CN110088286A - 用于细胞内递送物质的装置、系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及配置成可拆卸地联接到流体挤出装置的附件，所述附件包括：具有多个孔的膜，所述孔配置成允许细胞通过同时所述孔对细胞引发机械应力，使得促进向所述细胞中引入一种或多种物质；接合构件，所述接合构件用于联接到流体挤出装置的出口，使得所述膜与流体挤出装置的出口流体连通，其中流体挤出装置配置成通过机械致动挤出流体。流体挤出装置可以包括移液管、微量移液管、滴定管、注射器或液体处理系统。所述膜的孔优选通过膜是线性的，并且其平均孔径是细胞平均直径的40％‑70％。本发明还包括将物质引入细胞中的方法、流体挤出装置及其系统。
Description
技术领域
本公开广泛涉及用于细胞内递送的装置、系统和方法。
背景技术
用于生物制剂的研究和商业生产的细胞经常被改造为赋予它们新的功能，这些功能可以用于理解基础生物学或产生治疗或商业目的的分子。改造细胞内的任何物质所需的最关键的过程之一是使诸如DNA(脱氧核糖核酸)质粒和蛋白的大分子进入细胞中的能力。
细胞递送技术在过去的几十年中已经发展成为一个巨大的行业，并且预计到2020年仅用于研究的DNA/RNA(核糖核酸)递送的市场价值将超过9亿美元。利用两亲聚合物/分子和电穿孔的技术已经主导了细胞递送行业，特别是对于动物、昆虫和植物细胞而言。这些方法对于大量细胞类型是有效的，并且存在一系列经稍微修饰以针对一种细胞类型或另一种细胞类型进行优化的产品。还有使用病毒载体来递送核酸的其他方法。
与任何技术一样，这些方法也存在局限性。两亲性聚合物/分子在高剂量下是有毒的，可能是昂贵的，并且经常需要冷藏。对于某些敏感的细胞类型，也可以在低得多的剂量下观察到毒性。电穿孔需要离子强度非常低的缓冲液，因此与细胞培养不相容。一次性使用的筒(cartridge)也非常昂贵,并且本质上是低通量的。而且，购买电穿孔器很昂贵。病毒非常有效，但只能递送核酸，而且生产繁琐且昂贵。每种递送系统的功效进一步受到细胞的限制。
已经开发了使用微流体装置的方法，以通过细胞变形和剪切应力将核酸、蛋白、染料和小分子加载到细胞中。然而，微流体装置制造通常是非常耗时且昂贵的过程。这种系统的操作还需要专用仪器。当然不清楚如何将这种系统小型化和简化以与常用的实验室装备和工作流程集成。
具有与细胞直径相似的尺寸或小于细胞直径的孔的膜理论上可以用于通过细胞变形和剪切应力将核酸、蛋白、染料和小分子加载到细胞中。然而，通常用于细胞培养应用的化学交联过滤器具有截留高于所需孔径的颗粒并且不适于引发机械剪切的曲折路径。由于每个过滤器中的孔径分布很大，因此细胞也优先通过最大的孔离开，从而限制了所引起的机械剪切的程度。
因此，需要寻求解决上述问题中的一个或多个的用于细胞内递送的装置、系统和方法。
发明概述
根据一个方面，提供了配置成可拆卸地联接到流体挤出装置的附件，所述附件包括：具有多个孔的膜，所述孔配置成允许细胞通过同时所述孔对细胞引发机械应力，从而促进向细胞中引入一种或多种物质；接合构件，用于联接到流体挤出装置的出口，使得所述膜与流体挤出装置的出口流体连通，其中流体挤出装置配置成通过机械致动挤出流体。
用于联接到流体挤出装置的出口的接合构件可以在联接到流体挤出装置的出口时形成基本上气密的密封。
接合构件可以包括用于接合流体挤出装置出口的圆周的柔韧材料。
接合构件可以配置成经由鲁尔锁配合(luer lock fitting)联接到流体挤出装置的出口。
流体挤出装置可以选自移液管、手动微量移液管、电动微量移液管、滴定管、注射器、自动/半自动液体处理系统和液体处理机器人。
多个孔可以限定通过膜的基本上线性的路径。
多个孔的孔尺寸遍及所述多个孔可以基本上是均匀的。
孔尺寸可以是以下中的至少一种：平均直径、平均横截面积和通过膜的平均路径长度。
多个孔的平均孔径可以是细胞平均直径的40％至70％。
附件可以进一步包括：具有孔的过滤器，所述孔的平均直径大于膜的孔的平均直径，用于降低细胞团块或细胞聚集体到达膜的发生率。
附件还可以包括将膜保持在基本固定的位置的保持环。
附件还可以包括一个或多个阀，所述阀邻近膜设置，以便促进细胞和一种或多种物质沿单一方向移动通过多个孔。
根据另一个方面，提供了用于将一种或多种物质引入细胞中的方法，所述方法包括：将流体挤出装置的出口可拆卸地联接到附件的接合构件，所述附件包括具有多个孔的膜，从而流体挤出装置与膜流体连通；使一种或多种物质和细胞通过多个孔，以通过对细胞引发机械应力促进向所述细胞中引入一种或多种物质，其中流体挤出装置配置成通过机械致动挤出流体。
所述方法还可以包括，当接合构件联接到流体挤出装置的出口时形成基本上气密的密封。
接合构件可以包括用于接合流体挤出装置出口的圆周的柔韧材料。
将流体挤出装置的出口可拆卸地联接到附件的接合构件的步骤可以包括通过鲁尔锁配合联接。
流体挤出装置可以选自移液管、手动微量移液管、电动微量移液管、滴定管、注射器、自动/半自动液体处理系统和液体处理机器人。
多个孔可以限定通过膜的基本上线性的路径。
多个孔的孔尺寸遍及所述多个孔可以是基本上均匀的。
孔尺寸可以是以下中的至少一种：平均直径、平均横截面积和通过膜的平均路径长度。
多个孔的平均孔径可以是细胞平均直径的40％至70％。
所述方法还可以包括减小膜的一侧的体积的步骤，以产生跨膜压差，从而促进细胞和一种或多种物质流过多个孔。
减小体积的步骤可以是手动步骤。
所述方法还可以包括使一种或多种物质和细胞通过具有孔的过滤器，所述孔的平均直径大于膜的孔的平均直径，以降低细胞团块或细胞聚集体到达膜的发生率。
根据另一方面，提供了用于将一种或多种物质引入细胞中的流体挤出系统，所述系统包括：本文所公开的附件；可拆卸地联接到附件的流体挤出装置，其中流体挤出装置配置为通过机械致动挤出流体。
根据另一方面，提供了用于将一种或多种物质引入细胞中的流体挤出装置，所述装置包括：流体流动室；设置在流体流动室内的膜，所述膜具有多个孔，所述孔配置为允许细胞通过同时所述孔对细胞引发机械应力，从而促进向细胞中引入一种或多种物质；以及致动器，用于在流体流动室中施加减小的体积以产生跨膜压差，从而促进流体流过膜。
定义
如本文所用的术语“存活的”是指培养物中的细胞在合适的培养条件下复制的能力。本文所用的术语还指在特定时间在培养物中存活的细胞。
如本文所用的术语“不能存活的”是指在任何已知条件下不能复制的细胞。
本文所用的术语“基底”应广义地解释为指任何支撑结构。
本文所用的术语“微”应广义地解释为包括约1微米至约1000微米的尺寸。落入该术语内的示例性子范围包括但不限于下述范围：约10微米至约900微米，约20微米至约800微米，约30微米至约700微米，约40微米至约600微米，约50微米至约500微米，约60微米至约400微米，约70微米至约300微米，约80微米至约200微米，或约90微米至约100微米。
本文所用的术语“纳米”应广义地解释为包括小于约1000nm的尺寸。落入该术语内的示例性子范围包括但不限于下述范围：小于约900nm，小于约800nm，小于约700nm，小于约600nm，小于约500nm，小于约400nm，小于约300nm，小于约200nm，小于约100nm，小于约50nm，小于约20nm，或小于约10nm。
本文所用的术语“颗粒”广泛地指离散实体或离散体。本文描述的颗粒可以包括有机颗粒、无机颗粒或生物颗粒。本文所述使用的颗粒也可以是由多个亚颗粒的聚集体或小物体的碎片形成的大颗粒。本公开的颗粒可以是球形、基本上球形或非球形，例如不规则形状的颗粒或椭圆形颗粒。当用于涉及颗粒时，术语“尺寸”广泛地指颗粒的最大尺寸。例如，当颗粒基本上是球形时，术语“尺寸”可以指颗粒的直径；或者当颗粒基本上是非球形时，术语“尺寸”可以指颗粒的最大长度。
除非另有说明，否则本说明书中使用的术语“接合”、“联接”或“连接”旨在涵盖直接连接或通过一个或多个中间机构(means)连接。
当涉及两个元件时，本文所用的术语“与......相关联”是指两个元件之间的广泛关系。所述关系包括但不限于物理关系、化学关系或生物关系。例如，当元件A与元件B相关联时，元件A和B可以直接或间接地彼此相关联，或者元件A可以包含元件B，反之亦然。
当提到两个元件时，本文使用的术语“邻近”是指一个元件紧邻另一个元件，并且可以是但不限于元件彼此接触，或者还可以包括元件由设置于其中的一个或多个其他元件隔开。
术语“和/或”，例如“X和/或Y”应理解为表示“X和Y”或“X或Y”，并且应当认为为这两种含义或任一含义提供了明确的支持。
此外，在本文的描述中，术语“基本上”无论何时使用都应理解为包括但不限于“全部地”或“完全地”等。另外，诸如“包含”、“包括”等术语，无论何时使用，都旨在是非限制性的描述语言，因为除了未明确提到的其他组件以外它们还广泛地包括在这些术语之后提到的元件/组件。此外，诸如“约”、“近似”等术语通常无论何时使用都意味着合理的变化，例如所公开值的+/-5％的变化，或者所公开值的4％的变化，或者所公开值的3％的变化，所公开值的2％的变化，或者所公开值的1％的变化。
此外，在本文的描述中，可以在一定范围内公开某些值。显示范围端点的值旨在说明优选范围。无论何时描述范围，所述范围都旨在涵盖和教导所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。也就是说，范围的端点不应被解释为不灵活的限制。例如，1％至5％范围的描述旨在具有1％至2％、1％至3％、1％至4％、2％至3％等具体公开的子范围，以及所述范围内的单独值，例如1％，2％，3％，4％和5％。上述具体公开的意图适用于范围的任何深度/宽度。
另外，当描述一些实施方案时，本公开可能已将方法和/或过程公开为具体的步骤顺序。然而，除非另有要求，否则应当理解，所述方法或过程不应限于所公开的具体步骤顺序。其他步骤顺序也是可能的。本文公开的具体步骤顺序不应解释为不适当的限制。除非另有要求，否则本文公开的方法和/或过程不应限于以书面顺序执行的步骤。步骤顺序可以变化并且仍然在本公开的范围内。
实施方案的描述
下文公开了用于细胞内递送的装置、系统和方法的示例性、非限制性实施方案。
提供了用于将一种或多种物质引入细胞中的附件形式的装置。附件可以包括一个或多个具有具体限定尺寸的过滤器/膜，以在细胞通过膜时将一种或多种物质递送到细胞中。附件可以配置成可拆卸地联接到流体挤出装置，例如，生物技术领域所用的注射器、移液管和微量移液管。在一些实施方案中，附件可以直接联接到流体挤出装置。在一些实施方案中，附件可以是适配器。
有利的是，附件能够将一种或多种物质引入细胞中，而不需要复杂和/或笨重的装备(equipment)/设置(setup)。附件可以设计成使用便宜的材料制造并且用于一次性使用。这提高了用户友好性，并使附件可以容易地集成到现有的实验室工作流程中。虽然附件可能不需要使用复杂和/或笨重的装备/设置，但它也适合通过制药和高通量筛选中使用的实验室机器人进行自动化，从而允许更广泛地使用附件。在各种实施方案中，应当理解，附件不是微流体装置。
可以引入细胞中的一种或多种物质可以包括但不限于小分子、纳米颗粒、大分子、多核苷酸、寡核苷酸、质粒、RNA、DNA、氨基酸、肽、蛋白、聚合物、药物、生长因子、物质组合物及其组合。取决于待引入的物质的性质，一种或多种物质可以在无核酸酶的培养基中，在无蛋白酶的培养基中，或在盐水缓冲液中。
有利的是，如本文所公开的附件可以允许通常不能进入细胞的物质被引入细胞中，例如，引入细胞的细胞质中。应当认识到，可能需要化学处理，例如与基于脂质或聚合物的递送系统复合，或在例如病毒递送系统中进行基因处理，以在递送过程中稳定和保护物质和/或当物质通常在未修饰的情况下不能在正常生理条件下透过时允许物质透过细胞膜。然而，某些处理技术可能改变待递送物质的性质。在各种实施方案中，附件的使用可以有利地避免在递送之前对物质进行过度处理的需要。
细胞可以包括但不限于动物细胞、植物细胞、细菌细胞、原生动物细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞或人细胞。在一个实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，细胞是人细胞。细胞可以在通过本文所公开的附件的膜后保持存活形式。细胞的变形可以允许在细胞死亡最低的情况下摄入物质。有利的是，在使用本文所公开的附件递送过程中，细胞死亡和损失可以不高于本领域已知的可比较的细胞加载技术。细胞活力可以使用诸如MTT测定、台盼蓝染料、流式细胞术等技术测量。应当理解，虽然使用了“细胞”的单数术语，但是本文所公开的附件可以允许将一种或多种物质引入多种细胞中。
在各种实施方案中，与本文所公开的附件一起使用的平均细胞密度可以是至少约104个细胞/ml，至少约105个细胞/ml，或至少约106个细胞/ml。在一个示例性实施方案中，与附件一起使用的平均细胞密度为约1×106个细胞/ml。
本文所公开的附件可以包括具有多个孔的膜，所述孔配置成允许细胞通过同时所述孔对细胞引发机械应力，以促进向所述细胞中引入一种或多种物质。机械应力可以包括剪切应力和/或细胞的变形和/或细胞膜的变形。机械应力可以在通过其中的细胞的细胞膜中产生瞬时扰动，这可以增加细胞膜的渗透性以促进一种或多种物质的引入。在各种实施方案中，将多个孔配置成对细胞可靠地引发剪切应力，以促进向所述细胞中引入一种或多种物质。这优于不适于引发机械剪切的化学交联过滤器。
多个孔的孔尺寸遍及所述多个孔可以是基本上均匀的。孔尺寸可以是以下中的至少一种：平均直径、平均横截面积和通过膜的平均路径长度。孔尺寸可以在微米范围内。
多个孔可以限定通过膜的基本上线性的路径。每个基本上线性的路径可以始终具有基本均匀的横截面积。与具有截留高于所需孔径的颗粒并且不适于引发机械剪切的曲折路径的孔相比，具有限定基本上线性路径的孔可能是特别有利的。
基本上线性的路径可以具有这样的横截面积：所述横截面积具有的平均直径能够对细胞引发机械应力，并且又不会过小而使从中通过的细胞破裂。在一个实施方案中，平均孔径可以近似等于细胞的平均直径。在另一个实施方案中，平均孔径可以小于细胞的平均直径。
在各种实施方案中，基本上线性的路径横截面的平均直径和/或平均孔径可以是细胞平均直径的至少约25％，至少约30％，至少约35％，至少约40％，至少约45％，至少约50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约100％，至少约105％，至少约110％，至少约115％，至少约120％，至少约125％，至少约130％，至少约135％，至少约140％，至少约145％，或至少约150％。
在各种实施方案中，基本上线性的路径横截面的平均直径和/或平均孔径可以为约0.1μm至约5μm，约0.5μm至约4μm，约1μm至约3μm，约2μm至约3μm，约5μm至约20μm，约6μm至约19μm，约7μm至约18μm，约8μm至约17μm，约9μm至约16μm，约10μm至约15μm，约11μm至约14μm，或约12μm至约13μm。
在各种实施方案中，由多个孔限定的基本上线性的路径的平均路径长度可以为约5μm至约100μm，约10μm至约95μm，约15μm至约90μm，约20μm至约85μm，约25μm至约80μm，约30μm至约75μm，约35μm至约70μm，约40μm至约65μm，约45μm至约60μm，或约50μm至约55μm。
在各种实施方案中，平均路径长度与平均孔径的比可以为约250：1，约200：1，约150：1，约100：1，约50：1，约25：1，约10：1，约9：1，约8：1，约7：1，约6：1，约5：1，约4：1，约3：1，约2：1，或约1：1。
在各种实施方案中，膜的平均厚度可以为约5μm至约100μm，约10μm至约95μm，约15μm至约90μm，约20μm至约85μm，约25μm至约80μm，约30μm至约75μm，约35μm至约70μm，约40μm至约65μm，约45μm至约60μm，或约50μm至约55μm。
有利的是，具有多个尺寸基本上均匀(例如，明确限定的孔径和基本上线性的路径长度)的孔的膜可以确保细胞经历的机械应力基本上是均匀的。另外，这样的配置可以确保流体(例如包含细胞和一种或多种待引入的物质的有效负载/混合物)均匀地流过多个孔。
可以将多个孔设置在膜的细胞可接近的区域上。在各种实施方案中，膜的细胞可以接近的区域的直径可以为约1mm至约45mm，约2mm至约40mm，约2mm至约35mm，约2mm至约30mm，约2mm至约25mm，约2mm至约20mm，约2mm至约15mm，约2mm至约10mm，约2mm至约5mm，或约2mm至约4mm。在一个示例性实施方案中，膜的细胞可接近的区域的直径为约4mm。流动阻力在膜的细胞可接近的区域内也可以是基本上均匀的。
在各种实施方案中，在横跨膜的所述细胞可以接近的区域，所述膜能够承受允许约0.1ml/s至约2ml/s、约0.2ml/s至约1.9ml/s、约0.3ml/s至约1.8ml/s、约0.4ml/s至约1.7ml/s、约0.5ml/s至约1.6ml/s、约0.6ml/s至约1.5ml/s、约0.7ml/s至约1.4ml/s、约0.8ml/s至约1.3ml/s、约0.9ml/s至约1.2ml/s或约1.0ml/s至约1.1ml/s的流率(flowrate)的压力。在一个示例性实施方案中，在横跨膜的所述细胞可以接近的区域，所述膜能够承受允许1ml/s的流率的压力。在另一个示例性实施方案中，所述附件能够使流体以至少(20mm×膜的横截面积)/秒的速率通过。
在各种实施方案中，在横跨膜的所述细胞可接近的区域，膜能够承受允许约1cm/s至约30cm/s、约2cm/s至约28cm/s、约4cm/s至约26cm/s、约6cm/s至约24cm/s、约8cm/s至约22cm/s、约10cm/s至约20cm/s、约12cm/s至约18cm/s或约14cm/s至约16cm/s的流通速度的压力。在一个示例性实施方案中，所述膜能够承受允许约1cm/s至约30cm/s的流通速度的压力。
已经认识到，施加以使细胞通过多个孔的压力与膜的细胞可接近的区域成反比。假设流率保持恒定，则所述区域缩小会将导致施加在膜上的压力增加。
应当理解，在各种实施方案中，将压力、流率和流通速度设定在允许细胞经历机械应力而不使细胞破裂的水平。在各种实施方案中，通过膜的流率为约0.1ml/s至约1ml/s。在一个示例性实施方案中，在膜孔隙率为约40％时，流通速度为约5cm/s至约50cm/s。在另一个示例性实施方案中，在膜孔隙率为约1％时，流通速度为约2cm/s至约20cm/s。因此，在某些实施方案中，当膜孔隙率为约40％时，流速为约50cm/s，通过膜的流率为约1ml/s；当膜孔隙率为约20％时，流速为约20cm/s，通过膜的流率为约1ml/s。正如根据上述内容应当认识到的，可以理解当改变膜的孔隙率、流速或流率中的一种时，可以基于上述实施方案中提供的值成比例地计算另两个参数。
具有多个孔的膜可以是使用轨道蚀刻技术制造的轨道蚀刻膜。轨道蚀刻膜具有多个使用带电粒子轰击和化学蚀刻的组合形成的孔，从而产生基本直的限定直径的轨道。
轨道蚀刻膜可以由能够被轨道蚀刻的任何已知材料制成。轨道蚀刻膜可以由聚合物制成，所述聚合物包括但不限于聚酯，聚苯乙烯，芳族聚酯，聚碳酸酯，聚烯烃，包括聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚丙烯，乙烯基塑料，如聚二氟乙烯(PVDF)，和纤维素酯，例如硝酸纤维素、丁酸纤维素和醋酸纤维素。在一个实施方案中，轨道蚀刻膜包含聚碳酸酯。
本文所公开的附件还可以包括用于保持膜的壳体(housing)/外壳(casing)。壳体可以是圆柱形的，具有限定内室的内圆周和限定壳体外部形状的外圆周。壳体可以包括设置在壳体的基本上相对端的第一开口和第二开口。第一开口可以是用于接收流体(例如，细胞和待递送的一种或多种物质)的入口，第二开口可以是允许流体从壳体中离开的出口，反之亦然。可以将膜设置在壳体的内室中，位于第一开口和第二开口之间的任何位置。膜可以横跨内室的横截面延伸，从而将内室分成第一子室(sub-chamber)和第二子室，第一子室和第二子室彼此流体连通。
壳体可以包括一个或多个设置在壳体的内圆周上用于将膜支撑和维持在固定位置的凸缘。还可以使用密封机构(sealing means)将膜固定到壳体上，以密封膜的周边，从而引导流体流过多个孔而不是围绕膜的周边流过。密封机构可以包括使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)、硝化纤维素、环氧树脂、氰基丙烯酸酯、硅酮和其他粘合剂等。壳体可以在一端逐渐变细，例如在第一开口处逐渐变细，以形成用于挤出流体的尖端，而另一端(例如第二开口)可以配置成可接合到流体挤出装置的出口。
壳体可以由聚合物制成，所述聚合物包括但不限于聚四氟乙烯、聚砜、聚醚砜、聚丙烯、聚乙烯、含氟聚合物、醋酸纤维素、聚苯乙烯、聚苯乙烯/丙烯腈共聚物、PVDF及其组合。应当理解，壳体可以有利地具有诸如材料成本低、易于制造、易于大规模生产、可灭菌、对细胞低毒性等品质。
本文所公开的附件还可以包括设置在壳体的内室中的保持环。保持环可以邻近膜放置，以将膜维持在基本固定的位置，并防止膜在使用时移位。可以在保持环的中心处形成口(aperture)以暴露膜的区域并使膜的所述区域可为细胞接近从而使细胞通过。可以改变口的直径以限定膜的细胞可接近的区域。
本文所公开的附件还可以包括用于联接到流体挤出装置的出口的接合构件，从而膜与流体挤出装置的出口流体连通。附件可以能够通过接合构件可拆卸地联接到流体挤出装置的出口。
用于联接到流体挤出装置出口的接合构件当联接到流体挤出装置的出口时形成基本上气密的密封。接合构件可以包括足够柔韧的材料，例如弹性体或塑料(例如聚丙烯、聚乙烯)，用于联接到流体挤出装置的出口。接合构件可以是弹性环或其他提供夹持的构造的形式，用于接合流体挤出装置出口的圆周。圆周可以是流体挤出装置出口的内圆周或外圆周。接合构件可以配置成通过摩擦配合、螺纹配合、鲁尔锁配合等连接/接合流体挤出装置的出口。
本文所公开的附件还可以包括过滤器/预过滤器，例如具有孔的细网，所述孔的直径大于膜的多个孔的直径，以降低不需要的颗粒到达膜的发生率。不需要的颗粒可以包括细胞团块、细胞聚集体和碎片。因此，到达膜的细胞可以基本上未聚集。
本文所公开的附件还可以包括设置在壳体内的一个或多个阀。所述一个或多个阀可以是用于允许流体基本上单向流动的单向阀(unidirectional/one-way valve)。在一个示例性实施方案中，可以在与膜基本上相同的平面内邻近膜设置阀。单向阀可以配置成促进流体在从壳体的出口到壳体的入口的方向上流动。以这种配置，单向阀提供了阻力较小的路径，供流体在促进的方向上流动而不是流过膜。这样的配置可以允许流体在从入口到出口的方向上一次或多次通过膜。
在另一个示例性实施方案中，第一单向阀可以邻近膜设置，并且可以配置成促进在从壳体的入口到壳体的出口的第一方向上流动。第二单向阀可以在与膜基本上相同的平面内邻近膜设置。第二单向阀可以配置成促进在从壳体的出口流到壳体的入口的第二方向上流动。这样的配置还可以允许流体在一个方向即第一方向上一次或多次通过膜。
本文所公开的附件可以联接到流体挤出装置，所述装置可以包括但不限于移液管、手动微量移液管、电动微量移液管、滴定管、注射器、自动/半自动流体/液体处理系统和经设计使用微量移液管吸头的液体处理机器人。流体挤出装置可以包括配置成与本文所公开的附件的入口流体连通地接合的出口。流体挤出装置的出口的形状可以具有适当的尺寸，以通过摩擦配合、螺纹配合或鲁尔锁配合来连接/接合附件的入口。
流体挤出装置可以配置成通过机械致动挤出流体，例如依靠诸如柱塞的机械部件的位移和移动来致动(例如提供驱动力)并产生压差以挤出流体。这与利用气体(带或不带阀门)的引入来排出流体的气体压力/加压系统相反。流体挤出装置还可以包括可由操作人员手动致动或自动/半自动机器人机制(例如机械臂)致动的活塞或柱塞形式的致动器。活塞或柱塞可以配置成进行分配运动，从而使流体从例如注射器的主体或从移液管吸头挤出。当连接到本文所公开的附件时，活塞或柱塞的分配运动可以使附件的内室内的容积减小，从而导致附件的内室内在膜面向入口一侧的压力增加。这产生跨膜压差并迫使流体(例如含有细胞和一种或多种物质的混合物)通过膜上的多个孔。流体挤出装置可以是手持式流体挤出装置，其可以是便携式的。在各种实施方案中，跨膜压差不是由气体供应产生或调节的。
还提供了将一种或多种物质引入细胞中的方法。所述方法可以包括使细胞穿过本文所公开的附件，所述附件包括一个或多个具有具体限定尺寸的膜，以在细胞通过膜时将一种或多种物质递送到细胞中。所述方法可以包括在细胞通过膜时对细胞引发机械应力，从而促进向所述细胞中引入一种或多种物质。
所述方法可以包括使细胞和一种或多种物质穿过膜一次。即，使细胞和一种或多种物质经从流体挤出装置的出口到附件的入口通过，然后使细胞和一种或多种物质穿过膜，然后将细胞和一种或多种物质从附件的出口挤出。
所述方法可以包括减小膜面向附件入口一侧的流体体积的步骤，从而产生跨膜压差，并迫使流体(例如细胞和一种或多种物质)流过膜。当连接到本文所公开的附件时，活塞或柱塞的分配运动可以使附件内室内的容积减小，从而导致附件内室内在膜面向入口一侧的压力增加。这产生跨膜压差并迫使流体(例如含有细胞和一种或多种物质的混合物)通过膜中的多个孔。应当理解，在各种实施方案中，施加跨膜压差的步骤不需要使用气体供应来施加压力和/或产生压差。
所述方法可以包括使细胞和一种或多种物质多次穿过膜。在一个实施方案中，使细胞和一种或多种物质多次穿过膜的步骤可以包括在单一方向上多次穿过膜。使细胞和一种或多种物质穿过膜的步骤可以包括通过邻近膜设置的单向阀以促进在单一方向上流动多次。所述方法可以包括减小膜面向附件入口一侧的流体体积的步骤，从而产生第一跨膜压差，所述第一跨膜压差迫使流体(例如细胞和一种或多种物质)在从壳体的入口到出口的第一方向上流过膜。这之后可以是增加膜面向附件入口一侧的空间容积的步骤，从而产生第二相反的压差，所述第二相反的压差将流体吸回到壳体中，流过单向阀而不是膜。可以重复上述步骤，以使细胞和一种或多种物质在单一方向上多次穿过膜。
在另一个实施方案中，使细胞和一种或多种物质多次穿过膜的步骤可以包括在第一方向上穿过膜；并在基本上与第一方向相反的第二方向上穿过膜。所述方法可以包括减小膜面向附件入口一侧的流体体积的步骤，从而产生第一跨膜压差，所述第一跨膜压差迫使流体(例如细胞和一种或多种物质)在从壳体的入口到出口的第一方向上流过膜。这之后可以是增加膜面向附件入口一侧的空间容积的步骤，从而产生第二相反的压差，所述第二相反的压差将流体吸回到壳体中，在第二相反方向流过膜。可以重复上述步骤，以使细胞和一种或多种物质在两个方向上多次穿过膜。
使细胞穿过膜的步骤可以以基本恒定的流率进行。基本恒定的流率可以是预定的流率。在各种实施方案中，预定的流率为约0.1ml/s至约2ml/s，或约0.2ml/s至约1.9ml/s，或约0.3ml/s至约1.8ml/s，或约0.4ml/s至约1.7ml/s，或约0.5ml/s至约1.6ml/s，或约0.6ml/s至约1.5ml/s，或约0.7ml/s至约1.4ml/s，或约0.8ml/s至约1.3ml/s，或约0.9ml/s至约1.2ml/s，或约1.0ml/s至约1.1ml/s。
在各种实施方案中，使细胞穿过膜的步骤可以以约1cm/s至约30cm/s、或约2cm/s至约28cm/s、或约4cm/s约26cm/s、或约6cm/s至约24cm/s、或约8cm/s至约22cm/s、或约10cm/s至约20cm/s、或约12cm/s至约18cm/s、或约14cm/s至约16cm/s的流通速度进行。
所述方法还可以包括在使细胞穿过膜之前使细胞穿过具有孔的过滤器，所述孔的直径大于膜的孔的直径，以降低不需要的颗粒到达膜的发生率。
所述方法还可以包括在使细胞穿过膜的步骤之后检查细胞以确定是否已将一种或多种物质引入细胞中。
还提供了用于将一种或多种物质引入细胞中的流体挤出系统。流体挤出系统可以包括流体流动室；设置在流体流动室内的本文所公开的膜；以及用于在流体流动室中施加减小的体积以产生跨膜压差的致动器。致动器可以是柱塞的形式。流体挤出系统可允许细胞双向流过膜。流体挤出系统还可以包括设置在流体流动室内、用于允许细胞基本上单向流过膜的单向阀。在流体流动室内的所公开的膜可以是一次性的和可更换的。在各种实施方案中，本文公开的系统没有外部气体供应和/或气体调节器。
还提供了用于将一种或多种物质引入细胞中的系统。所述系统可以包括流体挤出装置；和本文所公开的联接到流体挤出装置的出口的附件。在一个实施方案中，提供了一种用于将分子递送到细胞中的设备(apparatus)。所述设备可以包括注射器；和与注射器流体连通的膜，其中膜包括具有基本上均匀尺寸的孔。
在一个实施方案中，提供了使用两个过滤器将核酸/蛋白/大分子递送到真核细胞中的装置，所述装置被设计成通过弹性体夹持器配合到微量移液管吸头和经由鲁尔锁配合到注射器的。
还提供了将一种或多种分子递送到细胞中的方法。所述方法可以包括将一种或多种分子和细胞加载到注射器中；并且注射所述分子和所述细胞使它们通过与注射器流体连通的膜，其中膜包括具有基本上均匀尺寸的孔。
附图的简要说明
图1是示例性实施方案中用于将一种或多种物质引入细胞中的附件的示意图。
图2是示例性实施方案中用于将一种或多种物质引入细胞中的附接到移液管吸头的附件的示意图。
图3是示例性实施方案中用于将一种或多种物质引入细胞中的移液管吸头的示意图。
图4是示例性实施方案中用于将一种或多种物质引入细胞中的移液管吸头附件的示意图。
图5是另一个示例性实施方案中用于将一种或多种物质引入细胞中的移液管吸头的示意图。
图6是示例性实施方案中用于将一种或多种物质引入细胞中的方法的示意性流程图。
图7是显示另一个示例性实施方案中将一种或多种物质引入细胞中的方法的示意图。
图8是显示又一个示例性实施方案中将一种或多种物质引入细胞中的方法的示意图。
图9A是用peGFP-C1质粒转染的HEK293T细胞的显微照片(比例尺＝500μm)。
图9B是用peGFP-C1质粒转染的HEK293T细胞的显微照片(比例尺＝50μm)。
图10是比较有预过滤或无预过滤的设置的转染效率的图表。
图11是比较不同的细胞加载浓度的转染效率的图表。
图12是比较不同的质粒加载浓度的转染效率的图表。
图13是比较不同过滤器孔径的转染效率的图表。
图14是比较过滤器区域的不同口径(aperture)/直径的转染效率的图表。
图15是比较不同流率的转染效率的图表。
图16是比较不同细胞恢复时间的转染效率的图表。
图17是用peGFP-C1和pDsRed-N1质粒转染的HEK293T细胞的显微照片(比例尺＝100μm)。
图18是一组显示已经注射的细胞和已经孵育的细胞的显微照片(比例尺＝100μm)。
图19A是用peGFP-C1转染的H1细胞的显微照片(比例尺＝100μm)。
图19B是显示用peGFP-C1转染的H1细胞的另一视图的显微照片(比例尺＝100μm)。
图20是一组显示已经通过具有3μm或5μm孔的过滤器注射的细胞的显微照片。
图21是比较将质粒递送到细胞中的不同方法的转染效率的图表。
图22是比较不同物质转染到细胞中的效率的图表。
图23是比较在使用和不使用过滤膜的情况下在CHO细胞中递送质粒的转染效率的图表。
附图详述
根据以下讨论，并且适用时结合附图，本公开的示例性实施方案将会更好地为本领域普通技术人员所理解，并且容易是显而易见的。应当理解，在不背离本发明范围的情况下，可以进行与结构、材料和机械变化相关的其他修改。示例性实施方案不必定是互斥的，因为一些可以与一个或多个实施方案组合以形成新的示例性实施方案。
参考图1，示出了示例性实施方案中用于将一种或多种物质引入细胞中的附件100的示意图。附件100包括：壳体102，壳体102具有在其中形成的内室104、入口106和设置在壳体102的基本上相对端的出口108；设置在内室104内并且横跨内室104的横切面延伸的膜110；和联接到入口104的接合构件112。内室104、入口106和出口108流体连通。
膜110包括多个孔114(参见膜110的分解视图)。多个孔114中的每一个都限定基本上线性的路径，并且具有通过膜110的基本均匀的横截面积。多个孔114中每一个孔的平均直径都基于通过膜110的细胞的平均直径预定。具体而言，多个孔114的平均直径为约3-20μm，并且限定为使得其近似等于或小于细胞的平均直径。当细胞通过多个孔114时，这引发剪切应力和/或细胞变形形式的扰动。
膜110由聚碳酸酯材料制成，并且多个孔114使用轨道蚀刻技术制成。
图2是示例性实施方案中用于将一种或多种物质引入细胞中的附接到移液管吸头214的附件200的示意图。附件200在功能上基本上类似于图1的附件100。附件200包括：壳体202，壳体202具有在其中形成的内室204、入口206和设置在壳体202的基本上相对端的出口208；设置在内室204内并且横跨内室204的横切面延伸的膜210；和联接到入口204的接合构件212。内室204、入口206和出口208流体连通。
在示例性实施方案中，附件200可拆卸地联接到移液管吸头214，移液管吸头214又可拆卸地联接到移液管216。将细胞和一种或多种物质通过入口206从流体挤出装置递送到附件200中。
图3是在示例性实施方案中用于将一种或多种物质引入细胞中的移液管吸头300的示意图。移液管吸头300包括：壳体302，壳体302具有在其中形成的内室304。移液管吸头300还包括入口306和出口308，入口306配置成可拆卸地联接到移液管，出口308用于挤出流体，例如含有细胞和一种或多种待引入的物质的混合物。在示例性实施方案中，横跨内室304的横切面延伸的膜310邻近出口308设置，并且通过保持环312保持在基本固定的位置。保持环312形成口314，通过所述口314细胞可接近膜316的区域。
图4是在示例性实施方案中用于将一种或多种物质引入细胞中的移液管吸头附件400的示意图。移液管吸头附件400被配置为用于可拆卸地联接到移液管的适配器，并且包括壳体402，壳体402具有在其中形成的内室404。移液管吸头附件400还包括入口406和出口408，入口406具有用于适应移液管出口的预定直径，出口408用于挤出流体，例如含有细胞和一种或多种待引入的物质的混合物。在示例性实施方案中，横跨内室404的横切面延伸的膜410邻近出口408设置，并且通过保持环412保持在基本固定的位置。保持环412形成口414，通过所述口414细胞可接近膜410的区域。
图5是另一个示例性实施方案中用于将一种或多种物质引入细胞中的移液管吸头500的示意图。移液管吸头500包括壳体502，壳体502具有在其中形成的内室504。移液管吸头500还包括入口506和出口508，入口506配置成可拆卸地联接到移液管，出口508用于挤出流体，例如含有细胞和一种或多种待引入的物质的混合物。
在示例性实施方案中，膜510横跨内室504的横切面的一部分设置，并通过保持环512保持在适当位置。第一单向阀514邻近膜510设置，更接近入口506，并配置为促进在从入口506到出口508的第一方向516上流动。第二单向阀518在与膜510基本上相同的平面中邻近膜510设置。第二单向阀518配置成促进在从出口508到入口506的第二方向520上流动。这种配置允许流体在一个方向即第一方向516上通过膜510。
在使用时，移液管上的分配动作导致在膜510面向入口506一侧的流体体积减小，从而产生跨膜510的第一压差，所述第一压差迫使流体在从入口506到出口508的第一方向516上流过膜510。在移液管上的吸取动作导致在膜510面向入口506一侧的空间容积增加，从而产生跨膜510的第二相反的压差，所述第二相反的压差将流体通过出口508吸回到壳体502中。被吸回到壳体502中的流体在第二方向520上通过第二单向阀518。在移液管上的吸取动作导致第一单向阀514关闭，并且流体不能在第二方向520上流过膜510。移液管的分配和吸取动作可以重复多次，以使含有细胞和一种或多种物质的流体在单个方向上多次穿过膜510。
图6是示例性实施方案中用于将一种或多种物质引入细胞中的方法的示意性流程图600。在步骤602，包括具有多个孔的膜的附件的接合构件可拆卸地联接到流体挤出装置的出口，所述流体挤出装置配置成通过机械致动挤出流体，使得流体挤出装置与膜流体连通。在步骤604，使一种或多种物质和细胞通过多个孔，以通过对细胞引发机械应力促进向所述细胞中引入一种或多种物质。
图7是显示在另一个示例性实施方案中将一种或多种物质引入细胞中的方法700的示意图。包含细胞和货物(即一种或多种待引入的物质)的混合物702被吸入附接到移液管706的移液管吸头704。将含有混合物702的移液管吸头704联接到附件708。附件包括具有多个孔的膜710，所述孔配置成允许细胞通过同时所述孔对细胞引发机械应力，使得货物被递送到细胞内部。在通过膜710后，将混合物702收集在收集盘712中。
图8是显示又一个示例性实施方案中将一种或多种物质引入细胞中的方法800的示意图。首先用包含小分子(例如用于改善递送效率的组合物)的预处理混合物804处理培养中的细胞802。将细胞802与预处理混合物804一起孵育6小时，然后用胰蛋白酶消化以解离并收获培养皿上贴壁的细胞802。还制备含有待送递到细胞802中的货物806的溶液。将细胞802与货物溶液806混合在一起，以形成混合物808，然后将混合物808吸入注射器810中。将含有混合物808的注射器810可拆卸地联接到包括膜814的附件812。将附件812直接联接到注射器810。
以特定速率施加手动压力而不使用来自气体供应的气体压力，以使混合物通过膜814。膜814包括多个具有限定尺寸的孔816，用于在细胞802通过多个孔816时对细胞802施加机械应力。如膜814的分解视图所示，在通过多个孔816后货物806被递送到细胞802的内部(参见附图标记820)。
实施例
根据以下实施例、表格以及适用时结合附图，本公开的示例性实施方案将会更好地为本领域普通技术人员理解，并且容易是显而易见的。
在以下实施例中，进行了一系列实验以评价本文所公开的附件将一种或多种物质引入细胞中的性能。实验中使用的质粒(例如peGFP-C1)购自Clontech。直径为25mm的轨道蚀刻膜购自Whatman(英国)，并将其容纳在25mm不锈钢保持架(也来自Whatman)中。通过使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)封闭侧面来控制过滤器孔径，并且冲压出穿过PDMS的所需直径的孔(实施例1-6)。使研究中使用的HEK293T和CHO细胞在补充有10％FCS和1％青霉素/链霉素的DMEM中于37℃、5％CO2中生长。
实施例1-可以通过过滤器转染递送eGFP质粒
基于如图8所示的设置组装转染筒。将12μg在转染时表达eGFP的peGFP-C1与1x106个HEK293T细胞在1ml OptiMEM血清减少的培养基中混合，并通过4mm的口以1ml/s注射通过具有10μm孔的膜。然后将得到的细胞在在OptiMEM中放置5分钟，然后加入3ml细胞培养基。然后在1天后对细胞成像。
图9A是用peGFP-C1质粒转染的HEK293T细胞的显微照片(比例尺＝500μm)。图9B是用peGFP-C1质粒转染的HEK293T细胞的显微照片(比例尺＝50μm)。从图9看出，许多转染的细胞(参见附图标记900和902)发绿色荧光(参见附图标记900和902)，这表明过滤器“转染”方法起作用。观察到由于细胞团块在注射过程的尾端处在过滤器中发生堵塞，所述细胞团块与像HEK293T一样的彼此具有非常强的粘附性的细胞一起出现。
实施例2–限定过滤器转染的基本参数
为了理解哪个参数对于获得高效递送是重要的，通过一次修改一个参数来研究每个参数，一式两份进行。在默认情况下，将5×105个HEK293T细胞与5μg peGFP-C1在500μlOptiMEM中混合，并使之以1ml/s通过具有10μm孔和4mm口的过滤器。然后将所得细胞置于OptiMEM中5分钟，然后加入细胞培养基。然后在通过过滤器后1-3天后对细胞成像。
比较细胞数、孔径、口径、过滤速度、恢复时间、质粒浓度和预过滤需求，以确定哪个参数对于影响转染效率是重要的。为了测量转染效率，对细胞在至少3个单独的视野中以明视场和绿色荧光进行成像，然后用绿色荧光覆盖的总面积除以每个视野中细胞覆盖的面积，这给出了有关转染百分比的近似值。使用该测量方法代替在没有解离的情况下的计数细胞，所述计数细胞是困难的，因为细胞经常汇合，并且因此单个细胞难以彼此区分。
图10是比较有预过滤或无预过滤的设置的转染效率的图表。从图10看出，使用40μm过滤器的预过滤对转染效率的影响最小，在有预过滤和无预过滤的情形中转染效率类似。然而，观察到预过滤对减轻过滤器的堵塞具有显著影响。
图11是比较不同的细胞加载浓度的转染效率的图表。观察到降低细胞浓度也降低了加载的细胞的百分比，这可能是由于细胞相对于货物的浓度所致。
图12是比较不同的质粒加载浓度的转染效率的图表。令人惊讶的是，观察到质粒浓度对递送效率的影响最小。这表明质粒浓度在所用的浓度范围内可能不是限制性的，尽管当浓度降至1μg/ml以下时，预期递送效率会下降。
图13是比较不同过滤器孔径的转染效率的图表。由于HEK293T细胞的直径为约14-20μm，如果迫使其通过直径小于5μm的孔，细胞不太可能存活。因此，不使用小于5μm的孔径。正如预期的那样，在未过滤的情况下，没有看到荧光。结果表明，最佳收缩(constriction)为8-10μm，在此种情形中，转染效率显著高于其他孔径。观察到很少的细胞(具有绿色荧光的面积小于5％)在通过5μm孔后存活并发荧光。通过20μm网孔时，也很少有细胞发荧光(具有绿色荧光的面积小于1％)。然而，令人惊讶地观察到20μm的收缩足以使一些质粒进入细胞，这表明剪切应力而不是单独的细胞变形导致质粒的摄入。
图14是比较过滤器区域的不同口径/直径的转染效率的图表。改变过滤器区域的口径或直径应该影响递送效率，因为如果流率恒定，过滤器表面积会影响压力。从图14看出，过滤器区域从4mm减小至2mm或增加至25mm导致较低的递送效率。然而，由于递送效率在使用2mm口径的情况下仍然是可接受的，这表明所述系统可以小型化至适于制造成注射器吸头或微量移液管吸头的尺寸。
图15是比较不同流率的转染效率的图表。与口径的改变类似，减慢流率降低了压力和剪切应力。从图15看出，流率降至0.3ml/s和0.1ml/s显著降低递送效率。结合起来，这表明对于具有4mm口径的膜而言，最佳流率为1ml/s。
图16是比较不同细胞恢复时间的转染效率的图表。观察到在通过过滤器之后允许细胞恢复的时间显然不是必需的，因为加载效率不随不同的恢复期间而显著改变。
实施例3-可以一起递送多种质粒
为了研究是否可以将两种单独的质粒共同递送到同一细胞中，将12μg pDsRed-N1、12μg peGFP-C1和3x105个HEK293T细胞在1ml OptiMEM中以1ml/s注射通过4mm口径的10μm孔。在通过过滤器4天后对所得到的细胞成像。
图17是用peGFP-C1和pDsRed-N1质粒转染的HEK293T细胞的显微照片(比例尺＝100μm)。从显微照片看出，一些细胞对红色和绿色荧光蛋白均呈阳性(参见突出显示的区域1702和1704)。结果表明，可以将多种单独的质粒一起递送到同一细胞中。有趣的是，对DsRed和eGFP两者阳性的细胞的数量高于eGFP阳性细胞和DsRed阳性细胞的随机独立分布，这表明转染(阳性细胞数量)受到成为“可渗透的”细胞的数量的限制，而不是质粒浓度的限制。因此，通过创新性过滤器设计改进细胞剪切路径的设计可以增加经由剪切成为可渗透的细胞的数量。
实施例4-过滤还可以将肽加载到细胞中
进行实验以研究所述方法是否也可用于以类似方式将肽加载到细胞中。PM2是用荧光素标记的订书肽(stapled peptide)，因此可以在显微镜下观察。将5μM PM2与1x106个HEK293T细胞在1ml OptiMEM中混合。将一组样品仅与肽一起孵育，将另一组样品以1ml/s注射通过10μm孔。1天后更换培养基，并在成像前将细胞洗涤三次。
图18是一组显示已经注射的细胞和已经孵育的细胞的显微照片(比例尺＝100μm)。顶行的图像是在明视场显微镜下拍摄的。中间行的图像对应于顶行的图像，并在荧光显微镜下拍摄。底行的图像是通过合并顶行和中间行中的图像而获得的处理图像。A组的图像集属于仅与肽一起孵育的样品组。B组的图像集属于以1ml/s注射通过10μm孔的样品组。从B组中的图像看出，绿色荧光的存在表明，与仅仅孵育而没有注射的A组样品相比，细胞在注射后以高得多的浓度摄入肽。然而，在A组样品中仍然观察到一些绿色荧光，表明在仅仅孵育的情况下有一些摄入。
实施例5-过滤可用于加载难以加载的细胞类型
进行实验以研究在其他细胞类型，特别是难以转染的干细胞和原代细胞的情况下所述方法是否可以起作用。使用与HEK293T细胞类似的方案研究1×106个H1细胞。
图19A是用peGFP-C1转染的H1细胞的显微照片(比例尺＝100μm)。图19B是显示用peGFP-C1转染的H1细胞的另一视图的显微照片(比例尺＝100μm)。从图19A和图19B看出，peGFP-C1质粒的转染也实现了有效递送(参见附图标记1902和1904)。
接下来，在1ml培养基中加入10μg peGFP-C1和2×106个白细胞(其直径平均为6μm)，并以1ml/s注射通过具有4mm口径的3μm或5μm孔的膜。一天后，对细胞成像。
图20是一组显示已经注射通过具有3μm或5μm孔的过滤器的细胞的显微照片。顶行的图像是在明视场显微镜下拍摄的。中间行的图像对应于顶行的图像，并在荧光显微镜下拍摄。底行的图像是通过合并顶行和中间行中的图像而获得的处理图像。A组的图像集属于注射通过具有3μm孔的过滤器的样品组。B组的图像集属于注射通过具有5μm孔的过滤器的样品组。从图20看出，一些细胞对eGFP荧光呈阳性，这表明所述方法对于原代白细胞而言起作用(参见附图标记2002、2004、2006和2008)。
实施例6-过滤器可以在移液管吸头中实施，并且在手动/自动移液管分配器中使
用的典型压力下操作
一般而言，注射器通常不在实验室环境中用于分配和转移液体。因此进行实验以研究过滤器是否在使用移液管吸头的情况下起作用。将1000μl的移液管吸头以图2所示的方式与装配有10μm孔径的轨道蚀刻过滤器的注射器过滤器配合。将10μg peGFP-C1与40万个HEK293T在500μl OptiMEM中混合，并使用1ml移液管将混合物通过过滤器上下移液，一式三份地进行。这意味着在整个过程中细胞会通过膜两次。
图21是比较将质粒递送到细胞中的不同方法的转染效率的图表。用流式细胞术处理后2天，分析具有绿色荧光的细胞百分比，显示移液管吸头与lipofectamine 2000对照一样起作用。未通过过滤器的对照样品不会导致任何呈现绿色荧光的细胞。当用移液管吸头进行相同的实验时，似乎通过过滤器两次提高了递送效率，尽管效果在统计学上不显著。
实施例7-移液管吸头过滤器可用于加载各种货物
为了确定是否可以用这种方法加载其他货物，将40万个HEK293T细胞与50皮摩尔荧光素标记的21nt DNA寡核苷酸、50皮摩尔荧光素标记的21nt双链siRNA或5μg荧光素-葡聚糖(MW 3000-5000)在500μl OptiMEM中混合。吸出混合物并用1ml移液管通过过滤器分配，一式三份地进行。然后将混合物转移到2ml常规DMEM培养基中，使细胞在37℃下恢复12小时。之后，用DMEM将细胞洗涤3次并收集用于流式细胞术。
图22是比较不同物质转染到细胞中的效率的图表。观察到，对于所有类型的货物而言，在用移液管移液通过过滤器后具有高于背景荧光的细胞的百分比明显高于当细胞不通过过滤器时发出绿色荧光的细胞的百分比。这表明过滤可用于将不同类型的货物递送到HEK293T细胞中，所述货物包括DNA、RNA和大分子(葡聚糖)。
实施例8-其他细胞类型也可以利用过滤加载质粒货物
为了确定这种方法是否广泛适用于其他哺乳动物细胞，用peGFP-C1质粒评估中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。将20万个CHO细胞与10μg质粒在500μl OptiMEM中混合，吸出混合物，并分配通过图2所示移液管设置中的10μm过滤膜。图23是比较在CHO细胞中在具有和不具有滤膜的情况下递送质粒的转染效率的图表。观察到挤压CHO细胞通过过滤器导致质粒被递送到细胞中，如荧光高于阈值的细胞的百分比所示。
应用
本文提供的本公开的实施方案可以提供配置成可拆卸地联接到流体挤出装置的附件形式的装置。在各种实施方案中，所述附件包括具有多个孔的膜，所述孔配置成允许细胞通过同时所述孔对细胞引发机械应力，从而促进向所述细胞中引入一种或多种物质。
本公开的各种实施方案提供了比电穿孔更便宜和更有效的选项。
本公开的各种实施方案强调使用不需要任何额外仪器和/或操纵的一次性装置，并且可以直接插入现有的细胞培养工作流程中。设置的各种实施方案不需要复杂的设置中的本身不能适应按比例增加的气体供应，例如气体罐或笨重装备。本文公开的附件的各种实施方案被设计成可以联接到实验室中存在的普通注射器和微量移液管，并且可以通过实验室机器人(例如制药和高通量筛选所用的液体处理机器人和自动/半自动液体处理器)自动化，从而允许更广泛地使用这种技术。
例如，如图2中的实施方案所示，本文所公开的附件的各种实施方案可以被设计为对于研究用途而言是极其用户友好的。在该实施方案中，使用者仅需要将一次性“吸头”联接到常规的1000ml移液管，向上注射，向下注射，并且细胞将被转染。
甚至更有利的是，本文公开的实施方案能够递送到多种细胞类型中，以及递送多种试剂。递送也是充分耐受的，并且可以实现递送的优化。可以经由使细胞通过具有特定限定的孔尺寸的膜以对细胞施加机械应力，将诸如基因、蛋白和小分子的物质递送/转染到细胞中。在各种实施方案中，细胞的变形允许摄入而细胞死亡非常少。在本公开的各种实施方案中，在递送过程中可能存在一些细胞死亡和损失，但是其不高于可比较的细胞加载技术。在本公开中还描述了大大提高转染效率的具体策略。
在本公开的各种实施方案中，代替微流体装置，本发明人选择利用膜使细胞经受机械剪切。为了确保细胞经历的机械应力是均匀的，本公开的各种实施方案提供了具有以小变化充分限定的孔径和路径长度的膜。这些要求可以通过轨道蚀刻膜来实现，轨道蚀刻膜是通过粒子轰击制备的，从而产生限定直径的直线性轨道。在各种实施方案中，鉴于孔尺寸(长度和直径)的均匀性，细胞/有效负载混合物会均匀地流过孔。
本公开的示例性实施方案提供了使细胞经受机械应力的不同方式。可以使用的一个示例性实施方案如图2所示，其中可以将包括膜的过滤器附件装配到移液管吸头。在该实施方案中，将弹性体密封件设置在过滤器附件上，以在过滤器附件和移液管吸头之间提供流体密封。在使用时，移液管吸头先吸取一定体积的含有细胞和待引入的货物/物质的溶液。然后给移液管吸头装配过到滤器附件，并通过移液管施加压力以喷射所述溶液，使其通过过滤器附件中的膜。
在另一个实施方案中，可以将用于向细胞中引入物质的膜合并到注射器/移液管的流动室中，或者附接到注射器/移液管的吸头。如图3和图4所示，将膜设置在注射器/移液管的流动室内，通过保持环保持在适当位置。可以通过例如调节膜在流动室内的位置来设置口(即膜与含有细胞和待引入的物质的溶液流体连通的部分)。
本领域技术人员应当理解，在不背离广泛描述的本公开的精神或范围的情况下，可以对本文公开的实施方案进行其他变型和/或修改。因此，本发明的实施方案在所有方面都应视为是说明性的而非限制性的。
Claims (26)
1.附件，其配置成可拆卸地联接到流体挤出装置，所述附件包括：
具有多个孔的膜，所述孔配置成允许细胞通过同时所述孔对所述细胞引发机械应力，从而促进向所述细胞中引入一种或多种物质；和
接合构件，所述接合构件用于联接到所述流体挤出装置的出口，使得所述膜与所述流体挤出装置的出口流体连通，
其中所述流体挤出装置配置成通过机械致动挤出流体。
2.根据权利要求1所述的附件，其中用于联接到所述流体挤出装置出口的所述接合构件在联接到所述流体挤出装置的出口时形成基本上气密的密封。
3.根据权利要求1或2所述的附件，其中所述接合构件包括用于接合所述流体挤出装置出口的圆周的柔韧材料。
4.根据权利要求1或2所述的附件，其中所述接合构件配置成经由鲁尔锁配合联接到所述流体挤出装置的出口。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的附件，其中所述流体挤出装置选自移液管、手动微量移液管、电动微量移液管、滴定管、注射器、自动/半自动液体处理系统和液体处理机器人。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的附件，其中所述多个孔限定通过所述膜的基本上线性的路径。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的附件，其中所述多个孔的孔尺寸遍及所述多个孔是基本上均匀的。
8.根据权利要求7所述的附件，其中所述孔尺寸是以下中的至少一种：平均直径、平均横截面积和通过所述膜的平均路径长度。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的附件，其中所述多个孔的平均孔径为所述细胞的平均直径的40％至70％。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的附件，所述附件还包括：
具有孔的过滤器，所述孔的平均直径大于所述膜的孔的平均孔径，用于降低细胞团块或细胞聚集体到达所述膜的发生率。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的附件，所述附件还包括将所述膜保持在基本固定的位置的保持环。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的附件，所述附件还包括一个或多个阀，所述阀邻近所述膜设置以促进所述细胞和所述一种或多种物质在单一方向上通过所述多个孔的移动。
13.将一种或多种物质引入细胞中的方法，所述方法包括：
将流体挤出装置的出口可拆卸地联接到附件的接合构件，所述附件包括具有多个孔的膜，所述联接使得所述流体挤出装置与所述膜流体连通；
使所述一种或多种物质和所述细胞通过所述多个孔，以通过对所述细胞引发机械应力促进向所述细胞中引入所述一种或多种物质，
其中所述流体挤出装置配置成通过机械致动挤出流体。
14.根据权利要求13所述的方法，所述方法还包括当所述接合构件联接到所述流体挤出装置的出口时，形成基本上气密的密封。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述接合构件包括用于接合所述流体挤出装置出口的圆周的柔韧材料。
16.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述将流体挤出装置的出口可拆卸地联接到附件的接合构件的步骤包括通过鲁尔锁配合联接。
17.根据权利要求13-16中任一项所述的方法，其中所述流体挤出装置选自移液管、手动微量移液管、电动微量移液管、滴定管、注射器、自动/半自动液体处理系统和液体处理机器人。
18.根据权利要求13-17中任一项所述的方法，其中所述多个孔限定通过所述膜的基本上线性的路径。
19.根据权利要求13-18中任一项所述的方法，其中所述多个孔的孔尺寸遍及所述多个孔是基本上均匀的。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述孔尺寸是以下中的至少一种：平均直径、平均横截面积和通过所述膜的平均路径长度。
21.根据权利要求13-20中任一项所述的方法，其中所述多个孔的平均孔径为所述细胞的平均直径的40％至70％。
22.根据权利要求13-21中任一项所述的方法，所述方法还包括减小所述膜的一侧的体积的步骤，以产生跨膜压差，从而促进所述细胞和所述一种或多种物质流过所述多个孔。
23.根据权利要求22所述的方法，其中减小体积的步骤是手动步骤。
24.根据权利要求13-23中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述一种或多种物质和所述细胞通过具有孔的过滤器，所述孔的平均直径大于所述膜的孔的平均直径，用于降低细胞团块或细胞聚集体到达所述膜的发生率。
25.用于将一种或多种物质引入细胞中的流体挤出系统，所述系统包括：
权利要求1-12中任一项所述的附件；和
流体挤出装置，其可拆卸地联接到所述附件，其中所述流体挤出装置配置成通过机械致动挤出流体。
26.用于将一种或多种物质引入细胞中的流体挤出装置，所述装置包括：
流体流动室；
设置在所述流体流动室内的膜，所述膜具有多个孔，所述孔配置成允许细胞通过同时所述孔对细胞引发机械应力，从而促进向所述细胞中引入一种或多种物质；和
致动器，所述致动器用于在所述流体流动室中施加减小的体积，以产生跨膜压差，从而促进流体流过所述膜。
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