CN110078792A - 一种靶向pd1/pdl1相互作用的抗肿瘤活性多肽imb-p6及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种靶向PD1/PDL1相互作用的抗肿瘤多肽及其应用。本发明所述的小分子多肽由13个氨基酸组成，其氨基酸序列为：Leu‑Thr‑Cys‑Ser‑Leu‑Ala‑Pro‑Asn‑Ile‑Ile‑Ser‑Gln‑Leu。本发明多肽利用固相化学合成法合成，产量高，工艺稳定，分子量为1372.64Da。本发明所提供的具有抑制PD1/PDL1相互作用的小分子多肽可用于制备肿瘤细胞选择性杀伤剂，高效应用于靶向杀伤肿瘤细胞。

Description

一种靶向PD1/PDL1相互作用的抗肿瘤活性多肽IMB-P6及其 应用

技术领域：

本发明涉及一种具有PD-1/PD-L1抑制活性的多肽IMB-P6及其应用，属于抗肿瘤药物研发与应用技术领域。

背景技术：

肿瘤的治疗是当前科研人员面临的最大挑战。肿瘤治疗方法包括：手术、放疗、化疗以及免疫治疗。由于肿瘤本身易侵袭转移和复发，传统的“手术+放疗+化疗”的治疗方法虽可应用于绝大部分肿瘤，但其应答率低和应答持久性差都是不能真正治疗肿瘤的根本因素，且由于靶向性较差，放疗和化疗易损伤正常细胞，产生严重的不良反应。区别于前三种传统的治疗方法，肿瘤免疫治疗是通过调动机体免疫系统，增强抗肿瘤免疫力，从而抑制和杀伤肿瘤细胞，具有治疗多种类型肿瘤的潜力。肿瘤免疫治疗是当前肿瘤治疗领域中最具前景的研究方向之一，由于卓越的疗效和创新性，2013年其被Science杂志评为年度十大科技突破之首。免疫疗法主要包括细胞免疫疗法、肿瘤疫苗，以及免疫检查点抑制剂等研究热点，并已取得了很多具有应用前景的研究成果。

免疫检查点是指免疫系统中存在的一些抑制性信号通路。机体在正常情况下，免疫检查点可以通过调节自身免疫反应的强度来维持免疫耐受，然而，机体在受到肿瘤侵袭时，免疫检查点的激活可抑制自身免疫，有利于肿瘤细胞的生长和逃逸。目前，已批准上市两个免疫检查点——CTLA-4和PD-1——的靶向药物。程序性死亡受体-1(programmeddeath-1，PD-1)是一种诱导表达于活化的T细胞、B细胞和NK细胞等表面的共刺激分子，两个天然配体分别为PD-L1和PD-L2，表达于肿瘤细胞和抗原递呈细胞。激活PD-1/PD-L通路对已活化的T细胞有反向调控作用，降低T细胞活性，甚至诱导其凋亡。反之，阻断PD-1/PD-L通路可以增强T细胞活性以达到肿瘤免疫治疗的效果。因此，研究PD-1/PD-L1信号通路调节T细胞活性的机制对肿瘤发生和发展，自身免疫性疾病和慢性病毒感染均具有重要的生物学意义。

抗癌活性肽(anticancer bioactive peptide，ACBPs)，以下简称“ACBPs”；是用人胃癌细胞碎片免疫山羊，从其脾脏中分离获得的具有良好抗肿瘤活性的分子量单一的(16.7kD)肽类混合物(该方法已获得发明专利，NO：ZL96/22236)。该项目开始于1996年，研究历经20余年。科研人员经动物体内实验证实ACBPs是一种无毒副作用，可长期反复使用并有明显的抑制肿瘤细胞增殖作用，同时，体外实验表明有较强的杀伤癌细胞、抑制肿瘤细胞DNA合成的生物功能。

虽然ACBPs良好的抗癌活性及卓越的成药潜质毋庸置疑，但来源有限、成份复杂等问题限制其作为多肽候选药的研发，因此进行抗癌生物活性肽的活性组分分析及生物信息获取的研究十分必要。本专利发明人带领课题组成员多年来一直围绕ACBPs的单组分化开展研究工作，取得了一系列原创性有意义的研究成果：(1)应用2D-nano-LC-ESI LTQ-Orbitrap MS/MS技术，已解析抗癌生物活性肽各组分的组成及各单组分的基本生物合成信息，其中可以获得九个单组分的基本生物合成信息；(2)已确证其中一个单组分，命名为sx1-5并进行异源表达，其体外增免抑瘤作用得到确证；(3)通过BLAST分析发现，sx1-5与来自于人体的负责调控细胞中活性氧分子水平的抗氧化酶家族Peroxiredoxin 5(简写为PRDX5)相似率达89％，通过相似序列具有相似功能的预测，因此推断PRDX5也有类似抗肿瘤活性；(4)对PRDX5进行异源表达，并进行体内活性测定，发现其对结肠癌C26荷瘤小鼠有明显的抑制作用且呈剂量依赖性，对评价药物或药物前体物通过免疫系统杀伤肿瘤的经典——荷B16黑色素瘤小鼠的活性优异，抑瘤率达39.44％。

本发明的目的是，结合hPRDX5在同族其他PRDX酶之间的保守型，截短设计提供一种由13个氨基酸组成的多肽，其特点是具有PD-1/PD-L1抑制活性，并且具有调节机体免疫功能和抑制肿瘤生长的活性，治疗肿瘤安全有效，可作为抗肿瘤药物。

发明内容：

第一方面，本发明提供了具有抗肿瘤活性的多肽的氨基酸序列SEQ ID No：1，所述多肽即为本发明中的IMB-P6。

第二方面，本发明提供了与IMB-P6具有相同功能的变体或衍生物，所述多肽变体或衍生物具有抗肿瘤的活性。

第三方面，本发明提供了药物或药物组合物，其包含本发明的多肽或其药物可接受的盐，以及赋形剂或药用载体。

第四方面，本发明提供了利用本发明的多肽、其变体或衍生物制备抗肿瘤药物或药物组合物的用途，所述药物或药物组合物还包含赋形剂或药用载体。

第五方面，本发明提供了抑制个体的肿瘤细胞或治疗个体的癌症的方法，包括对所述个体进行有效量的本发明的多肽、其变体或衍生物、药物或药物组合物的给药。

附图说明：

图1多肽IMB-P6的质谱图。

图2多肽IMB-P6对PD-1/PD-L1的抑制率。

具体实施方式：

结合hPRDX5在同族其他PRDX酶之间的保守型，截短设计并构建相关多肽库，经活性筛选获得具有PD-1/PD-L1抑制活性的多肽IMB-P6，该多肽对PD-1/PD-L1的抑制活性与百时美施贵宝的药物先导物S7912相当。

由此，一方面，本发明提供了多肽IMB-P6的氨基酸序列，该多肽具有抗肿瘤活性或抑制肿瘤生长。另一方面，提供了具有抗肿瘤活性或抑制肿瘤生长的多肽，其包含IMB-P6的氨基酸序列，或其具有相同功能的变体或衍生物。

本发明的“多肽”或“肽”可以交替使用，“多肽”或“肽”是二种或更多种氨基酸的任意链，无论翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)的情况如何，包括自然发生或非自然发生的氨基酸或氨基酸类似物。

在本领域中，众所周知可以在多肽的结构中进行诸如取代、添加或替换的某些修饰和变化而基本上不改变该多肽的生物学功能，从而得到生物学等同的多肽。

本发明的“多肽”或“肽”可包含有异常连接、交联和末端帽子，非肽键或其它修饰基团。这些修饰基团也在本发明范围之内。术语“修饰基团”是指包括直接附着于所述肽结构(例如，通过共价轭合)的结构，以及那些间接附着于所述肽结构(例如，通过稳定的非共价连接或通过共价偶联于其它的氨基酸残基或其模拟物、类似物或衍生物，其可以位于所述核心肽结构的侧翼)的结构。例如，所述修饰基团可以偶联于肽结构的氨基末端或羧基末端，或偶联于所述核心结构域侧翼的肽或肽模拟结构。或者，所述修饰基团可以耦合于肽结构的至少一个氨基酸残基的侧链，或偶联于所述核心结构域侧翼的肽或肽模拟区域(例如，通过丝氨酸残基或苏氨酸残基的羟基，或在氨基酸侧链上的其它适合的反应基团)。共价偶联于所述肽结构的修饰基团可通过本领域中公知的方式和方法结合于连接性化学结构，包括，例如酰胺、烷氨基、氨基甲酸盐或尿素键。

在本发明的一个实施方式中，本发明的多肽也可以扩展为生物学等同的多肽；或通过保守性氨基酸替换而获得的本发明所述多肽序列的部分序列的变体；或通过不影响生物学功能，例如所述结构域的非保守性替换而获得的本发明所述多肽序列的部分序列的变体。

本文所使用的术语“保守的氨基酸替换”是指在所述多肽的给定位置上一种氨基酸对另一种氨基酸的替换，其中可以在基本上不丧失相关功能的条件下进行所述替换。

保守性的氨基酸替换包括用对应的D-氨基酸或用自然发生的、非遗传编码形式的氨基酸替换L-氨基酸，或者是L-氨基酸的保守性替换。

在某些实施方案中，“保守取代”为用一氨基酸取代另一具有类似特性的氨基酸的取代，从而肽化学领域的技术人员将预料多肽的二级结构和亲水性不会发生实质性改变。氨基酸取代通常基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或兼性性质的相似性进行。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的带有不带电荷的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，甘氨酸和丙氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺，以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。其它可代表保守改变的氨基酸基团包括：(1)Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr；(2)Cys、Ser、Tyr、Thr；(3)Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；(4)Lys、Arg、His；和(5)Phe、Tyr、Trp、His。变体也可以或可择地含有非保守改变。

在其它实施方案中，保守性改变还可包括通过例如氨基酸的官能侧链反应，对非衍生残基进行化学衍生。因此，这些取代基可包括这样的化合物，其游离的氨基被衍生成盐酸胺、ρ-甲苯磺酰基、卞氧羰基、t-丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基。类似地，游离的羧基可被衍生形成盐，甲基或乙基酯或其它类型的酯或肼，且侧链可被衍生形成游离羟基的O-酰基或O-烷基衍生物，或组氨酸咪唑氮的N-亚氨苯甲基组氨酸。多肽类似物还可包括被化学改变的，例如甲基化，通过诸如乙胺、乙醇胺或乙二胺的烷基胺对C-末端氨基酸的酰胺化，或对氨基酸侧链的乙酰化或甲基化的氨基酸。多肽衍生物还可包括用取代的酰胺对酰胺键进行替换或酰胺键的同电子排列体。

本发明的另一方面涉及所述的多肽在制备药物、多肽药物或药物组合物中的用途，所述药物、多肽药物或药物组合物用于治疗和/或预防个体的肿瘤，优选恶性肿瘤或癌症。所述的多肽可以与脂质体、赋形剂或药用载体组成药物或药物组合物。

《实施例1》多肽的设计与合成

本发明所述多肽来源于hPRDX5，结合hPRDX5在同族其他PRDX酶之间的保守型，截短设计获得共计13个氨基酸的小分子多肽，序列如SEQ ID No：1所示。本发明所述多肽采用固相合成法合成，最终产物经过ESI-MS方法鉴定。纯化的多肽质谱图见图1。质谱分析表明，纯化多肽的分子量为1373Da，其分子量与计算值相符。

《实施例2》在体外评估IMB-P6对PD-1/PD-L1的抑制活性

PD-1重组蛋白和PD-L1重组蛋白分别用Dilution Buffer稀释至100nM和2nM，1∶1体积混匀，加入到384孔板中，每孔8μl。用Dilution Buffer稀释10mM DMSO溶解的小分子化合物10倍至1mM，每孔加入2μl稀释好的化合物。封膜后室温孵育15min。用DetectionBuffer将anti-Tag1-EuK稀释到1.83nM，anti-Tag2-XL665稀释到66.7nM。取同体积anti-Tag1-EuK和anti-Tag2-XL665混合，384孔板每孔加入10μl抗体混合液。封膜室温孵育，分别用酶标仪检测1h、2h、3h、5h以及过夜(12h及以上)等时间点的665nm及620nm的吸光度值，根据665nm/620nm的值计算多肽对PD-1/PD-L1结合的抑制率。

本领域技术人员可以理解，可以任意组合上文所述的各种实施方案，以便提供其它的实施方案。而且，在不违背本发明精神的前提下，可对上述实施方案的元素、步骤、特征做出适当的修改和替换，获得其等同的实施方案。

Claims (5)

1.具有靶向PD1/PDL1相互作用的抗肿瘤多肽分子，其特征在于，氨基酸序列为：

Leu-Thr-Cys-Ser-Leu-Ala-Pro-Asn-Ile-Ile-Ser-Gln-Leu。

2.权利要求1所述的抗肿瘤多肽，其特征在于，所述抗肿瘤多肽为直链多肽，含有13个氨基酸残基，分子量大小为1372.46Da。

3.由权利要求1所述的具有PD1/PDL1靶向性的小分子多肽制备得到的抗肿瘤药物分子。

4.抗肿瘤药物组合物，其包含权利要求1所述的多肽以及赋形剂。

5.权利要求1所述的具有PD1/PDL1靶向性的小分子多肽在制备抗肿瘤药物分子中的应用。