CN110108678A - 一种荧光纳米标准板及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药与先进制造技术领域，具体涉及一种荧光纳米标准板及其制备和应用。所述荧光纳米标准板包括纳米标尺结构和流动池，所述流动池包括流动腔，所述流动腔设于所述纳米标尺结构上，将流动池和纳米标尺结构结合，不仅实现纳米标尺结构的荧光发光，还通过流动池实现多种荧光物质的快速更换，其纳米标尺结构可重复使用，使用时操作简单，快速，灵活度高，所述荧光纳米标准板的制备方法包括制备荧光标尺结构和制备流动池，流动池的制备方法包括分步制备或整体制备，制备方法简单，精度高，形成的荧光纳米标准板密封性好，使用快捷迅速，本发明所述荧光纳米标准板在荧光分析领域具有很好地应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及超高分辨率荧光显微成像技术领域，具体涉及一种荧光纳米标准板及其制备和应用。
背景技术
荧光显微成像技术在生命科学领域的研究中具有重要作用，能在亚细胞水平研究细胞内的生命过程与机理，然而，由于传统光学中阿贝衍射极限的限制，其成像分辨率无法突破200nm以下。随着超高分辨荧光显微技术的兴起，如光敏定位显微技术(PALM)、荧光光敏定位显微技术(FPALM)、随机光学重建显微技术(STORM)等、受激发射损耗显微技术(STED)、结构光照明显微技术(SIM)和单分子定位显微成像技术等，这些技术使荧光显微镜可以观察到20nm至100nm的极微细结构。
随着超高分辨荧光显微技术的不断进步和商业化推广，越来越多的大学、研究所和公司开始自主研发或直接购买超高分辨荧光显微仪器用于生命科学研究。在仪器日常使用和维护过程中，经常需要对荧光显微镜的分辨率进行标定测量，因此需要使用具有确定尺寸的荧光标准结构。对此，中国专利文献CN103712965A首先提出了一种基于纳米沟槽填充荧光量子点的等间距式荧光纳米标准板；中国专利文献CN103954600A提出了一种基于金属纳米沟槽(Al、Au、Ag、Au)内填充荧光染料的宽线条窄间隔式荧光纳米标尺结构。上述专利文献都还存在一个共性问题，即荧光物质是以旋涂、填充或表面修饰的形式形成荧光纳米线条，荧光物质是固定的，虽然可以二次使用，但是需要重新去除原有荧光物质，然后再次旋涂、填充或者表面修饰，其操作复杂、费时、灵活度低，不适合于多种荧光物质的快速更换。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的荧光纳米标尺上的荧光物质固定，二次使用操作复杂、灵活度低的缺陷，从而公开一种荧光纳米标准板及所述荧光纳米标准板的制备方法和应用。
为此，本发明公开了一种荧光纳米标准板，包括纳米标尺结构和流动池，所述流动池包括流动腔，所述流动腔设于所述纳米标尺结构具有纳米线条结构的一面，所述流动腔与所述纳米线条结构相接。
优选的，所述纳米线条结构为纳米沟槽。
优选的，所述纳米标尺结构包括纳米沟槽掩模结构和承载纳米沟槽掩模结构的基底。
优选的，所述纳米沟槽掩模结构包括纳米沟槽，所述纳米沟槽的线条形式为单线条、等间距线条或宽线条窄间隔，所述纳米沟槽的横截面宽度为10-200nm。
优选的，所述流动池还包括流动池间隔层，设于流动腔的四周，形成流动腔的侧壁。优选的，所述流动池间隔层的高度为0.05-5mm。
优选的，所述流动池间隔层的材料为SU-8、PDMS或橡胶垫片。
优选的，所述纳米标尺结构和所述流动池间隔层为一体结构单独使用。
优选的，所述流动池还包括流动池上盖，所述流动池上盖的材料为高透光材料，采用PDMS、PMMA、PC、PS或石英玻璃基片。
优选的，所述流动池上盖还包括进液口、出液口、进液管路、出液管路、连接进液口和进液管路或连接出液口和出液管路的管路接头。
优选的，所述流动池上盖和所述流动池间隔层呈一体结构组合件。
优选的，所述荧光纳米标准板还包括夹具，用于固定所述纳米标尺结构和所述流动池的组合体。优选的，所述夹具材料为金属或者硬质聚合物。
本发明还公开了一种所述荧光纳米标准板的制备方法，包括制备纳米标尺结构步骤和制备流动池步骤。
优选的，所述制备流动池步骤包括以下操作：
S1在纳米标尺结构上制备流动池间隔层；
S2制备流动池上盖，安装管路接头、进液管路和出液管路；
S3将步骤S1中的纳米标尺结构和所述流动池上盖组合形成带有流动池的组合件。
优选的，所述制备流动池步骤包括以下操作：
S1采用机械加工制备流动池上盖和流动池间隔层的整体模具，浇入材质液体整体成型；
S2在流动池上盖上安装管路接头、进液管路和出液管路，形成流动池组件；
S3将纳米标尺结构和流动池组件整体组合形成带有流动池的组合件。
优选的，还包括夹具固定步骤，将带有流动池的组合件放入夹具内压紧。
本发明还公开了一种所述的荧光纳米标准板或者所述荧光纳米标准板制备方法制备的荧光纳米标准板在显微荧光分析领域的应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明所述的荧光纳米标准板，包括纳米标尺结构和流动池，所述流动池包括流动腔，所述流动腔设于所述纳米标尺结构上，将流动池和纳米标尺结构相结合，不仅能实现纳米标尺结构的荧光发光，还可通过流动池实现多种荧光物质的快速更换，所述纳米标尺结构可重复使用，实际使用时操作简单，快速，灵活度高。
2.本发明所述的荧光纳米标准板，所述纳米标尺结构包括纳米沟槽掩模结构和承载纳米沟槽掩模结构的基底，基底高透光；所述纳米沟槽掩模结构用于屏蔽纳米沟槽以外区域的荧光干扰，纳米沟槽掩模结构产生的荧光线条清晰，对比明显；所述基底和所述纳米沟槽掩模结构形成独立的荧光纳米标尺部件，作为一体结构，一方面易于制备，另一方面，可作为独立的部件便于更换；所述纳米沟槽的线条形式为单线条、等间距线条或宽线条窄间隔，本发明所述荧光纳米标准板的使用不受荧光线条形式的限制，灵活性好。
3.本发明所述荧光纳米标准板所述流动池还包括流动池间隔层，设于所述流动池上盖和所述纳米沟槽掩模结构之间，流动腔的四周，所述流动池间隔层的高度为0.05-5mm，可用于调节流动池的高度；所述流动池间隔层的材料为SU-8、PDMS或橡胶垫片，稳定性好和密封性好，不容易与荧光物质液体等发生反应；所述流动池间隔层可以和流动池上盖呈一体结构，便于制备，也提高密封效果，使用便捷快速。
4.本发明所述的荧光纳米标准板，所述流动池包括透光或不透光的上盖，便于在不同结构的荧光显微镜下使用，所述流动池上盖还包括进样口、出液口、进液管路、出液管路和液体接头，用于更换液体，实现原位操作。
5.本发明所述的荧光纳米标准板还包括夹具，所述夹具材料为金属或者硬质聚合物，将基底、纳米沟槽掩模结构和流动池的组合体固定，稳定流动腔的结构，提高密封性。
6.本发明所述荧光纳米标准板的制备方法包括制备荧光标尺结构和制备流动池步骤，采用光刻(X射线、电子束、离子束、紫外光等)的方式制备纳米沟槽掩模结构，具有较高的精度，流动池的制备方法包括分步制备和整体制备，制备方法简单，精度高，形成的荧光纳米标准板密封性好，使用快捷迅速。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1所述荧光纳米标准板的截面图；
图2为本发明实施例1所述荧光纳米标尺部件的结构示意图；
图3为本发明实施例1所述荧光纳米标准板的制备流程图；
图4为本发明实施例2所述荧光纳米标准板的截面图；
图5为本发明实施例2所述荧光纳米标尺部件的结构示意图；
图6为本发明实施例2所述荧光纳米标准板的制备流程图；
附图标记说明：
1-纳米标尺结构；11-基底；12-纳米沟槽掩模结构；121-纳米沟槽；122-导电层；2-流动腔；3-流动池间隔层；4-流动池上盖；41-进液口；42-进液管路；43-出液口；44-出液管路；45-管路接头；5-夹具。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
本实施例提供了一种荧光纳米标准板的具体实施方式。
一种荧光纳米标准板，如图1所示，包括纳米标尺结构1和流动池，所述流动池包括流动腔2，所述流动腔2设于所述纳米标尺结构1具有纳米线条结构的一面，所述流动腔2与所述纳米线条结构相接。将流动池和纳米标尺结构1相结合，不仅能实现纳米标尺结构1的荧光发光，还可通过流动池实现多种荧光物质的快速更换；在另一些实施例中，所述流动池可以为开口流动池、封闭流动池或微流道流动池，所述纳米标尺结构1能重复使用，实际使用时操作简单，快速，高效，灵活度高，测试结果精确。
在本实施例中，所述纳米线条结构为纳米沟槽，如图2所示，所述纳米标尺结构1包括纳米沟槽掩模结构12和承载纳米沟槽掩模结构的基底11，所述基底11透明，所述纳米沟槽掩模结构12用于屏蔽纳米沟槽以外区域的荧光干扰，纳米沟槽掩模结构12产生的荧光线条清晰，对比明显。
所述基底11和所述纳米沟槽掩模结构12形成独立的荧光纳米标尺部件，如图2所示；将所述基底11和纳米沟槽掩模结构12作为一体结构，一方面易于制备，另一方面，可作为独立的部件便于更换。
所述纳米沟槽掩模结构12包括纳米沟槽121，在使用时，所述流动腔2内的荧光物质进入所述纳米沟槽121内，产生荧光线条。所述纳米沟槽121的线条形式为等间距线条，所述纳米沟槽121的尺寸为100nm；在另一些实施例中所述纳米沟槽121的线条形式也可以是单线条或者宽线条窄间隔，宽荧光线条窄间隔的纳米沟槽掩模结构可以作为荧光显微镜的一般调试观察，而等间距荧光线条的纳米沟槽掩模结构精确性高，作为尺寸标准，所述纳米沟槽的尺寸为10nm，50nm，120nm，150nm，180nm或200nm，本发明所述荧光纳米标准板流动池的使用不受荧光线条形式的限制，灵活性好。
所述流动池还包括流动池间隔层3，设于流动腔2的四周，组成流动腔2的侧壁，所述流动池间隔层3的高度为5mm，在另一些实施例中可根据需要调整流动池间隔层的高度为0.05-5mm，在实际使用时更换不同高度的流动式间隔层，用于调节流动腔的高度和体积。
所述流动池间隔层3的材料为SU-8；在另一些实施例中为PDMS或橡胶垫片，这些材料呈化学惰性，具有弹性性质使得流动腔2具有良好的密封性，为了增加流动池应用的广泛性，所述纳米标尺结构和所述流动池间隔层可以为一体结构单独使用，构成开放式流动池。
所述荧光纳米标准板的流动池还包括流动池上盖4，所述流动池上盖4的材料为透明的塑料PC；在另一些实施例中，所述流动池上盖4的材料采用PDMS、PMMA或玻璃基片，为了便于在不同结构的荧光显微镜下使用，所述流动池上盖4的材料也可以为不透明的塑料PP。
所述流动池上盖4还包括进液口41、出液口43、进液管路42、出液管路44、连接进液口41和进液管路42或连接出液口43和出液管路44的管路接头45，用于更换液体，实现更换荧光物质的原位操作。
在另一些实施例中，为了简化安装操作过程，使得检测过程快速高效，所述流动池上盖4和流动池间隔层3呈一体结构组合件，或者，所述流动池上盖4、流动池间隔层3、进液管路42、出液管路44和管路接头45呈一体结构组合件。
所述荧光纳米标准板还包括夹具5，固定所述纳米标尺结构1和所述流动池组件，所述夹具5材料为金属，稳定流动腔的结构，提高密封性能，在一些实施例中，所述夹具5的材料也可以为硬质塑料。
本实施例所述荧光纳米标准板的制备方法包括以下步骤：
制备纳米标尺结构步骤：将厚度为0.17mm的盖玻片依次用分析纯的丙酮、乙醇、去离子水各超声5分钟，超声功率为100W，超声频率为40KHz然后用100W的氧等离子体处理5分钟；以质量分数为6％的HSQ胶在2000rpm/min在盖玻片上涂胶40秒，得到200nm厚的HSQ胶膜，放在80℃热板烘烤30秒，得到粘附力适中的HSQ胶层；将导电聚合物Espacer 300Z(主要成分：聚噻吩)以3000rpm/min的转速下旋涂30秒，然后放到80℃的热板上烘烤1分钟，得到导电层；采用电压为100kV的电子束进行光刻，用含有质量分数为1％的NaOH和质量分数为4％的NaCl混合液显影1分钟，然后用去离子水和IPA(分析纯)冲洗30秒；以0.2nm/s的速度沉积80nm的Cr作为掩模层；将样品浸入到质量分数为1％HF水溶液中处理20秒，将HSQ胶层结构腐蚀去除，得到荧光纳米标尺部件，如图2所示。
间隔层显影成型：如图3所示，在上述纳米沟槽掩模结构12上旋涂或者刮涂1毫米厚的SU-8胶作为光刻胶，然后在80℃的热板或者烘箱中加热10小时，采用254nm紫外光进行曝光5min，其纳米沟槽掩模结构12中有纳米沟槽121的区域不被曝光，其它区域则全部曝光；在另一些实施例中光刻胶可以选用PDMS，所述SU-8胶或PDMS的厚度可以是100μm、300μm、500μm或800μm，加热方式可以选择60℃烘箱或60-80℃的热板，加热时间可以为1h，3h，5h，7h，9h或12h；所述流动池间隔层还可以选择橡胶垫片。
上盖制备：选择尺寸与基底11尺寸一致的流动池上盖4，上盖材料为透明PC材料；将流动池上盖4进行打孔，形成进液口41和出液口43，在流动池上盖4上表面进液口41和出液口43处分别胶合有管路接头45，并将进液管路42与出液管路44插入管路接头45；在另一些实施例中，所述流动池上盖采用PDMS、PMMA、PP等聚合物材料，或者为具有一定强度的玻璃基片，为了方便不同类型的荧光显微镜进行观察，所述流动池上盖也可以为不透明的塑料。
组合：将带有SU-8流动池间隔层3的纳米标尺结构1与组装好的流动池上盖4对齐，形成带有流动池的组合件。
夹具固定步骤：将上述组合件放入夹具内并压紧，得到带有流动池的荧光纳米标准板。
实施例2
本实施例提供了一种荧光纳米标准板的具体实施方式。
一种荧光纳米标准板，如图4所示，包括纳米标尺结构1和流动池，所述流动池包括流动腔2，所述流动腔2设于所述纳米标尺结构1具有纳米线条结构的一面，所述流动腔2与所述纳米线条结构相接。
所述纳米标尺结构1包括纳米沟槽掩模结构12和承载纳米沟槽掩模结构基底11，基底11透明。
所述基底11和所述纳米沟槽掩模结构12形成独立的荧光纳米标尺部件，如图5所示。
所述纳米沟槽掩模结构12包括纳米沟槽121，所述纳米沟槽121的线条形式为宽线条窄间隔，所述纳米沟槽121的尺寸为200nm。
所述流动池还包括流动池间隔层3，设于流动腔2的四周，组成流动腔2的侧壁，所述流动池间隔层3的高度为3mm。
所述流动池间隔层3的材料为PDMS。
所述荧光纳米标准板的流动池还包括流动池上盖4，所述流动池上盖4的材料为透明的PP，所述流动池上盖和流动池间隔层呈一体结构组合件。
所述流动池上盖4还包括进液口41、出液口43、进液管路42、出液管路44、连接进液口41和进液管路42或连接出液口43和出液管路44的管路接头45。
所述荧光纳米标准板还包括夹具5，固定所述纳米标尺结构1和所述流动池的组合体，所述夹具5材料为硬质聚合物。
本实施例所述的荧光纳米标准板的制备方法包括以下步骤：
制备纳米标尺结构步骤：在清洗干净的玻璃片表面用磁控溅射的方式镀一层120nm厚的金属铝膜，再在铝膜上镀一层60nm厚的Si3N4作为抗刻蚀掩模层，进一步在Si3N4的表面用每分钟4000转的转速旋涂一层90nm厚的ZEP520光刻胶，把镀膜并旋涂光刻胶的样品安装到电子束曝光平台(Raith150-Two)上，按照预设定的图样曝光并用体积比为1:1的MIBK和IPA混合液进行显影，曝光区域的光刻胶经显影后被溶掉，未曝光区域的光刻胶作为掩模保留下来。经等离子体刻蚀机(Oxford Plasmalab 80Plus)两次用不同的气体刻蚀得到纳米沟槽掩模结构，其中第一次刻蚀采用SF6，CHF3和O2的混合气体把没有光刻胶的保护的Si3N4膜刻蚀掉，而第二次刻蚀则可采用Cl2、BCl3和N2的混合气体把没有Si3N4膜保护的铝膜去掉。
流动池上盖整体成型：采用机械加工制备上盖整体模具，浇入PDMS液体，待液体流平后放入80℃的烘箱2h，放入烘箱的时间也可以为1h，然后将PDMS从模具中脱出。
安装管路接头：将插有进液管路和出液管路的管路接头与PDMS流动池上盖进液口处和出液口处用PDMS进行胶合。
组合：将流动池上盖与纳米标尺结构对齐压紧形成组合件。
夹具固定步骤：将以上组合件放入夹具内压紧，得到密封的带有流动池的荧光纳米标准板。
实施例3
本实施例提供了一种荧光纳米标准板的具体使用方式。
一种带流动池的荧光纳米标准板，如图1所示，将其置于倒置荧光显微镜工作平台上固定，并进行调焦。将商品化荧光素FITC溶解于乙醇或者乙醇与水的混合液，并将其吸入注射器内。将含有荧光素的注射器与进液管路42连接，并采用手动或者注射泵进行注射并充满流动腔体3；
更换荧光素的方法是，先用大量乙醇或乙醇与水的混合液对流动腔进行冲洗，再通入另外一种荧光素溶液。如要更换第三种荧光素，步骤与以上相同。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (16)
1.一种荧光纳米标准板，其特征在于，包括纳米标尺结构(1)和流动池，所述流动池包括流动腔(2)，所述流动腔(2)设于所述纳米标尺结构(1)具有纳米线条结构的一面，所述流动腔(2)与所述纳米线条结构相接。
2.根据权利要求1所述的荧光纳米标准板，其特征在于，所述纳米线条结构为纳米沟槽(121)。
3.根据权利要求1或2所述的荧光纳米标准板，其特征在于，所述纳米标尺结构(1)包括纳米沟槽掩模结构(12)和承载纳米沟槽掩模结构(12)的基底(11)。
4.根据权利要求2或3所述的荧光纳米标准板，其特征在于，所述纳米沟槽掩模结构(12)包括纳米沟槽(121)，所述纳米沟槽(121)的线条形式为单线条、等间距线条或宽线条窄间隔，所述纳米沟槽(121)的横截面宽度为10-200nm。
5.根据权利要求1-4任一项所述的荧光纳米标准板，其特征在于，所述流动池还包括流动池间隔层(3)，设于流动腔(2)的四周，形成流动腔(2)的侧壁。优选的，所述流动池间隔层(3)的高度为0.05-5mm。
6.根据权利要求5所述的荧光纳米标准板，其特征在于，所述流动池间隔层(3)的材料为SU-8、PDMS或橡胶垫片。
7.根据权利要求5或6所述的荧光纳米标准板，其特征在于，所述纳米标尺结构(1)和所述流动池间隔层(3)为一体结构单独使用。
8.根据权利要求1-7任一项所述的荧光纳米标准板，其特征在于，所述流动池还包括流动池上盖(4)，所述流动池上盖(4)的材料为高透光材料，采用PDMS、PMMA、PC、PS或石英玻璃基片。
9.根据权利要求8所述的荧光纳米标准板，其特征在于，所述流动池上盖(4)还包括进液口(41)、出液口(43)、进液管路(42)、出液管路(44)、连接进液口(41)和进液管路(42)或连接出液口(43)和出液管路(44)的管路接头(45)。
10.根据权利要求5-9任一项所述的荧光纳米标准板，其特征在于，所述流动池上盖(4)和所述流动池间隔层(3)呈一体结构组合件。
11.根据权利要求1-10任一项所述的荧光纳米标准板，其特征在于，所述荧光纳米标准板还包括夹具(5)，用于固定所述纳米标尺结构(1)和所述流动池的组合体。优选的，所述夹具(5)材料为金属或者硬质聚合物。
12.一种权利要求1-11任一项所述荧光纳米标准板的制备方法，其特征在于，包括制备纳米标尺结构步骤和制备流动池步骤。
13.根据权利要求12所述的荧光纳米标准板的制备方法，其特征在于，所述制备流动池步骤包括以下操作：
S1在纳米标尺结构上制备流动池间隔层；
S2制备流动池上盖，安装管路接头、进液管路和出液管路；
S3将步骤S1中的纳米标尺结构和所述流动池上盖组合形成带有流动池的组合件。
14.根据权利要求12所述的荧光纳米标准板的制备方法，其特征在于，所述制备流动池步骤包括以下操作：
S1采用机械加工制备流动池上盖和流动池间隔层的整体模具，浇入材质液体整体成型；
S2在流动池上盖上安装管路接头、进液管路和出液管路，形成流动池组件；
S3将纳米标尺结构和流动池组件整体组合形成带有流动池的组合件。
15.根据权利要求12-14任一项所述的荧光纳米标准板的制备方法，其特征在于，还包括夹具固定步骤，将带有流动池的组合件放入夹具内压紧。
16.一种权利要求1-11所述的荧光纳米标准板或者权利要求12-15所述荧光纳米标准板制备方法制备的荧光纳米标准板在显微荧光分析领域的应用。
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