌株在37℃下温育4hrs。接下来，将包含微生物的溶液从孔中移除。轻轻冲洗表面、HA盘和聚苯乙烯板，以留下附着的细胞并去除浮游或松散结合的微生物。将以这种方法制备的表面浸泡在包含0.24-125mg/L的6的新鲜TSB培养基中以及作为对照的环丙沙星中。在于37℃下温育24hrs之后，使用生理盐水溶液冲洗表面并转移至1mL的0.5％皂苷(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)。将表面剧烈地涡旋混合1分钟以分离细胞。随后，将所有的微生物悬浮液稀释10-1至10-9倍。在适当的稳定的培养基(MacConkey、Columbia分别用于铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌)上对每个稀释液(100mL)进行培养，并在37℃下温育24hrs。这次之后，对微生物菌落进行计数，并评估形成生物膜的细胞数目。结果表示为每平方毫米表面CFU的平均数±平均值的标准误差。为了计算HA盘的表面积，应用x射线断层摄影分析。为了评估测试板底部的面积，应用圆面积公式：πr2。
6和11抑制金黄色葡萄球菌6538附着至HA的预防能力：将不同浓度的6和11引入悬浮于TSB微生物培养基中的HA粉末(小球)中。将包含6和HA小球的溶液引入24孔板的孔中。粉末的最终浓度为10mg/1mL，而缀合物的最终浓度为0.12-250mg/L。将悬浮液置于24hrs/37℃/振动。24hrs之后，将悬浮液从孔中移出并进行脉冲离心以沉淀HA粉末。接下来，将上清液轻轻丢弃，并将新鲜的1mL密度为105CFU/mL的金黄色葡萄球菌引入HA小球。随后，振动该溶液，使用580nm波长测量吸光度，并置于24hrs/37℃/振动。温育之后再次测量吸光度，并对0hr和24hrs的值进行比较以评估相对于对照样本一(没有小球的细菌悬浮液)和对照样本二(细菌悬浮液+小球但没有添加缀合物)的细菌生长的减少。此外，对溶液进行脉冲离心，轻轻丢弃上清液，而对包含细菌的HA小球像之前一样进行平板培养和定量评估。对于11的测试，制备了包含HA小球和更高浓度范围为1-400μg/mL的11以及浓度范围为0.5-400μg/mL的环丙沙星的溶液，并再次与对照样本(细菌悬浮液但无HA)在抑制生物膜形成的能力方面进行比较。测试更高浓度的11是因为已证实与氨基甲酸酯缀合物相比酰胺缀合物的活性较弱。
金黄色葡萄球菌在用6预处理的HA上温育24hrs之后的存活率：将HA盘浸泡在2mL包含各种浓度的BP-环丙沙星或单独的环丙沙星的溶液中，并放置24hrs/37℃。在DMSO或磷酸盐缓冲液中温育的HA盘作为对照样本。接下来，用无菌水冲洗盘3次。冲洗之后，将2mL的0.5MF的金黄色葡萄球菌ATCC6538引入包含HA盘作为基底的孔中用于生物膜发展，并像之前一样形成生物膜。
道德声明:所有的动物协议和程序都是按照南加利福尼亚大学(USC)的动物护理和使用委员会(IACUC)以及按照美国兽医协会组安乐死委员会批准和执行的。USC在美国农业部(USDA)注册，在国立卫生研究院(NIH)存档有完全批准的保证书(#A3518-01)，并被美国实验动物管理认证协会(AAALAC)认可。我们IACUC批准的协议的标题是：“Bone targetedantimicrobials for biofilm-mediated osteolytic infection treatment(骨靶向的抗微生物剂用于生物膜介导的溶骨性感染治疗)”，协议号为20474。本文所述的所有的动物实验方法以及参与动物研究的研究人员和工作人员都遵守用于实验动物的护理和使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)、USDA动物福利条例(CFR 1985)和有关人性化护理及使用实验动物的公共健康服务政策(Public Health Service Policyon Humane Care and Use of Laboratory Animals)(1996)。
体内动物研究:对于这项研究，在研究中使用了12只五月龄、未交配过的雌性Sprague-Dawley大鼠，体重大约为每只200g。每个笼子中安置两到三只动物，在动物饲养所中于22℃下12-hr光亮/12-hr黑暗循环，并用软食(Purina Laboratory Rodent Chow)随意喂养。按照USC关于使用和护理动物的指导和条例来照看所有动物。动物处于24hrs/天随时候召的全职兽医的监督下，他们每天亲自对动物进行评估。所有的动物实验都使用用于报告动物研究的ARRIVE45指南来描述，以确保结果的质量、信度、效度和重现性
此动物模型是专为研究生物膜介导的疾病和体内宿主反应而设计的内部颌骨种植体周围骨髓炎模型31。颌骨骨髓炎病原体Aa的生物膜以109CFU在微型钛种植体上预形成。为了在我们的动物研究之前确认Aa对母体药物环丙沙星的敏感性，除了如所述对于长骨骨髓炎病原体的生物膜HA测定之外，还进行了对浮游Aa的AST和MIC测定。当在体外将生物膜建立在种植体上之后，通过手术将生物膜转移到每只大鼠的颌骨。为进行手术，首先用4％异氟醚吸入剂然后腹膜内注射氯胺酮(80-90mg/kg)和甲苯噻嗪(5-10mg/kg)来麻醉动物。然后，通过在手术部位浸润注射0.25％布比卡因(bupivicaine)来给予局部麻醉。在割开初始切口之前，皮下给予丁丙诺啡缓释(1.0-1.2mg/kg)作为预镇痛。麻醉之后，缩回每只大鼠的颊粘膜，并用导向钻钻入前腭的自然牙间隙中的牙槽嵴来进行经粘膜截骨术。然后将种植体人工插入截骨中，并固定在骨中直到齿台处于粘膜水平。在每只大鼠(n＝12只大鼠)的双侧腭骨中放入两个接种了生物膜的种植体。
术后一周再次给予4％异氟醚以对大鼠进行短暂麻醉，并检查种植体稳定性，以及记录种植体处和感染部位的临床发现，诸如存在或不存在炎症。然后，通过腹膜内注射向动物给药BP-环丙沙星(6以0.1mg/kg、1mg/kg或10mg/kg作为单剂量，和0.3mg/kg 3x/周用于多剂量组)或单独的环丙沙星(10mg/kg 3x/周也作为多剂量组)作为阳性对照，以及无菌无内毒素盐水作为阴性对照。
通过随机化过程将动物分配到治疗组和对照组。多剂量组动物在该周中的每次额外注射之前都被麻醉。所有化合物均为药理级的，并以合适的pH值构成于注射用无菌生理盐水中。药物治疗一周后，将所有动物置于CO2室(60-70％浓度)内5分钟，然后颈椎脱位来安乐死。对种植体周围组织(1cm2)进行整块切除并移除种植体。在手术和切除处记录临床参数，诸如存在或不存在假体周围炎症。将分配到治疗组和对照组的大鼠进行去识别，并对随后分析微生物数据的研究人员隐瞒。
为了进行微生物分析，在手术切除之后立即将切除的种植体周围软组织和骨均质化并处理，通过放置在1mL的0.5％皂苷中并涡旋1min，然后进行连续稀释。制备以稀释因数为10(例如，将0.1mL的皂素溶液转移至0.9mL的0.9％无菌等渗盐水溶液中)范围为从100至10-9的连续稀释液，并使用涂布平板法将每种稀释液中的0.1mL溶液在板上培养。用于培养Aa的培养基由改性TSB组成，且冷冻储备液在-80℃下保持于20％甘油、80％改性TSB中。所有的培养均在37℃下5％CO2中进行48hrs。人工计数所培养的Aa细菌活菌的数目(每克组织中CFUs的数目)，并记录每克CFU的平均log10数目的减少作为治疗的函数。为了确认Aa细菌形态类型并也为了排除污染，一旦CFU计数完成之后，就通过对板上的菌落取样进行革兰氏染色和组织学评估。
统计分析
统计计算用SPSS 22.0(IBM，Armonk，NY)和Excel 2016(Microsoft Corporation，Redmond，WA)进行。在使用G Power 3软件实验之前，进行功效分析以确定用于体外和体内研究的样本量估计46。首先用描述统计学对每组的实验结果中的定量数据进行分析，以了解数据(参数或非参数)的分布情况并生成平均值、标准误差、标准偏差、峰度和偏度以及95％置信水平。然后，适用时使用Kruskall-Wallis检验或单因素ANOVA对数据进行分析，并当将治疗与对照进行比较时p＜0.05则存在统计学意义。此外，对于体内实验，使用未配对t-检验和用于多次比较的Dunnett’s检验进行事后(post-hoc)分析。
所用缩写词
Aa，伴放线凝聚杆菌；AAALAC，美国实验动物管理认证协会；ANOVA，方差分析；ARRIVE，动物研究：体内实验报告；AST，抗生素敏感性测试；ATCC，美国典型培养物保藏中心；BP，双膦酸；BTMS，溴三甲基硅烷；CFU，菌落形成单位；CLSI，临床实验室标准协会；EUCAST，抗微生物剂敏感性测试欧洲委员会；HA，羟基磷灰石；IACUC，动物护理和使用委员会；MBC，平均杀菌浓度；MBIC50，抑制50％的生物体生长所需的最小生物膜抑制浓度；MF，McFarland；MH，Mueller Hinton；MIC50，抑制50％的生物体生长所需的最小抑制浓度；MSSA，甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌；Pd/C，活性炭载钯；SD，标准偏差；BTMS，溴三甲基硅烷；DCM，二氯甲烷；SOCl2，二氯亚砜；SEM，扫描电子显微术。
实施例5的参考文献
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实施例6：
本文证明了氨基甲酸酯连接的双膦酸-环丙沙星是用于尤其是感染性骨疾病的靶向治疗的可行的抗微生物缀合物(图14)。
双膦酸(BP)可以与钙形成强的双齿和三齿相互作用，并从而靶向骨或羟基磷灰石(HA)表面(也是生物膜病原体驻留的地方)。通过成功设计、合成和测试双膦酸-氨基甲酸酯-环丙沙星(BCC，化合物6)缀合物在体外和体内对抗常见的骨生物膜病原体，证明了骨-生物膜-靶向抗微生物方法的可行性。我们的结果表明，在体外BCC(化合物6)对常见的长骨和颌骨骨髓炎生物体有强的杀菌谱，特别是当生物膜模型使用HA作为基底用于微生物生长和抗微生物测试时。在骨髓炎预防性实验环境中，化学吸附的BCC(化合物6)抑制了生物膜在HA上生长，其中缀合物显示出可预测的缓释速率，且在实现完全杀菌作用方面，是单独的母体药物环丙沙星的活性的20高。在体内在颌骨种植体周围炎的动物模型中证明了BCC(化合物6)对抗伴放线凝聚杆菌的生物膜的有效性和安全性。在体内，腹腔内单剂量的10mg/kg(15.6μmol/Kg)的缀合物产生99％种植体周围杀菌有效性，显示出比以多剂量给予的单独的母体抗生素环丙沙星(90.6μmol/Kg，总计6倍高的环丙沙星总体剂量)的活性高一个数量级。以此10mg/kg的单剂量，BCC(化合物6)示出了比以更高剂量多次给药的母体抗生素环丙沙星更大的有效性和疾病解决方案，且分别由于在生物膜感染部位的骨靶向/生物分布和持续的抗生素释放的药代动力学和药效动力学优势而没有潜在的全身毒性或副作用。
牙种植体是现代牙科实践的重要部分，据估计有多达3500万美国人在单颌或双颌缺失了全部牙齿。到2022年，用于替换和重建牙齿的这些种植体的总市场有望达到42亿美元。虽然大多数种植体会成功，但这些假体中有一些会由于种植体周围炎而失败，导致支撑骨破坏。种植体周围炎有双峰型发病率，包括早期(＜12个月)和晚期(＞5年)失败；这两种关键失败点在很大程度上都是种植体上和其周围细菌生物膜感染的结果。种植体周围炎是种植体失败的常见原因。牙科种植体失败通常是由生物力学或生物/微生物原因导致的。从目前的文献中很难确定种植体周围炎——导致支撑骨破坏的微生物相关种植体疾病的最严重形式——的患病率。然而，最近的研究表明种植体周围炎是患病率越来越高的日益严重的问题4。最近一项对150位患者随访5至10年的研究显示，种植体周围炎的发生率分别为大约17％和30％，表明这是一个重大的问题5。早期种植体失败或缺乏骨性结合是单独的问题，并在大约9％的植入颌骨中发生6。这在上颌骨中更常见6，并与手术期间或附近部位的细菌感染(例如牙周炎)以及其他公认且可改变的风险因素(诸如吸烟、糖尿病、过量的水门汀和口腔卫生不良)有关2。
生物膜感染可能与种植体周围炎的发病机理有关。生物膜感染代表了独特的治疗问题，且通常难以诊断，对标准抗生素治疗有抵抗性，对宿主免疫响应有抵抗性，并导致持续的顽固性感染7。自早期阐明细菌生长在基质支撑的群落中以来，感染的生物膜假说已经不断扩大8,9。现已证实，超过65％的慢性感染是由生长在生物膜中的细菌引起的7。这意味着，在美国每年大约有1200万人受到这些感染，且有近50万人死于这些感染。种植体周围炎和牙周炎是最常遇到的生物膜感染。已发现与牙周炎感染相比，种植体周围炎是相对简单的感染，且群落多样性(和重点病原体)较少。典型地，革兰氏阴性菌种占主导地位11。其他骨科或骨感染，包括颌骨感染，也都是由细菌生物膜群落引起的12，使得此处开发的技术同样适用于这些疾病。
目前治疗种植体周围炎的方法有其局限性。虽然种植体周围炎有多种成因，但主要的病因是细菌生物膜。目前尚无普遍接受的用于种植体周围炎治疗的指南或方案，许多用于细菌性种植体周围炎治疗的临床方案包括局部和全身性抗生素递送13和病变的外科清创，包括使用骨移植替代物的恢复性植骨14,15。然而，临床经验已经表明，很难将即使是局部抗生素递送装置推进到深的种植体周围袋的底部以及感染的颌骨，或使全身性抗生素充分渗透到感染的颌骨中以杀灭生物膜病原体16，这主要是由于抗生素的内在的差的骨(和种植体周围)生物分布或药代动力学17。在以往的长期研究中，即使当用杀菌剂局部清理感染的种植体并给药全身性抗生素时，仍然在超过晚期种植体周围炎病变的40％中有额外的支撑骨损失15。
此外，长期的全身性抗生素治疗可能导致全身毒性或不良反应以及耐药性。因此，使用局部递送系统来在骨中达到更高的治疗性抗菌浓度已成为临床医生的普遍做法。例如，牙医使用米诺环素(minocycline)或多西环素粉末(例如)或氯己定溶液(例如)与骨移植材料的诊疗椅边混合用于局部递送18。这样的方法仅仅是浆液，且不形成如BioVinc方法中的抗生素和骨替代物之间的强结合，并因此如之前所述遭受相对早的清除和较低效的药代动力学。此外，研究人员还使用了几种可生物降解和不可生物降解的局部抗生素递送系统19。然而，这些方法有一些局限性，例如，不可生物降解的方法(例如聚甲基丙烯酸甲酯水门汀)需要第二次手术来去除抗生素负载装置，与某些抗生素不相容，且遭受低效的释放动力学；在一些情况下，＜10％的总递送抗生素被释放17。包括纤维、凝胶和小珠的可生物降解的材料正受到越来越多的关注，然而，其治疗种植体周围炎的临床有效性尚未得到很好的证实。即使当使用有效的抗微生物剂/杀菌剂治疗颌中的种植体周围炎时，诸如局部氯己定递送，对于治疗效果的影响也很小，如在前瞻性动物和人类研究中所证实15,17。这些数据综合起来进一步支持了前面提到的抗生素在骨中差的药代动力学，并突出了对骨结合/骨靶向和持续的抗生素释放策略的需要。
BP-缀合物
考虑到目前治疗方法的局限性，开发靶向骨/生物膜的抗微生物药剂是该领域中的重大进展。本文提供的BP-抗生素(BP-Ab)缀合物可以克服与骨中以及骨结合的生物膜内差的抗生素药代动力学或生物利用度相关的许多挑战。这些化合物可以通过“靶向并释放方法”减少感染，其可以降低对全身毒性和/或在其他(例如非感染)组织中的药物暴露的担忧。可以将BP-Ab缀合物整合到骨移植替代物中。BP-Ab可以是BP-氟喹诺酮缀合物。在一些情况下，BP-Ab可以是双膦酸-氨基甲酸酯-环丙沙星(BCC，化合物6)，如图15所示。图15的示例性结构在本文也称为BCC(化合物6)。当整合到骨移植物中时，BP-Ab骨移植材料也可以称为BP-Ab-骨移植物。例如，当抗生素是氟喹诺酮时，可以称它为BP-FQ-骨移植物。这些化合物能有效地吸附在羟基磷灰石(HA)/骨上，且随时间推移能够实现持续的释放以及对生物膜病原体的抗微生物有效性。本文所提供的化合物以及整合了化合物的移植材料可以用作抗感染骨移植替代物用于种植体周围炎的辅助治疗或预防。缀合物将从移植材料中以缓释动力学局部地释放，并在细菌活性或破骨细胞活性存在的情况下裂解，正如我们之前在本文其他地方所提供的其他结果中在体外和体内已经证明的那样。与目前的递送途径相比，以这种方式移植物可以提供更大的FQ(诸如环丙沙星)局部浓度。总之，本文提供的化合物和骨移植材料可以包含与安全的或无药理学活性的(非抑制吸收的)BP部分缀合的抗生素，其通过强多齿静电相互作用与移植材料中的钙/HA结合，且抗生素随时间释放；它不简单地代表仅以浆的形式与现有骨移植材混合的局部抗生素，如在此背景下一些目前的临床方法那样。因此，这种附着在磷酸钙矿物(HA)上的化学吸附的药物是该领域中的重要进展，并克服了在向种植体周围骨递送抗生素以实现对生物膜病原体有效的杀菌活性方面的许多限制。
通过将活性药物分子连接至BP来靶向骨的总体概念已经在一篇综述30中讨论。然而，由于早期尝试的结果为全身性不稳定的前体药物或不可裂解的缀合物，发现其大部分由于干扰药效基团需求而使缀合物的任一组分均失去活性，所以在此时期尚未开发出FDA批准的药物。在喹诺酮领域，Herczegh描述了一个突出的实例，其中氟喹诺酮的抗菌特性在稳定的BP连接的同源物的情况下由于缀合被减弱31-32。因此，需要靶向并释放接头策略。
近年来，利用较不稳定连接技术的药物化学策略开始出现。其他一些具有通过羧酸基团与几种不同的BP部分连接的氟喹诺酮。他们发现当在大鼠骨髓炎模型中预防性地使用抗生素莫西沙星和加替沙星的羟乙酰胺酯前体药物时减少了感染33。此同一小组使用了基于酰氧基氨基甲酸酯和苯丙酮的接头通过胺功能性将相同的抗生素系链到简单的BP系统上34。他们示出，使用相同的预防性大鼠模型，这些缀合物在抑制感染建立方面也优于母体抗生素。Targanta团队33已经在与糖肽类抗生素奥利万星(oritavancin)35一起使用上进行了几种这些前体药物策略。这种双重功能药物似乎在预防感染方面有一定程度的效果。然而，到目前为止，他们还没有发表表明它们能够治疗已建立的感染的研究，且他们也没有发表该前体药物的药代动力学。据信，由于他们的药物候选选择部分地基于血浆不稳定性，而这些类似物在血液中太不稳定，以至于无法用此治疗性方法完全实现成功。因此，认为这些小组开发的这些化合物不能实现抗生素的有效局部浓度。
BCC化合物(图15)可以将氨基甲酸苯酯接头的苯基部分直接并入分子的BP部分。可以通过用吸电子或供电子基团对苯环进行修饰来修改或调整释放动力学，其可以改变接头的可靠性。此外，BP核心缺乏作为抗吸收剂的效力，并因此不像更有效的含氮BP药物(例如唑来膦酸)那样带有药物相关的颌骨坏死的风险39,40。这里和本文其他实施例中都证明了这种使用氨基甲酸苯酯接头的靶向并释放策略很可能直接将活性药物释放到骨环境中的细菌生物膜中。骨靶向是如此有效以至于它比环丙沙星对抗生长在HA骨基质替代物上的生物膜的效果更好，且在对抗在塑料容器中生长的浮游培养物的效果上也更好。研究发现，用不可裂解的酰胺连接制成的类似缀合物(双膦酸-酰胺-环丙沙星，BAC，化合物11)，其舍弃氨基甲酸酯的酚氧，在任何情况下对细菌生长均几乎没有作用，表明抗微生物活性需要缀合物的活跃裂解。
BCC(化合物6)的合成方案如图16所示。通过1H、13C和31P NMR以及质谱对化合物进行表征。为了帮助确定抗微生物活性是否主要是由于所释放的环丙沙星，我们决定也合成旨在不从缀合物中释放环丙沙星的酰胺连接的缀合物。此化合物的合成进展顺利(图31)，并以合理的收率得到了对照化合物BAC(化合物11)。
进行了一系列测定以确定BCC(化合物6)(也称为“BCC(6)”)、BAC(化合物11)(也称为“BAC(11)”)和母体药物环丙沙星对一组金黄色葡萄球菌(SA)菌株的最小抑制浓度(MIC)。这些实验是根据抗微生物剂敏感性测试欧洲委员会的指南(参考文献43)使用稀释法测定进行的。对这三种化合物的测试(图17)表明，BCC(化合物6)缀合物对这些病原体保留了显著的杀菌活性，而BAC(化合物11)则失去了大部分活性。这些抗生素敏感性测试(AST)和MIC数据表明，环丙沙星和BCC(化合物6)对浮游的和临床相关的SA病原体具有强的杀菌活性，且缀合连接影响母体药物的抗微生物活性，如BAC(化合物11)的活性较弱所证明的。我们对于环丙沙星对抗这些菌株的测试与已建立的临床折点一致。
由于HA是骨中主要的无机组成，因此测试了化合物吸附至悬浮的HA珠，作为骨结合的替代方案。我们的BCC(化合物6)确实被HA珠所吸收，如在去除珠之后对上清液中残留的缀合物的测量所表明(图18)。通过分光光度法在0和24hrs使用275nM(BCC(化合物6)的确定的λmax)处的吸光度测量上清液中的缀合物。这清楚地表明，BCC(6)与骨替代物相结合。我们没有测量BAC(化合物11)的结合，因为BCC(化合物6)的数据与此类BP的结合一致，其也将带动BAC(化合物11)的结合(参考文献35,44)。
下一个体外测试是将BCC(6)的骨替代物靶向活性与如抗SA菌株的MIC活性所示的环丙沙星的即刻释放相结合。在此实验中，HA盘用指定浓度的缀合物或环丙沙星的溶液进行预处理，然后通过冲洗去除化合物溶液。允许SA(菌株ATCC-6538)的生物膜按照我们公布的程序生长。生长24hrs之后进行菌落形成单位(CFU)的定量计数。使用用DMSO和PBS预处理的盘作为对照。结果表明，10μg/mL的BCC(6)抑制所有的细菌生长(图11)，而纯环丙沙星在100μg/mL时可完全抑制。由于缀合物的分子量大约为纯环丙沙星的分子量的一半，这表明BCC(化合物6)在完全抑制细菌生物膜生长方面的效力约为母体药物的20倍。这支持药物在骨基质环境中随时间从缀合物中释放。酰胺缀合物BAC(11)即使在非常高的浓度下也不能抑制生物膜在骨替代物上生长(数据未示出)，表明环丙沙星的释放对此活性至关重要，并与早期文献和浮游培养研究一致(图18)30,34,35,44。
在上述结果表明我们的BCC(6)具有杀菌活性下，我们已准备好在动物模型中测试其抗生物膜感染的活性。简单来说，将非大鼠正常菌群所固有的且对颌骨感染有特异性的伴放线凝聚杆菌(Aa；野生型粗糙菌株D7S-1；血清型a)以109CFU预先接种在微型钛种植体上。为了在我们的动物研究之前确认Aa对母体药物环丙沙星的敏感性，我们用Aa进行了AST和MIC测定，如先前描述的对长骨骨髓炎病原体所进行的那样。盘扩散抑制区测定显示直径＞40mm，且MIC90为2mg/mL，表明Aa对母体药物环丙沙星有很强的敏感性。将承载Aa生物膜的接种的种植体置于12只大鼠中(每只动物2个种植体)。该模型可靠地在颌骨周围形成了特征明显的生物膜感染，导致了炎症和相关的种植体周围疾病。(参考文献45)在允许生物膜发展之后，将动物随机分成三个治疗组(5只动物为BCC(6)10mg/kg单剂量，2只动物为BCC(6)0.3mg/kg 3×每周，5只动物为用无菌盐水对照处理)。预试验(2只动物/组)表明，以10mg/kg的BCC(6)单剂量与给予总剂量30mg/kg以每周3×10mg的方案给药的环丙沙星的效果相同(未示出)。因此，我们决定在更大的实验中不再包括环丙沙星对照，以减少动物的使用。所有动物均对治疗和药物治疗有良好的耐受性，无不良事件。在临床上安乐死和手术切除期间，我们观察到与治疗组中的大多数动物具有无炎症的种植体周围组织相比，对照组中的大多数动物显示出局部假体周围炎症的证据，且种植体保留为总体23/24种植体(96％)，提供了稳健的统计分析。
对安乐死后切除的种植体周围组织(23/24)中Aa的CFU进行了定量确定，且结果如图19所示，其中在此实验中单剂量的10mg/kg BCC(6)展示出杀灭大约6log单位，且甚至多次低剂量也显示出杀灭2-3(99％至99.9％)log。通过此实验，单剂量的10mg/kg BCC(6)显示出最大的有效性，且与对照组相比具有高度统计学意义(p＝0.0005)。
在这两种动物模型中，BCC(6)均通过腹膜内注射递送以确保对化合物的暴露，因为与氟喹诺酮的静脉或胃肠道给药途径有相对生物等效性。我们认为这些结果总体上证明了使用可释放的BP-抗生素(BP-Ab)缀合物作为治疗种植体周围疾病和相关骨髓炎的药物的可行性。在此，我们建议在这些结果的基础上，将BP-Ab缀合物并入牙科骨移植替代材料中，用于局部口腔递送和释放。
实施例7
额外的BP-Ab缀合物的设计与合成(图20)。额外的BP-Ab缀合物可以使用例如环丙沙星和莫西沙星通过基于氨基甲酸酯的接头(例如氨基甲酸酯、S-硫代氨基甲酸酯和O-硫代氨基甲酸酯)与BP(例如，4-羟基苯基乙叉基BP(BP 1，图20)、它的包含羟基的类似物(BP2，图20，具有较高的骨亲和力)和帕米膦酸(BP 3，图20)缀合来设计。图21示出了用于合成有O-硫代氨基甲酸酯接头的BP-Ab缀合物的示例性合成方案。具有S-硫代氨基甲酸酯键的缀合物(略微更不稳定)可以由通过Newman-Kwart重排对具有O-硫代氨基甲酸酯键的缀合物进行异构化来获得(参考文献47，48)。已经进行了初步的化学实验，以证明快速合成这些目标的可行性。因此使用包含α-OH的BP很好地证明了添加骨亲和性(49)。添加骨亲和性将增强骨表面缀合物的浓度，并促进更高的短期和长期局部药物浓度。对于有包含α-OH的BP(BP 2和帕米膦酸，图20)的缀合物的合成，由于α-OH双膦酸酯很容易重排成膦酰基磷酸，因此可以用叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)基团保护α-OH(方案2，图22)(50)。然后将α-O-TBSBP 2酯通过氯甲酸4-硝基苯酯活化，并类似地如图21与环丙沙星或莫西沙星反应。对于α-O-TBS BP 3酯，使用有苯酚基团的接头(例如，接头1(间苯二酚)、接头2(对苯二酚)、接头3(4-羟基苯基乙酸)，图20)将BP和抗微生物药剂系连，且以使用接头3的合成路线作为实例在此说明(方案3，图23)。所有BP-Ab缀合物均通过1H、31P、13C NMR、MS、HPLC和元素分析来表征以保证一致性/身份(identity)。
可以确定BP-Ab缀合物的矿物质结合亲和性。简单地说，可以精确称重(1.4-1.6mg)大粒径(均匀地1-2mm)无机牛骨并悬浮于包含适当体积的测定缓冲液[0.05％(wt/vol)吐温20，10μM EDTA和100mM HEPES pH＝7.4]的4mL透明小瓶中3hr。然后，可将此骨材料与逐渐增加的量的BP-Ab(0、25、50、100、200和300μM)一起温育。可以将测定缓冲液中的样本于37℃下轻轻振动3h。平衡期之后，可将小瓶以10,000rpm离心5min以分离固体和上清液。可收集上清液(0.3mL)并使用Shimadzu UV-VIS光谱仪(275nm波长)测量平衡溶液的浓度。荧光发射也可以用于计算结合参数。在不存在HA的情况下，作为对照，可用类似的程序测量非特异性结合。由输入量与结合之后上清液中回收的量的差值推导出与HA结合的母体药物/BP-Ab缀合物量。结合参数(Kd和Bmax，分别表示平衡解离常数和结合位点的最大数目)可以使用PRISM程序(Graphpad，USA)计算，并在5个独立的实验中测量。平衡解离常数(Kd)低于20μM(～2×母体BP的Kd)的化合物可以是优选的。可使用双样本t-检验评估BP-Abs的结合参数。每组中的样本量(n＝5)可以用于检测到此假设的效应量为1.72，功效80％，且单侧I型误差0.05。
可以确定BP-Ab缀合物的连接稳定性。简单地说，可以在有不同pH(pH＝1、4、7.4、10)和人或犬血清的PBS缓冲液中测试每种BP-Ab缀合物的连接稳定性。可以将BP-Ab悬浮于400μL的上述PBS中或400μL的50％(v/v在PBS中)人或犬血清中。可以将悬浮液/溶液在37℃下温育24h并以13000rpm离心2min，并可回收上清液。可以向每种上清液中加入甲醇(相对于上清液5×体积)，并可将混合物涡旋15min以提取所释放的氟喹诺酮。然后，可以将混合物以10000rpm离心15min以沉淀不溶物质。可将包含所提取的氟喹诺酮的上清液回收并蒸发至干。可将干燥的球粒重新悬浮于PBS中，并如之前所述通过UV-VIS测量来确定所释放的氟喹诺酮的量。然后，可基于输入量和所测量的药物释放量计算释放的氟喹诺酮药物的百分比。如果浓度足够，可通过LC-MS分析和/或NMR确认所释放药物的一致性/身份(identity)。
可以确定在体外HA盘上生物膜生长的抑制。简单地说，可使用可商购的HA粉末用于定制盘的制造。可在没有粘结剂的情况下压制直径为9.6mm的粉末球粒。可在900℃下进行烧结。可使用用于静态拉伸、压缩和弯曲测试的通用测试系统(Instron model 3384；Instron，Norwood，MA)对片剂进行压缩。可分别使用LEXT OLS4000显微镜(Olympus，CenterValley，PA)和Metrotom 1500显微断层摄影仪(Carl Zeiss，Oberkochen，德国)通过共聚焦显微术和微计算机断层成像术(显微CT)检查所制造的HA盘的质量。然后，可以将HA盘引入以下浓度[mg/mL]的每种BP-Ab缀合物和环丙沙星/莫西沙星中：800、400、200、100、50、25、10、5、1，并放置24h/37℃。温育之后，可将HA盘移除并引入1mL的PBS中，并放置在柔和摇动振动器中5min；随后以这种方式进行3次冲洗。冲洗之后，可将1mL的Aa悬浮液引到盘上并放置24h/37℃。然后，可以冲洗盘以去除未结合的细菌并进行涡旋振动。然后，可将获得的悬浮液的连续稀释液涂布在改良TSB琼脂板上进行培养，并在24h后对菌落生长进行计数。
可以在用于骨移植的上牙槽种植体周围缺损模型中评估BP-FQ-骨移植物在临界尺寸上的骨融合作用。简单地说，在这种分开的口腔设计中，对6只比格犬(3只雄性，3只雌性)双侧拔除下颌PM2-PM4，并允许愈合12周。在翻粘骨膜瓣之后进行嵴切开。进行截骨术以生成6mm的上牙槽缺损。在每个前磨牙区通过用以直径渐变的内部冲洗钻(internallyirrigated drills)在充分冲洗下连续切割来进行种植体部位截骨术准备。以这样的方式将种植体(Astra Tech Osseospeed3×11mm)放置在每侧PM2-PM4的位置，使得种植体被定位在相对于生成的缺损的嵴上4mm处并距颊皮质骨板相同的距离。将狗随机分成3个不同的组(每组2只狗)：
1.右侧使用化学吸附有BP-氟喹诺酮的无机牛骨(1g大粒径1-2mm)，且左侧使用胶原蛋白填塞物(阴性对照)。
2.右侧使用无机牛骨(1g大粒径1-2mm，阳性对照)，且左侧使用胶原蛋白填塞物(阴性对照)。
3.右侧使用化学吸附有BP-氟喹诺酮的Bio-(1g大粒径1-2mm)，且左侧使用Bio-(1g大粒径1-2mm，阳性对照)。
从上述实验得到的化学过程和抗微生物测定结果可以告知用于吸附至移植材料的缀合物的理想标准化数量的计算，以在这里所述的所有体内实验中使用。基于初步结果预计的早期计算表明，5mg或更少的缀合物吸附到1g的移植材料上将提供比所测病原体的MIC高2-3个数量级的杀菌活性。我们的BP-氟喹诺酮缀合物可应用于一系列骨移植材料，包括可商购的骨移植材料，例如Bio-因此，我们在研究中选择自制的无机牛骨和BioOss作为阳性对照，用于证明缀合物的广泛应用。所有缺损(根据以上分组)均用标准化量的生物材料填充直至两侧上每个种植体的平台，并使用Bio-膜来覆盖移植物和种植体以提高稳定性。借助于骨膜释放切口、内部垫以及最后地边缘单间断缝合(PTFE 4.0，Cytoplast，USA)使膜瓣以无张力的方式闭合。此时获取显微CT，并临床监测动物的炎症和不良事件。此外，正如接下来的实验中所描述，对这些动物进行PK研究以评估对移植材料内的成分(例如完整的缀合物、BP、抗生素或接头)的任何全身暴露。12周之后处死动物并切除下颌骨，并通过显微CT然后通过组织学制备进行检查。将对颌骨的基线显微CT扫描与实验后的扫描进行比较。进行定量化3D容积显微CT和组织形态计量学分析以检查种植体周围部位出现的新骨的体积，以及第一骨-至-种植体接触率/面积、总缺损面积、再生面积、总缺损面积内的再生面积、再生骨、残留骨替代材料、矿化组织的百分比、软组织和空隙。最后，进行尸体剖检以获得对器官和系统的验尸评估，获得局部口腔治疗引起的耐受性问题的大体和显微镜下的迹象。
BP-FQ-骨移植物的抗微生物有效性可以在犬种植体周围炎模型中进行评估。简单地说，在这种分开的口腔设计中，使用微创技术对8只比格犬(4只雄性，4只雌性；总共48颗牙齿)双侧拔除下颌PM2-PM4。经过3个月的愈合后，在颌两侧提起粘骨膜瓣，并在每个前磨牙区通过用以直径渐变的内部冲洗钻在充分外部冲洗下连续切割来进行种植体部位截骨术准备。使用非埋藏式技术，将种植体(Astra Tech Osseospeed3×11mm)安装在每个部位。种植体放置的顺序在两侧是相同的，但计算机生成的狗之间的随机化方案是随机化的。愈合的基台与种植体和膜瓣相连，使用可吸收的缝合线近似。菌斑控制方案包括每周用牙膏刷牙四次。在种植体放置十二周之后，就在实验性种植体周围炎开始之前，用无菌纸捻(paper points)(Dentsply，Maillefer，size 35，Ballaigues，瑞士)从所有种植体周围部位获取微生物学样本，并立即放置在Eppendorf管(Starlab，Ahrensburg，德国)中用于微生物学分析。如我们之前详述的，通过DNA提取和16S rRNA PCR扩增进行微生物学分析(55)。使用Roche 454 GS FLX平台对PCR扩增子进行测序，并用定量洞察微生物生态学(QIIME)软件包分析数据(56)。如前期在我们I阶段研究中所述确定样本中的菌落形成单位计数(CFU/mL)。此时，如下开始实验性种植体周围炎。如我们之前在大鼠动物模型上的实验以及我们之前的动物种植体周围炎研究中所进行的那样，使关键的牙周病原体伴放线凝聚杆菌(Aa)生物膜在体外愈合的基台上开始形成，其对犬类菌群不是内源性的。将温育了生物膜的愈合的基台放置在种植体上，并将棉结扎线置于种植体颈部周围的靠近边缘位置。在细菌感染10周后，像之前一样再次进行微生物取样和分析，并采取纤维CT扫描作为种植体周围缺损的基线。通过由提起全厚度颊舌瓣对所有种植体部位进行外科手术清创，使用气粉磨损装置从种植体表面去除任何现存的结石，并用葡萄糖酸氯己定0.12％中浸泡的纱布擦拭种植体表面来开始对此实验性种植体周围炎模型的治疗。如下将动物分成4组(每组2只狗)：
1.右侧使用有化学吸附的BP-氟喹诺酮的无机牛骨(1g大粒径1-2mm)，且左侧使用胶原蛋白填塞物(阴性对照)。
2.右侧使用无机牛骨(1g大粒径1-2mm，阳性对照)，且左侧使用胶原蛋白填塞物(阴性对照)。
3.右侧使用有化学吸附的BP-氟喹诺酮的无机牛骨(1g大粒径1-2mm)，且左侧使用抗微生物剂释放装置(100mg局部米诺环素，阳性对照)。
4.右侧使用有化学吸附的BP-氟喹诺酮的Bio-(1g大粒径1-2mm)(阳性对照)，且左侧使用抗微生物剂释放装置(100mg局部米诺环素，阳性对照)。
未来进行数据分析的研究者对治疗组分配是不知情的。在治疗组中使用标准化且相当的量的抗微生物剂。治疗之后，将膜瓣重新定位并缝合(PTFE 4,0，Cytoplast，USA)，拆线后1周之后重新建立口腔卫生措施。手术后3个月，再次进行临床和显微CT扫描检查，且同样如上所述在此时获取微生物样本用于分析。种植体周围炎手术后六个月，将动物安乐死并进行显微CT扫描，并切除颌骨用于评估组织病理学参数，如在部分“临界尺寸上牙槽种植体周围缺损模型”中所详述。如先前所详述从组织学切片确定炎症评分(参考文献57)，用于与临床和放射学结果关联。
统计分析：统计计算用SPSS 22.0(IBM，Armonk，NY)和Excel 2016(MicrosoftCorporation，Redmond，WA)进行。进行功效分析以确定用于使用G Power 3软件的所有动物研究的样本量估计58。在从这些动物研究中收集数据之后，首先用描述统计学对定量结果进行分析，以了解数据(参数或非参数)的分布情况并生成平均值、标准误差、标准偏差、峰度和偏度以及95％置信水平。适用时使用Kruskall-Wallis测试、ANOVA或混合线性模型分析数据，且当比较多个组时统计学意义以α＝0.05水平进行。还使用未配对t-检验和用于多次比较的Dunnett’s检验进行事后分析以进一步证实结果。所有的动物实验都使用用于报告动物研究的ARRIVE指南来描述，以确保结果的质量、信度、效度和重现性59。
可对BCC(6)的药物化合物和成分稳定性以及体外ADME进行评估。这些数据可以帮助确定人类新陈代谢与实验的动物之间是否很可能存在任何大的差异。与人类、大鼠和狗肝微粒体和肝细胞一起温育6，然后对代谢物混合物进行LC/MS分析。环丙沙星的代谢谱是已知的62,63，并因此我们的关注点是分子的BP部分的任何代谢物和母体的任何代谢物(例如，对于环丙沙星已知的哌嗪环裂解)。一旦在体外确定了代谢物，就使用上述其他体内实验中的血浆样本在体内以稳态确定这些化合物。
可以在大鼠和狗中评估BCC(6)的毒理学以确定NOAEL。为了在大鼠和狗中确定NOAEL和最大耐受剂剂量(MTD)，我们首先进行了剂量范围研究。向6只大鼠(3只雄性，3只雌性)的组给予静脉注射单剂量10mg/kg的6，或者基于我们此时的最佳评估。通过加倍逐渐提高剂量直到发现急性毒性(MTD)，然后将此剂量依次降低20％直到无作用，这将是化合物的NOAEL。毒性被评估为轻度、中度或大量，且由在≥2只动物中为中度毒性或在≥1只动物中为大量毒性定义MTD64。对动物进行为期5天的体重和临床观察。5天后，将动物安乐死并进行尸体剖检以评估器官重量和组织学(15个切片包括肝脏和肾脏，基于临床BP毒理学)。对狗也进行了类似的剂量范围研究(1只/性别，从等量剂量开始，如由异速比例法(allometricscaling)4mg/kg所确定的，假设大鼠250g和狗10kg)，且除了与大鼠中相同的终点研究之外还包括血液学和临床化学。这可以使用总共4-6个队列。
可以在动物组中以NOAEL和MTD进行扩大的急性毒性测试，包括毒代动力学和恢复性测试。包括10只/性别的48只大鼠的组可用于每种剂量以评估毒性，且9只/性别用于毒代动力学，以及5只/性别用于恢复性。在每种剂量的给药之后，于6个时间点(从雄性或雌性中随机选择3只大鼠/时间点)确定毒代动力学。时间点为给药后5、30、60、120min、12hrs和24hrs。观察恢复动物14天，然后如上述研究评估器官重量和组织学。从毒代动力学研究来看，PK参数是通过包括Cmax、AUC和半衰期的非房室分析(NCA)确定的。在犬类中进行了相同的实验，但包括总共10只动物(3只/性别用于给药，以及2只/性别用于恢复)，并在与对于大鼠相同的时间点从每只动物抽取多次血液。使用犬类在NOAEL的AUC计算来自骨移植物/BP-氟喹诺酮缀合物的最大允许暴露，如目标2中所述，并使用犬类中的PK实验确定是否有超过此水平的1/100的全身暴露。
对于群体模型，BP药代动力学的独特的3-室(血/尿/骨)数学模型已经临床验证并应用于当前项目65。犬类研究中，在安乐死时，我们在每只动物中取样骨(颌骨和股骨)、肌腱(腓肠肌)用于测定BP和氟喹诺酮浓度。我们将这些数据与我们的模型结合来描述狗中的时间过程。根据此模型，我们可以用可替代的给药或重复的给药来模拟骨和软骨对BP和氟喹诺酮两者的预期暴露。这可以为后续的人类给药提供信息。在R的Pmetrics程序包(Laboratory of Applied Pharmacokinetics and Bioinformatics，Los Angeles，CA)内执行的自适应γ的非参数自适应网格(NPAG)算法被用于如先前所述的所有PK模型-拟合程序66-68。使用误差多项式作为测量浓度的函数来考虑分析误差(SD)，且比较性能评估使用Akaike's信息准则、观察到的对比预测的浓度的回归、PK参数-协变量回归的可视化图和简约性的规则来完成。
实施例8
可以将BP-Ab缀合物整合到移植物和移植装置中。在实施方式中，可以将一种或多种BP-Ab缀合物整合到已批准的骨移植产品中，诸如(Geistlich Pharma AG，瑞士)或(BioHorizons，Birmingham，AL)的牛骨材料，等等。BP-Ab缀合物可以与支撑材料混合作为牙科骨移植替代物使用。该产品将包括吸附在无机牛骨材料上的缀合物。这种材料将允许抗生素局部递送至骨移植物植入的区域，以降低细菌感染率和相关的牙科病理，诸如种植体周围炎和其他感染。我们的产品的牙科应用不仅可包括种植体周围炎治疗，还包括拔牙后的牙槽保护、嵴或窦提升、牙周炎预防或治疗、骨髓炎或骨坏死治疗或预防，或其他在其中这样的骨移植物有益的口腔和牙周手术应用。BP-氟喹诺酮缀合物材料将紧密地吸附在骨移植替代物上，且我们的初步数据示出了在感染情况下其被持续释放至骨破坏的区域，这允许我们的产品更有效地递送抗生素至感染的部位，同时对缀合化合物的任一组分的全身暴露为可忽略不计至没有。
该移植材料也可有益于非牙科移植术，诸如窦移植术。
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实施例9：
本实施例展示了各种BP缀合化合物和合成方案。BP-氨基甲酸酯-环丙沙星BP缀合物及合成方案在图16和相关描述中示出。BP-氨基甲酸酯-莫西沙星BP缀合物及合成方案在图38中示出。图39示出了BP-氨基甲酸酯-加替沙星BP缀合物及合成方案。图40示出了BP-p-羟苯基乙酸-环丙沙星BP缀合物及合成方案。图41示出了BP-OH-环丙沙星BP缀合物及合成方案。图42示出了BP-O-硫代氨基甲酸酯-环丙沙星BP缀合物及合成方案。图43示出了BP-S-硫代氨基甲酸酯-环丙沙星BP缀合物及合成方案。图44示出了BP-间苯二酚-环丙沙星BP缀合物及合成方案。图45示出了BP-对苯二酚-环丙沙星BP缀合物及合成方案。
图46示出了BP-氟喹诺酮缀合物的通式结构的一种实施方式，其中W可以是O或S或N，X可以是O、S、N、CH2O、CH2N或CH2S，Y可以是H、CH3、NO2、F、Cl、Br、I或CO2H，Z可以是H、CH3、OH、NH2、SH、F、Cl、Br或I，且n可以是1-5。图47示出了各种BP-氟喹诺酮缀合物。
图48示出了包含芳基基团的膦酸类的通式结构的一种实施方式，其中X可以是H、CH3、OH、NH2、SH、F、Cl、Br或I，Y可以是PO3H2或CO2H。Z可以是OH、NH2、SH或N3，且n可以是1或2。图49示出了各种BP，其中X可以是F、Cl、Br或I，且n可以是1或2。
图50示出了有末端伯胺的各种BP。图51示出了各种BP与包含末端羟基和胺官能团的接头偶联，其中R可以是利塞膦酸、唑来膦酸、米诺膦酸、帕米膦酸或阿仑膦酸。图52示出了各种BP-帕米膦酸-环丙沙星缀合物。图53示出了各种BP-阿仑膦酸-环丙沙星缀合物。
实施例10：
评估了硫代氨基甲酸酯BP缀合物(13)的抗微生物特性。
化合物13(O-硫代氨基甲酸酯BP缀合物)
化合物13也可以被称为1-环丙基-7-(4-((4-(2,2-二膦酰基乙基)苯氧基)硫羰基)哌嗪-1-基)-6-氟-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸。如下合成化合物13。将(2-(4-羟基苯基)乙烷-1,1-二基)双(膦酸)四异丙酯(0.10mmol)在水中乳化并在冰浴中冷却，同时剧烈搅拌。加入1,1’-硫羰基二咪唑(0.12mmol)并允许搅拌1小时。然后移除冰浴，并在室温下再继续搅拌1小时。然后，加入环丙沙星(0.12mmol)并在室温下搅拌反应过夜，同时用箔覆盖以避光。第二天，使用熔块漏斗过滤白色糊，并先用水然后用醚清洗固体。将固体收集并通过使用MeOH:CHCl3梯度的硅胶柱色谱进行纯化，以得到灰白色固体。将固体溶解在DCM中，并加入溴三甲基硅烷(BTMS)(4.00mmol)，并于35℃下在油浴中加热过夜。通过蒸发去除溶剂和BTMS，并加入MeOH，并允许在室温下搅拌30分钟。在旋转蒸发器上去除溶剂，并在冷冻的MeOH中沉淀产物。将悬浮液用熔块漏斗过滤，并用额外的MeOH清洗。收集固体并蒸发多余的溶剂以得到目标化合物。
图24示出了展示O-硫代氨基甲酸酯BP缀合物对浮游金黄色葡萄球菌菌株ATCC6538的MIC评估结果的图和图像：阴性对照＝培养基+微生物，没有缀合物处理；阳性对照＝无微生物的无菌培养基。
图25示出了展示硫代氨基甲酸酯缀合物对金黄色葡萄球菌菌株ATCC 6538在作为基底的聚苯乙烯上形成的生物膜的抗微生物活性或细菌负荷降低的评估结果的图：阴性对照＝微生物稀释液，没有缀合物处理；阳性对照＝无微生物的无菌稀释液。
图26示出了展示所测试的O-硫代氨基甲酸酯BP缀合物对金黄色葡萄球菌ATCC6538在作为基底的羟基磷灰石上预先形成的生物膜的抗微生物活性的评估结果的图；阴性对照＝无缀合物处理的微生物稀释液。(*p<0.05，Kruskal-Wallis测试；一式三份；比较物＝对照)。
图27示出了展示对使用O-硫代氨基甲酸酯BP缀合物处理的羟基磷灰石盘评估防止金黄色葡萄球菌ATCC 6538的生物膜形成的能力的研究结果的图；阴性对照＝无缀合物处理的微生物稀释液。(*p<0.05，Kruskal-Wallis测试；一式三份；比较物＝对照)。
图28示出了展示对使用O-硫代氨基甲酸酯BP缀合物处理的羟基磷灰石粉末评估防止金黄色葡萄球菌ATCC 6538的生物膜形成的能力的研究结果的图；阴性对照＝无缀合物处理的微生物稀释液。(*p<0.05，Kruskal-Wallis测试；一式三份；比较物＝对照)。
实施例11。
本实施例中描述的是额外的示例性BP-缀合物和它们的合成。
1-环丙基-7-(4-((4-(2,2-二膦酰基乙基)苯氧基)羰基)哌嗪-1-基)-6-氟-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(6)
将环丙沙星(0.12mmol)悬浮于水中，并使用Na2CO3将pH调整为8.5。在冰浴中冷却悬浮液，并逐滴加入溶解于THF的碳酸4-(2,2-双(二异丙氧基磷酰基)乙基)苯酯(4-硝基苯)酯(0.10mmol)。然后将反应混合物从冰浴中取出，避光并在室温下搅拌过夜。第二天，将反应混合物用水稀释并通过细玻璃熔块漏斗过滤。用水清洗留下的固体直到没有黄色残留。然后用DCM将固体溶解并从熔块漏斗中洗出。在使用MeOH:DCM梯度的硅胶柱上进一步纯化回收的粗产物。得到标题化合物为白色固体，将其溶解在DCM中，并加入溴三甲基硅烷(BTMS)(4.00mmol)，并于35℃下在油浴中加热过夜。通过蒸发去除溶剂和BTMS，并加入MeOH，并允许在室温下搅拌30分钟。在旋转蒸发器上去除溶剂，并在冷冻的MeOH中沉淀产物。将悬浮液用熔块漏斗过滤，并用额外的MeOH清洗。收集固体并蒸发去除多余的溶剂以得到目标化合物。
1-环丙基-6-氟-7-(4-((4-(2-羟基-2,2-二膦酰基乙基)苯氧基)羰基)哌嗪-1-基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(12)
将(1-羟基-2-(4-羟基苯基)乙烷-1,1-二基)双(膦酸)(0.10mmol)溶解在水中并在冰浴中冷却，同时剧烈搅拌。加入1,1’-羰基二咪唑(0.12mmol)并允许搅拌1小时。然后移除冰浴，并在室温下再继续搅拌1小时。然后，加入环丙沙星(0.12mmol)并在室温下搅拌反应过夜，同时用箔覆盖以避光。第二天，通过蒸发去除溶剂并加入MeOH沉淀产物。将悬浮液用熔块漏斗过滤，并用额外的MeOH清洗。收集固体并蒸发多余的溶剂以得到目标化合物。
1-环丙基-7-(4-((4-(2,2-二膦酰基乙基)苯氧基)硫羰基)哌嗪-1-基)-6-氟-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(13)
将(2-(4-羟基苯基)乙烷-1,1-二基)双(膦酸)四异丙酯(0.10mmol)在水中乳化并在冰浴中冷却，同时剧烈搅拌。加入1,1’-硫羰基二咪唑(0.12mmol)并允许搅拌1小时。然后移除冰浴，并在室温下再继续搅拌1小时。然后，加入环丙沙星(0.12mmol)并在室温下搅拌反应过夜，同时用箔覆盖以避光。第二天，使用熔块漏斗过滤白色糊，并先用水然后用醚清洗固体。将固体收集并通过使用MeOH:CHCl3梯度的硅胶柱色谱进行纯化，以得到灰白色固体。将固体溶解在DCM中，并加入溴三甲基硅烷(BTMS)(4.00mmol)，并于35℃下在油浴中加热过夜。通过蒸发去除溶剂和BTMS，并加入MeOH，并允许在室温下搅拌30分钟。在旋转蒸发器上去除溶剂，并在冷冻的MeOH中沉淀产物。将悬浮液用熔块漏斗过滤，并用额外的MeOH清洗。收集固体并蒸发多余的溶剂以得到目标化合物。
1-环丙基-6-氟-7-(4-((4-(2-羟基-2,2-二膦酰基乙基)苯氧基)硫羰基)哌嗪-1-基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(14)
将(1-羟基-2-(4-羟基苯基)乙烷-1,1-二基)双(膦酸)(0.10mmol)溶解在水中并在冰浴中冷却，同时剧烈搅拌。加入1,1’-硫羰基二咪唑(0.12mmol)并允许搅拌1小时。然后移除冰浴，并在室温下再继续搅拌1小时。然后，加入环丙沙星(0.12mmol)并在室温下搅拌反应过夜，同时用箔覆盖以避光。第二天，通过蒸发去除溶剂并加入MeOH沉淀产物。将悬浮液用熔块漏斗过滤，并用额外的MeOH清洗。收集固体并蒸发多余的溶剂以得到目标化合物。
1-环丙基-7-(4-(((4-(2,2-二膦酰基乙基)苯基)硫代)羰基)哌嗪-1-基)-6-氟-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(15)
在微波小瓶中，将化合物13悬浮于NMP并于290℃下在微波反应器中加热20分钟。将悬浮液过滤并用MeOH清洗以得到目标化合物。
1-环丙基-6-氟-7-(4-(((4-(2-羟基-2,2-二膦酰基乙基)苯基)硫代)羰基)哌嗪-1-基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(16)
在微波小瓶中，将化合物14悬浮于NMP并于290℃下在微波反应器中加热20分钟。将悬浮液过滤并用MeOH清洗以得到目标化合物。
1-环丙基-7-((4aR,7aR)-1-((4-(2,2-二膦酰基乙基)苯氧基)羰基)八氢-6H-吡咯并[3,4-b]吡啶-6-基)-6-氟-8-甲氧基-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(17)
根据关于化合物6所述的程序，用莫西沙星替换环丙沙星来合成化合物17。
1-环丙基-6-氟-7-((4aR,7aR)-1-((4-(2-羟基-2,2-二膦酰基乙基)苯氧基)羰基)八氢-6H-吡咯并[3,4-b]吡啶-6-基)-8-甲氧基-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(18)
根据关于化合物12所述的程序，用莫西沙星替换环丙沙星来合成化合物18。
1-环丙基-7-((4aR,7aR)-1-((4-(2,2-二膦酰基乙基)苯氧基)硫羰基)八氢-6H-吡咯并[3,4-b]吡啶-6-基)-6-氟-8-甲氧基-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(19)
根据关于化合物13所述的程序，用莫西沙星替换环丙沙星来合成化合物19。
1-环丙基-6-氟-7-((4aR,7aR)-1-((4-(2-羟基-2,2-二膦酰基乙基)苯氧基)硫羰基)八氢-6H-吡咯并[3,4-b]吡啶-6-基)-8-甲氧基-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(20)
根据关于化合物14所述的程序，用莫西沙星替换环丙沙星来合成化合物20。
1-环丙基-7-((4aR,7aR)-1-(((4-(2,2-二膦酰基乙基)苯基)硫代)羰基)八氢-6H-吡咯并[3,4-b]吡啶-6-基)-6-氟-8-甲氧基-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(21)
在微波小瓶中，将化合物19悬浮于NMP并于290℃下加热20分钟。将悬浮液过滤并用MeOH清洗以得到目标化合物。
1-环丙基-6-氟-7-((4aR,7aR)-1-(((4-(2-羟基-2,2-二膦酰基乙基)苯基)硫代)羰基)八氢-6H-吡咯并[3,4-b]吡啶-6-基)-8-甲氧基-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(22)
在微波小瓶中，将化合物20悬浮于NMP并于290℃下加热20分钟。将悬浮液过滤并用MeOH清洗以得到目标化合物。
1-环丙基-7-(4-((4-(2,2-二膦酰基乙基)苯氧基)羰基)-3-甲基哌嗪-1-基)-6-氟-8-甲氧基-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(23)
根据关于化合物6所述的程序，用加替沙星替换环丙沙星来合成化合物23。
1-环丙基-6-氟-7-(4-((4-(2-羟基-2,2-二膦酰基乙基)苯氧基)羰基)-3-甲基哌嗪-1-基)-8-甲氧基-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(24)
根据关于化合物12所述的程序，用加替沙星替换环丙沙星来合成化合物24。
1-环丙基-7-(4-((4-(2,2-二膦酰基乙基)苯氧基)硫羰基)-3-甲基哌嗪-1-基)-6-氟-8-甲氧基-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(25)
根据关于化合物13所述的程序，用加替沙星替换环丙沙星来合成化合物25。
1-环丙基-6-氟-7-(4-((4-(2-羟基-2,2-二膦酰基乙基)苯氧基)硫羰基)-3-甲基哌嗪-1-基)-8-甲氧基-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(26)
根据关于化合物14所述的程序，用加替沙星替换环丙沙星来合成化合物26。
1-环丙基-7-(4-(((4-(2,2-二膦酰基乙基)苯基)硫代)羰基)-3-甲基哌嗪-1-基)-6-氟-8-甲氧基-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(27)
在微波小瓶中，将化合物25悬浮于NMP并于290℃下加热20分钟。将悬浮液过滤并用MeOH清洗以得到目标化合物。
1-环丙基-6-氟-7-(4-(((4-(2-羟基-2,2-二膦酰基乙基)苯基)硫代)羰基)-3-甲基哌嗪-1-基)-8-甲氧基-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(28)
在微波小瓶中，将化合物26悬浮于NMP并于290℃下加热20分钟。将悬浮液过滤并用MeOH清洗以得到目标化合物。
7-(4-((4-(2,2-二膦酰基乙基)苯氧基)羰基)哌嗪-1-基)-1-乙基-6-氟-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(29)
根据关于化合物6所述的程序，用诺氟沙星替换环丙沙星来合成化合物29。
1-乙基-6-氟-7-(4-((4-(2-羟基-2,2-二膦酰基乙基)苯氧基)羰基)哌嗪-1-基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(30)
根据关于化合物12所述的程序，用诺氟沙星替换环丙沙星来合成化合物30。
7-(4-((4-(2,2-二膦酰基乙基)苯氧基)硫羰基)哌嗪-1-基)-1-乙基-6-氟-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(31)
根据关于化合物13所述的程序，用诺氟沙星替换环丙沙星来合成化合物31。
1-乙基-6-氟-7-(4-((4-(2-羟基-2,2-二膦酰基乙基)苯氧基)硫羰基)哌嗪-1-基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(32)
根据关于化合物14所述的程序，用诺氟沙星替换环丙沙星来合成化合物32。
7-(4-(((4-(2,2-二膦酰基乙基)苯基)硫代)羰基)哌嗪-1-基)-1-乙基-6-氟-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(33)
在微波小瓶中，将化合物31悬浮于NMP并于290℃下加热20分钟。将悬浮液过滤并用MeOH清洗以得到目标化合物。
1-乙基-6-氟-7-(4-(((4-(2-羟基-2,2-二膦酰基乙基)苯基)硫代)羰基)哌嗪-1-基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(34)
在微波小瓶中，将化合物32悬浮于NMP并于290℃下加热20分钟。将悬浮液过滤并用MeOH清洗以得到目标化合物。
1-环丙基-7-(4-(((4-(2,2-二膦酰基乙基)苯基)硫代)硫羰基)哌嗪-1-基)-6-氟-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(35)
1-环丙基-6-氟-7-(4-(((4-(2-羟基-2,2-二膦酰基乙基)苯基)硫代)硫羰基)哌嗪-1-基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(36)。

Claims (34)

1.一种根据式(6)的化合物
2.一种药物组合物，包括：
根据式(6)的化合物
药学上可接受的载体。
3.一种治疗有需要的受试者中的骨感染的方法，所述方法包括：
向所述有需要的受试者给药一定量的权利要求1所述的化合物或权利要求2所述的药物制剂。
4.一种化合物，包括：
双膦酸；和
喹诺酮化合物；
其中，所述喹诺酮化合物通过接头与所述双膦酸可释放地偶联。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中，所述双膦酸选自由以下组成的组：羟基苯基烷基或芳基双膦酸、羟基苯基(或芳基)烷基羟基双膦酸、氨基苯基(或芳基)烷基双膦酸、氨基苯基(或芳基)烷基羟基双膦酸、羟基烷基双膦酸、羟基烷基羟基双膦酸、羟基烷基苯基(或芳基)烷基双膦酸、羟基苯基(或芳基)烷基羟基双膦酸、氨基苯基(或芳基)烷基双膦酸、氨基苯基(或芳基)烷基羟基双膦酸、羟基烷基双膦酸、羟基烷基羟基双膦酸、羟基吡啶基烷基双膦酸、吡啶基烷基双膦酸、羟基咪唑基烷基双膦酸、咪唑基烷基双膦酸、依替膦酸、帕米膦酸、奈立膦酸、奥帕膦酸、阿仑膦酸、伊班膦酸、利塞膦酸、唑来膦酸、米诺膦酸和其组合，其中所有所述化合物是任选地进一步取代的或未取代的。
6.根据权利要求4-5中任一项所述的化合物，其中，所述喹诺酮化合物是氟喹诺酮。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的化合物，其中，所述喹诺酮化合物选自由以下组成的组：阿拉曲沙星、氨氟沙星、巴洛沙星、贝西沙星、卡达唑胺、环丙沙星、克林沙星、达氟沙星、德拉沙星、二氟沙星、依诺沙星、恩诺沙星、非那沙星、氟罗沙星、氟甲喹、加替沙星、吉米沙星、格帕沙星、依巴沙星、JNJ-Q2、左氧氟沙星、洛美沙星、马波沙星、莫西沙星、那氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、奥比沙星、帕珠沙星、培氟沙星、普拉沙星、普卢利沙星、芦氟沙星、沙氟沙星、西他沙星、司帕沙星、替马沙星、妥舒沙星、曲伐沙星、扎博沙星、奈诺沙星和其组合。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的化合物，其中，所述喹诺酮化合物具有根据式A的结构，
其中，R1是选自由以下组成的组的一种或多种取代基：烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、苯基、取代的苯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤素、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基、芳氧基、取代的芳氧基、烷硫基、取代的烷硫基、苯硫基、取代的苯硫基、芳硫基、取代的芳硫基、氰基、异氰基、取代的异氰基、羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰氨基、取代的酰氨基、磺酰基、取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、取代的磷酰基、膦酰基、取代的膦酰基、聚芳基、取代的聚芳基、C3-C20环、取代的C3-C20环、杂环、取代的杂环、氨基酸、肽和多肽基团，
其中，R2选自由以下组成的组：烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、苯基、取代的苯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤素、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基、芳氧基、取代的芳氧基、烷硫基、取代的烷硫基、苯硫基、取代的苯硫基、芳硫基、取代的芳硫基、氰基、异氰基、取代的异氰基、羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰氨基、取代的酰氨基、磺酰基、取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、取代的磷酰基、膦酰基、取代的膦酰基、聚芳基、取代的聚芳基、C3-C20环、取代的C3-C20环、杂环、取代的杂环、氨基酸、肽和多肽基团，
其中，R3选自由以下组成的组：烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、苯基、取代的苯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤素、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基、芳氧基、取代的芳氧基、烷硫基、取代的烷硫基、苯硫基、取代的苯硫基、芳硫基、取代的芳硫基、氰基、异氰基、取代的异氰基、羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰氨基、取代的酰氨基、磺酰基、取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、取代的磷酰基、膦酰基、取代的膦酰基、聚芳基、取代的聚芳基、C3-C20环、取代的C3-C20环、杂环、取代的杂环、氨基酸、肽和多肽基团，并且
其中，R4选自由以下组成的组：烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、苯基、取代的苯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤素、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基、芳氧基、取代的芳氧基、烷硫基、取代的烷硫基、苯硫基、取代的苯硫基、芳硫基、取代的芳硫基、氰基、异氰基、取代的异氰基、羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰氨基、取代的酰氨基、磺酰基、取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、取代的磷酰基、膦酰基、取代的膦酰基、聚芳基、取代的聚芳基、C3-C20环、取代的C3-C20环、杂环、取代的杂环、氨基酸、肽和多肽基团。
9.根据权利要求4-8中任一项所述的化合物，其中，所述接头是氨基甲酸酯接头。
10.根据权利要求4-9中任一项所述的化合物，其中，所述接头是氨基甲酸芳酯接头。
11.根据权利要求4-10中任一项所述的化合物，其中，所述接头是硫代氨基甲酸-O-芳酯接头。
12.根据权利要求4-10中任一项所述的化合物，其中，所述接头是硫代氨基甲酸-S-芳酯接头。
13.根据权利要求4-10中任一项所述的化合物，其中，所述接头是氨基甲酸苯酯接头。
14.根据权利要求4-10中任一项所述的化合物，其中，所述接头是硫代氨基甲酸酯接头。
15.根据权利要求4-10和14中任一项所述的化合物，其中，所述接头是O-硫代氨基甲酸酯接头。
16.根据权利要求4-10和14中任一项所述的化合物，其中，所述接头是S-硫代氨基甲酸酯接头。
17.根据权利要求4-16中任一项所述的化合物，其中，所述接头连接到式A的所述R1基团。
18.根据权利要求4-17中任一项所述的化合物，其中，所述乙叉基双膦酸的α位置被羟基、氟、氯、溴或碘取代。
19.根据权利要求4-18中任一项所述的化合物，其中，所述双膦酸包括对羟基苯基乙叉基基团或其衍生物。
20.根据权利要求4-19中任一项所述的化合物，其中，所述乙叉基双膦酸在所述α位置不包含α-羟基。
21.根据权利要求4所述的化合物，其中，所述化合物具有根据式(12)的式：
22.根据权利要求4所述的化合物，其中，所述化合物具有根据式(13)的式，
23.根据权利要求4所述的化合物，其中，所述化合物具有根据式(15)的式，
24.一种药物制剂，包括：
一定量的如权利要求4-23中任一项所述的化合物；和
药学上可接受的载体。
25.根据权利要求24所述的药物制剂，其中，所述化合物的所述量是杀灭或抑制细菌的有效量。
26.根据权利要求24-25中任一项所述的药物制剂，其中，所述化合物的所述量是治疗或预防骨髓炎、骨坏死、种植体周围炎和牙周炎的有效量。
27.一种治疗有需要的受试者中的骨髓炎的方法，所述方法包括：
向有需要的受试者给药一定量的如权利要求1和4-23中任一项所述的化合物或如权利要求2和24-26中任一项所述的药物制剂。
28.一种治疗有需要的受试者中的种植体周围炎或牙周炎的方法，所述方法包括：向有需要的受试者给药一定量的如权利要求1和4-23中任一项所述的化合物或如权利要求2和24-26中任一项所述的药物制剂。
29.一种治疗有需要的受试者中的糖尿病足的方法，所述方法包括：向有需要的受试者给药一定量的如权利要求1和4-23中任一项所述的化合物或如权利要求2和24-26中任一项所述的药物制剂。
30.一种骨移植组合物，包括:
骨移植材料和如权利要求1和4-23中任一项所述的化合物或如权利要求2或24-26中任一项所述的药物制剂，其中，所述化合物或药物制剂与所述骨移植材料相附连、结合、化学吸附或混合。
31.根据权利要求30所述的骨移植组合物，其中，所述骨移植材料是自体移植骨材料、同种异体移植骨材料、异种移植骨材料、合成骨移植材料或其任意组合。
32.一种方法，包括：
将权利要求30-31中任一项所述的骨移植组合物植入有需要的受试者中。
33.一种预防在骨或植入手术部位或在进行骨移植的手术部位的生物膜感染的方法，其中所述方法包括：
向有需要的受试者给药如权利要求1和4-23中任一项所述的化合物或如权利要求2和24-26中任一项所述的药物制剂。
34.一种预防在骨或植入手术部位或在进行骨移植的手术部位的生物膜感染的方法，其中所述方法包括：
将如权利要求30-31中任一项所述的骨移植组合物植入到有需要的受试者中。
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