CN110073221A - 白细胞粘附功能测定、设备和/或用途 - Google Patents

白细胞粘附功能测定、设备和/或用途 Download PDF

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Abstract

本公开涉及测定(包括但不限于白细胞粘附功能测定(LAFA))、使用此类测定的设备和/或方法。所公开的实施例可以用于诊断、分析和/或预后应用。某些实施例还涉及分层、预测和/或确定一个或多个受试者如何可能和/或正在对药物做出应答。本公开还涉及一种或多种方法，其对服用药物的一个或多个受试者的给药方案进行优化。另外，本公开还涉及最小化或潜在地减少药物副作用。

Description

白细胞粘附功能测定、设备和/或用途
技术领域
本公开涉及测定，其包括但不限于白细胞粘附功能测定(LAFA)、使用此类测定的设备和/或方法。本公开还涉及所公开的实施例在诊断、分析和/或预后应用中的用途。本公开还涉及评估异常活化白细胞粘附分子和/或趋化因子受体。本公开还涉及分层、预测和/或确定一个或多个受试者如何可能和/或正在对药物做出的应答。本公开还涉及优化服用药物的一个或多个受试者的给药方案的一种或多种方法。另外，本公开还涉及最小化或潜在地减少药物副作用。
交叉引用
本申请涉及于2016年10月14日提交的题为“Leukocyte Adhesive FunctionAssays,Devices and/or Uses”的澳大利亚申请号2016904169，并且要求该澳大利亚申请的优先权。该申请通过引用整体并入本文。另外，本公开中提及的其他参考文献或出版物也通过引用整体并入本文。
背景技术
如果本文中提及现有技术出版物，则并不意味着该参考文献在澳大利亚国内或任何其他国家构成本领域公知常识的一部分。
白细胞从循环到周围组织的募集在诱导炎症期间是早期但关键步骤之一。为了从快速行进的血流中募集，白细胞经历与血管内皮的一系列相互作用，这些相互作用包括粘连、滚动、缓慢滚动、牢固粘附、爬行和最终的经内皮迁移。应当理解，这些白细胞和内皮细胞的相互作用依赖于白细胞和内皮细胞两者所表达的特异性膜分子(诸如粘附分子、趋化因子和趋化因子受体)之间的物理相互作用。
首先，循环白细胞经由白细胞表达的PSGL-1(P-选择素糖蛋白配体-1)与其内皮配体(P-选择素和E-选择素)之间的相互作用而沿着内皮表面粘连和滚动。由于趋化因子诱导的细胞活化，所以滚动白细胞随后降低其滚动速度。这允许白细胞β2和α4整合素与其内皮配体(包括细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和血管细胞粘附分子-1(VCAM-1))之间的相互作用，导致白细胞牢固粘附在内皮表面上。粘附白细胞能够使用αL整合素(CD11a)和αM整合素(CD11b)与内皮细胞ICAM-1相互作用，从而在找到白细胞外渗的部位之前，允许白细胞在内皮表面上爬行。
然而，在疾病状况下，这些粘附分子的功能被更改，导致白细胞募集异常和炎症。大量研究已经证明来自患有炎性疾病的患者的组织活检样品中白细胞的异常外观，其与疾病进展期间的不可逆器官损伤相关。例如，已经报道了来自患有多发性硬化症(MS)的患者的白细胞的α4β1整合素表达和活性增加，该多发性硬化症是一种慢性自身免疫性疾病，其特征是由于脑血屏障(BBB)两端的白细胞浸润增加所致的中枢神经系统中的脱髓鞘和轴突变性。为了减弱α4整合素活化，已经开发出了抗人α4整合素抗体那他珠单抗(Natalizumab)。
因而，已经表明那他珠单抗疗法减少脑血屏障两端的白细胞浸润，因此消除疾病进展。因此，识别白细胞粘附功能中的这种异常提供了关于它们离开循环的电位以及它们引起组织损伤的能力的信息。
尽管其在疾病发病机理中的作用，但是在临床设置中使用的当前监测和测试方案中缺少评估白细胞粘附功能的能力。在研究实验室中，平行板流动室技术可以用于研究白细胞和内皮细胞的相互作用。然而，现有技术缺乏在通常临床设置和时间限制下准确评估白细胞迁移和/或白细胞粘附功能的能力。例如，为了研究白细胞的特异性亚组，研究实验室中的细胞通常需要从全血中分离。然后，在不存在其他血液成分(例如，红细胞和血小板)的情况下，分离的白细胞用于流动室测定，其已知是白细胞募集的关键调节剂。该分离过程不仅需要大量的人血液，而且还更改白细胞的活化状态，其可能影响和/或危害以下测定。附加地，目前的成像技术缺乏定量评估特异性粘附分子的粘附功能的能力，从而限制了它们在临床和药物环境中的应用。
本领域需要这些特征和/或缺点中的一个或多个的解决方案。本公开描述了示例性实施例，其解决了本文中所公开的一个或多个特征和/或优点。本公开旨在解决本文中所公开的这些和其他问题。如将从本文中的讨论中变得显而易见的，本公开还旨在克服和/或改善现有技术的至少一个缺点。
发明内容
示例性实施例涉及白细胞粘附功能测定和设备的新用途。
示例性实施例涉及一种或多种白细胞粘附功能测定，用于在现实生理条件下或在模拟、尝试模拟或基本上模拟体内条件的条件下评估白细胞迁移。
示例性实施例涉及测量白细胞粘附于内皮细胞、内皮粘附分子、内皮膜蛋白或其组合的能力的测定。例如，在现实的生理条件下或在模拟、尝试模拟或基本上模拟体内条件的条件下。
示例性实施例涉及白细胞粘附功能测定，其仅需要少量全血、分离的白细胞、培养的白细胞和/或白细胞细胞系。
示例性实施例提供了一种方法(或多种方法)以评估受试者对用于控制疾病进展的药物治疗做出的应答或潜在应答，其中药物能够更改白细胞募集、粘附和/或迁移，该方法包括以下步骤：
从受试者获得血液样品；
对血液样品进行至少一次白细胞功能测定(LAFA)，其中LAFA评估白细胞募集、粘附和/或迁移至以下各项的至少一项或多项：至少一种内皮分子和至少一种细胞；以及
至少部分地基于至少一次LAFA的一个或多个结果，评估受试者对用于控制疾病进展的药物治疗做出的应答或潜在应答。
示例性实施例提供了一种方法(或多种方法)以评估受试者对用于控制疾病进展的药物治疗做出的应答或潜在应答，其中药物能够更改白细胞募集、粘附和/或迁移，该方法包括以下步骤：
从受试者获得血液样品；
对血液样品进行至少一次白细胞功能测定(LAFA)，其中至少一次LAFA在实际生理条件下定量和/或半定量地评估白细胞募集、粘附和/或迁移至以下各项中的至少一项或多项：至少一种内皮分子和表达内皮分子的至少一种细胞；以及
至少部分地基于至少一次LAFA的一个或多个结果，评估受试者对用于控制疾病进展的药物治疗做出的应答或潜在应答。
示例性实施例提供一种方法(或多种方法)以评估一种或多种白细胞分子的粘附功能，该方法包括以下步骤：
从受试者获得血液样品；
对血液样品进行至少一次白细胞功能测定(LAFA)，其中至少一次LAFA在实际生理条件下定量和/或半定量地评估白细胞募集、粘附和/或迁移至以下各项中的至少一项或多项：至少一种内皮分子和表达内皮分子的至少一种细胞；以及
至少部分地基于至少一次LAFA的一个或多个结果，评估一种或多种白细胞分子的活化水平。
示例性实施例提供了用于以下各项中的一项或多项的方法：(1)预测受试者如何可能响应用于控制疾病进展的药物；(2)确定药物是否可以用于控制和/或预防受试者的疾病进展；(3)选择用于预防和/或控制受试者的疾病进展的药物；以及(4)识别用于预防和/或控制受试者的疾病进展的药物，其中该药物能够至少更改一种或多种白细胞与内皮分子的白细胞粘附，所述方法包括以下步骤：
对从受试者获得的至少一种血液样品在体外进行至少一次白细胞粘附功能测定；以及
基于至少一种测定的结果，(a)预测受试者如何可能响应用于控制疾病进展的药物，(b)确定药物是否可以用于控制和/或预防受试者的疾病进展，(c)选择用于预防和/或控制受试者的疾病进展的药物，和/或(d)识别用于预防和/或控制受试者的疾病进展的药物。
示例性实施例提供了用于以下各项中的一项或多项的方法：(1)预测一个或多个受试者如何可能响应用于控制疾病进展的药物，(2)确定药物是否可以用于控制和/或预防一个或多个受试者的疾病进展，(3)选择用于预防和/或控制一个或多个受试者的疾病进展的一种或多种药物，以及(4)识别用于预防和/或控制一个或多个受试者中一种和/或多种疾病的进展的一种或多种药物，其中该一种或多种药物能够至少更改一种或多种白细胞与内皮分子的白细胞粘附，所述方法包括以下步骤：
对从一个或多个受试者获得的至少一个血液样品在体外进行至少一次白细胞粘附功能测定；以及
基于至少一种测定的结果，(a)预测一个或多个受试者如何可能响应用于控制疾病进展的药物，(b)确定一种或多种药物是否可以用于控制和/或预防一个或多个受试者中一种和/或多种疾病的进展，(c)选择用于预防和/或控制一个或多个受试者中一种和/或多种疾病的进展的一种或多种药物，和/或(d)识别用于预防和/或控制一种或多种受试者中一种和/或多种疾病的进展的一种或多种药物。
示例性实施例提供了一种方法：(1)预测受试者如何可能响应用于控制疾病进展的药物，(2)确定药物是否可以用于控制和/或预防受试者的疾病进展，(3)选择用于预防或控制受试者的疾病进展的药物，和/或(4)识别用于预防或控制受试者的疾病进展的药物，其中该药物能够更改白细胞与内皮分子的粘附，所述方法包括以下步骤：
对从受试获得的至少一种血液样品在体外进行至少一次白细胞粘附功能测定；以及
基于该测定的结果，(a)预测受试者如何可能响应用于控制疾病进展的药物，(b)确定药物是否可以用于控制和/或预防受试者的疾病进展，(c)选择用于预防或控制受试者的疾病进展的药物，和/或(d)识别用于预防和/或控制受试者的疾病进展的药物。
示例性实施例涉及一种确定施用用于控制疾病进展的药物的受试者如何对该药物做出应答的方法，其中该药物能够更改白细胞与内皮分子的粘附，所述方法包括以下步骤：
对从受试者获得的含有药物的至少一种血液样品在体外进行至少一次白细胞粘附功能测定；以及
基于测定结果，确定受试者如何对药物做出应答。
示例性实施例涉及确定施用用于控制疾病进展的一种或多种药物的受试者如何对该一种或多种药物做出响应的方法，其中该一种或多种药物能够更改白细胞与至少一种内皮分子的粘附。所述方法包括以下步骤：
对从受试者获得的含有药物的至少一种血液样品在体外进行至少一次白细胞粘附功能测定；以及
基于测定结果，确定受试者如何对药物做出应答。
示例性实施例提供了优化至少一个受试者的给药方案的方法，该受试者服用用于控制一种或多种疾病的进展的一种或多种药物，其中该一种或多种药物能够至少部分地更改白细胞与一种或多种内皮分子的粘附，所述方法包括以下步骤：
对从受试者获得的含有药物的至少一种血液样品在体外进行至少一次白细胞粘附功能测定；以及
基于测定结果，优化受试者的药物给药方案以控制疾病进展。
示例性实施例提供了优化受试者的给药方案的方法，该受试者服用用于控制疾病进展的药物，其中该药物能够至少部分地更改白细胞与内皮分子的粘附，所述方法包括以下步骤：
对从受试者获得的含有药物的至少一种血液样品在体外进行至少一次白细胞粘附功能测定；以及
基于测定结果，优化受试者的药物给药方案以控制疾病进展。
示例性实施例提供了用有效药物剂量和/或剂量范围治疗患者并减少由于施用有效药物剂量和/或剂量范围而产生的副作用的方法，其中药物能够至少部分地更改白细胞与一种或多种内皮分子的粘附，所述方法包括以下步骤：
(1)在一时间段内对受试者施用已知量的药物；
(2)在步骤(1)之后，对从受试者获得的血液样品进行体外白细胞粘附功能测定；以及
(3)至少部分地基于测定的结果，重复步骤(1)和(2)，直到可以确定受试者的最小有效药物剂量或药物剂量范围为止。
示例性实施例提供了一种确定用于控制疾病进展的给受试者的最小有效药物剂量的方法，其中该药物能够更改白细胞与内皮分子的粘附，所述方法包括以下步骤：
(1)在预定时间段内对受试者施用已知量的药物；
(2)在步骤(1)之后，对从受试者获得的含有药物的血液样品进行体外白细胞粘附功能测定；以及
(3)基于测定结果，重复步骤(1)和(2)，直到可以确定用于控制疾病进展的给受试者的最小有效药物剂量为止。
示例性实施例提供一种或多种流动测定或一种或多种流动设备，其用于执行本文中所公开的一种或多种方法。
示例性实施例提供了生成至少一个受试者的白细胞粘附谱的方法，所述方法包括以下步骤：
对至少一种血液样品在体外进行至少一次白细胞粘附功能测定，以便评估不同白细胞亚组与一种或多种不同内皮分子的粘附功能；以及
使用以下各项中的一项或多项的测定结果：识别一种或多种白细胞异常；确定个性化发病机理；识别一种或多种疾病标志物；识别一种或多种疾病的早期症状；疾病预测；疾病预防；协助早期和/或准确诊断；为受试者开发有效且个性化的治疗；监测一个或多个受试者的健康状况；无论疾病如何，对不同受试者进行分组；无论疾病诊断如何，为一个或多个受试者开展治疗；在疾病诊断之前，推荐治疗；在病因不明和/或没有疾病诊断的情况下，推荐治疗；以及在疾病诊断未知的情况下，推荐治疗。
示例性实施例提供了一种生成受试者的白细胞粘附谱的方法，所述方法包括以下步骤：
对从受试者获得的至少一种血液样品在体外进行至少一次白细胞粘附功能测定，以便基本上同时定量地评估不同白细胞亚组与一种或多种不同内皮分子的粘附功能；以及
使用以下各项中的一项或多项的测定结果：识别白细胞异常；确定个性化发病机理；识别疾病的新疾病标志物；识别疾病的早期症状；疾病预测；疾病预防；协助早期和准确诊断；为受试者开发有效且个性化的治疗；监测受试者的健康(健康状况)；无论疾病如何，对不同受试者进行分组；以及无论疾病诊断如何，为受试者开展治疗。
附图说明
参考附图，仅通过示例对本公开的实施例进行描述。
图1A至图1I图示了根据示例性实施例的Mn2+处理对VCAM-1底物上CD4、CD8和CD15细胞的迁移谱的不同影响。图1A图示了使用缀合到全血中不同荧光团的抗体标记的CD4(绿色)、CD8(红色)和CD15(青色)细胞，允许同时检测到这些白细胞亚组。使用微流体通道评估VCAM-1底物上的细胞募集。在图1A中，示出了对照(左)和Mn2+处理(右)血液样品的代表性截图。图1B示出了Mn2+对相互作用的CD4、CD8和CD15细胞数量的影响。全部相互作用的CD4(图1C)、CD8(图1D)和CD15(图1E)细胞根据其细胞平均速度(Smean)分为4组：S，静态细胞(Smean<5μm/min)；C，爬行细胞(Smean＝5-20μm/min)；SR，缓慢滚动细胞(Smean＝20-300μm/min)；以及R，滚动细胞(Smean＝300-6000μm/min)。确定Mn2+对每组的细胞数量的影响。更进一步地，还评估了Mn2+对相互作用的CD4、CD8和CD15细胞的平均速度(图1F)、停留时间(图1G)和直线度(图1H)的影响。在图1B至图1H中，数据表示每组n＝10个独立受试者的均值±SEM。在图1I中，引入抗人CD16-BV510抗体以识别CD16+CD15+双阳性细胞(嗜中性粒细胞)。结果，在对照和Mn2+处理的样品中计算CD16+CD15+细胞在总CD15+细胞中的百分比，并且在图1I中说明。在图1I中：(n＝4)，*，p<0.05；**，p<0.01。
图2A至图2C图示了根据某些示例性实施例的那他珠单抗抑制VCAM-1底物上的CD4、CD8和CD15细胞募集。使用示例1中描述的微流体通道系统，在分析之前用各种剂量的那他珠单抗处理血液。确定了那他珠单抗对对照(圆圈)和Mn2+处理的(方形)CD4(图2A)、CD8(图2B)和CD15(图2C)细胞的募集的影响。每条曲线上方的数字指示没有经过那他珠单抗处理的相互作用的细胞的数量。数据代表每组n＝4-6个受试者的均值±SEM。
图3A至图3F示出了根据某些示例性实施例的低(10μg/ml)和高(300μg/ml)剂量的那他珠单抗对白细胞牢固粘附在TNFα活化的HUVEC上的抑制效果。使用平行板流动室系统评估那他珠单抗对白细胞与TNFα活化的HUVEC的相互作用的影响。在用于流动测定之前，使用全血中Hoechst33342标记白细胞。在5分钟内以高帧速率(每秒2帧)获取图像以捕获所有类型的细胞相互作用。在没有那他珠单抗或使用低剂量(10μg/ml)的那他珠单抗的情况下处理全血，并且确定相互作用的白细胞的数量和它们的平均速度，并且分别在图3A和图3B中示出。在相同的实验中，还评估了低剂量那他珠单抗对静态、爬行、缓慢滚动和滚动细胞的各部分的影响(图3C)。数据代表每组n＝7个受试者的均值±SEM。在单独的实验中，确定高剂量(300μg/ml)那他珠单抗对相互作用的细胞数量(图3D)、细胞速度(图3E)和四种细胞相互作用类型(图3F)的影响。数据代表每组n＝6个受试者的均值±SEM。*，p<0.05；**，p<0.01。
图4A至图4F图示了低剂量和高剂量那他珠单抗更改TNFα活化的HUVEC上的CD4和CD15细胞而非CD8细胞的细胞迁移行为。根据某些示例性实施例，使用平行板流动室系统评估那他珠单抗对TNFα活化的HUVEC上的缓慢移动(静态和爬行)白细胞的迁移行为的影响。使用缀合到未经处理的全血中的不同荧光团的抗体对CD4、CD8和CD15细胞进行标记，允许同时检测到这些白细胞亚组。在30分钟内以低帧速率(每30秒1个堆栈)将数据记录为3D图像堆栈，允许捕获缓慢移动细胞的详细3D运动。在用于流动测定之前，在没有那他珠单抗或使用低剂量(10μg/ml)的那他珠单抗的情况下处理人全血。确定了相互作用的CD4、CD8和CD15细胞的数量(图4A)、以及它们的直线度(图4B)和平均速度(图4C)。数据代表n＝5个血液供体/组的均值±SEM。在单独的实验中，在流动测定之前，在没有那他珠单抗或使用高剂量(300μg/ml)的那他珠单抗的情况下处理全血。然后，评估那他珠单抗对相互作用的细胞数量(图4D)、直线度(图4E)和速度(图4F)的影响。数据代表每组n＝6个受试者的均值±SEM。*，p<0.05；**，p<0.01。
图5A至图5C示出了共同原点图显示Mn2+抑制VCAM-1底物上的CD4和CD8细胞而非CD15细胞的运动性。根据某些示例性实施例，使用微流体系统研究VCAM-1诱导的白细胞募集。在测定之前，在没有5mM Mn2+或使用5mM Mn2+的情况下处理人血。分析图像并且跟踪相互作用的细胞。通过将所检测到的轨迹归一化到同一原点坐标来获得每个白细胞亚组的共同原点图。
图6A至图6C示出了共同原点图显示低剂量和高剂量那他珠单抗抑制TNFα活化的HUVEC上的CD4和CD15细胞而非CD8细胞的细胞运动性。根据某些示例性实施例，使用流动室技术研究TNFα活化的HUVEC上的细胞迁移行为。在用于流动测定之前，在没有那他珠单抗或使用低(10μg/ml)或高(300μg/ml)剂量的那他珠单抗的情况下处理人全血。如图5所示，生成共同原点图。
图7示出了根据示例性实施例的现场医护血液测试流程图。
图8A和图8B示出了根据某些示例性实施例的配体占据测定以检查那他珠单抗对CD4淋巴细胞上的α4整合素的占据。在用于配体占据测定之前，使用或不用5mM MnCl2活化细胞。使用不同剂量的那他珠单抗处理细胞，并且使用PE缀合的抗人IgG二抗检测那他珠单抗占据。通过FACS测定PE阳性细胞(A)和CD4淋巴细胞(B)的PE MFI的百分比。数据代表每组n＝3-4个受试者的均值±SEM。
图9A至图9H示出了根据某些示例性实施例的Mn2+处理对MAdCAM-1底物上CD4和CD8细胞的迁移谱的影响。在用于LAFA之前，在约5分钟内，在室温下使用或不用5mM Mn2+处理从健康志愿者收集的血液样品。A：Mn2+对相互作用的CD4、CD8、CD15和CD19细胞的数量的影响。还评估了相互作用的CD4、CD8、CD15和CD19细胞的平均速度(B)、直线度(C)和停留时间(D)。基于它们的平均迁移速度，全部相互作用的细胞分为静态(<5μm/min)、爬行(5-20μm/min)、缓慢滚动(20-300μm/min)和滚动细胞(300-6000μm/min)。Mn对每种相互作用的细胞的数量的影响分别在9E(CD4)、9F(CD8)、9G(CD15)和9H(CD19)中示出。数据代表每组n＝14个单独受试者的均值±SEM。
图10A至图10D图示了根据某些示例性实施例的维多珠单抗减弱了CD4细胞和MAdCAM-1底物之间的相互作用。使用如图1中的微流体通道系统，在分析之前，使用不同剂量的维多珠单抗处理血液。在不存在(蓝色圆圈)和存在(红色方形)Mn2+的情况下，确定了维多珠单抗对相互作用的CD4(A)和CD8(C)细胞的数量、以及CD4(B)和CD8(D)细胞的速度的影响。每条曲线上方的数字显示了没有经过维多珠单抗处理的相互作用的细胞的数量和它们的速度。数据代表每组n＝3-4个受试者的均值±SEM。
图11图示了根据某些示例性实施例的配体占据测定以检查维多珠单抗对CD4淋巴细胞上的α4β7整合素的占据。在用于配体占据测定之前，使用或不用5mM MnCl2活化细胞。使用不同剂量的维多珠单抗处理细胞，并且使用PE缀合的抗人IgG二抗检测维多珠单抗占据。通过FACS确定PE阳性CD4细胞的百分比。数据代表每组n＝2个受试者的均值±SEM。
图12图示了根据某些示例性实施例的维多珠单抗对VCAM-1底物上的白细胞募集的影响。在用于白细胞粘附功能测定之前，使用或不用10和100μg/ml的维多珠单抗处理全血。然后，确定相互作用的CD4、CD8、CD15和CD19细胞的数量。数据代表每组n＝3个受试者的均值±SEM。
图13图示了根据某些示例性实施例的那他珠单抗对MAdCAM-1底物上的白细胞募集的影响。在使用MAdCAM-1作为底物用于白细胞粘附功能测定之前，使用或不用10μg/ml的那他珠单抗处理全血。然后，确定相互作用的CD4和CD8细胞的数量。数据代表每组n＝4个受试者的均值±SEM。
图14A至图14D示出了根据某些示例性实施例的那他珠单抗和维多珠单抗对P选择素和E选择素底物上的白细胞募集的影响。在使用P选择素和E选择素作为底物用于LAFA分析之前，使用10μg/ml那他珠单抗或维多珠单抗处理血液。然后，如示例1中所述，确定相互作用的细胞的数量(A)、速度(B)、停留时间(C)和直线度(D)。数据代表每组n＝4-6个单独受试者的均值±SEM。*，p<0.05。
图15A至图15C示出了白细胞CXCR1和CXCR4功能的评估。根据某些示例性实施例，在用于LAFA分析之前，VCAM-1与微流体通道上的IL-8或SDF1α共涂覆。然后，确定相互作用的CD4、CD8和CD15细胞的数量(A)、它们的平均直线度(B)和停留时间(C)，如示例1中所述。数据代表每组n＝6-8个单独受试者的均值±SEM。*，p<0.05。
图16A至图16P示出了根据某些示例性实施例的来自个体IBD患者的CD4和CD8细胞对维多珠单抗处理的发散应答。从患有活动性炎性肠病的患者收集血液样品。在使用MAdCAM-1作为粘附底物通过LAFA示例性实施例进行分析之前，使用0.1μg/ml维多珠单抗处理血液。然后，如示例10中详述的，确定IBD患者#1的相互作用的CD4(A)和CD8(C)细胞的数量及其速度(B和D)。还确定了IBD患者#2(E-H)、患者#3(I-L)和患者#4(M-P)的相同参数。
图17A至图17B示出了根据某些示例性实施例的经历那他珠单抗疗法的MS患者中药物功效的检测。在输注那他珠单抗后的各个时间点(2、4、6、10周)收集血液样品，然后，使用VCAM-1作为粘附底物通过LAFA示例性实施例进行分析。然后，如示例1中所描述的，确定CD4相互作用的细胞的数量(图17A)及其停留时间(图17B)。包括了来自考帕松(Copaxone)疗法的患者的血液样品作为阴性对照组。
图18A至图18J图示了根据某些示例性实施例的α4β1(VCAM-1的配体)粘附功能的个人谱(白细胞粘附指纹)。在大约三个月的时段期间，在不同的时间点从单个健康血液供体收集六个血液样品。当进行血液测试#5(方形)时，该血液供体患有智齿疼痛。在血液测试#5之前7天执行血液测试#4。如示例1和4中所描述的，使用VCAM-1作为底物，在存在或不存在5mM MnCl2的情况下通过LAFA示例性实施例分析血液。然后，确定相互作用的CD4细胞的数量(A)、细胞速度(B)、直线度(C)、停留时间(D)和停留时间活化电位比(DTAPR)(E)。还评估了CD8白细胞(F至J)的相同参数。
图19A至图19J图示了根据某些实施例的α4β7(MAdCAM-1的配体)粘附功能的个人谱。在大约三个月的时段期间，在不同的时间点从单个健康血液供体收集六个血液样品。当进行血液测试#5(方形)时，该血液供体患有智齿疼痛。在血液测试#5之前7天执行血液测试#4。如示例10和11中所描述的，使用MAdCAM-1作为底物，在存在或不存在5mM MnCl2的情况下通过LAFA示例性实施例分析血液。然后，确定了相互作用的CD4细胞的数量(A)、细胞速度(B)、直线度(C)、停留时间(D)和直线度活化电位比(STAPR)(E)。还评估了CD8白细胞(F至J)的相同参数。
图20A至图20L图示了根据某些示例性实施例的PSGL-1(P-选择素的配体)粘附功能的个人谱。在大约六周的时段期间，在不同的时间点从单个健康血液供体收集四个血液样品。当进行血液测试#5(方形)时，该血液供体患有智齿疼痛。在血液测试#5之前7天执行血液测试#4。如示例16中所描述的，使用P-选择素作为底物，通过LAFA示例性实施例分析血液。然后，确定了相互作用的CD4细胞的数量(图20A)、细胞速度(图20B)、直线度(图20C)和停留时间。还评估了CD8白细胞(图E至H)和CD15白细胞(图20I至L)的相同参数。
图21A至图21F示出了根据某些示例性实施例的评估α4β1整合素和α4β7整合素在患有多发性硬化(MS)和/或炎性肠病(IBD)的患者中的基础炎性状态。根据某些示例性实施例，从健康对照、MS和IBD患者收集血液样品，然后，使用VCAM-1和MAdCAM-1作为底物通过LAFA示例性实施例进行分析。如示例3和11中所详述的，计算VCAM-1底物上的相对直线度指数(RSTI)(图21A)、相对速度指数(RSI)(图21B)和相对停留时间指数(RDTI)(图21C)。类似地，确定了MAdCAM-1上的RSTI(图21D)、RSI(图21E)和RDTI(图21F)。图表上的每个点都呈现一个单独受试者。*：p<0.05，**：p<0.01，与对应健康对照有关。
图22A至图22F图示了根据某些示例性实施例的评估α4β1整合素和α4β7整合素在患有多发性硬化(MS)和炎性肠病(IBD)的患者中的Mn2+诱导的活化电位。从健康对照、MS和IBD患者收集血液样品，然后，使用VCAM-1和MAdCAM-1作为底物通过LAFA示例性实施例进行分析。如示例4中详述的，计算VCAM-1底物上的直线度活化电位比(STAPR)(图22A)、速度活化电位比(SAPR)(图22B)和停留时间活化电位比(DTAPR)(图22C)。类似地，还确定了MAdCAM-1底物上的STAPR(图22D)、SAPR(图22E)和ATAPR(图22F)。图表上的每个点都显示一个单独受试者。*：p<0.05，**：p<0.01，与对应健康对照有关。
图23示出了根据某些示例性实施例的依据维多珠单抗剂量抑制MAdCAM-1底物上来自IBD患者的CD4白细胞的募集。从IBD患者收集血液样品，然后，在使用MAdCAM-1作为底物用于LAFA示例性实施例之前，使用一定剂量范围的维多珠单抗处理。然后，在个体IBD患者中确定维多珠单抗IC50值，如示例12中所详述的。
图24A至图24H：根据某些示例性实施例，评估在患有多发性硬化(MS)和/或炎性肠病(IBD)的患者中白细胞表达CXCR1和CXCR4的功能。从健康受试者(n＝8)、MS患者(n＝2)和IBD患者(n＝4)收集血液，然后，使用VCAM-1+IL-8或VCAM-1+SDF1α作为底物用于LAFA示例性实施例，如示例17中所详述的。然后，确定VCAM-1+IL-8底物上的相互作用的CD4、CD8和CD15白细胞的数量(图24A)、细胞速度(图24B)、直线度(图24C)和停留时间(图D)，如示例1中所详述的。同样，还评估VCAM-1+SDF1α底物上的参数(图E至图H)。*，p<0.05，**，p<0.01。
图25A至图25D图示了根据某些示例性实施例的评估MS和/或IBD患者中白细胞PSGL-1粘附功能。从健康对照(n＝6)、MS患者(n＝2)和IBD患者(n＝4)收集血液样品，然后，使用P和E选择素作为底物通过LAFA示例性实施例进行分析，如示例16中所详述的。然后，确定相互作用的细胞的数量(图25A)、速度(图25B)、直线度(图25C)和停留时间(图25D)，如示例16中所详述的。*：p<0.05。
图26图示了根据某些示例性实施例的降低那他珠单抗诱导的PML风险的模型。在药物输注后，那他珠单抗饱和水平将逐渐降低至低于最大功效至某个点(例如，80％)，其中仍可以维持完整药物功效，这可以被定义为药物再给药窗口。将药物饱和度降低至低于最大药物功效可以导致白细胞募集和/或免疫应答的重建，其可以使免疫系统恢复对JCV感染做出应答并且消除该JCV感染的能力，从而降低PML的风险。通过LAFA示例性实施例，可以在一个或多个受试者中准确地识别该药物再给药窗口。
图27图示了图像和数据分析的流程图。根据某些示例性实施例，使用来自斐济图像分析软件的Trackmate来处理和分析在白细胞粘附功能测定(LAFA)中捕获的图像。Trackmate的输出由R程序进行进一步分析，以生成描述性统计。还指示了图像分析过程中所牵涉的5个程序的用途。
具体实施方式
参考一个或多个实施例对本发明进行更详细的描述，其一些示例在附图中说明。示例和实施例通过解释来提供，并且不应视为对本公开的范围的限制。此外，作为一个实施例的一部分说明或描述的特征可以由其自身使用以提供其他实施例，并且作为一个实施例的一部分说明或描述的特征可以与一个或多个其他实施例一起使用以提供进一步的实施例。本公开涵盖这些变型和实施例以及其他变型和/或修改。
如所提及的，示例性实施例涉及白细胞粘附功能测定和/或设备的新用途。
白细胞粘附功能测定可以用于确定一个或多个受试者如何做出反应或可以对一种药物和/或多种药物的组合做出反应。在某些示例性实施例中，当白细胞粘附功能测定用于确定一个或多个受试者如何做出反应或可以对一种药物和/或多种药物的组合做出反应时，可以存在本文中所讨论的一个或多个优点。这些优点中的一个或多个也可以在本申请中公开的白细胞粘附功能测定示例性实施例的其他用途中找到。其优点是体外功能测定可以用于预测药物在体内的效果。这样做的一个优点是药物无应答者可以通过定量评估药物靶标的活化水平而与药物应答者区分开来。这样做的另一个优点是可以在个性化的基础上对受试者进行治疗。也就是说，可以针对每个受试者优化或充分优化药物给药方案，即，至少部分地基于测定结果来针对个体受试者的需要进行定制。另一个优点是不需要对受试者施用大于实现治疗效果所必需的药物。又一个优点是可以通过施用最小治疗有效量和/或范围减少由某些药物引起的不希望的副作用。该优点可能与那些具有病理性和/或危及生命的副作用的药物有关。通过确定受试者的最小治疗有效量和/或范围，可以更安全地施用这些药物而副作用较少。白细胞粘附功能测定的另一个优点是它可以提供更准确的药物有效性评估，而不管血清药物浓度如何。白细胞粘附功能测定的另一个优点是它可以提供更准确的药物有效性评估，并且可能与血清药物浓度无关。示例性LAFA实施例直接评估药物对白细胞的功能影响，从而更有效地评估药物有效性。与药物血清水平的常规测量不同，某些LAFA实施例提供功能性读数以指示药物功效，其较少受到其他因素的干扰(与常规方法相比)，这些因素包括但不限于药物血清浓度和/或抗药物抗体。例如，抗药物抗体的产生可以显著降低某些药物的药物活性，其不能通过简单地测量药物血清水平来检测。另一方面，LAFA示例性实施例可以容易地从抗药物抗体检测到这些影响，从而与其他常规方法相比显示出LAFA示例性实施例的准确性和/或敏感度优势。
例如，在某些示例性实施例中，白细胞粘附功能测定可以用于以下各项中的一项或多项：(a)预测受试者如何可能对用于控制疾病进展的药物做出应答，(b)确定药物是否可以用于控制或预防受试者的疾病进展；(c)选择用于预防或控制受试者的疾病进展的药物，和(d)识别用于预防或控制受试者的疾病进展的药物。
在某些示例性实施例中，提供了一种方法：(a)预测受试者如何可能对用于控制疾病进展的药物做出应答，(b)确定药物是否可以用于控制或预防受试者的疾病进展；(c)选择用于预防或控制受试者的疾病进展的药物，以及(d)识别用于预防或控制受试者的疾病进展的药物，其中该药物能够更改白细胞与内皮分子的粘附，所述方法包括以下步骤：
对从受试者获得的至少一种血液样品在体外进行至少一次白细胞粘附功能测定；以及
基于测定结果，(a)预测该至少一个受试者如何可能对用于控制疾病进展的药物做出响应，(b)确定药物是否可以用于控制或预防受试者的疾病进展；(c)选择用于预防或控制受试者的疾病进展的药物，和(d)识别用于预防或控制受试者的疾病进展的药物。
该一种方法(或多种方法)可以用于个性化药品。
该一种方法(或多种方法)可以用于区分药物应答者和药物无应答者。
该一种方法(或多种方法)可以用于测试许多受试者，用于受试者分层(患者分组)。
该一种方法(或多种方法)可以包括以下步骤：根据测定结果，对受试者进行用于控制疾病进展的药物试验。
该一种方法(或多种方法)可以包括以下步骤：根据测定结果，使用用于控制疾病进展的药物治疗受试者。
该一种方法(或多种方法)可以包括以下步骤：根据测定结果，确定用于控制疾病进展的药物的有效最小治疗剂量，同时使由药物引起的不希望的副作用最小化。药物剂量可以允许在体内恢复白细胞与内皮细胞的最小的相互作用，以便最小化或预防诸如进行性多灶性白质脑病(PML)之类的病理。也就是说，药物可以是免疫抑制药物，并且最小治疗药物剂量可以允许最小的免疫应答恢复，同时在体内维持足够的药物功效，以便最小化例如PML的风险。
该一种方法(或多种方法)可以包括以下步骤：根据测定结果，优化用于控制疾病进展的给受试者的药物的给药方案，例如，通过更改药物剂量或改变顺序施药之间的时间长度。
该一种方法(或多种方法)可以用于预测或确定药物(即，化合物、化学品、分子、试剂、生物制剂、抗体或其他)是否可以用于控制先前没有指示的药物的疾病的进展。
该一种方法(或多个方法)的一次测定或多次测定可以包括以下步骤：识别粘附畸形或异常或药物靶标，然后基于药物靶标来选择用于控制疾病进展的适当药物。
该一种方法(或多种方法)的一次测定或多次测定可以包括以下步骤：识别粘附畸形或异常或药物靶标，然后基于药物靶标和那些靶标的药物的参考数据库来选择用于控制疾病进展的合适药物。这样，实际上不需要诊断和/或识别和/或得知疾病本身。
该一种方法(或多种方法)的一次测定或多次测定可以包括以下步骤：构建药物靶标和药物的数据库。可以基于已知药物靶标和药物来构建数据库。可以基于体内药物治疗来构建数据库。
该方法的测定可以包括以下步骤：一次测定多于一个的粘附畸形或异常或药物靶标(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个药物靶标或者更多个)。
该一种方法(或多个方法)的一次测定或多次测定可以包括以下步骤：测定以下各项中的一项或多项：一种或多种粘附畸形、一种或多种异常、以及一种或多种药物靶标。例如，一种或多种粘附畸形、一种或多种异常和/或一种或多种药物靶标中的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
该一种一种方法(或多个方法)可以是高吞吐量测定，一次测试多个粘附畸形或异常或药物靶标。
该一种方法(或多种方法)可以用于生成受试者的白细胞粘附指纹(白细胞粘附功能的个人谱)。
该一种方法(或多种方法)可以用于识别受试者中的不同白细胞畸形或异常。
该一种方法(或多种方法)可以用于识别疾病标志物。
该一种方法(或多种方法)可以用于对个体/受试者进行分组(无论疾病如何)。
该一种方法(或多种方法)可以用于为受试者开展治疗，无论疾病诊断如何。
该一种方法(或多种方法)可以用于体内或体外的高吞吐量药物筛选。
该一种方法(或多种方法)可以用于实验室动物的工业规模药物筛选。
例如，在示例性实施例中，可以使用白细胞粘附功能测定来确定施用用于控制疾病进展的药物的受试者如何对该药物做出应答。
在某些示例性实施例中，提供了一种确定施用用于控制疾病进展的药物的受试者如何对该药物做出应答的方法，其中该药物能够更改白细胞与内皮分子的粘附，所述方法包括以下步骤：
对从受试者获得的含有药物的至少一种血液样品在体外进行至少一次白细胞粘附功能测定；以及
基于测定结果，确定受试者如何对药物做出应答。
该一种方法(或多种方法)可以用于个性化药品。
该一种方法(或多种方法)可以用于区分药物应答者和药物无应答者。
该一种方法(或多种方法)可以用于测试许多受试者，用于受试者分层(患者分组)。
该一种方法(或多种方法)可以用于体内或体外的高通量药物筛选。
该一种方法(或多种方法)可以用于实验室动物的工业规模药物筛选。
该一种方法(或多种方法)可以包括以下步骤：根据测定结果，确定用于控制疾病进展的给受试者的药物的有效最小治疗剂量，同时使由药物引起的不希望的副作用最小化。药物剂量可以允许在体内恢复白细胞与内皮细胞的最小的相互作用，以便最小化或预防诸如进行性多灶性白质脑病(PML)的病理。
该一种方法(或多种方法)可以包括以下步骤：根据测定结果，优化用于控制疾病进展的给受试者的药物的给药方案，例如，通过更改药物剂量或改变顺序施药之间的时间长度。
例如，在某些示例性实施例中，可以使用白细胞粘附功能测定来优化服用用于控制疾病进展的药物的受试者的给药方案。
在某些示例性实施例中，提供了优化服用用于控制疾病进展的药物的受试者的给药方案的方法，其中该药物能够更改白细胞与内皮分子的粘附，所述方法包括所述以下步骤：
对从受试者获得的含有药物的至少一种血液样品在体外进行至少一次白细胞粘附功能测定；以及
基于测定结果，优化受试者的药物给药方案以控制疾病进展。
该一种方法(或多种方法)可以包括以下步骤：根据测定结果，确定用于控制疾病进展的给受试者的药物的有效最小治疗剂量，同时使由药物引起的不希望的副作用最小化。药物剂量可以允许在体内恢复白细胞与内皮细胞的最小的相互作用，以便最小化或预防诸如进行性多灶性白质脑病(PML)的病理。也就是说，药物可以是免疫抑制药物，并且最小治疗药物剂量可以允许最小的免疫应答恢复，同时在体内维持足够的药物功效，以便最小化例如PML的风险。
该一种方法(或多种方法)可以包括以下步骤：根据测定结果，优化用于控制疾病进展的给受试者的药物给药方案，例如，通过更改药物剂量或改变顺序施药之间的时间长度。每次进行测定时，可以相应地优化给药方案或最小有效药物剂量。
该一种方法(或多种方法)可以提供药物有效性的准确评估，无论血清药物浓度如何。
例如，在某些示例性实施例中，在其他实施例中，白细胞粘附功能测定可以用于确定用于控制疾病进展的给受试者的最小有效药物剂量。
在某些示例性实施例中，提供了一种确定用于控制疾病进展的给受试者的最小有效药物剂量的方法，其中该药物能够更改白细胞与内皮分子的粘附，所述方法包括以下步骤：
(1)在预定的时间段内对受试者施用已知量的药物；
(2)在步骤(1)之后，对从受试者获得的含有药物的血液样品进行体外白细胞粘附功能测定；以及
(3)基于测定结果，重复步骤(1)和(2)，直到可以确定用于控制疾病进展的给受试者的最小有效药物剂量为止。
该一种方法(或多种方法)可以包括：最小化由药物引起的不希望的副作用。
该一种方法(或多种方法)可以包括以下步骤：根据测定结果，优化用于控制疾病进展的给受试者的药物给药方案(如前所述)。
可以使用IC50或IC99测试受试者的药物敏感度以获得最小有效药物剂量。
最小有效药物剂量可以允许在体内恢复白细胞与内皮细胞的最小的相互作用，以便最小化或预防诸如进行性多灶性白质脑病(PML)的病理。也就是说，药物可以是免疫抑制药物，并且最小治疗药物剂量可以允许最小的免疫应答恢复，同时在体内维持足够的药物功效，以便最小化例如PML的风险。
在某些示例性实施例中，提供了一种用于实施本文中所公开的其他示例性实施例中所描述的方法的流动测定或流动设备。
在一些实施例中，该方法可能需要执行白细胞粘附功能测定以识别白细胞粘附异常，基于白细胞粘附异常的性质来选择合适的药物，以及确定药物对白细胞粘附异常的影响。
这可能需要进行以下步骤：1.对从受试者获得的血液样品进行白细胞粘附功能测定以识别白细胞异常；2.选择可能用于此类异常的合适候选药物(或多于一种候选药物)；3.在体外用各种剂量的合适候选药物处理血液样品；4.执行进一步的白细胞粘附功能测定，以测试候选药物对白细胞异常的影响；5.为受试者选择最佳或最有效的药物；6.对受试者施用药物；7.在给药后的不同时间点从受试者中采集血液；以及8.进行白细胞粘附功能测定以确认受试者的药物效果。
确定药物在人受试者中的效果可能需要进行以下步骤：1.从受试者收集血液；2.进行第一次白细胞粘附功能测定以获得基线；3.对受试者施用药物；以及4.在给药后的各个时间点进行白细胞粘附功能测定以确定药物效果。
确定药物在动物模型/实验室动物受试者(小鼠、灵长类动物等)中的效果可能需要进行以下步骤：1.从受试者收集血液；2.进行第一次白细胞粘附功能测定以获得基线；3.以不同剂量对受试者施用药物(每个剂量将是独立测定)；以及4.在给药后的各个时间点进行白细胞粘附功能测定以确定药物效果。
可替代地，可以使用体外模型。这可能需要执行以下步骤：1.从受试者收集血液；2.施用不同剂量的药物处理血液；以及3.在药物治疗开始后的各个时间点执行白细胞粘附功能测定，以确定药物效果以及达到这种效果所需的时间。这可以以高吞吐量方式完成。
药物
应当理解，如本文中所用的术语“药物”包括对受试者具有生理作用的化合物、化学品、分子、试剂、生物制剂、抗体、其他部分及其组合，无论该药物功能是否已知或未知。可以用于本文所述方法的合适类型的药物提供了药物能够更改白细胞与内皮分子的粘附，无论药物功能是否已知或未知。在某些示例性实施例中，药物可以是白细胞粘附的抑制剂或启动子(激动剂)。在某些示例性实施例中，药物是白细胞粘附的抑制剂。例如，可以开发药物用于与白细胞粘附功能无关的目的。然而，一旦由一个或多个受试者施用，该药物可能对该受试者具有多种影响。因此，通过在药物施用后分析来自该受试者的血液样品，可以确定该药物对白细胞粘附功能的潜在影响。另外，在通过LAFA示例性实施例分析之前，还可以通过用血液样品对该药物进行体外处理来预测药物对白细胞粘附功能的影响。因此，LAFA示例性实施例提供了识别药物和/或化合物对白细胞粘附功能的未知和/或脱靶和/或副作用的工具。
在一些实施例中，药物可以直接干扰白细胞与内皮分子的结合。在一些实施例中，药物可以间接干扰白细胞与内皮分子的结合。在一些实施例中，药物可以靶向、结合、缔合或以其他方式干扰白细胞的白细胞粘附分子或其他结合分子。在一些实施例中，药物可以靶向、结合、缔合或以其他方式干扰内皮分子。在一些实施例中，药物可以靶向、结合、缔合或以其他方式干扰白细胞粘附分子或其他结合分子和内皮分子。在其他实施例中，药物可以通过对白细胞粘附途径的另一部分或分子施加其作用而间接影响白细胞和内皮分子之间的粘附/相互作用。在其他实施例中，药物可以：调节基因的表达，该表达影响白细胞粘附(例如，药物可以作用于细胞内信号传导途径以调节基因的表达，该表达影响白细胞粘附)；影响基因产物(RNA或蛋白质)的翻译后修饰，该翻译后修饰影响白细胞粘附；调节基因产物的运输或转位，该运输或转位影响白细胞粘附；和/或调节基因产物从细胞内存储的释放，该释放影响白细胞粘附。
合适类型的白细胞包括但不限于以下各项中的一项或多项：中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、CD4T淋巴细胞、CD8T淋巴细胞、T调节细胞、B淋巴细胞、树突细胞、单核细胞和自然杀伤细胞。
合适类型的白细胞粘附分子或白细胞的其他结合分子包括以下各项中的一项或多项：选择素、整合素、趋化因子、趋化因子受体、以及其他类型的分子。
合适类型的内皮分子包括以下各项中的一项或多项：选择素、细胞粘附分子(CAM)、趋化因子、趋化因子受体、以及其他类型的分子。
合适类型的白细胞粘附分子包括但不限于以下各项中的一项或多项：PSGL-1、L-选择素、α1整合素、α2整合素、α3整合素、α4整合素、α5整合素、α6整合素、α7整合素、α8整合素、α9整合素、α10整合素、α11整合素、αD整合素、αE整合素、αV整合素、αX整合素、CD11a(αL整合素)、CD11b(αM整合素)、β1整合素、β2整合素、β4整合素、β5整合素、β6整合素、β7整合素、β8整合素、CD44、ESL-1、CD43、CD66、CD15s、以及ALCAM。
合适类型的内皮分子包括以下各项中的一项或多项：E-选择素、P-选择素、VCAM-1、ICAM-1、ICAM-2、MadCAM-1、PECAM、GlyCAM-1、JAM-A、JAM-B、JAM-C、JAM-4、JAM-L、CD34、CD99、VAP-1、L-VAP-2、ESAM、E-LAM、钙粘蛋白、以及透明质酸。
合适类型的趋化因子和趋化因子受体包括以下各项中的一项或多项：趋化因子CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL26、CX3CL1、XCL1以及XCL2；趋化因子受体CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR11、CX3CR1以及XCR1。
在一些实施例中，药物可以调节细胞因子或趋化因子的活性。
在一些实施例中，药物可以更改粘附分子或趋化因子的翻译后修饰，更改粘附分子的蛋白质膜转位，调节粘附分子从细胞内存储的释放，作用于细胞内信号传导途径以调节粘附分子或趋化因子基因的表达，或调节粘附分子的动员。
在一些实施例中，药物减弱白细胞α4整合素活化。
在一些实施例中，药物干扰白细胞α4整合素与其内皮分子之间的相互作用。白细胞α4整合素的示例是α4β7整合素、CD11a(αL整合素)和CD11b(αM整合素)。
在一些实施例中，药物干扰白细胞表达的PSGL-1(P-选择素糖蛋白配体-1)与其内皮分子(即，P-选择素和/或E-选择素)之间的相互作用。
在一些实施例中，药物干扰白细胞β2整合素与其内皮分子之间的相互作用。
在一些实施例中，药物干扰细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和/或血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)与其/它们的白细胞粘附分子之间的相互作用。
药物的示例包括靶向特异性白细胞粘附分子和/或结合分子和/或内皮分子的抗体。例如，靶向特异性白细胞粘附分子和/或结合分子和/或内皮分子的抗人抗体。
在某些实施例中，药物是干扰α4整合素与其内皮分子之间的结合的抗体。该药物可以是抗人α4整合素抗体。在某些实施例中，药物是那他珠单抗。
在某些实施例中，药物是干扰α4β7整合素和MAdCAM-1之间的结合的抗体。该药物可能是维多珠单抗。
在实施例中，药物是干扰CD11a(αL)和ICAM-1之间的结合的抗体。该药物可以是依法利珠单抗或奥度莫单抗。
在某些实施例中，药物是干扰CD11b(αM)和ICAM-1之间的结合的抗体。该药物可能是UK279,276。
在某些实施例中，药物是干扰β2整合素与其内皮分子之间的结合的抗体。该药物可以是厄利珠单抗或罗维珠单抗。
在某些实施例中，药物是干扰β7整合素与其内皮分子之间的结合的抗体。该药物可能是依曲利珠单抗。
合适药物的其他示例包括类固醇，诸如糖皮质激素(皮质类固醇)。合适的类固醇包括但不限于布地奈德、可的松、地塞米松、甲基强的松龙、泼尼松龙、强的松和/或其组合。
合适药物的又其他示例包括非甾体抗炎药(NSAID)。合适的NSAID包括但不限于塞来昔布、艾托考昔、布洛芬、酮洛芬、萘普生、舒林酸和/或其组合。
合适药物的又其他示例包括免疫选择性抗炎衍生物(ImSAID)。合适的ImSAID包括但不限于下颌下腺肽-T(SGP-T)和苯丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸(FEG)和/或其组合。
合适药物的又其他示例包括来自植物(包括药草)的生物活性化合物。合适的化合物包括但不限于白花丹素(来自白花丹(Plumbago zylanica))和鸡蛋花素(来自鸡蛋花(Himatanthus sucuuba))和/或其组合。
合适药物的其他示例包括可以进入循环以影响白细胞生物学和功能的那些(包括相关代谢物)。
疾病
在本文中所描述的方法中，药物可以用于控制某个或某些合适疾病的进展。在一些实施例中，该药物用于控制涉及异常白细胞募集的疾病。在一些实施例中，该药物用于控制涉及炎症的疾病。在一些实施例中，药物可以用于控制自身免疫疾病的进展。在一些实施例中，药物可以用于控制免疫缺陷疾病的进展。在一些实施例中，药物可以用于控制感染病的进展。在患有感染病的患者中，免疫系统由于外来病原体的侵入而高度活化，导致炎症升高和白细胞粘附功能增加。在病原体被消除后，活化的免疫系统仍可以保持其高水平的活性，从而对组织产生不必要的损害。为了解决该问题，抗粘附疗法可以用于减弱活化的白细胞以减少组织损伤。在某些示例性实施例中，药物可以用于以下各项中的一项或多项：至少部分地控制某些疾病的进展；至少部分地控制涉及异常白细胞募集的疾病；至少部分地控制涉及炎症的疾病；至少部分地控制自身免疫疾病的进展；至少部分地控制免疫缺陷疾病的进展；以及至少部分地控制感染病的进展。
感兴趣的疾病包括但不限于：
炎性关节炎，例如，类风湿性关节炎、血清阴性脊柱关节炎(贝切特氏病(Behcetsdisease)、莱特尔氏综合征(Reiter's syndrome)等)、幼年型类风湿性关节炎、血管炎，银屑病关节炎、聚皮肌炎或其组合。
炎性皮肤病，例如，牛皮癣、疱疹样皮炎、湿疹、坏死性和皮肤性血管炎、大疱性疾病或其组合。
系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘、再灌注损伤、脓毒性休克(脓毒症)、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、与组织移植有关的组织损伤、心肺分流(cardiopulmonary bypass)、热损伤(烧伤)，其包括休克、肺水肿或其组合。
其他自身免疫性疾病，诸如肾小球肾炎、青少年发病糖尿病、多发性硬化症、过敏性疾病、自身免疫性甲状腺炎、同种异体移植物排斥(例如，移植肾、心脏或肝脏的排斥)、克罗恩病、移植物抗宿主病、或其组合。
与在心肺分流和血液透析中使用泵-氧合器系统相关联的全身性炎症，其可以导致被称为泵后综合征或灌注后综合征的器官功能障碍、糖尿病或其组合。
不良炎症反应的其他疾病和临床相关性，其包括与以下各项相关联的那些疾病：溶血性贫血、血液透析、输血、某些血液恶性肿瘤、肺炎、缺血后心肌炎症和坏死、气压伤(减压病)、溃疡性结肠炎、炎性肠病、动脉粥样硬化、细胞因子诱导的毒性、坏死性小肠结肠炎、粒细胞输血相关综合征、雷诺综合征、继发于败血症或创伤的多器官损伤综合征、急性化脓性脑膜炎、其他中枢神经系统炎性疾病、或其组合。
影响白细胞的其他疾病可以包括但不限于：淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、嗜酸性粒细胞增多症、霍奇金淋巴瘤或其组合。
自身免疫疾病可以包括但不限于：艾迪生病、丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征(APS)、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病(AIED)、轴突和神经元神经病变(AMAN)、贝切特氏病、大疱性类天疱疮、Castleman氏病(CD)、乳糜泻、南美锥虫病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多发性骨髓炎(CRMO)、血管炎、瘢痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮、耳蜗前庭综合征(Cogan’ssyndrome)、冷凝集素疾病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇心肌炎、CREST综合征、克罗恩病、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克氏病(Devic’s disease)(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、心肌梗塞后综合征(Dressler’s syndrome)、子宫内膜异位症、嗜酸性粒细胞性食管炎(EoE)、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、必需混合性冷球蛋白血症、伊文氏综合征(Evans syndrome)、纤维肌痛、纤维化肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞心肌炎、肾小球肾炎、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture’s syndrome)、肉芽肿病伴多血管炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、过敏性紫癜(HSP)、妊娠期疱疹或类天疱疮妊娠期(PG)、低血球蛋白血症、IgA肾病、IgG4相关性硬化症、包涵体肌炎(IBM)、间质性膀胱炎(IC)、青少年关节炎、青少年糖尿病(1型糖尿病)、青少年肌炎(JM)、川崎病、肌无力综合征(Lambert-Eatonsyndrome)、白细胞碎屑性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、木质性结膜炎、线性IgA病(LAD)、狼疮、慢性莱姆病、梅尼埃病、显微镜下多血管炎(MPA)、混合性结缔组织病(MCTD)、莫伦氏溃疡(Mooren’s ulcer)、急性苔癣豆疮样干癣(Mucha-Habermann disease)、多发性硬化症(MS)、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎、中性粒细胞减少症、眼瘢痕性类天疱疮、视神经乳头炎(Optic neuritis)、回文性风湿病(PR)、PANDAS(与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神疾病)、副肿瘤性小脑变性(PCD)、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、ParryRomberg氏综合征、睫状体扁平部炎(Pars planitis)(外周葡萄膜炎)、Parsonnage-Turner氏综合征、天疱疮、周围神经病变、周围性脑脊髓炎、恶性贫血(PA)、POEMS综合征(多发性神经病、器官肿大、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病、皮肤改变)、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、多发性肌炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、黄体酮皮炎、牛皮癣、银屑病关节炎、纯红细胞再生障碍(PRCA)、坏疽性脓皮病、雷诺氏现象、反应性关节炎、反射性交感神经营养不良、瑞特综合征、复发性多软骨炎、不宁腿综合征(RLS)、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿关节炎是(RA)、结节病、施密特综合征、巩膜炎、硬皮病、干燥综合征、精子和睾丸自身免疫、僵硬人综合征(SPS)、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、苏萨克综合征、交感性眼炎(SO)、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、Tolosa-Hunt氏综合征(THS)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎(UC)、未分化结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、韦格纳肉芽肿病(现在称为患有多血管炎的肉芽肿病(GPA)或其组合。
由于免疫抑制(例如，由于AIDS、maycer化学疗法、放射疗法、皮质类固醇疗法或其他自身免疫疾病疗法)、先天性免疫缺陷或其组合引起的疾病或病症。
感染病包括但不限于：ICAM-1介导的感染，诸如鼻病毒感染、阿米巴脑膜脑炎、急性风湿热、炭疽、非典型分枝杆菌病、禽流感(禽流感)、巴贝虫病、细菌性阴道病、龟头炎、巴马森林病毒感染、囊胚菌感染、肉毒杆菌、布鲁氏菌感染、弯曲杆菌感染、水痘和带状疱疹、基孔肯雅病毒、唇疱疹(单纯疱疹1型)、感冒、结膜炎、隐孢子虫感染、巨细胞病毒(CMV)感染、登革热、贾第虫感染、腺热、淋病、乙型流感嗜血杆菌(Hib)、肝炎、手足口病、亨德拉病毒感染、包虫病、人乳头瘤病毒(HPV)、生殖器疣及相关癌症、日本脑炎、Kunjin/西尼罗河病毒感染、Kunjin/西尼罗河病毒感染、麻风病、嗜肺军团菌感染、钩端螺旋体病、李斯特菌感染、莱姆病、麻疹、脑膜炎球菌感染、感染性软疣、腮腺炎、生殖道支原体感染、肺炎支原体感染、中东呼吸综合征(MERS)、非特异性尿道炎(NSU)、诺如病毒感染、细小病毒B19感染、鼠疫、肺炎球菌感染、脊髓灰质炎病毒感染、鹦鹉热、Q发热、狂犬病病毒和澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)感染、立克次体感染、Roseola病毒感染、罗氏河病毒感染、轮状病毒感染、风疹、沙门氏菌感染、学校疮、严重急性呼吸道综合征、产志贺毒素大肠杆菌(STEC))和溶血性尿毒症综合征(HUS)、志贺氏菌感染、天花、金黄色葡萄球菌、包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、链球菌喉咙痛、梅毒、破伤风、鹅口疮、毒性休克综合征、弓形虫感染、滴虫感染、肺结核、土拉菌病、伤寒和副伤寒、尿路感染、副溶血性弧菌感染、病毒性气体肠炎、病毒性出血热、病毒性脑膜炎、病毒性呼吸道感染、疣、百日咳、蠕虫、黄热病、耶尔森氏菌感染、耶尔森氏菌感染、寨卡病毒感染或其组合。
由红细胞病症引起的疾病可以包括但不限于：贫血、慢性病贫血、再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血、地中海贫血、疟疾、镰状细胞性贫血、真性红细胞增多症、急性胸部综合征、巴马病、红细胞发育不良、3型血色素沉着症、血红蛋白Lepore综合征、血红蛋白变异、血红蛋白血症、含铁血黄素尿症、遗传性焦嗜酸细胞增多症、HFE、高铁血红蛋白血症遗传性血色病、McLeod氏综合征、微小细胞增多症、肌肉红细胞增多症、粒细胞增多症、多发性肌炎、红细胞增多症、卟啉症、网状细胞减少症、Rh缺乏症、病态细胞综合征、球形红细胞增多症、硫化血红蛋白血症、儿童暂时性成红细胞减少症或其组合。
由血小板病症引起的疾病可以包括但不限于：血小板减少症、血小板减少症、某些遗传性疾病、心房颤动、血友病、冯维勒布兰德病、鼻出血、月经过多、瘀点、毛细血管扩张、瘀斑、输血后紫癜、循环(周期性)血小板减少症、弥散性血管内凝血病、血栓性血小板减少性紫癜、过敏性紫癜、假性血小板减少症、或其组合。
在某些实施例中，该药物用于控制炎性疾病的进展。在某些实施例中，该药物用于控制以下各项中的一项或多项的进展：多发性硬化、克罗恩病、哮喘、牛皮癣和类风湿性关节炎。在某些实施例中，所述药物用于控制由以下各项中的一项或多项引起的疾病进展：器官移植、中风、心肌梗塞和创伤性休克。
血液样品
在一些实施例中，白细胞粘附功能测定仅需要少量全血，诸如5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、200、300、400、500、750和1,000μl。
该方法可以包括：对从受试者获得的多于一种血液样品进行一次或多次白细胞粘附功能测定。
该方法可以包括以下步骤：从受试者中分离血液样品。这可以以各种合适的方式实现。例如，可以通过刺破手指并收集一滴或多滴血或通过静脉穿刺来获得血液。在某些实施例中，该方法可以使用一滴血。在某些实施例中，白细胞粘附功能测定可能需要少于约100μL的血液，诸如5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100μL。在一些实施例中，白细胞粘附功能测定可能需要少于约100μL的血液，诸如小于5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100μL。
在一些实施例中，血液样品可以是全血，无论是否经过处理。在一些其他实施例中，血液样品是经处理的样品，由此全血的一种或多种成分已经彼此分离。也就是说，在一些实施例中，血液样品可以是全血，并且在其他实施例中，血液样品可以包含(经加工/处理的)全血的一种或多种白细胞成分。
在某些实施例中，血液成分不与全血样品分离，以便在体内模拟血液。在某些实施例中，可以使用分离的血细胞、培养的血细胞和/或血细胞系。
可以用于收集和储存血液样品的抗凝血剂可以包括但不限于肝素、EDTA、ACD、柠檬酸盐、水蛭素、聚烯丙基磺酸钠和草酸钾/氟化钠。
白细胞粘附功能测定和设备
白细胞粘附功能测定可以是各种合适类型的测定。该方法可以包括：进行多于一次的白细胞粘附功能测定，以获得一个或多个结果。白细胞粘附功能测定可以包括一个或多个特异性测试以提供集体结果。
在某些示例性实施例中，白细胞粘附功能测定结果可以是半定量的和/或定量的。
白细胞粘附功能测定可以实现以以下各项中的一项或多项：表征白细胞细胞募集；表征白细胞细胞追踪；以定量方式表征白细胞细胞迁移行为。
在一些实施例中，白细胞粘附功能测定可能需要定量地确定白细胞迁移。这可以包括检测、测量或观察白细胞细胞粘连、滚动、缓慢滚动、牢固粘附、爬行和/或经内皮迁移。在一些实施例中，白细胞粘附功能测定可能需要检测、测量或观察白细胞的平均速度、位移、加速度、减速度、方向性、停留时间和/或直线度。
相互作用的白细胞可以通过速度分布来表征。例如，根据细胞平均速度(Smean)，相互作用的白细胞可以分为五种相互作用类型：静态细胞(Smean<5μm/min)、爬行细胞(Smean＝5-20μm/min)、缓慢滚动细胞(Smean)＝20-300μm/min)以及滚动细胞(Smean＝300-6000μm/min)。另外，直方图可以用于显示细胞速度的分布。
在某些实施例中，白细胞粘附功能测定需要在现实生理条件下检测、测量和/或观察白细胞迁移。
在一些实施例中，该测定允许同时检测不同的白细胞亚组。
在某些实施例中，白细胞粘附功能测定涉及流动测定。
作为白细胞粘附功能测定的一部分，血液样品可以与一种或多种细胞染色剂、一种或多种化学品(例如，诸如诱导α4整合素活化的锰)、一种或更多种药物(具有或不具有可检测部分)、一种或多种抗体、和/或一种或多种可检测部分或其他试剂或药剂一起预混合、预处理或预孵育。
在一些实施例中，该方法可以包括：在体外使用一种或多种药物、试剂或药剂处理受试者(人或动物)血液，然后进行白细胞粘附功能测定。
在一些实施例中，该方法可以包括：在体内对受试者施用一种或多种药物、试剂或药剂，然后进行白细胞粘附功能测定。
在一些实施例中，白细胞粘附功能测定可以评估在现实生理条件下的白细胞迁移。
在一些实施例中，白细胞粘附功能测定可以利用使用缀合到荧光团或其他可检测部分的抗体来标记的白细胞。在一些实施例中，该测定可能需要使用缀合到不同荧光团的特异性抗体亚组检测不同的白细胞亚组。例如，可以将抗体或抗体混合物和/或染色剂添加到血液样品中。例如，可以在执行流动测定之前将针对特异性白细胞膜标志物的荧光标记的抗体添加到血液样品中。
白细胞粘附功能测定或流动测定可以利用合适类型的设备来检测、测量或观察白细胞迁移等，其包括在真实生理条件下检测、测量或观察白细胞迁移等。在以下文献中描述了合适的微流体测定和/或设备的示例：US 8,940,494；US8,380,443；US 7,326,563；W092/21746；Vaidyanathan R1，Shiddiky MJ，Rauf S，Dray E，Tay Z，Trau M.；Tunable"nano-shearing":a physical mechanism to displace nonspecific cell adhesionduring rare cell detection；Anal Chem.，2014年2月18日；86(4)：2042-9.doi：10.1021/ac4032516.Epub 2014年2月4日，其全部内容通过交叉引用并入本文。
微流体设备可以用于进行流动测定。在一些实施例中，流动测定需要使用具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个微流体通道的微流体设备，例如，用于检测不同的白细胞亚组和/或粘附分子。
在一些实施例中，可以在微流体设备中测定血液样品以模拟体内血流。
在一些实施例中，流动测定需要将血液样品拉入或推入一个或多个微流体通道，例如，使用注射器泵，优选地，在约0.5至30达因/cm2的剪切应力下，包括0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、100、150、200、300达因/cm2在内。
白细胞粘附功能测定可以允许视觉分析以表征白细胞迁移行为，表征白细胞细胞追踪，或表征内皮粘附分子的白细胞募集。视觉分析可以以任何合适的方式进行。例如，可以使用显微镜和图像记录器(例如，视频或延时摄影)来实现可视化。可以通过计算机分析由图像记录器捕获的图像来分析白细胞迁移行为、跟踪、募集等。可以确定粘附和/或非粘附白细胞的种类和数量，并且可以以定量方式记录和分析它们各自的速度/行为。
在一些实施例中，白细胞粘附功能测定需要在一时间段内以足以捕获所有类型的白细胞细胞相互作用的高帧速率获取图像。例如，该测定可能需要在5分钟内以每秒2帧的速度获取图像以捕获各个类型的细胞相互作用。在一些实施例中，白细胞粘附功能测定可能需要捕获白细胞的详细3D运动。在一些实施例中，白细胞粘附功能测定需要记录荧光显微镜时间序列。
以下列方式导出白细胞动力学参数：所记录的图像时间序列提供所检测到的每个相互作用的白细胞的x，y和z(位置)和t(时间)坐标。通过使用诸如‘最近邻居’之类的数学算法在几个帧之间链接同一白细胞的定位，可以随时间跟踪细胞，并且获得各种参数以表征细胞运动(诸如轨迹方向、长度、位移、持续时间、直线度、平均速度、加速度/减速度、定向/受限/随机运动类型)。然后，这些参数可以用于区分药物治疗期间的不同白细胞亚群的运动性行为或运动性改变。
可替代地，可以使用其他检测白细胞的方法，如例如在Nan Sun、Yong Liu、LingQin、Guangyu Xu和Donhee Ham，2012年9月，Solid-State and Biological SystemsInterface；固态设备研究会议(ESSDERC)；DOI：10.1109/ESSDERC.2012.6343324；http://people.seas.harvard.edu/～donhee/ESSDERC-ESSCIRC-2012-Ham.pdf(其全部内容通过交叉引用并入)中所描述的。
内皮分子的形式可以例如是与支持物或底物结合的重组蛋白。换句话说，在一些实施例中，测定可以涉及使用固定于支持物或底物(可能包括脂质双层)的多个内皮分子，并且在其他实施例中，测定可以涉及使用表达此类内皮分子的实际细胞。关于固定在支持物或底物上的内皮分子，在Dohyun Kim和Amy Herr的Protein immobilizationtechniques for microfluidic assay，Biomicrofluidics，2013中引用了若干种技术，并且其全部内容通过引用并入本文。此外，这些分子在以下文献中描述，其全部内容通过引用并入本文：US 8,940,494；US 8,380,443；US 7,326,563；以及WO 92/21746。
在白细胞粘附功能测定中可以用作粘附底物(即，与支持物或底物结合)的内皮分子包括但不限于以下各项中的一项或多项：
1.如本文中已经描述的粘附分子；
2.如本文中所提及的趋化因子；
3.纯化抗原和人工抗原呈递细胞系统：
a.纯化抗原：i)α，β和ε毒素以及iii)抗原CFA/I。
b.人工抗原呈递细胞系统，其于1)Anna Thomas和Marcela Maus等人的“A Cell-Based Artificial Antigen-Presenting Cell Coated with Anti-CD3andCD28Antibodies Enables Rapid Expansion and Long-Term Growth of CD4TLymphocytes”临床免疫学，2002以及2)Turtle，C.，Riddell，S.的“Artificial antigenpresenting cells for use in adoptive immunotherapy”Cancer J，2010中公开，这些参考文献通过引用整体并入本文。
4.其他分子(包括蛋白质)，其可以调节细胞-细胞相互作用；以及
5.如本文中所公开的趋化因子受体。
在一些实施例中，白细胞粘附功能测定可能需要检测、测量或观察白细胞表达的PSGL-1(P-选择素糖蛋白配体-1)与其内皮分子(P-选择素和/或E-选择素)之间的相互作用。
在一些实施例中，白细胞粘附功能测定可能需要定量评估α4整合素粘附功能。
在一些实施例中，白细胞粘附功能测定可能需要检测、测量或观察增加的白细胞α4整合素表达和活性。
在一些实施例中，白细胞粘附功能测定可能需要测量、检测和/或观察白细胞α4整合素和内皮VCAM-1之间的相互作用。
在一些实施例中，白细胞粘附功能测定可能需要检测、测量和/或观察CD11a(αL整合素)和ICAM-1之间的相互作用。
在一些实施例中，白细胞粘附功能测定可能需要检测、测量或观察CD11b(αM整合素)和ICAM-1之间的相互作用。
在一些实施例中，白细胞粘附功能测定可能需要检测、测量和/或观察α4β7整合素和MAdCAM-1之间的相互作用。
在一些实施例中，白细胞粘附功能测定可能需要检测、测量和/或观察细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和/或血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)与其白细胞粘附分子之间的相互作用。
在一些实施例中，白细胞粘附功能测定可能需要检测、测量和/或观察白细胞β2整合素与其内皮分子之间的相互作用。
白细胞粘附功能测定可能需要测量白细胞的一种或多种特异性亚组，诸如CD4、CD8和CD15细胞。
在一些实施例中，白细胞粘附功能测定可能需要检测、测量或观察细胞因子或趋化因子(例如，TNFα和IL-4)活化的原代内皮细胞(例如，HUVEC)或固定的内皮细胞系(例如，人微循环内皮细胞(HMEC))上的白细胞迁移行为。
在一些实施例中，白细胞粘附功能测定可能需要检测、测量和/或观察药物那他珠单抗对白细胞与TNFα活化的HUVEC相互作用的影响。
在一些实施例中，白细胞粘附功能测定可能需要检测、测量和/或观察那他珠单抗与白细胞上的α4整合素的特异性结合。
在一些实施例中，白细胞粘附功能测定可能需要测量、检测和/或观察那他珠单抗对α4整合素功能的抑制作用。
在一些实施例中，白细胞粘附功能测定可能需要通过用特异性膜标志物标记亚组来同时检测、测量和/或观察不同的白细胞亚组。这些标志物可以是缀合到不同荧光团的抗体。
白细胞粘附功能测定可以包括一个或多个对照。所采用的一个或多个对照的性质可以取决于测定的性质和采用该测定的方法的性质。例如，对照可以是从没有疾病或病症(例如，炎症或自身免疫疾病)的健康个体获得的血液样品。例如，对照可以是从未接受药物治疗的个体(例如，抗炎药)获得的血液样品。例如，对照可以是在施用药物之前、在接受药物治疗之前、或在接受给药方案之前或在给药方案期间从受试者获得的血液样品。对照可以是血液样品，其包括从不同个体(群组)汇集的血液样品。
在一些实施例中，该方法/白细胞粘附功能测定可能需要进行以下步骤：1.用内皮分子预涂覆流动通道；或者如果在内皮细胞模型中，在流动通道中播种和培养细胞，并且通过用试剂或炎性细胞因子或趋化因子(例如，TNFα)处理细胞来活化内皮细胞粘附分子的表达；2.在不使用或使用不同剂量的药物(例如，小分子、抗体等)的情况下孵育流动通道，其更改内皮细胞粘附分子的功能；3.从受试者收集血液；4.在药物治疗后的不同时间点执行白细胞粘附功能测定以确定药物效果(通过与不含药物对照的比较)。对合适测定的示例进行了描述。
给药方案
给药方案通常可以取决于药物的性质、疾病状况和/或受试者的特点。优化药物给药方案可以包括例如改变以下各项：药物施用路径；盖伦药物制剂；药物单位剂量；施用频率/施用之间的时间长度；药物加载剂量；和/或治疗长度，其需要根据测定结果判断。
优化药物给药方案(例如，免疫抑制药物)可以包括：允许给药周期的每个、大部分或一部分药物血清水平降低至低于最大功效，但在没有包括或基本上不牺牲药效的情况下。如示例7中所详述的，一旦低于最大功效阈值，受试者的免疫应答可以在药物再给药之前的某个时间段内恢复。
在某些示例性实施例中，优化药物给药方案和/或确定最小有效药物剂量可以意味着仅需要施用最小量的药物和/或可以根据需要延长或缩短顺序施用药物之间的时间。在某些示例性实施例中，优化药物给药方案和/或确定最小有效药物剂量可以意味着可以最小化和/或消除由药物引起的病理性或致命性副作用。例如，可能降低进行性多灶性白质脑病(PML)的风险，该PML是那他珠单抗疗法的致命副作用。
受试者
受试者可以是哺乳动物或任何其他合适类型的动物。哺乳动物包括人、灵长类动物、牲畜和农场动物(例如，马、绵羊和猪)、伴侣动物(例如，狗和猫)和实验室试验动物(例如，大鼠、小鼠和兔)。在某些实施例中，受试者可以是人。
治疗受试者
可以以对于该特定疾病已知的常规方式治疗受试者。另外，可以以非常规方式治疗受试者。例如，基于LAFA分析的结果，即使该药物通常不用于该特定疾病，也可以预测药物对于患有某些疾病的受试者的治疗的适合性。
那他珠单抗
某些示例性实施例发现关于那他珠单抗治疗患有多发性硬化症的受试者的应用。例如，通常在初始输注后每四周进行一次在患有多发性硬化的受试者中再给药那他珠单抗。那他珠单抗的标准剂量为每次输注每个受试者300mg。优化药物给药方案可以包括例如减少施用的药物量和/或增加施用之间的长度，其需要根据测定结果判断。
在一些实施例中，该方法可以作为血液测试进行，在那他珠单抗输注后的各个时间点执行。因而，测定结果可以用于确定再给药那他珠单抗的需要。可以在个体受试者中进行血液测试，以确保药物有效性，从而便于针对个体受试者开展最佳/个性化治疗方案。可以对许多受试者进行血液测试以进行患者分层。
来自延长给药间隔(EDI)研究的最近临床数据表明延长那他珠单抗治疗间隔(长达8周)不仅可以像标准间隔(4周)一样有效地抑制疾病进展，而且还显著降低PML的风险。这些发现表明EDI降低了PML的风险，尽管其机制尚不清楚。有理由提出，一旦那他珠单抗的血清水平达到低于某一阈值(例如，100％饱和度阈值)，可以恢复最小的免疫应答以降低JCV感染的风险。本文中所描述的方法可以定量评估那他珠单抗的有效性，精确地指示药物饱和度水平和再给药的需要。因此，该方法可以便于免疫应答的恢复，而不包括药物功效，允许给药周期的每个、大部分或一部分有足够的免疫应答，以有效地消除、减轻和/或降低PML的风险。
某些示例性实施例涉及使用白细胞粘附功能测定来检测药物靶标的活化，该白细胞粘附功能测定然后可以用于预测药物控制疾病进展的能力。该方法/测定还可以用于预测该药物是否可以用于控制尚未知使用该药物可治疗的其他疾病的进展。例如，如果在受试者中检测到α4整合素活化，那么对于一些受试者而言，那他珠单抗可以是除用于治疗多发性硬化和克罗恩病之外的药物。
尽管在多发性硬化症(MS)患者中控制疾病活性的早期成功，但是应当指出，25.8％和17.1％的那他珠单抗接受者对治疗做出的不良且仅部分应答。迄今为止，强调这种低药物有效性的机制仍然未知。尽管建立了α4整合素在MS中的病理作用，但α4整合素活化水平极不可能在高度异质的患者群体中相同。那他珠单抗治疗功效的幅度在个体MS患者之间显著变化的结果支持了这一观点，表明α4整合素的病理作用可能在这些患者中不同。因而，与α4整合素活化低或α4整合素没有活化的患者相比，α4活化水平高的患者更可能对那他珠单抗疗法做出应答。某些示例性实施例可以能够定量评估活化α4整合素，提供预测受试者如何可能对那他珠单抗疗法做出应答的良好工具，以及便于患者分层。
在某些示例性实施例中，提供了一种生成受试者的白细胞粘附谱的方法，所述方法包括以下步骤：
对从受试者获得的至少一种血液样品在体外进行至少一次白细胞粘附功能测定，以便基本上同时定量评估不同白细胞亚组对一种或多种不同内皮分子的粘附功能；以及
使用测定结果：识别白细胞异常；确定个性化发病机制；识别疾病的新疾病标志物；识别疾病的早期症状；疾病预测；疾病预防；协助早期准确诊断；为受试者开发有效且个性化的治疗；监测受试者的健康(健康状况)；不论疾病如何，对受试者进行分组；或者无论疾病诊断如何，为受试者开展治疗。
可以对从单个受试者获得的血液样品进行该一种方法(或多种方法)。可以对从多个不同受试者获得的血液样品进行该一种方法(或多种方法)。一个受试者(或多个受试者)可以是健康受试者。一个受试者(或多个受试者)可能患有疾病。
可以对受试者的血液样品进行一次测定(或多次测定)，并且血液样品可以是全血样品或处理的血液样品。
白细胞粘附功能测定可以是流动(细胞)测定，用于通过一种或多种内皮粘附分子和/或表达这些分子的其他相关分子和/或细胞来定量白细胞迁移行为、白细胞细胞追踪或白细胞募集。
该一种或多种内皮分子的形式是与支持物或底物结合的重组蛋白，或过表达该一种或多种内皮粘附分子的细胞系统。
合适类型的白细胞包括例如本文中所公开的白细胞。
白细胞的合适类型的白细胞粘附分子或其他结合分子包括例如本文种所公开的分子。
一种或多种内皮分子可以包括例如本文种所公开的分子。
该一种方法(或多种方法)可以包括：测定各个流动通道中不同白细胞亚组的粘附，该流动通道可以预涂覆有特异性内皮分子底物。结果，可以生成特异性白细胞亚组上的粘附分子的每个、大部分或一部分的细胞迁移谱。
该一种方法(或多种方法)的测定可以包括以下步骤：识别药物靶标，然后基于药物靶标来选择用于控制疾病进展的适当药物。
该一种方法(或多种方法)的测定(或多次测定)可以包括以下步骤：识别药物靶标，然后基于药物靶标和那些靶标的药物的参考数据库来选择用于控制疾病进展的适当药物。这样，不需要实际上诊断和/或识别和/或得知疾病本身。
该一种方法(或多种方法)的一次测定(或多次测定)可以包括以下步骤：构建药物靶标和药物的数据库。
该一种方法(或多种方法)的一次测定(或多次测定)可以包括以下步骤：一次测定多于一种药物靶标(例如，2，3，4，5，6，7，8，9或10个药物靶标或更多个)。
该一种方法(或多种方法)可以是高吞吐量测定，一次测试多个药物靶标。
该一种方法(或多种方法)可以具有如针对其他实施例所描述的其他特征。
本文中所描述的任何特征可以与本发明范围内的本文中所描述的任一个或多个其他特征的任何组合相结合。
某些示例性实施例的材料和方法
为了实际概括人微循环，在微流体系统中使用未处理的人全血来模拟体外血流。使用与缀合到不同荧光团的抗体，通过使用特异性膜标志物标记细胞来同时检测不同的白细胞亚组。检查白细胞α4整合素和内皮VCAM-1之间的相互作用，如同VCAM-1底物上的白细胞募集一样，并且采用细胞动力学来表征细胞迁移行为，允许定量评估α4整合素粘附功能。
材料和方法
抗体、化学品和试剂
人重组VCAM-1和TNFα购自R&D Systems(明尼阿波利斯，明尼苏达州)。抗人白细胞表面分子的抗体(Abs)、CD4-Alexa488、CD8-PE、CD15-APC和CD16-BV510获自BDBiosciences(圣地亚哥，加利福尼亚州)。那他珠单抗(Tysabri)购自Biogen(剑桥，马萨诸塞州)。备选抗人α4整合素Ab(克隆：7.2R)购自R&D Systems。
用于研究VCAM-1依赖性白细胞募集的流动通道系统
从健康志愿者收集人血到肝素锂血液采集管中，在室温下储存，并且在采血后4小时内使用。为了研究VCAM-1依赖性白细胞募集，采用购自微流体芯片店(耶拿，德国)的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)-底部微流体芯片(通道宽度×深度×长度：1,000×200×18,000μm)。将重组人VCAM-1蛋白(10μg/ml)轻轻加载到通道中，并且在4℃下温育过夜。为了识别特异性白细胞亚组，将100μl全血与下列抗体(Ab)混合物在室温下混合5分钟(min)：抗CD4-Alex488(1:50稀释)、抗CD8-PE(1:66.7)和抗CD15-APC(1:33.3)。然后，在1.5达因/cm2的剪切应力下通过注射器泵(Harvard Apparatus，霍利斯顿，马萨诸塞州)将血液拉入微流体通道。为了活化α4整合素，在室温下用5mM氯化锰(Sigma，圣路易斯，密苏里州)处理全血5分钟。为了研究那他珠单抗对α4整合素功能的抑制作用，在用于流动测定之前，将血液与各种剂量的那他珠单抗在室温下孵育5分钟。在那些需要区分嗜中性粒细胞(CD15+CD16+)和嗜酸性粒细胞(CD15+CD16-)的实验中，还包括抗人CD16-BV510Ab(1:50)。
在临界照射下，在具有10X物镜和Olympus IX71底座的DeltaVision Widefield显微镜(Applied Precision，伊瑟阔，华盛顿州)上记录荧光显微镜时间序列，其中相机读出速度为20MHz而像素装仓为4x4以便于高速图像采集。在通道中心(距离通道入口9,000μm)，在10分钟内，以每秒2帧记录数据采集。在温度受控和平衡的环境(37℃和5％CO2)下执行实验。
细胞追踪和数据分析
使用Imaris(Bitplane AG)软件完成细胞追踪。通过检测每帧中经过质量过滤的荧光点来自动跟踪细胞，然后在最大距离为30μm且最大间隙大小为2的情况下链接。随后，手动检查轨迹，并且校正误差。然后，输出轨迹参数和统计，诸如停留时间、直线度和平均速度，以便在GraphPad Prism中进行统计分析。
根据细胞平均速度(Smean)，相互作用的细胞分为五种相互作用类型：静态细胞(Smean<5μm/min)、爬行细胞(Smean＝5-20μm/min)、缓慢滚动细胞(Smean)＝20-300μm/min)和滚动细胞(Smean＝300-6000μm/min)。使用R Studio计算那他珠单抗的半数抑制浓度(IC50)值。通过将检测到的轨迹归一化到同一原点坐标(0，0μm)，使用R Studio获得常见原点图。
用于研究内皮细胞的白细胞募集的流动室测定
为了研究人血管内皮细胞的白细胞募集，使用平行板流动室系统(Glycotech，盖瑟斯堡，马里兰州)。简而言之，首先用含有Ca2+和Mg2+的Hank’s平衡盐溶液(HBSS)以1:10稀释肝素化人血液。为了检测各个类型的细胞相互作用(包括快速滚动)，使用高帧率记录。在用于流动测定之前，在5分钟内，全血在室温下仅用Hoechst33342标记。在5分钟内，仅在Hoechst通道中以高帧速率(每秒2帧)获取图像。对于那他珠单抗实验，在室温下用10或300ng/ml的那他珠单抗处理血液5分钟。在用胰蛋白酶消化并播种在涂有纤连蛋白的玻璃盖玻片上之前，将原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养至100％汇合。然后，在用10ng/ml人肿瘤坏死因子α(TNFα)活化过夜之前，培养细胞24小时。此后，将流动室小心地放置到盖玻片上，然后通过注射器泵以150s-1的剪切速率将血液拉入腔室。如本文中所提及的，执行细胞追踪和数据分析。
为了进一步研究不同白细胞亚组中的细胞迁移行为，将Hoechst33342加上含有抗CD4-Alex488、抗CD8-PE和抗CD15-APC的抗体混合物加入全血中，它们然后在流动测定之前在室温下孵育5分钟。使用20X 0.75NA物镜记录白细胞和HUVEC之间的相互作用。在20μm的范围内以1μm的间隔记录四通道3D z-堆叠，以考虑内皮细胞涂覆的表面的三维性。低帧速率(每30秒1帧)用于检测缓慢移动细胞的3D运动，这些缓慢移动细胞包括静态、爬行和缓慢滚动细胞。在垂直于流动方向布置的三个不同位置处记录图像。对于可视化和数据预处理，使用SoftWoRx软件(Applied Precision)对3D数据集进行去卷积。
示例1：Mn2+活化α4β1整合素粘附功能。
在该示例性实施例中，为了评估白细胞与内皮VCAM-1相互作用的能力，采用微流体系统来模拟体外血液微循环，该微流体系统由微流体泵和微流体芯片组成。在4℃下用VCAM-1蛋白(10μg/ml)预涂覆芯片的底部过夜，然后在微流体泵的驱动下以10μl/min的流速通过通道灌注全血。除非另有说明，否则在附录I中设置所使用的方案。
同时检测CD4、CD8和CD15细胞的VCAM-1依赖性募集
在本实施例中，为了避免细胞分离并且实现多个特异性白细胞亚组的同时检测，在执行流动测定之前，将针对特异性白细胞膜标志物的荧光标记的抗体加入人全血中。如图1A所示，可以清楚地区分白细胞的CD4+(绿色)、CD8+(红色)和CD15+(青色)亚群。相互作用的CD4和CD8细胞的数量相似，而CD15细胞的数量显著低于CD4和CD8细胞(p<0.05)(图1B)。事实上，在所分析的50％血样中没有检测到相互作用的CD15细胞。这些结果表明，与健康对照血液中的CD15细胞相比，VCAM-1优先募集CD4和CD8细胞。
Mn2+(整合素活化剂)诱导α4β1整合素活化，因此导致与其配体VCAM-1的结合活性增加。为了测试系统检测Mn2+诱导的白细胞粘附功能的能力，在用于流动测定之前，用Mn2+处理全血。与未处理的血液相比，Mn2+对相互作用的CD4细胞的数量没有显著影响，而检测到CD8细胞减少>50％(图1B)。相反，Mn2+处理诱导相互作用的CD15细胞的数量增加至近5倍(图1B)，表明CD15细胞上α4β1整合素支持细胞与VCAM-1的相互作用的功能性作用。
为了表征细胞迁移行为，一系列细胞动力学参数用于评估α4β1整合素的配体结合活性。根据它们的平均迁移速度，全部相互作用的细胞分为静态(<5μm/min)、爬行(5-20μm/min)、缓慢滚动(20-300μm/min)和滚动细胞(300-6000μm/min)。在未活化的血液中，检测到非常少的静态CD4细胞(0.2±0.2细胞/mm2)，而大多数相互作用的CD4细胞是缓慢滚动细胞(68.8±16.1细胞/mm2，图1C)。与未处理的对照相比，Mn2+处理显著增加静态CD4细胞的数量至2.9±1.0个细胞/mm2，p<0.05。相反，Mn2+显著降低了缓慢滚动和滚动CD4细胞的数量(图1C)。这些发现表明，Mn2+增强α4β1整合素配体结合能力以及细胞-VCAM-1相互作用，导致细胞迁移速度降低。在CD8细胞中，Mn2+显著降低缓慢滚动(p<0.05)和滚动(p<0.01)CD8细胞的数量，而未观察到对静态和爬行细胞的影响(图1D)。这些发现表明，Mn2+处理抑制α4β1整合素支持CD8细胞滚动的能力。另外，Mn2+显著增加了爬行和缓慢滚动CD15细胞的数量(图1E)，表明α4β1整合素在调节CD15细胞粘附功能中的作用。
为了确定Mn2+对相互作用细胞速度的总体影响，比较了存在和不存在Mn2+时三种白细胞亚组的平均速度。与没有Mn2+对照相比，Mn2+处理显著降低了CD4和CD8细胞的速度(图1F)。一致地，共同原点图表明Mn2+显著抑制CD4和CD8细胞的运动性(图5A和图5B)。这些结果与图1C至图1D中的发现一致，表明Mn2+对细胞迁移的抑制作用。
附加地，Mn2+处理显著增加了相互作用的CD4和CD8细胞的停留时间(图1G)，而Mn2+显著降低了CD4和CD8细胞的直线度(图1H)。总之，这些结果表明Mn2+处理诱导α4β1整合素粘附功能，允许细胞与VCAM-1的相互作用更强。另一方面，相互作用的CD15细胞的速度、运动性、停留时间和直线度不受Mn2+的影响(图1F至图1H，图5C)。这些发现表明Mn2+处理增强了CD15细胞的募集而不影响其迁移行为。
示例2：使用多种膜标志物来识别特异性白细胞亚组
根据某些示例性实施例，本实施例涉及在测定中识别CD15和CD16双阳性嗜中性粒细胞。遵循附录I中所陈述的方案，其中进行以下修改以执行实验：
1.在用于测定之前，将3μl的抗人CD15-APC(BD，目录号：551376)和2μl的抗人CD16-BV510(BD，目录号：563830)加入100μl的人全血中，并在室温下孵育大约5分钟，
2.在斐济软件中使用被称为“Multi_Channel.ijm”的宏来跟踪CD15CD16双阳性细胞。
大多数相互作用的CD15细胞是嗜中性粒细胞。嗜酸性粒细胞是一小群粒细胞，已知其不仅具有高表达水平的α4整合素，而且对CD15表达也呈阳性。为了确定相互作用的CD15细胞是嗜中性粒细胞还是嗜酸性粒细胞，在测定中引入针对人CD16的附加荧光标记的抗体，从而区分嗜中性粒细胞(CD15+CD16+)和嗜酸性粒细胞(CD15+CD16-)。如图1I所示，几乎所有相互作用的CD15细胞也是CD16阳性的，表明这些CD15细胞中的大多数细胞是嗜中性粒细胞。
该策略可以用于使用2、3、4或更多个膜标志物检测其他特异性白细胞亚组。例如，CD14和CD16双阳性可以用于识别炎性单核细胞，而CD4和CD25双阳性可以用于识别CD4T调节(Treg)淋巴细胞。在用于LAFA分析之前，可以向全血添加针对CD14和CD16(或Treg的CD4和CD25)的不同荧光团缀合的抗体。结果，可以通过显微镜检测CD14CD16双阳性细胞(炎性单核细胞)，然后可以如示例1中所述定量评估它们的粘附功能。
示例3：α4β1整合素的基础炎性状态的半定量评估
本示例涉及示出可以在某些示例性实施例中使用的半定量评估工具。在疾病受试者中，与健康受试者相比，增加活化的α4β1整合素分子的部分，导致白细胞与α4β1整合素内皮配体(例如，VCAM-1)的结合能力增强，并且白细胞募集和/或炎症应答增加。
以下准则用于定义一个或多个健康受试者：
1.包括病史在内的医学评估所确定的明显健康。
2.未怀孕或目前正在哺乳的妇女
3.未被诊断出任何自身免疫、炎症、血液和血管病症
4.目前没有服用处方药，避孕药除外
5.目前没有服用可能影响血细胞功能的非处方药，其包括抗组胺药、阿司匹林等在内。本研究可接受维生素补充剂
6.目前没有重感冒、发烧或已知的过敏反应
7.最近(最近5年)没有吸烟史。
如图1G至图1H所示，范围参数可以用于表征α4β1整合素的基础炎性状态。本文中的结果表明Mn2+处理显著降低了VCAM-1底物上CD4和CD8细胞的直线度和速度。已知在患有自身免疫疾病的受试者中活化α4β1整合素功能，但尚不清楚α4β1整合素在个体受试者中的活性如何。如图1H所示，直线度是受Mn2+处理影响的最佳且最稳健的参数，表明直线度的降低可能是Mn2+诱导的α4整合素活化的良好标志物。由于Mn2+处理将α4β1整合素化学活化至最大水平，因此一个或多个受试者的白细胞的直线度值很可能落在对照和Mn2+处理的样品的值之间。未处理的CD4细胞的平均直线度值为0.40±0.06，其通过Mn2+处理降低至0.16±0.03。因此，如果对照和Mn2+处理的白细胞的平均直线度值分别任意设定为10和1(相对直线度指数(RSTI))，则来自一个或多个受试者的白细胞的RSI值很可能落在10和1之间，提供半定量方法来评估α4β1整合素的基础炎性状态和/或粘附功能。在这种情况下，RSTI越接近1，患者的α4β1整合素的活性越高，基础炎性状态越高。因此，可以确定α4β1整合素在个体患者中的基础炎性状态。
另外，在图1F中，如果对照和Mn2+处理的白细胞的平均白细胞速度分别任意设定为10和1(也称为相对速度指数(RSI))，则RSI值提供半定量工具以评估个体受试者中α4β1整合素粘附功能。例如，在CD4细胞中，在不存在和存在Mn2+的情况下，平均白细胞速度为135.7和17.9μm/min，这两个数据点可以分别用于为CD4细胞的RSI值定义为10和1。如果受试者的CD4细胞RSI值落在10和1之间，则RSI越接近1，α4β1整合素的活性越高，并且基础细胞炎性状态越高。
同样，在图1G中，如果对照和Mn2+处理的白细胞的平均停留时间分别任意设定为1和10(也称为相对停留时间指数(RDTI))，则RDTI值也将提供半定量工具以评估α4β1整合素粘附功能。例如，在CD4细胞中，在不存在和存在Mn2+的情况下，平均白细胞停留时间是1.53和3.52分钟，这两个数据点可以分别用于为CD4细胞的RDTI值定义为10和1。在这种情况下，RDTI越接近1，α4β1整合素的活性越高。
α4β1整合素的基础炎性水平可以用作半定量工具以评估一个或多个受试者(诸如患有多发性硬化、克罗恩病、结肠炎、动脉粥样硬化、自身免疫性甲状腺炎、阑尾炎、憩室炎、结节病、皮肤病、血管炎、狼疮和硬皮病或其组合的患者)的基础α4β1整合素活化水平和/或基础炎性状态。一个或多个白细胞亚组中的RSI、RDTI、RSTI测试或其组合以及所生成的数据可以用于评估与炎性疾病状态有关的受试者的状态。关于其他细胞，该示例中公开的方法可以用于为RSI、RDTI和/或RSTI设置介于1和10之间的范围参数或一些其他合适的范围参数和/或评价工具。对其可以进行该方法的其他细胞的非限制性示例包括：CD8淋巴细胞、CD15白细胞、嗜中性粒细胞、CD19B细胞、以及CD14单核细胞等。其他方法也可以用于设置范围参数。例如，对于细胞速度，500μm/min的固定速度可以定义为10，而对于RSI，10μm/min可以定义为1，因此可以确定个体受试者的RSI值。另外，对于直线度，直线度值1和0.1可以分别为RSTI定义为10和1。
示例4：α4整合素的Mn2+诱导的活化电位
本实施例涉及显示可以用于某些示例性实施例的半定量评估工具。Mn2+是一种整合素活化剂，其增强白细胞膜α4整合素的活性，该白细胞膜α4整合素包括α4β1整合素和α4β7整合素。然后，在存在和不存在Mn2+的情况下，白细胞与α4整合素配体的结合能力的差异可以用于定义α4整合素的“活化电位”，表明可以由Mn2+诱导多少α4整合素活化。
如图1F和示例1中所示，未处理和经Mn2+处理的细胞在VCAM-1底物上的平均速度的比例可以定义为“速度活化电位比(SAPR)”，其可以随后用于半定量评估α4β1整合素的活化电位。例如，对于特定受试者的测试的全血，在不存在和存在Mn2+的情况下，CD4细胞的平均速度分别为163.9和23.1μm/min。因此，该受试者的CD4细胞的SAPR值为163.9/23.1＝7.1。在这种情况下，SAPR值越低，活化电位越小，α4β1整合素处于活化形式的部分更多。同样，同一公式可以用于使用图9、示例10中的数据来确定α4β7整合素的SAPR值。
如图1G所示，未处理和Mn2+处理的细胞在VCAM-1底物上的平均停留时间的比例可以定义为“停留时间活化电位比(DTAPR)”，其也可以用于半定量评估α4β1整合素的活化电位。例如，对于特定受试者的测试的全血，在不存在和存在Mn2+的情况下，CD4细胞的平均停留时间分别为1.43和4.03分钟。因此，该受试者血液的CD4细胞的DTAPR值将是1.43/4.03＝0.355。在这种情况下，DTAPR值越高，活化电位越小，α4β1整合素处于活化形式的部分更多。同样，同一公式可以用于使用图9、示例10中的数据确定α4β7整合素的DTAPR值。
如图1H所示，未处理和Mn2+处理的细胞在VCAM-1底物上的平均直线度的比例可以定义为“直线度活化电位比(STAPR)”，其也可以用于半定量评估α4β1整合素的活化电位。例如，对于特定受试者的测试的全血，在不存在和存在Mn2+的情况下，CD4细胞的平均直线度分别为0.40和0.12。因此，该受试者血液的CD4细胞的STAPR值将是0.40/0.12＝3.33。在这种情况下，STAPR值越小，活化电位越小，α4β1整合素处于活化形式的部分更多。同样，同一公式可以用于使用图9、示例10中的数据确定α4β7整合素的DTAPR值。
α4β1整合素和/或α4β7整合素的Mn2+诱导的活化电位可以用作半定量工具以评估一个或多个受试者(诸如患有多发性硬化症、克罗恩病、结肠炎、动脉粥样硬化、自身免疫性甲状腺炎、阑尾炎、憩室炎、结节病、皮肤病、血管炎、狼疮和硬皮病或其组合的患者)中活化的α4β1整合素和/或α4β7整合素的部分。一个或多个白细胞亚组中的SAPR、DTAPR、DTAPR测试或其组合以及所生成的数据可以用于评估与炎性疾病状态有关的受试者的状态。在示例21、22、24和25中对在临床环境中使用Mn2+诱导的活化电位比进行讨论。
示例5：那他珠单抗抑制VCAM-1依赖性白细胞募集
本示例涉及使用白细胞粘附功能测定法检测那他珠单抗功效。附录I中陈述的方案使用以下修改来执行实验：
1.在用于LAFA分析之前，在室温下使用一系列剂量的那他珠单抗(Biogen，马萨诸塞州剑桥)处理血液样品。对于Mn2+活化的样品，在室温下于全血中使用不同剂量的那他珠单抗(例如，0.01、0.03、0.1、0.2、0.3、1、3和10μg/ml)处理大约5分钟之前，在室温下使用Mn2+处理血液大约5分钟。
那他珠单抗(中和性抗人α4整合素抗体)被认为是患有复发缓解型多发性硬化症(RRMS)的患者最有效的治疗之一。那他珠单抗抑制α4整合素配体结合，导致白细胞募集减少。因此，在本示例中，测试了根据示例性实施例的系统检测由那他珠单抗诱导而降低α4整合素粘附功能的能力。在用于流动测定之前，使用一定剂量范围的那他珠单抗(0.01、0.03、0.1、0.2、0.3、1、3和10μg/ml)处理血液样品。
在没有Mn2+的情况下，与没有那他珠单抗对照(105.6±20.5细胞/mm2，图2A)相比，0.01μg/ml的那他珠单抗处理对CD4相互作用细胞的数量(69.8±29.4细胞/mm2)没有影响。另一方面，与没有那他珠单抗对照(73.5±17.1细胞/mm2，图2B)相比，这种水平的那他珠单抗导致相互作用的CD8细胞的数量(36.9±10.1细胞/mm2)减少约50％(p<0.05)。增加那他珠单抗剂量则逐渐减少了CD4和CD8相互作用细胞的数量。在0.3μg/ml时，那他珠单抗完全抑制CD4和CD8细胞的CDAM-1依赖性募集(图2A和图2B)。
然而，在Mn2+处理的血液中，与没有那他珠单抗对照相比，0.3μg/ml的那他珠单抗对CD4和CD8细胞的募集没有影响(图2A和图2B)。完全抑制Mn2+活化的CD4和CD8细胞的募集所需的最小的那他珠单抗剂量被确定为10μg/ml(图2A)。另外，Mn2+处理诱导了CD4和CD8细胞两者中那他珠单抗IC50值增加超过15倍(图2D)，清楚地表明Mn2+诱导对α4整合素粘附功能的活化。有趣的是，与CD4细胞相比，Mn2+活化的CD8细胞显示出IC50值的轻微但显著(p<0.05)的增加，表明活化的CD8细胞对那他珠单抗的抗性比活化的CD4细胞稍高。
在不存在Mn2+的情况下，仅观察到少量相互作用的CD15细胞(图1B)。当使用那他珠单抗治疗时，相互作用的CD15细胞的数量保持较低并且0.3μg/ml的那他珠单抗导致完全消除相互作用的CD15细胞(图2C)。在Mn2+处理的血液中，有趣的是，与没有那他珠单抗对照(135.0±35.1细胞/mm2，图2C)相比，0.3μg/ml的那他珠单抗导致CD15细胞数量减少8倍至18.7±8.6个细胞/mm2(p<0.01)。另外，在7μg/ml的那他珠单抗下实现了对CD15细胞募集的完全抑制(图2C)。一致地，Mn2+处理的CD15细胞的IC50值显著低于CD4和CD8细胞的IC50值(p<0.05，图2D)。这些结果表明，与CD4和CD8细胞相比，Mn2+处理的CD15细胞对那他珠单抗治疗更敏感。
这些结果清楚地表明LAFA示例性实施例在体外准确评估那他珠单抗功效的能力。因此，LAFA示例性实施例可以用于辅助某些药物的药代动力学(PK)研究。传统上，基于药物或相关药物代谢物的血清水平来进行大多数药物的PK研究。然而，数量不一定转化为功能。本文中的某些实施例涉及可以用于评估那他珠单抗的主要功能的技术，而不考虑或基本上不考虑受试者血液中的药物浓度，允许对药物有效性进行更准确的评估。因此，本文中所讨论的技术可能是提高新药物/其他药物的PK研究的准确性的有用工具。
示例6：LAFA的准确性和/或敏感度优势
根据某些示例性实施例，本示例旨在说明与常规配体占据测定相比，LAFA示例性实施例评估那他珠单抗功效的准确性和/或敏感度优势。
为了执行配体占据测定，在室温下用或不用5mM MnCl2处理100μl全血大约10分钟。然后将一定剂量范围的那他珠单抗(例如，0.001、0.01、0.1、1、10、100和300μg/ml)加入血液中，并在室温下温育大约5分钟。还加入2μl的抗人CD4-Alexa488抗体以检测CD4阳性T淋巴细胞。此后，使用5ml的红血液裂解缓冲液(NH4Cl)裂解红细胞以除去红细胞。在使用PBS缓冲液洗涤3次后，将PE缀合的抗人IgG二抗(1:500稀释)加入白细胞中，并且在室温下避光孵育大约20分钟。然后，在用于流式细胞术测定之前，使用PBS缓冲液洗涤细胞3次。Alexa488用于识别CD4阳性T淋巴细胞，而PE阳性和平均荧光强度用于评估那他珠单抗与α4整合素的结合能力。
在对照(未处理的)血液中，0.001μg/ml的那他珠单抗不会导致PE阳性CD4淋巴细胞(图8A，圆圈)，表明该剂量的那他珠单抗没有诱导那他珠单抗与α4整合素结合。另一方面，随着那他珠单抗剂量的增加，PE阳性CD4淋巴细胞的百分比逐渐增加，并且在1μg/ml时达到73.9％的平台期(图8A)。附加地，与1μg/ml相比，在较高剂量的那他珠单抗时未检测到PE阳性CD4淋巴细胞百分比的进一步显著增加(图8A)，表明那他珠单抗与α4整合素的结合在1μg/ml时饱和。一致地，随着那他珠单抗剂量的增加，CD4淋巴细胞的PE MFI逐渐增加，并且在1μg/ml时达到平台期(图8B，圆圈)，表明那他珠单抗在α4整合素上的占据在那他珠单抗为1μg/ml时饱和。
在Mn2+活化的血液中，那他珠单抗的α4整合素占据几乎与未处理的血液中观察到的占据相同。如图8A和图9B(方形)所示，PE阳性CD4淋巴细胞和PE MFI的百分比均在那他珠单抗为1μg/ml时饱和，表明Mn2+活化对那他珠单抗与α4整合素的结合没有影响。
总之，这些发现表明，与未处理的对照相比，常规配体占据测定未能检测到那他珠单抗完全抑制Mn2+活化的细胞中α4整合素功能的更高要求。另一方面，使用LAFA分析可清楚地检测到在Mn2+处理的细胞和未处理的细胞之间完全抑制α4整合素功能所需的不同剂量(图2A)。因此，这些数据表明LAFA示例性实施例相对于常规配体占据测定的敏感度和准确度优点。因此，使用LAFA来准确确定药物功效可以应用于其他药物，其包括但不限于PTG-100和Bio-1211。
示例7：降低PML风险的模型
本示例涉及使用白细胞粘附功能测定来优化那他珠单抗治疗方案，因此降低药物诱导的副作用的风险，该药物诱导的副作用包括进行性多灶性白质脑病(PML)。
那他珠单抗抑制免疫系统的功能，因此控制疾病进展，但它也使患者面临诸如PML之类的副作用的风险，该PML是由John Cunningham病毒(JCV)感染引起的罕见且常常致命的疾病。全世界大约50％的多发性硬化患者携带JCV，并且在进行那他珠单抗疗法时存在PML的风险。
如图2所示，LAFA可以用于准确监测那他珠单抗功效，因此可以用于确定药物再给药的需要。例如，如果处于那他珠单抗的最大功效，则LAFA不会检测到细胞相互作用，表明不需要药物再给药。
然而，一旦药物功效降低至低于最大功效(例如，100％)，细胞相互作用将逐渐变得可被LAFA示例性实施例检测到。细胞相互作用的恢复指示免疫应答的重建，其可能有益于降低PML的风险。例如，在药物输注后，那他珠单抗饱和度水平将逐渐降至低于最大疗效至可以维持完整药物功效的某个点(例如，95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％)，该点可以定义为药物再给药窗口(图26)。将药物饱和度降低至低于最大功效可以导致白细胞募集和免疫应答的重建，其可以使免疫系统恢复应答和消除JCV感染的能力，从而降低PML的风险。
LAFA示例性实施例可以用作在逐个受试者的基础上准确地确定药物再给药窗口的工具，允许必要的免疫应答重建，而不牺牲药物功效。如果对于药物给药周期的每个、大部分或一部分允许药物再给药窗口的某个时段(例如，1、2、3、4、5、6或7天)，则可以有效减少那他珠单抗疗法的患者罹患PML的风险。延长给药间隔(最多5、6、7或8周)的患者不太可能患有PML，该延长给药间隔为患者的标准给药间隔(4周)。
然而，如表1和表5中所示，那他珠单抗敏感度可以在个体受试者之间显著变化，表明固定给药间隔可能不起作用或对某些受试者有效。这由图17中的数据支持，表明在药物输注后4周在一组MS患者中检测到不同水平的那他珠单抗功效。因此，LAFA示例性实施例可以用于确定个体受试者中的药物再给药窗口，从而因为可以在受试者中延长给药间隔，所以导致针对个体患者的更有效的个性化治疗方案并且降低PML风险。
示例8：低(10μg/ml)和高剂量(300μg/ml)那他珠单抗抑制白细胞与TNFα活化的HUVEC的牢固粘附
本示例旨在确认低剂量和高剂量的那他珠单抗对白细胞粘附功能具有类似影响。LAFA示例性实施例用于显示与低剂量相比，高剂量的那他珠单抗没有附加治疗益处，或基本上没有附加治疗益处。
白细胞向发炎组织的募集涉及白细胞和内皮细胞之间的一系列相互作用，其由多种粘附分子及其对应配体介导。本文中显示了那他珠单抗对α4整合素的抑制，其取消了VCAM-1依赖性白细胞募集。因此，在下一组实验中评估了α4整合素阻断对白细胞与内皮细胞相互作用的影响。因此，为了实际概括体内微循环，接下来研究那他珠单抗对流动条件下白细胞和肿瘤坏死因子α(TNFα)活化的人原代HUVEC之间的相互作用的影响。
人体内的原始药代动力学(PK)研究表明，在药物输注后，那他珠单抗血清水平的平均值可以达到110±52μg/ml。因此，选择高剂量的那他珠单抗(300μg/ml)以确保药物功效的饱和。在初始输注后第28天，平均那他珠单抗血清水平降至～10μg/ml，在～10μg/ml时，通常推荐使用那他珠单抗再给药，如Rudick，R.A.和A.Sandrock.于2004年的“Natalizumab:alpha 4-integrin antagonist selective adhesion moleculeinhibitors for MS.Expert review of neurotherapeutics”4:571-580所公开的，其全部内容通过引用并入本文。因此，本示例中还包括低那他珠单抗剂量(10μg/ml)。
仅在未处理的人全血中用Hoechst33342标记白细胞，并且使用每秒2帧的高帧率，允许捕获各个类型的相互作用细胞。与那他珠单抗对照相比，当使用低(10μg/ml)或高剂量(300μg/ml)的那他珠单抗治疗时，未检测到对相互作用的白细胞的数量的影响(图3A和图3D)。尽管低剂量的那他珠单抗使平均白细胞迁移速度略微降低(p<0.05)(图3B)，但与没有那他珠单抗对照(图3E)相比，高剂量的那他珠单抗显著增加(p<0.01)细胞速度。进一步的细胞动力学分析表明，10μg/ml的那他珠单抗将静态细胞的百分比(p<0.05)从43.6±7.3％(没有那他珠单抗对照)显著降至31.4±1.4％，同时爬行细胞的比例显著增加(p<0.05)(图3C)。同样，也在高剂量的那他珠单抗处理的细胞中检测到对静态和爬行细胞的百分比几乎相同的影响(图3F)。这些发现表明，低剂量和高剂量的那他珠单抗都能够以类似方式抑制白细胞牢固粘附在人内皮细胞上。
低剂量和高剂量的那他珠单抗更改TNFα活化的HUVEC上的CD4和CD15而非CD8细胞的迁移行为。
为了进一步表征低剂量和高剂量的那他珠单抗对特异性白细胞亚组的影响，将荧光标记的抗CD4、CD8和CD15抗体加入血液样品中。以每30秒1帧获取三维(3D)图像堆栈，随时间提供缓慢移动的细胞(静态和爬行细胞)的3D数据集。如图4A和图4D所示，10μg/ml和300μg/ml的那他珠单抗都不影响TNFα活化的HUVEC上相互作用的CD4、CD8和CD15细胞的数量。与没有那他珠单抗对照相比，低剂量和高剂量的那他珠单抗两者显著降低了CD4(p<0.05)和CD15(p<0.01)细胞的直线度，而没有检测到对CD8细胞的这种影响(图4B和图4E)。附加地，与没有那他珠单抗对照相比，低剂量和高剂量的那他珠单抗两者显著降低了CD15细胞的迁移速度，而高剂量的那他珠单抗也导致CD4细胞的速度降低(图4C和图4F)。这些发现说明了那他珠单抗抑制这些细胞的运动性的能力。另一方面，在CD8细胞中没有检测到低剂量或高剂量的那他珠单抗对细胞速度的这种影响(图4C和图4F)。一致地，那他珠单抗对CD4和CD15细胞运动性的抑制作用也得到共同原点图的支持(图6)。总之，这些结果表明，低剂量(10μg/ml)和高剂量(300μg/ml)的那他珠单抗对TNFα活化的HUVEC上的白细胞迁移行为具有几乎相同的影响。
示例9A：那他珠单抗有效性测试
那他珠单抗的标准剂量是每位患者每次输注300mg，通常每4周给予一次。那他珠单抗的批准给药方案基于药物的血清浓度，假设在高度异质的患者群体中具有相似的功效和代谢。然而，有人提出延长间隔给药(EID)长达8周不仅可以维持相同的治疗功效，而且还可以降低进行性多灶性白质脑病(PML)的风险，该PML是那他珠单抗治疗的致命副作用。另一方面，确定最佳和/或个性化的给药间隔以确保个体患者的药物有效性对于这种改善是有用的。本公开提供了这样的技术和能力。如本文中所描述的，某些示例性实施例涉及已经开发的新技术，其允许快速和/或准确评估那他珠单抗的有效性，而不管血清药物浓度如何。
当使用那他珠单抗治疗时观察到相互作用细胞数量的剂量依赖性减少(图2A至图2C)，提供评估那他珠单抗有效性的定量方法。相互作用的细胞的不存在可以用作那他珠单抗有效性阳性的指标。另外，结果表明个体血液供体之间的IC50值可以相差高达10倍(表1)，说明不同个体之间的药物敏感度存在显著差异。
表1-各个血液供体之间的IC50值。在用一系列剂量的那他珠单抗(0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3和10μg/ml)治疗之前，使用或不用5mM Mn2+处理血液。随后，在VCAM-1涂覆的微流体通道中分析血液样品，并且确定CD4、CD8和CD15相互作用细胞的数量。然后，计算那他珠单抗的半数抑制浓度(IC50)值。与CD4和CD8细胞的值相比，*，p<0.05；与CD4细胞的值相比，#，p<0.05。
表1
因此，为了确保患者安全，通常在个体患者中执行那他珠单抗有效性测试。还应当指出，发现完全阻断α4整合素功能所需的最小那他珠单抗浓度远低于目前所推荐的浓度。这些结果说明那他珠单抗可以保持其有效性的水平远低于之前认可的水平。
这些发现可以发展成新的血液测试，在那他珠单抗输注后的不同时间点执行。因而，测试结果可以用于确定需要那他珠单抗再给药。可以在个体患者中进行该血液测试以确保药物有效性，便于个体患者的最佳和/或个性化治疗方案的开发。
示例9B：来自多个测试的单个健康受试者中的那他珠单抗敏感度变异性。
本示例涉及从多个测试中评估单个受试者中的那他珠单抗敏感度。每1-2周从单个健康受试者收集血液样品5次。然后，根据示例5中所描述的方案，样品用于使用确定每个测试的IC50值的VCAM-1作为粘附底物进行白细胞粘附功能测定分析。使用那他珠单抗对CD4相互作用细胞的数量抑制影响来例示IC50值。
如表2中所示，来自测试2的IC50值(0.2624μg/ml)比测试4(0.047μg/ml)的值高近6倍，表明单个健康受试者中的那他珠单抗敏感度可能随时间显著变化。这些结果表明LAFA示例性实施例确定不同时间点那他珠单抗在相同受试者中的敏感度的细微差异的良好敏感度。这些差异还表明需要监测那他珠单抗功效并且定期确定个体患者的药物再给药窗口(详见示例7)。
测试 测试1 测试2 测试3 测试4 测试5
IC50(μg/ml) 0.0949 0.2624 0.05709 0.047 0.1932
表2：在表2中，提供了来自多个测试的单个健康受试者中的IC50值。每1-2周从单个健康受试者收集血液样品5次。然后，根据示例性实施例，根据附录A中的方案，样品使用确定每个测试的IC50值的VCAM-1作为粘附底物用于白细胞粘附功能测定。使用那他珠单抗对CD4相互作用细胞的数量的抑制影响来例示IC50值。
示例10：Mn对MAdCAM-1底物上的白细胞迁移谱的影响。
本示例涉及评估白细胞与内皮MAdCAM-1相互作用的能力。基于附录A中所规定的方案，进行了以下修改以执行实验：
1.人MAdCAM-1蛋白(R&D，目录号：6056-MC)用于以5μg/ml的浓度预涂覆微流体通道。
2.将以下抗体加入人全血样品中以识别特异性白细胞亚组：
CD4-Alexa488
CD8-PE
CD15-APC
CD19-BV510
为了表征细胞迁移行为，一定范围的细胞动力学参数用于评估α4β7整合素的配体结合活性。如图9A所示，与未处理的对照相比，Mn2+处理不影响MAdCAM-1底物上相互作用的CD4、CD8、CD15和CD19细胞的数量。然而，与未处理对照(CD4，1,227.3±115.0和CD8，2,248.8±293.2)相比，CD4和CD8细胞的平均速度分别显著(p<0.01)降至167.2±21.4和375.0±64.1μm/min，而在CD15和CD19细胞中没有检测到这种减少(图9B)。这些结果表明，Mn2+可以增强α4β7整合素与MAdCAM-1底物的结合能力，其可以导致细胞与MAdCAM-1的相互作用更强和相互作用的白细胞的速度更低。
基于它们的平均迁移速度，全部相互作用的细胞分为静态(<5μm/min)、爬行(5-20μm/min)、缓慢滚动(20-300μm/min)和滚动细胞(300-6000μm/min)，如示例1中详细描述的。如图9E和图9F所示，Mn2+显著(p<0.01)增加静态、爬行和缓慢滚动CD4和CD8细胞的数量，而与没有Mn2+对照相比，快速滚动的CD4和CD8细胞显著减少(图9E和图9F)。这些结果与Mn2+对细胞速度的影响一致，如图9B所示。没有检测到Mn2+对相互作用的CD15和CD19细胞的明显影响(图9G和图9H)。
附加地，与未处理的对照相比，通过Mn2+处理，相互作用的CD4、CD8和CD19细胞的直线度显著降低(p<0.01)，表明Mn2+诱导的细胞与底物的相互作用更强。同样，与未处理的对照(CD4，54.1±6.0和CD8，14.2±1.8秒)相比，Mn2+也显著(p<0.01)将CD4和CD8细胞的停留时间分别增加至135.8±11.4和138.8±12.9秒(图9D)。
总之，这些发现证明了Mn2+能够增强α4β7整合素活性并导致细胞与MAdCAM-1的相互作用更强。这些结果还表明LAFA示例性实施例能够在体外使用全血样品准确和/或定量评估α4β7整合素活性。
另外，可以扩展LAFA的用途以评估其他白细胞粘附分子的粘附功能。在本研究中，研究了白细胞α4β1和α4β7整合素与内皮VCAM-1和MAdCAM-1的相互作用，并且数据清楚地证明了定量检测α4整合素的活化和抑制的能力。本文中所描述的技术可以容易地扩展到其他白细胞粘附分子以及白细胞的其他结合分子，它们也在许多其他人类疾病(例如，示例16和21)的发病机理中牵涉到。例如，还可以使用相同的技术对白细胞表达的趋化因子受体对白细胞粘附功能的影响进行研究，如示例17和28中所详述的。结果，LAFA示例性实施例的应用可以显著扩展到许多其他药物和人类疾病。
潜在的应用包括：
-其他现有药物的患者分组/分层；
-识别其他人类疾病的新治疗靶标；以及
-扩展其他现有药物的应用
这些白细胞粘附分子的候选物、它们的特异性配体、相关疾病、靶向这些分子的药物以及药物制造商包括下表3中所示的那些。
表3-其他白细胞粘附分子候选物、配体、疾病和感兴趣的药物。
表3：已经或正在开发的药物清单。注意：带下划线的药物意味着这些药物目前在市场上销售。
示例11：α4β7整合素的基础炎性状态的半定量评估
本示例涉及示出可以在某些示例性实施例中使用的半定量评估工具。
如图9B至图9D所示，范围参数可以用于表征α4β7整合素的基础炎性状态。在图9B中，如果对照和Mn2+处理的白细胞的平均白细胞速度分别任意设定为10和1(也称为相对速度指数(RSI))，RSI值提供半定量工具来评估α4β7整合素在个体受试者和/或一个或多个受试者中的粘附功能。例如，在CD4细胞中，在不存在和存在Mn2+的情况下，平均白细胞速度是1,127.3μm/min和167.2μm/min，然后CD4细胞的RSI值可以分别定义为10和1。如果受试者的CD4细胞RSI值落在10和1之间，则RSI越接近1，α4β7整合素的活性越好，基础细胞炎性状态越高。
同样，在图9C中，如果对照和Mn2+处理的白细胞的平均停留时间分别任意设定为1和10(也称为相对停留时间指数(RDTI))，则RDTI值也将提供半定量工具，以评估α4β7整合素粘附功能。例如，在CD4细胞中，在不存在和存在Mn2+的情况下，平均白细胞停留时间为54.1秒和135.9秒，然后CD4细胞的RDTI值可以分别定义为10和1。在这种情况下，RDTI越接近10，α4β7整合素的活性越好。
在图9D中，如果对照和Mn2+处理的白细胞的平均直线度值分别任意设定为10和1(也称为相对直线度指数(RSTI))，则RSTI提供半定量方法来评估α4β7整合素粘附功能。例如，在CD4细胞中，在不存在和存在Mn2+的情况下，平均白细胞直线度为0.76和0.60，然后CD4细胞的RSTI值可以分别定义为10和1。在这种情况下，RSTI越接近1，α4β7整合素的活性越好。
α4β7整合素的基础炎性水平可以用作半定量工具以评估一个或多个受试者(诸如患有多发性硬化症、克罗恩病、结肠炎、动脉粥样硬化、自身免疫性甲状腺炎、阑尾炎、憩室炎、结节病、皮肤病、血管炎、狼疮和硬皮病或其组合的患者)的基础α4β7整合素活化水平和/或基础炎性状态。一个或多个白细胞亚组中的RSI、RDTI、RSTI测试或其组合以及所生成的数据可以用于评估与炎性疾病状态有关的受试者的状态。
示例12：维多珠单抗功效的检测
本示例涉及使用白细胞粘附功能测定示例性实施例检测维多珠单抗功效。基于示例10中描述的方案，进行以下修改以执行实验：
1.在用于LAFA示例性实施例之前，在室温下用一定剂量范围的维多珠单抗(Takeda)处理血液样品大约5分钟。对于Mn2+活化的样品，在室温下使用不同剂量的维多珠单抗处理约5分钟之前，在室温下使用Mn2+处理血液大约5分钟。
维多珠单抗(中和性抗人α4β7整合素抗体)用于治疗患有包括克罗恩病和结肠炎在内的炎性肠病的患者。维多珠单抗抑制α4β7整合素粘附功能，导致白细胞募集减少。因此，在本研究中，使用MAdCAM-1作为粘附底物，使用根据某些实施例的系统能够检测维多珠单抗抑制的α4β7整合素粘附功能。在用于白细胞粘附功能测定示例性实施例之前，在全血中使用一定剂量范围的维多珠单抗处理全血样品。
在不存在Mn2+的情况下，未检测到明显的维多珠单抗(范围为0.01至1μg/ml)对相互作用的CD4和CD8细胞的数量的影响(图10A和图10C)。与没有维多珠单抗对照(906.7±27.6μm/min)相比，0.01μg/ml的维多珠单抗治疗导致CD4细胞中平均细胞速度降低至411.5±85.9μm/min(图10B)。同样，通过相同剂量的维多珠单抗，CD8细胞的细胞速度也从2,974.6±845.3降至2,248.6±373.2μm/min(图10D)。这些结果表明0.01μg/ml的维多珠单抗略微增强了CD4和CD8细胞与MAdCAM-1底物之间的相互作用。相互作用的CD4细胞的降低速度逐渐增加并达到与1μg/ml的没有维多珠单抗对照相同的水平，表明高剂量(≥0.1μg/ml)的维多珠单抗对CD4细胞和MAdCAM-1底物之间的相互作用(图10B)具有抑制作用。另一方面，维多珠单抗的增加对CD8细胞的速度没有影响(图10D)。
然而，在Mn2+活化的细胞中，维多珠单抗的增加(从0.1到10μg/ml)导致相互作用的CD4细胞的数量从129.4±30.3细胞/mm2(没有维多珠单抗对照)逐渐减少到16.9±5.8细胞/mm2(10μg/ml的维多珠单抗)，表明维多珠单抗对MAdCAM-1底物上CD4细胞募集的抑制作用(图10A)。在Mn2+活化的CD8细胞中也观察到类似的维多珠单抗抑制作用(图10C)。如示例5中所述，计算各个供体中Mn2+活化的CD4细胞的IC50值。如表4所示，供体4的IC50值几乎是供体2的2倍，表明LAFA示例性实施例能够很好地检测不同受试者的维多珠单抗敏感度水平。
附加地，随着维多珠单抗浓度的增加，CD4细胞的平均速度逐渐增加，并且在10μg/ml时，细胞速度达到与没有维多珠单抗对照的相同水平或基本上相同的水平(图10B)。这表明维多珠单抗抑制α4β7整合素功能，导致细胞与MAdCAM-1的相互作用减弱以及细胞速度增加。同样，随着维多珠单抗剂量的增加，Mn2+处理的CD8细胞的平均速度也增强(图10D)，表明维多珠单抗对MAdCAM-1底物上CD8细胞募集存在类似抑制作用。还应当指出，在使用和不用Mn2+处理的CD4细胞之间分离了维多珠单抗剂量应答曲线，证明了某些示例性实施例能够准确确定不同水平的维多珠单抗敏感度(图10B)。
总之，这些结果表明LAFA示例性实施例不仅准确和/或定量评估维多珠单抗功效，而且还评估不同受试者之间维多珠单抗敏感度的细微差异。
表4：个体受试者中的维多珠单抗敏感度。在使用一定剂量范围的维多珠单抗治疗之前，使用Mn2+活化全血。然后，通过LAFA分析血液，然后如示例5中所述，确定IC50值。
附加地，随着维多珠单抗浓度的增加，CD4细胞的平均速度逐渐增加，并且在10μg/ml时，细胞速度达到与没有维多珠单抗对照的相同水平或基本上相同的水平(图13B)。这表明维多珠单抗抑制α4β7整合素功能，导致细胞与MAdCAM-1的相互作用减弱以及细胞速度增加。同样，随着维多珠单抗剂量的增加，Mn2+处理的CD8细胞的平均速度也增强(图13D)，表明维多珠单抗对MAdCAM-1底物上CD8细胞募集存在类似抑制作用。还应当指出，在使用和不用Mn2+处理的CD4细胞之间分离了维多珠单抗剂量应答曲线，证明了某些示例性实施例能够准确确定不同水平的维多珠单抗敏感度(图13B)。
总之，这些结果表明LAFA示例性实施例不仅能够准确和/或定量评估维多珠单抗功效，而且还能够评估不同受试者之间维多珠单抗敏感度的细微差异。
示例13：与常规配体占据测定相比，LAFA的准确度和/或敏感度优势。
本示例旨在显示根据某些示例性实施例的LAFA示例性实施例的准确性和/或敏感度优势，以评估与常规配体占据测定相比的维多珠单抗功效。基于示例6中描述的方案，对该方案进行以下修改以执行实验：
1.在用于FACS分析的细胞制备过程之前，使用一定范围的维多珠单抗剂量(0.001、0.01、0.1、1、10和100μg/ml)处理全血。
在对照细胞中，维多珠单抗剂量低于0.01μg/ml不会引起PE阳性CD4细胞，表明没有诱导维多珠单抗与其配体结合(α4β7整合素)(图11，圆圈)。增加维多珠单抗剂量逐渐诱导配体结合，并且在1μg/ml时达到50.7％的PE阳性CD4细胞的平台期。较高的维多珠单抗剂量(高达100μg/ml)不会导致配体结合的显著增加，表明维多珠单抗配体结合在1μg/ml时饱和(图11)。
在Mn2+活化的细胞中，维多珠单抗的α4β7整合素占据几乎与未处理的细胞中观察到的相同。如图11(方形)所示，PE阳性CD4淋巴细胞的百分比在维多珠单抗为1μg/ml时也饱和。这些结果表明，常规配体占据测定未能检测到α4β7整合素的Mn2+诱导的活化，其可以使用如图10和示例12中所示的LAFA示例性实施例检测到。该示例说明与常规配体占据测定相比，LAFA示例性实施例是更准确和/或更灵敏的测定以确定维多珠单抗的体外功效。
示例14：维多珠单抗对VCAM-1底物上白细胞募集的影响
本示例涉及确定维多珠单抗对VCAM-1底物上白细胞募集的影响。如示例1和12中所述，在用于白细胞粘附功能测定之前，用低(10μg/ml)和高(100μg/ml)剂量的维多珠单抗处理全血样品。
维多珠单抗是特异性结合α4β7整合素的单克隆抗体，对α4β1整合素没有交叉反应性。预计维多珠单抗不会影响VCAM-1底物上的白细胞募集。为了证实这一点，在用于LAFA分析之前，用两种剂量的维多珠单抗(10和100μg/ml)处理全血。
如图12所示，检测到维多珠单抗对相互作用的CD4、CD8、CD15和CD19细胞的数量没有影响。这些结果表明，维多珠单抗不能影响VCAM-1底物上的白细胞募集，证实了维多珠单抗对其靶分子的高度脓毒性。这些发现还表明LAFA示例性实施例在药物开发和/或筛选过程中识别以下各项中的一项或多项的潜在脱靶的能力：药物、小分子、抗体、肽和化合物。
示例15：那他珠单抗对MAdCAM-1底物上白细胞募集的影响
本示例涉及确定那他珠单抗对MAdCAM-1底物上白细胞募集的影响。如示例5和12中所述，在用于白细胞粘附功能测定之前，用10μg/ml的那他珠单抗处理全血样品。
那他珠单抗是针对α4β1整合素的单克隆抗体，但也已知具有与α4β7整合素的交叉反应性。那他珠单抗还可以抑制MAdCAM-1底物上的白细胞募集。为了测试这一点，在使用MAdCAM-1作为底物用于LAFA分析之前，使用或不使用10μg/ml的那他珠单抗处理健康全血，然后确定相互作用的细胞的数量。
如图13所示，10μg/ml的那他珠单抗几乎完成了对MAdCAM-1的CD4和CD8细胞募集的抑制。这些结果还表明LAFA示例性实施例在药物开发和/或筛选过程中识别以下各项中的一项或多项的潜在脱靶的优异能力：药物、小分子、抗体、肽和化合物。
示例16：那他珠单抗和维多珠单抗对P选择素底物和E选择素底物上的白细胞募集的影响。
本示例涉及使用白细胞粘附测定示例性实施例来检测那他珠单抗和维多珠单抗对P选择素底物和E选择素底物上的白细胞募集的影响。附录I中陈述的方案与以下修改一起用于执行实验：
1.微流体通道预涂覆人P-选择素蛋白(R&D System，目录号：ADP3)和人E-选择素蛋白(R&D System，目录号：ADP1)的组合，浓度分别为10μg/ml和为0.5μg/ml。
P选择素和E选择素是由血管内皮细胞表达的两种粘附分子。P和E选择素选择性地与其内皮配体(P-选择素糖蛋白配体1(PSGL-1))结合，以诱导白细胞在血管内皮上粘连和滚动。由于那他珠单抗和维多珠单抗特异性结合白细胞α4整合素，所以那他珠单抗或维多珠单抗会影响表达PSGL-1的白细胞的功能。因此，那他珠单抗或维多珠单抗可能对P和E选择素(PSGL-1配体)底物上的白细胞募集没有影响。
如图14所示，未处理的对照相比，除了那他珠单抗治疗的CD15细胞速度略微增加之外(图14B)，那他珠单抗或维多珠单抗对相互作用细胞数量、速度、或停留时间或直线度没有其他明显影响。这些结果表明，那他珠单抗和维多珠单抗都不会影响P和E选择素底物上的白细胞募集。
在那他珠单抗和维多珠单抗功效测试(如示例5和12中所述)中，如果药物功效接近或高于最大值，则将检测到很少或没有检测到细胞的相互作用。为了排除血液收集过程中血细胞可能受损的可能性，P和E选择素测定提供了合适的内部对照测定以确保血细胞的活力。同样，P和E选择素测定也可以用作内部对照，用于检测其他抗粘附药物的功效，包括但不限于依曲利珠单抗、依法利珠单抗、PTG-100和Bio-1211。
示例17：评估表达CXCR1和CXCR4的白细胞的功能。
本示例涉及使用白细胞粘附功能测定示例性实施例来评估表达CXCR1和CXCR4的白细胞的功能、以及它们对VCAM-1底物上白细胞募集的影响。附录I中陈述的方案使用以下修改来执行实验：
1.在用于测定之前，微流体通道预涂覆以下一种和/或多种底物之一：
VCAM-1(10μg/ml)，
VCAM-1(10μg/ml)+IL-8(1μg/ml，R&D System，目录号：208-IL)，
VCAM-1(10μg/ml)+SDF1α(1μg/ml，R&D System，目录号：350-NS)。
IL-8和SDF-1α是两种趋化因子，其可以通过形成浓度梯度来指导白细胞的迁移。表明IL-8主要诱导中性粒细胞趋化性，而SDF-1α主要调节T淋巴细胞趋化性。CXCR1和CXCR4分别是IL-8和SDF1α的受体，可以在白细胞膜上表达，并且起到调节白细胞迁移的作用。因此，CXCR1和CXCR4起到调节白细胞迁移行为的作用。在该示例中，IL-8和SDF1α与VCAM-1组合用作粘附底物，从而可以评估表达CXCR1和CXCR4的白细胞的功能。
与单独的VCAM-1相比，SDF1α加VCAM-1显著(p<0.05)减少了相互作用的CD4和CD8细胞的数量，而CD15细胞的数量显著增加(图15A)，表明CXCR4在这些白细胞上的表达和功能。一致地，SDF1α也显著(p<0.05)降低了相互作用的CD4细胞的直线度，表明CD4细胞能够从SDF1α接收信号，证实了CXCR4的功能作用(图15B)。附加地，与单独的VCAM-1相比，在VCAM-1和IL-8存在下，相互作用的CD15细胞的停留时间显著增加，表明CXCR1起到调节CD15细胞迁移行为的功能性作用(图15C)。
总之，这些结果表明LAFA示例性实施例检测趋化因子受体功能的能力，以及它们对特异性白细胞亚组中白细胞迁移行为的影响。然后，可以使用类似的策略来评估表达趋化因子受体和/或趋化因子的其他白细胞的功能。已经表明，可以在疾病状态下活化某些趋化因子受体和/或趋化因子的表达和功能。因此，LAFA示例性实施例提供了用于定量识别这些异常活化的合适工具，其然后可以用于根据个人情况和/或针对一个或多个受试者开展最佳治疗。
示例18：预测IBD患者对维多珠单抗疗法做出应答的可能性。
本示例涉及使用白细胞粘附功能测定示例性实施例来预测患者对维多珠单抗疗法做出应答的可能性。基于示例10中描述的方案，进行以下修改以执行实验：
1.从患有活动性炎性肠病的患者中采集血液，该患者目前未进行维多珠单抗治疗。为了测试患者白细胞能够对维多珠单抗做出应答，在用于LAFA分析之前，用各种剂量的维多珠单抗(例如，0.01、0.03、0.1、0.3、1、3和10μg/ml)处理血液。
与未处理的对照相比，尽管没有明显检测到维多珠单抗对相互作用的CD4和CD8细胞的数量的影响，但是维多珠单抗处理(0.1μg/ml)增加了IBD患者#1中CD4和CD8白细胞相互作用的速度(图16A和图16D)。这些结果表明，维多珠单抗减弱了白细胞和MAdcAM-1底物之间的相互作用，导致细胞速度的增加。这些发现还证明了来自患者#1的CD4和CD8白细胞能够在体外对维多珠单抗治疗做出应答，基于此，可以预测患者#1可能对维多珠单抗治疗做出应答。该预测与示例24和25中撤回的结论一致，其中也预计IBD患者#1对维多珠单抗治疗做出的应答最佳。
在IBD患者#2中，与未治疗的对照相比，维多珠单抗治疗也增加了CD4白细胞的速度，而在CD8白细胞中未检测到这种影响(图16F和图16H)。这些结果表明来自患者#2的CD4白细胞能够在体外对维多珠单抗治疗做出应答，表明IBD患者#2也可能对维多珠单抗治疗做出应答。
另一方面，在IBD患者#3中，与未处理的细胞相比，没有检测到维多珠单抗对CD4和CD8白细胞的数量的明显影响(图16I和图16K)。维多珠单抗治疗没有改变CD4细胞的平均速度，而CD8细胞的速度急剧下降(图16J和图16L)。这些结果表明，来自患者#3的白细胞不能在体外对维多珠单抗治疗做出应答。因此，可以预测患者#3可能不太可能对维多珠单抗疗法做出应答。
对于IBD患者#4，与未治疗的对照相比，维多珠单抗治疗引起CD4和CD8白细胞数量的适度减少，表明维多珠单抗在MAdCAM-1底物上募集CD4和CD8细胞的抑制作用。基于这些结果，可以预测患者#4也会对维多珠单抗疗法做出应答。
总之，该示例中的结果表明LAFA示例性实施例对IBD患者进行分层的能力，这些IBD患者可能对维多珠单抗疗法做出应答，这种能力可能潜在地导致分层后的患者群体中维多珠单抗疗法的临床缓解率增加。附加地，类似的策略可以用于预测患者对其他抗粘附疗法做出应答的可能性，这些疗法包括例如以下各项中的一项或多项：PTG-100、那他珠单抗、Bio-1211、依曲利珠单抗和依法利珠单抗。还可以使用本示例和/或其他示例性实施例中概述的程序评估其他合适的抗粘附疗法。
示例19：在经历那他珠单抗功效的MS患者中检测药物功效
根据某些示例性实施例，本示例涉及使用白细胞粘附功能测定示例性实施例来评估经历那他珠单抗治疗的多发性硬化(MS)患者中的那他珠单抗功效。基于示例1中描述的方案，对该方案进行了以下修改以执行实验：
1.从目前未经历维多珠单抗治疗的MS患者中采集血液。
在药物输注后的不同时间点(2、4、6和10周)收集血液样品，然后使用VCAM-1作为粘附剂底物通过LAFA示例性实施例进行分析。考帕松疗法的MS患者用作阴性对照组，因为考帕松不太可能对α4整合素功能产生任何影响。
在不存在Mn2+的情况下，如图20A所示，在考帕松患者中检测到大量相互作用的CD4细胞(326.9细胞/mm2)。另一方面，在输注那他珠单抗后第2周仅观察到CD4细胞的背景水平(11.5细胞/mm2)，表明在该患者中完全或基本上抑制CD4细胞与VCAM-1底物的相互作用。同样，在药物输注后第4周收集的血液样品中未检测到VCAM-1底物上的明显CD4募集(图20A)，表明100％那他珠单抗功效。
然而，在输注那他珠单抗后第6周，检测到少量(23.9细胞/mm2)相互作用的CD4细胞，并且在药物输注后第10周，观察到更明显的CD4细胞募集(70.1细胞/mm2)，表明在这些时间点那他珠单抗功效较低而非最大(图20A)。还应当指出，在输注那他珠单抗后第6周和第10周(不是第2周和第4周)，Mn2+处理增加了相互作用的CD4细胞的停留时间，证实在第6周和第10周时，药物功效降低至低于最大值(图20B)。
总之，这些结果表明LAFA示例性实施例的优异能力和/或敏感度，以准确和定量评估经历那他珠单抗疗法的患者的药物功效。由于那他珠单抗的敏感度可以随时间并且在个体受试者之间显著变化，因此LAFA示例性实施例提供了快速且准确的工具以根据个人情况监测药物功效，从而便于开发个性化治疗方案以最大化药物疗法益处并最小化药物诱导的副作用。附加地，类似的策略可以用于监测其他抗粘附药物的功效，这些其他抗粘附药物包括以下各项中的一项或多项：维多珠单抗、依法利珠单抗、PTG-100和Bio-1211。还可以使用本示例和/或其他示例性实施例中概述的程序来评估其他合适的抗粘附疗法。
示例20：LAFA在临床设置中作为即时检验的用途。
本示例涉及使用白细胞粘附功能测定示例性实施例来开展一定范围的现场护理测试。
例如，本文中所描述的技术可以用于开展现场护理血液测试，其检测那他珠单抗的体外有效性。血液测试可以包括分析设备、微流体系统(例如，微流体泵和微流体芯片)、分析算法、数据传输平台和相关试剂。如图7所示，用户/患者可以：1.通过手指刺破从指尖获取血液样品；2.将血液加载到芯片中；3.将芯片插入分析设备；以及4.获得结果。
无论血清药物浓度如何，现场护理血液测试可以允许直接评估那他珠单抗功能。目前没有技术具备这种能力。血液测试仅需<100μl(手指刺破量，例如，10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900和1,000μl)的全血，并且可以在30分钟(例如，5、10、15、20、25、30、40、50、60、90、120、180、240分钟)内提供结果。血液测试可以被实现为当前的治疗方案，因为它可以在施用那他珠单抗后的不同时间点使用，从而仅当通过血液测试检测到药物有效性的降低时才通知需要再给药那他珠单抗输注。结果，血液测试可以便于开展个体患者的个性化治疗方案。其目的是使血液测试与现有设备和/或平台，甚至智能手机兼容，以实现与GP/专家的远程数据共享，从而显著减少繁忙的MS专家的工作量。
另外，还可以从LAFA示例性实施例开展其他临床应用，包括但不限于：
1.现场护理测试以确定其他药物的功效，包括但不限于维多珠单抗、依曲利珠单抗、依法利珠单抗、PTG-100和Bio-1211。
2.根据个人情况优化治疗方案，以降低药物引起的副作用的风险。
3.监测一个或多个受试者的健康状态。
4.识别个体患者中白细胞粘附功能的标志物。
5.识别更改的白细胞粘附功能(与健康对照相关)。
6.预测一个或多个受试者对某些疗法做出应答的可能性。
7.为病因不明或无疾病诊断的一个或多个受试者推荐合适的治疗。
示例21：为白细胞粘附功能(白细胞粘附指纹)创建个人谱。
本示例涉及根据某些示例性实施例的使用白细胞粘附功能测定示例性实施例分析在不同时间点从单个健康受试者收集的多个血液样品。在示例1、10和16中详述在该示例中使用的LAFA示例性实施例。使用VCAM-1(α4β1整合素配体)、MAdCAM-1(α4β7整合素配体)和P-选择素(PSGL-1配体)作为底物通过LAFA示例性实施例对血液样品进行分析。结果，如示例3和11中所详述的，产生了基础水平的白细胞粘附功能的个人谱。在用于LAFA分析之前，也用5mM MnCl2对血液进行处理，从而可以确定Mn2+诱导的活化电位，如示例4中所详述的。
使用LAFA示例性实施例进行七次血液测试(从测试1至测试7)。在第1周、第9周、第11周、第12周、第13周、第15周和第16周内，在大约三个月的时段内，在不同时间点从健康个体收集血液样品。该示例的最初目标是使用这7个血液测试的数据来为这个健康个体创建个人白细胞粘附功能谱。然而，当执行血液测试#5(第13周)时，该个体患有智齿疼痛(智齿附近发炎的牙龈)。如下文详细介绍的，不仅在血液测试#5中检测到异常白细胞活化，而且在血液测试#5之前7天执行的血液测试#4(第12周)中检测到异常白细胞活化。
在VCAM-1底物上，在测试#1-6中观察到CD4和CD8细胞直线度的非常微小的变化。这证明了LAFA示例性实施例能够在不同时间点产生一致结果(图18C和图18H)。然而，与其他血液测试的结果相比，在血液测试#4中观察到静息的CD4和CD8白细胞中异常低的白细胞速度，表明这些白细胞的活化。此外，还检测到静息的CD4和CD8细胞的停留时间长(图18D和图18I)。在血液测试#4中，CD4和CD8细胞的停留时间活化电位比(DTAPR，如示例4中所述)高，表明与该序列中测试的其他血液样品相比，大部分α4β1整合素被活化。这些发现表明在牙龈炎症之前7天执行的血液测试#4中，α4β1整合素在CD4和CD8白细胞上异常活化。这些结果证明使用DTAPR作为标志物来检测全身和/或局部炎症中的免疫应答的早期症状。
在MAdCAM-1底物上，在CD4和CD8白细胞中检测到平均细胞速度的微小的变化，表明LAFA示例性实施例评估白细胞粘附功能的良好一致性。然而，当出现智齿疼痛时，在血液测试#5中，在静息的CD4细胞中观察到低直线度(图19C)。与在该序列中测试的其他血液样品中发现的值相比，在测试#5中，静息的CD4细胞的停留时间也异常长(图19D)。CD4和CD8白细胞两者中直线度活化电位比(STAPR)的值低，表明在血液测试#5中，CD4和CD8白细胞上大部分α4β7整合素被活化(图19E和图19J)。这些结果证明了使用ATAPR作为用于评估和/或预测全身和/或局部炎症中免疫应答的标志物。
在P-选择素底物上，在血液测试#4和#5中，检测到大量相互作用的CD4和CD8细胞，并且当与其他测试结果比较时，表明这些白细胞中的不寻常的PSGL-1(P-选择素配体)活化(图20A和图20E)。附加地，血液测试#5中CD15细胞的数量高于其他测试的平均值的几乎8倍，表明CD15白细胞上的PSGL-1高度活化(图20I)。在血液测试#4和#5中，CD4、CD8和CD15细胞的平均细胞速度异常低，表明这些白细胞和P-选择素底物之间存在强烈的相互作用(图20C、图20G和图20K)。当与其他血液检测结果相比时，在血液测试#5中，CD8和CD15细胞的停留时间异常长。这表明CD8和CD15白细胞上的PSGL-1高度活化，导致白细胞和P-选择素素底物之间的相互作用增强。
总之，这些发现证明了LAFA示例性实施例能够在受试者中为基础水平的炎性状态创建个人谱。尽管智齿疼痛，但是白细胞迁移谱的几个参数不受这种局部牙龈炎症的影响，这些参数包括VCAM-1底物上的细胞直线度(图18C和图18H)、以及MAdCAM-1底物中的细胞速度(图19B和图19G))。这些发现证明了LAFA示例性实施例用于检测白细胞粘附功能的良好再现性。
然而，基于该基础水平的炎性状态，在急性炎症之前至多7天，可清楚地检测到牙龈炎症对一定范围的其他参数的影响。我们的结果清楚地表明在血液测试#4和#5中，α4β1整合素、α4β7整合素和PSGL-1的活化。还应当指出，局部牙龈炎症的影响在不同白细胞亚组中的不同参数之间显著不同。因此，这些结果表明特异性白细胞亚组上的特定参数的改变的潜在用途，这些用途确定异常免疫应答的早期症状，该早期症状然后可以用于预测某些疾病的可能性。
创建“白细胞粘附指纹”
通过能够评估特异性白细胞亚组中多种白细胞粘附分子的粘附功能，可以比以前更详细地定量表征白细胞粘附功能。可以在各个流动通道中研究多种白细胞粘附分子的粘附功能，这些流动通道预涂覆特异性粘附内皮分子底物。结果，可以生成特异性白细胞亚组上的每个粘附分子的细胞迁移谱。结合先进的生物信息学，可以为个体受试者/患者生成白细胞粘附指纹。白细胞粘附指纹可以用作用于识别白细胞异常的有用工具。因此，白细胞粘附指纹的潜在应用包括：
确定个体化发病机理
识别疾病的新疾病标志物
识别疾病的早期症状
协助早期准确诊断
疾病预测
监测健康人的健康状态(常规健康检查)
一些实施例能够使用未处理的全血同时评估多个白细胞亚组上的多个白细胞粘附分子的粘附功能。某些示例性实施例的潜在应用可以不限于某些白细胞分子、或某些白细胞亚组、或某些哺乳动物物种。
示例22：评估患有多发性硬化症(MS)和炎性肠病(IBD)的患者中白细胞分子的基础炎性状态
本示例涉及根据某些示例性实施例，与健康受试者对照相比，识别患有多发性硬化症(MS)和/或炎性肠病(IBD)的患者的白细胞粘附功能的异常活化。从MS和/或IBD患者采集血液样品，然后，使用VCAM-1和MAdCAM-1作为底物用于白细胞粘附测定分析，如示例1和10中所详述的。计算α4β1整合素和α4β7整合素的基础炎性状态，如示例3和11中所详述的。
为了比较健康受试者对照与MS和/或IBD患者的基础炎性状态，采用相对直线度指数(RSTI)、相对速度指数(RSI)和相对停留时间指数(RDTI)，如示例3和11中所详述的。在示例3中陈述在该示例中用于选择在对照组中使用的健康受试者的准则。
如图21A所示，与健康对照相比，在MS和IBD患者中观察到CD4和CD8白细胞中显著更低的RSTI值，表明在MS和IBD细胞中α4β1整合素活化增强。在MS和IBD患者中也检测到CD4和CD8白细胞中显著较低的RSI值，表明在MS和IBD细胞中α4β1整合素的基础炎性状态异常增加(图21B)。一致地，还在MS和IBD CD4和CD8白细胞中检测到RDTI值降低(图21C)。这些结果清楚地表明MS和IBD患者中α4β1整合素的异常活化。
如图21D所示，与健康对照相比，在来自IBD患者的CD4白细胞中检测到显著更低的RSTI值，表明IBD患者中CD4白细胞中α4β7整合素被高度活化。一致地，在来自IBD患者的CD4白细胞中也观察到较低的RSI和RDTI值。另一方面，在MS患者中未观察到α4β7整合素的这种活化，表明与健康对照有关的MS CD4白细胞中α4β7整合素功能正常。
总之，这些结果清楚地表明LAFA示例性实施例能够检测α4β1整合素和α4β7整合素对MS和IBD患者中特异性白细胞亚组的异常活化。如示例23中的图18C和图18H所示，白细胞直线度通常不受局部炎症(诸如智齿疼痛)的影响。因此，MS和IBD白细胞中较低的RSTI值可以用作以下各项中的一项或多项的特异性疾病标志物：1.协助疾病诊断，2.对患者亚群进行分层，3.检测疾病的早期症状，以及4.根据个人情况优化治疗条件。RSTI、RSI和RDTI的使用便于该技术应用于临床设置。
示例23：评估患有多发性硬化(MS)和炎性肠病(IBD)的患者中白细胞分子的Mn2+诱导的活化电位。
本示例涉及评估MS和IBD患者中白细胞分子的Mn2+诱导的活化电位。从MS和IBD患者采集血液样品，然后，使用VCAM-1和MAdCAM-1作为底物用于白细胞粘附测定分析，如示例1和10中所详述的。计算α4β1整合素和α4β7整合素的Mn2+活化电位，如示例4所详述的。
为了比较健康对照与患有MS和IBD的患者的基础炎性状态，采用直线度活化电位比(STAPR)、速度活化电位比(SAPR)和停留时间活化电位比(DTAPR)，如示例4中所详述的。
如图22A所示，在VCAM-1底物上IBD CD8白细胞的STAPR值显著(p<0.01)低于健康对照，表明IBD CD8细胞中大部分α4β1整合素被活化且Mn2+诱导的活化电位较低。一致地，与健康对照相比，观察到IBD CD8白细胞中显著更高的DTAPR值(图22C)。应当指出，IBD CD4白细胞的DTAPR值也高于健康对照，表明在IBD CD4细胞中Mn2+诱导的活化电位较低(图22C)。与健康对照相比，检测到MAdCAM-1底物上的MS和IBD患者中STAPR、SAPR或DTAPR没有明显差异(图22D至图22F)。
总之，这些结果清楚地表明LAFA示例性实施例能够检测α4β1整合素和α4β7整合素对MS和IBD患者中特异性白细胞亚组的异常Mn2+诱导的活化电位。因此，STAPR、SAPR或DTAPR值可以用作高度特异性疾病标志物以：1.协助疾病诊断，2.对患者亚群进行分层，3.检测疾病的早期症状，以及4.根据个人情况优化治疗条件。STAPR、SAPR或DTAPR的使用应当便于某些示例性实施例应用于临床设置。
示例24：使用基础炎性状态预测一个或多个受试者对抗粘附疗法做出应答的可能性。
本示例涉及使用白细胞分子的基础炎性状态预测一个或多个受试者对抗粘附疗法做出应答的可能性，包括但不限于单克隆抗体、小分子、化合物和肽。在示例3和11中详述了白细胞粘附分子的基础炎性状态的计算。
在示例性实施例中，白细胞分子的基础炎性状态可以用于对这些分子中活性高度增强的患者亚群进行分层，包括但不限于α4β1、α4β7整合素、αL整合素、αM整合素、CXCR1和CXCR4。
已经开发了或正在开发几种药物(包括但不限于那他珠单抗、维多珠单抗、依曲利珠单抗、PTG-100、Bio-1211和依法利珠单抗)来抑制白细胞粘附分子的功能，因此减弱疾病进展。可以预测具有高基础炎性状态的患者亚群更可能对抑制这些分子功能的治疗做出应答。
例如，如图21A所示，在所有4个IBD患者中，IBD患者#1在VCAM-1底物量上具有最低的RSTI值，表明患者#1的α4β1整合素最活化。基于该结果，可以预测IBD患者#1可以对抑制α4β1整合素功能的疗法(例如，那他珠单抗或Bio-1211)做出最佳应答。
同样，如图21D所示，在所有4个IBD患者中，IBD患者#1在MAdCAM-1底物量上也具有最低的RSTI值，表明患者#1的α4β7整合素最活化。基于该结果，可以预测患者#1可以对抑制α4β7整合素功能的疗法(例如，维多珠单抗或PTG-100)做出最佳应答。
总之，我们的结果表面RSI、RDTI和RSTI作为标志物能够预测一个或多个受试者对特定疗法做出应答的可能性。
因而，这些数据清楚地表明LAFA可以用于患者分组/分层。例如，尽管α4β1整合素在MS患者中被活化，但是α4β1整合素的基础炎性状态可能在个体患者之间显著变化。本文中所生成的半定量工具允许确定个体患者中α4β1整合素的活化水平。结果，可以识别α4β1整合素高度活化的患者并将其与α4β7整合素活化低或α4β7整合素没有活化的患者分开。然后，可以预测，与其他患者组相比，那他珠单抗疗法在α4β1整合素高度活化的MS患者中会更有效。
示例25：使用Mn2+诱导的活化电位预测一个或多个受试者对抗粘附疗法做出应答的可能性。
本示例涉及使用Mn2+诱导的活化电位预测一个或多个受试者对抗粘附疗法做出应答的可能性，包括但不限于单克隆抗体、小分子、化合物和肽。在示例4中详述了白细胞粘附分子的Mn2+诱导的活化电位(例如，直线度活化电位比(STAPR)、速度活化电位比(SAPR)和停留时间活化电位比(DTAPR))的计算。
在示例性实施例中，特异性白细胞分子的Mn2+诱导的活化电位也可以用于对具有增强部分的这些分子的活化形式(或低Mn2+诱导的活化电位)的患者亚群进行分层，这些分支包括但不限于α4β1整合素、α4β7整合素、α3β1整合素、αVβ3整合素、αLβ2整合素、αIIbβ3整合素、α6β1整合素、α1β1整合素、α2β1整合素、αvβ3整合素、以及α5β1整合素。
已经开发了或正在开发几种药物(包括但不限于那他珠单抗、维多珠单抗、依曲利珠单抗、PTG-100、Bio-1211和依法利珠单抗)来抑制白细胞粘附分子的功能，因此减弱疾病进展。可以预测具有大部分的这些分子的活化形式(或低Mn2+诱导的活化电位)的患者亚群更可能对抑制这些分子功能的治疗做出应答。
例如，尽管健康对照和IBD患者之间的STAPR没有显著差异，但是在所有IBD患者中，IBD患者#1的STAPR值量最低，表明该患者中最高部分的α4β1整合素被活化。基于该结果，可以预测IBD患者#1可以对抑制α4β1整合素功能的疗法(例如，那他珠单抗或Bio-1211)做出最佳应答。该预测与基于示例24中的RSTI值的预测相同，其中预测同一患者(IBD#1)对抗α4β1整合素疗法做出最佳应答。
总之，我们的结果表明STAPR、SAPR和DTAPR作为标志物能够预测一个或多个受试者对特异性疗法做出应答的可能性。
示例26：基于白细胞粘附功能测定(LAFA)的结果推荐特异性抗粘附疗法。
本示例涉及使用白细胞粘附功能测定示例性实施例向病因未知的患者和/或疾病诊断之前、疾病诊断之后或其组合向该患者提供特异性疗法的推荐。
LAFA示例性实施例可以用于直接评估来自一个或多个受试者的白细胞能够对某些药物做出应答，这些药物包括但不限于单克隆抗体、小分子、化合物和肽。基于这些结果，然后可以预测对一个或多个受试者进行特异性疗法的可能性，如示例18中所详述的。
LAFA示例性实施例允许定量评估一定范围的白细胞表达分子的功能，这些白细胞表达分子包括但不限于α4β1整合素、α4β7整合素、PSGL-1、CXCR1和CXCR4，导致对这些分子的基础炎症状态进行半定量评估，如示例3和11中所详述的。基于这些分子的基础炎性状态，然后可以预测对一个或多个受试者进行特异性疗法的可能性，如示例24中所详述的。
同样，LAFA示例性实施例还提供了半定量工具以评估Mn2+诱导的活化电位，使得可以确定特异性白细胞亚组上活化的白细胞分子的部分。基于这些结果，然后可以预测对一个或多个受试者进行特异性疗法的可能性，如示例25中所详述的。
LAFA示例性实施例可以用于针对未知病因的受试者(或多个受试者)和/或在疾病诊断之前开展治疗。例如，与健康对照相比，如果在一个受试者(或多个受试者)中识别出α4β1整合素活化更改，则可以预测抗α4整合素疗法(例如，那他珠单抗)可以适用于在对该一个和/或多个受试者中进行疾病诊断之前，治疗该一个和/或多个受试者。
在示例性实施例中，与健康对照相比，在一个或多个受试者中检测到α4β1整合素活性更改可以表明应该给予一个或多个受试者抗α4整合素疗法(例如，那他珠单抗)以治疗该一个或多个受试者。在示例性实施例中，检测一个或多个受试者中α4β1整合素活性更改表明应当给予一个或多个受试者抗α4整合素疗法(例如，那他珠单抗)以减轻该一个或多个受试者的疾病进展，其中在一个或多个受试者的疾病诊断之前，给予一个或多个受试者抗α4整合素疗法。在某些示例性实施例中，检测α4β1整合素活化状态的基础炎性状态可以用于指示抗α4整合素治疗可以适用于病因未知的一个或多个受试者和/或在疾病诊断之前、在疾病诊断之后或其组合。在某些示例性实施例中，α4β1整合素的Mn2+诱导的活化电位的检测可以用于指示抗α4整合素治疗可以适用于病因未知的一个或多个受试者和/或在疾病诊断之前、在疾病诊断之后或其组合。
如表3中所示，已经开发了一定范围的抗粘附药物以抑制这些白细胞分子的功能，旨在减弱疾病进展。因此，可以使用类似的策略来识别一个和/或多个受试者中其他白细胞分子(例如，β1整合素、β7整合素、PSGL-1、CXCR1和/或CXCR4)的活化更改，基于其，可以在病因未知的情况下和/或在疾病诊断之前、在疾病诊断之后或其组合开发合适的治疗策略。
另外，LAFA示例性实施例可以用于识别某些药物的新应用，包括但不限于那他珠单抗、维多珠单抗、依法利珠单抗、依曲利珠单抗、PTG-100和Bio-1211。例如，那他珠单抗疗法的应用目前仅限于MS和克罗恩病。使用本文中所开发的定量方法，可以分析来自患有其他炎性疾病的患者的血液样品，从而识别α4整合素功能增加的患者群体，如示例18、24和25中所详述的。因此，预计那他珠单抗疗法能够控制这些患者群体的疾病进展。结果，那他珠单抗疗法的应用可能会扩展到其他人类疾病。
示例27：确定个体MS和IBD患者中抗粘附疗法的药物敏感度。
本示例涉及使用白细胞粘附功能测定示例性实施例以使用IC50值确定个体患者的药物敏感度水平，如示例5和12中所详述的。
例如，为了定量评估多发性硬化(MS)患者中的那他珠单抗敏感度，从MS患者收集血液样品，然后使用VCAM-1作为底物用于LAFA分析，如示例5中所详述的。如表5中所示，患者#1的那他珠单抗IC50值(0.2657μg/ml)是患者#2的那他珠单抗IC50值(0.06843μg/ml)的几乎4倍，表明患者#1对那他珠单抗的耐药性是患者#2对那他珠单抗的耐药性的4倍。另外，患者#1的那他珠单抗IC50值也高于健康对照中的平均IC50值(0.03μg/ml)，如表1所示。
患者 MS患者#1 MS患者#2
那他珠单抗IC50(μg/ml) 0.2657 0.06834
表5：个体MS患者的那他珠单抗IC50值。如示例5中所详述的，从MS患者收集血液样品，然后使用VCAM-1作为底物用于LAFA。然后，如示例5中所详述的，确定每个患者的IC50值。
在另一示例中，如示例12中所详述的，为了定量评估患者中的维多珠单抗敏感度，从IBD患者收集血液样品，然后使用MAdCAM-1作为底物用于LAFA。在图10A和示例12中表明维多珠单抗不会抑制健康受试者中MAdCAM-1底物上静息的CD4白细胞的数量。然而，如图23所示，随着维多珠单抗浓度的增加，相互作用的CD4白细胞的数量逐渐减少，表明维多珠单抗抑制IBD CD4白细胞募集的能力。还确定了三个单独的IBD患者中的维多珠单抗IC50值。如表6所示，患者#3中的维多珠单抗IC50值(2.573μg/ml)是患者#2中的维多珠单抗IC50值(1.009μg/ml)的2.5倍，表明维多珠单抗敏感度在不同IBD患者中存在较大差异。
表6：各个IBD患者的维多珠单抗IC50值。如示例12中所详述的，从IBD患者收集血液样品，然后使用MAdCAM-1作为底物用于LAFA。然后，如示例12中所详述的，确定每个患者的IC50值。
总之，这些结果表明LAFA示例性实施例能够使用IC50值定量评估个体患者的不同药物敏感度水平。来自LAFA示例性实施例的结果可以便于针对范围广泛的药物和/或治疗根据个人情况开展最佳给药方案。
示例28：评估患有多发性硬化(MS)和炎性肠病(IBD)的患者中表达CXCR1和CXCR4的白细胞的功能。
本示例涉及评估MS和IBD患者中表达CXCR1(IL-8受体)和CXCR4(SDF1α受体)的白细胞的功能。如示例17中所详述的，从患者收集血液样品，然后使用VCAM-1+IL-8或VCAM-1+SDF1α作为底物通过LAFA示例性实施例进行分析。
如图25所示，与健康对照相比，在MS患者中，VCAM-1+IL-8底物上的相互作用的CD4(p<0.01)和CD15(p<0.05)白细胞的数量显著增加，表明在MS患者中CXCR1功能被活化(图25A)。VCAM-1+SDF1α底物上相互作用的MSCD15细胞的数量增加，表明MS CD15白细胞上的CXCR4的活性增加(图25E)。
另外，比较健康对照，在IBD患者中，CD4和CD8白细胞在VCAM-1+SDF1α上的停留时间显著(p<0.05)增加，表明IBD CD4白细胞和IBD CD8白细胞中CXCR4的活化增强。一致地，与健康相比，IBD CD4白细胞和IBD CD8白细胞的直线度降低(几乎达到统计学显著性)，表明IBD CD4白细胞和IBD CD8细胞经由CXCR4从SDF1α接收信号的能力增强。
总之，这些结果清楚地表明LAFA示例性实施例能够检测患有MS和IBD的患者中表达CXCR1和CXCR4的白细胞的异常活化。因此，这些测试也可以用于评估其他疾病中其他白细胞趋化因子受体的功能。基于测定的结果，然后可以对患者进行分层和/或然后可以根据个人情况来开展更多靶向疗法。例如，如果药物数据库中的LAFA识别到药物和/或化合物和/或抗体和/或肽对CXCR1功能的抑制作用(如示例15中所详述的)，则该药物可能被预测为对于CXCR1活化增强的一个或多个受试者具有疗法益处。
示例例29：评估MS和IBD患者中白细胞表达PSGL-1的粘附功能。
本示例涉及使用白细胞粘附功能测定示例性实施例来评估患有多发性硬化症(MS)和炎症性肠病(IBD)的患者中白细胞P-选择素糖蛋白配体1(PSGL-1、P和E选择素的配体)的粘附功能，如示例16中所详述的。
如图25A所示，与健康对照相比，在MS患者中检测到CD4、CD8和CD15白细胞的数量增加，表明这些MS白细胞中PSGL-1功能升高。另一方面，与健康对照相比，在MS和IBD白细胞中未观察到细胞速度、直线度或停留时间的改变(图25B至图25D)。
这些结果表明LAFA示例性实施例能够在患有MS但没有IBD的患者中检测到PSGL-1粘附功能增强。类似的策略可以用于检测其他疾病中其他粘附分子的粘附功能更改。
示例30：图像和数据分析
本示例涉及根据某些示例性实施例使用斐济图像分析软件和R studio来处理和分析在白细胞粘附功能测定(LAFA)期间生成的图像的应用，从而可以确定一定范围的细胞动力学参数和/或用于表征细胞迁移行为。另外，在下文的示例中，其他图像软件可以用于分析图像和/或生成结果。
例如，如图27所示，图像和数据分析过程可以包括以下步骤：
1.在斐济图像分析软件中打开用显微镜捕获的原始TIF图像，并且重新组织为延时序列。
2.应用正确的缩放信息。通过裁剪从图像中除去流动通道边缘。应用图像修正算法以除去不均匀的背景荧光。
3.将图像序列拆分为单独通道以供分析。
4.使用来自斐济软件的TrackMate插件跟踪每个通道的具有设置好的细胞大小和强度阈值的各个细胞。
5.R统计软件包对TrackMate的输出进行进一步分析，以将数据转换为一定范围的细胞动力学参数所需的测量单位，包括但不限于细胞数、速度、直线度、停留时间、扩散系数。
6.以及生成描述性统计图(例如，动力学参数的盒须图、速度分布直方图、直线度分布直方图、持续时间直方图、停留时间分布直方图、运动性曲线、共同原点图、外观图)。
通过描述所要求保护的主题的某些实施例的以下示例，所要求保护的主题的进一步优点将变得显而易见。
示例1A.一种评估受试者对适于控制疾病进展的药物治疗做出的应答或潜在应答的方法，其中该药物能够更改白细胞募集、粘附和/或迁移，该方法包括以下步骤：
从受试者获得血液样品；
对血液样品进行至少一次白细胞功能测定(LAFA)，其中LAFA评估白细胞募集、粘附和/或迁移至以下各项中的至少一项或多项：至少一种内皮分子和至少一种细胞；以及
至少部分地基于至少一次LAFA的一个或多个结果，评估受试者对用于控制疾病进展的药物治疗做出的应答或潜在应答。
2A.一种评估受试者对适于控制疾病进展的药物治疗做出的应答或潜在应答的方法，其中该药物能够更改白细胞募集、粘附和/或迁移，该方法包括以下步骤：
从受试者获得血液样品；
对血液样品进行至少一次白细胞功能测定(LAFA)，其中至少一次LAFA在实际生理条件下定量和/或半定量地评估白细胞募集、粘附和/或迁移至以下各项中的至少一项或多项：至少一种内皮分子和表达内皮分子的至少一种细胞；以及
至少部分地基于至少一次LAFA的一个或多个结果，评估受试者对用于控制疾病进展的药物治疗做出的应答或潜在应答。
3A.示例1A的方法，其中对以下一种或多种底物进行至少一次LAFA：VCAM-1、MAdCAM-1、P-选择素、E-选择素、IL-8、SDF1α和表达内皮分子的一种或多种细胞。
4A.示例1A的方法，其中对以下两种或更多种底物进行至少一次LAFA：VCAM-1、MAdCAM-1、P-选择素、E-选择素、IL-8、SDF1α和表达内皮分子的一种或多种细胞。
5A.示例1A的方法，其中对以下三种或更多种底物进行至少一次LAFA：VCAM-1、MAdCAM-1、P-选择素、E-选择素、IL-8、SDF1α和表达内皮分子的一种或多种细胞。
6A.示例1A-4A中的一个或多个示例的方法，其中该至少一次LAFA测量以下参数中的一项或多项：所检测到的滚动白细胞的定量，所检测到的粘附白细胞的定量，所检测到的爬行白细胞的定量，所检测到的个体白细胞的平均速度，所检测到的个体白细胞的平均直线度，所检测到的个体白细胞的平均位移以及所检测到的个体白细胞的平均停留时间。
7A.示例1A-4A中的一个或多个示例的方法，其中该至少一次LAFA测量以下参数中的两项或更多项：所检测到的滚动白细胞的定量，所检测到的粘附白细胞的定量，所检测到的爬行白细胞的定量，所检测到的个体白细胞的平均速度，所检测到的个体白细胞的平均直线度，所检测到的个体白细胞的平均位移以及所检测到的个体白细胞的平均停留时间。
8A.示例1A-4A中的一个或多个示例的方法，其中该至少一次LAFA测量以下参数中的四项或更多项：所检测到的滚动白细胞的定量，所检测到的粘附白细胞的定量，所检测到的爬行白细胞的定量，所检测到的个体白细胞的平均速度，所检测到的个体白细胞的平均直线度，所检测到的个体白细胞的平均位移以及所检测到的个体白细胞的平均停留时间。
9A.示例1A-4A中的一个或多个示例的方法，其中该至少一次LAFA测量以下参数中的六项或更多项：所检测到的滚动白细胞的定量，所检测到的粘附白细胞的定量，所检测到的爬行白细胞的定量，所检测到的个体白细胞的平均速度，所检测到的个体白细胞的平均直线度，所检测到的个体白细胞的平均位移以及所检测到的个体白细胞的平均停留时间。
10A.示例1A-9A中的一个或多个示例的方法，其中使用Mn2+对来自受试者的血液样品进行处理，并且对Mn2+处理的血液样品进行至少一次LAFA，并且至少一次LAFA的一个或多个结果用于生成一个或多个参数，这些参数用于生成一个或多个指数。
11A.示例1A-10A中的一个或多个示例的方法，其中用Mn2+处理至少一种健康血液样品，并且对至少一种健康的Mn2+血液处理的样品进行至少一次LAFA，并且至少一次LAFA的一个或多个结果用于生成一个或多个参数，这些参数用于生成一个或多个指数。
12A.一个或多个示例1A-11A的方法，其中来自受试者的血液样品的至少一次LAFA的一个或多个结果用作对照，其用于生成一个或多个参数，这些参数用于生成一个或多个指数。
13A.一个或多个示例1A-12A的方法，其中来自至少一个健康血液样品的至少一次LAFA的一个或多个结果用作对照，其用于生成一个或多个参数，这些参数用于生成一个或多个指数。
14A.一个或多个示例1A-13A的方法，其中生成以下一个或多个指数中的一个或多个：受试者的相对直线度指数(RSTI)、相对速度指数(RSI)、以及相对停留时间指数(RDTI)。
15A.一个或多个示例1A-14A的方法，其中将基于来自受试者血液的至少一次LAFA的一个或多个结果除以受试者的Mn2+处理的血液样品的至少一次LAFA的一个或多个结果，生成受试者血液的活化电位比。
16A.示例1A和15A中的一个或多个示例的方法，其中该疾病至少部分涉及以下各项中的一项或多项：异常白细胞募集、粘附和/或迁移；炎症的进展；自身免疫状态的进展；免疫缺陷状态的进展；以及感染状态的进展。
17A.示例1A和16A中的一个或多个示例的方法，其中该疾病至少部分涉及多发性硬化(MS)。
18A.示例1A和17A中的一个或多个示例的方法，其中该疾病至少部分涉及炎性肠病(IBD)。
19A.示例1A-18A中的一个或多个示例的方法，其中该至少一次LAFA的一个或多个结果用于对受试者进行分层并且评估受试者对用于控制疾病进展的药物治疗做出的应答或潜在应答。
20A.示例1A-19A中的一个或多个示例的方法，其中该至少一次LAFA的一个或多个结果用于对受试者进行分层并且预测受试者对用于控制疾病进展的药物治疗做出的应答或潜在应答。
21A.示例1A-20A的方法，其中在静态或非静态条件下进行至少一次LAFA。
22A.一种用于基于一个或多个示例1A-21A的方法来执行至少一次LAFA的系统。
23A.一种用于基于一个或多个示例1A-21A的方法来执行至少一次LAFA的设备。
示例1B.一种评估一种或多种白细胞分子的粘附功能的方法，该方法包括以下步骤：
从受试者获得血液样品；
对血液样品进行至少一次白细胞功能测定(LAFA)，其中至少一次LAFA在实际生理条件下定量和/或半定量地评估白细胞募集、粘附和/或迁移至以下各项中的至少一项或多项：至少一种内皮分子和表达内皮分子的至少一种细胞；以及
至少部分地基于至少一次LAFA的一个或多个结果，评估一种或多种白细胞分子的活化水平。
2B.示例1B的方法，其中对以下一种或多种底物进行至少一次LAFA：VCAM-1、MAdCAM-1、P-选择素、E-选择素、IL-8、SDF1α和表达内皮分子的一种或多种细胞。
3B.示例1B的方法，其中对以下两种或更多种底物进行至少一次LAFA：VCAM-1、MAdCAM-1、P-选择素、E-选择素、IL-8、SDF1α和表达内皮分子的一种或多种细胞。
4B.示例1B的方法，其中对以下三种或更多种底物至少一次LAFA进行：VCAM-1、MAdCAM-1、P-选择素、E-选择素、IL-8、SDF1α和表达内皮分子的一种或多种细胞。
5B.示例1B-4B中的一个或多个示例的方法，其中该至少一次LAFA测量以下参数的一项或多项：所检测到的滚动白细胞的定量，所检测到的粘附白细胞的定量，所检测到的爬行白细胞的定量，所检测到的个体白细胞的平均速度，所检测到的个体白细胞的平均直线度，所检测到的个体白细胞的平均位移以及所检测到的个体白细胞的平均停留时间。
6B.示例1B-4B中的一个或多个示例的方法，其中该至少一次LAFA测量以下参数中的两项或更多项：所检测到的滚动白细胞的定量，所检测到的粘附白细胞的定量，所检测到的爬行白细胞的定量，所检测到的个体白细胞的平均速度，所检测到的个体白细胞的平均直线度，所检测到的个体白细胞的平均位移以及所检测到的个体白细胞的平均停留时间。
7B.示例1B-4B中的一个或多个示例的方法，其中该至少一次LAFA测量以下参数中的四项或更多项：所检测到的滚动白细胞的定量，所检测到的粘附白细胞的定量，所检测到的爬行白细胞的定量，所检测到的个体白细胞的平均速度，所检测到的个体白细胞的平均直线度，所检测到的个体白细胞的平均位移以及所检测到的个体白细胞的平均停留时间。
8B.示例1B-4B中的一个或多个示例的方法，其中该至少一次LAFA测量以下参数中的六项或更多项：所检测到的滚动白细胞的定量，所检测到的粘附白细胞的定量，所检测到的爬行白细胞的定量，所检测到的个体白细胞的平均速度，所检测到的个体白细胞的平均直线度，所检测到的个体白细胞的平均位移以及所检测到的个体白细胞的平均停留时间。
9B.示例1B-9B中的一个或多个示例的方法，其中使用Mn2+对来自受试者的血液样品进行处理，并且对Mn2+处理的血液样品进行至少一次LAFA，并且至少一次LAFA的一个或多个结果用于生成一个或多个参数，这些参数用于生成一个或多个指数。
10B.示例1B-10B中的一个或多个示例的方法，其中用Mn2+处理至少一种健康血液样品，并且对至少一种健康的Mn2+处理的血液样品进行至少一次LAFA，并且至少一次LAFA的一个或多个结果用于生成一个或多个参数，这些参数用于生成一个或多个指数。
11B.一个或多个示例1B-11B的方法，其中来自受试者的血液样品的至少一次LAFA的一个或多个结果用作对照，其用于生成一个或多个参数，这些参数用于生成一个或多个指数。
12B.一个或多个示例1B-12B的方法，其中来自至少一个健康血液样品的至少一次LAFA的一个或多个结果用作对照，其用于生成一个或多个参数，这些参数用于生成一个或多个指数。
13B.一个或多个示例1B-13B的方法，其中生成以下一个或多个指数中的一个或多个：受试者的相对直线度指数(RSTI)、相对速度指数(RSI)、以及相对停留时间指数(RDTI)。
14B.一个或多个示例1B-14B的方法，其中将基于来自受试者血液的至少一次LAFA的一个或多个结果除以受试者的Mn2+处理的血液样品的至少一次LAFA的一个或多个结果，生成受试者血液的活化电位比。
15B.示例1B和15B中的一个或多个示例的方法，其中一种或多种白细胞分子的活化水平用于评估(相对于受试者的疾病)来自受试者的血液样品中的一种或多种白细胞分子的粘附功能，该受试者的疾病至少部分涉及以下各项中的一项或多项：异常白细胞募集、粘附和/或迁移；炎症进展；自身免疫状态的进展；免疫缺陷状态的进展；以及感染状态的进展。
16B.示例1B和16B中的一个或多个示例的方法，其中该疾病至少部分涉及多发性硬化(MS)。
17B.示例1B和17B中的一个或多个示例的方法，其中该疾病至少部分涉及炎性肠病(IBD)。
18B.示例1B-18B中的一个或多个示例的方法，其中该至少一次LAFA的一个或多个结果用于对受试者进行分层并且评估受试者对用于控制疾病进展的药物治疗做出的应答或潜在应答。
19B.示例1B-19B中的一个或多个示例的方法，其中该至少一次LAFA的一个或多个结果用于对受试者进行分层并且预测受试者对用于控制疾病进展的药物治疗做出的应答或潜在应答。
20B.一个或多个示例1B-20B的方法，其中在静态或非静态条件下进行至少一次LAFA。
21B.一种或多种示例1B-20B的方法，其中至少一次LAFA的一个或多个结果用于评估正在使用药物治疗的受试者的药物功效。
22B.一种或多种示例1B-20B的方法，其中该至少一次LAFA的一个或多个结果用于评估正在使用药物治疗的受试者的药物敏感度。
23B.示例1B-20B中的一个或多个示例的方法，其中该方法用于评估受试者的药物敏感度，该方法还包括以下步骤：
(1)在预定时间段内对受试者施用已知量的药物；
(2)在步骤(1)之后，对来自受试者的另一血样进行至少一次LAFA；以及
(3)基于至少一次LAFA的一个或多个结果，重复步骤(1)和(2)，以便评估受试者的药物敏感度。
24B.示例1B-20B中的一个或多个示例的方法，其中该方法用于评估受试者的药物敏感度，该方法还包括以下步骤：
(1)在体外向来自受试者的血液样品中的一个或多个部分中加入一定已知数量或更大已知数量的药物；
(2)在步骤(1)之后，对血液样品的一个或多个部分进行至少一次LAFA；以及
(3)基于至少一次LAFA的一个或多个结果，确定受试者的药物敏感度。
25B.示例1B-20B中的一个或多个示例的方法，其中该方法用于监测受试者的药物功效，该方法还包括以下步骤：
(1)在预定时间段内对受试者施用已知量的药物；
(2)在步骤(1)之后，对来自受试者的另一血样进行至少一次LAFA；以及
(3)基于至少一次LAFA的一个或多个结果，重复步骤(1)和(2)以监测受试者的药物功效。
26B.示例1B-20B中的一个或多个示例的方法，其中该方法用于监测受试者的药物功效，该方法还包括以下步骤：
(1)在体外向来自受试者的血液样品中的一个或多个部分加入一定已知数量或更大已知数量的药物；
(2)在步骤(1)之后，对血液样品的一个或多个部分进行至少一次LAFA；以及
(3)基于至少一次LAFA的一个或多个结果，确定受试者的药物功效。
27B.示例1B-20B中的一个或多个示例的方法，其中该方法用于确定受试者的最小有效药物剂量，该方法还包括以下步骤：
(1)在预定时间段内对受试者施用已知量的药物；
(2)在步骤(1)之后，对来自受试者的另一血样进行至少一次LAFA；以及
(3)基于至少一次LAFA的一个或多个结果，重复步骤(1)和(2)以确定受试者的最小有效药物剂量。
28B.示例1B-20B中的一个或多个的方法，其中该方法用于确定受试者的最小有效药物剂量，该方法还包括以下步骤：
(1)在体外向来自受试者的血液样品加入已知量的药物；
(2)在步骤(1)之后，对具有已知量药物的血液样品进行至少一次LAFA；以及
(3)基于至少一次LAFA的一个或多个结果，重复步骤(1)和(2)，直至确定用于治疗受试者的最小有效药物剂量为止。
29B.示例1B-27B中的一个或多个示例的方法，其中该方法减少了被治疗的受试者的副作用。
30B.示例1B-28B中的一个或多个示例的方法，其中该方法用于确定药物对来自受试者的血液样品中的一种或多种白细胞分子的粘附功能的影响。
31B.示例1B-29B中的一个或多个示例的方法，其中该方法用于识别受试者的疾病标志物。
32B.示例1B-29B中的一个或多个示例的方法，其中该方法用于在一时间段内监测受试者的健康，该方法还包括以下步骤：
(1)从受试者获得一个或多个其他血液样品并对一个或多个其他血液样品进行至少一次LAFA；以及
(2)在一时间段内重复步骤(1)以监测受试者的健康；
其中一个或多个血液样品之间的时间段是以下各项中的至少一项或多项：1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、或2年。
一种用于基于一个或多个示例1B-32B的方法来执行至少一次LAFA的系统。
一种用于基于一个或多个示例1B-32B的方法来执行至少一次LAFA的设备。
示例1C.一种方法：(a)预测受试者如何可能对用于控制疾病进展的药物做出应答，(b)确定药物是否可以用于控制或预防受试者的疾病进展，(c)选择用于预防或控制受试者的疾病进展的药物，或(d)识别用于预防或控制受试者的疾病进展的药物，其中该药物能够更改白细胞与内皮分子的粘附，所述方法包括以下步骤：
对从受试者获得的至少一种血液样品在体外进行至少一次白细胞粘附功能测定；以及
基于测定结果，(a)预测至少一个受试者如何可能对用于控制疾病进展的药物做出应答，(b)确定药物是否可以用于控制或预防受试者的疾病进展，(c)选择用于预防或控制受试者的疾病进展的药物，或(d)识别用于预防或控制受试者的疾病进展的药物。
2C.示例1C的方法，其中该方法用于个性化药品。
3C.示例1C的方法，其中该方法用于区分药物应答者和药物无应答者。
4C.示例1C的方法，其中该方法用于测试许多受试者，用于受试者分层(患者分组)。
5C.示例1C的方法，包括以下步骤：根据测定结果，对受试者进行用于控制疾病进展的药物试验。
6C.示例1C的方法，包括以下步骤：根据测定结果，使用用于控制疾病进展的药物治疗受试者。
7C.示例1C的方法，包括以下步骤：根据测定结果，确定用于控制疾病进展的给受试者的药物的有效最小治疗剂量，同时使由药物引起的不希望的副作用最小化。
8C.示例7C的方法，其中药物剂量允许在体内恢复白细胞与内皮细胞的最小的相互作用，从而最小化或预防诸如进行性多灶性白质脑病(PML)之类的病理。
9C.示例1C的方法，包括以下步骤：根据测定结果，优化用于控制疾病进展的给受试者的药物的给药方案，例如，通过更改药物剂量或改变连续药物施用之间的时间长度。
10C.示例1C的方法，其中该方法用于预测或确定药物(即，化合物、化学品、分子、试剂、生物制剂、抗体或其他)是否可以用于控制先前没有指示的药物的疾病的进展。
11C.示例1C的方法，其中该方法的测定可以包括以下步骤：识别粘附畸形或异常或药物靶标，然后基于药物靶标来选择用于控制疾病进展的适当药物。
12C.示例1C的方法，其中该方法的测定可以包括以下步骤：识别粘附畸形或异常或药物靶标，然后基于药物靶标和那些标靶的药物的参考数据库来选择用于控制疾病进展的适当药物。
13C.示例12C的方法，其中该方法包括以下步骤：构建药物靶标和药物的数据库。
14C.示例13C的方法，其中基于已知的药物靶标和药物来构建数据库。
15C.示例13C的方法，其中基于体内药物治疗来构建数据库。
16C.示例1C的方法，其中该方法的测定包括以下步骤：一次测定多种粘附畸形或异常或药物靶标，优选地，2，3，4，5，6，7，8，9或10个药物靶标或更多个。
17C.示例1C的方法，其中该方法是高吞吐量测定，一次测试多个粘附畸形或异常或药物靶标。
18C.示例1C的方法，其中该方法用于生成受试者的白细胞粘附指纹。
19C.示例1C的方法，其中该方法用于识别受试者中的不同白细胞畸形或异常。
20C.示例1C的方法，其中该方法用于识别疾病标志物。
21C.示例1C的方法，其中该方法用于对个体/受试者进行分组，而不管疾病如何。
22C.示例1C的方法，进一步包括以下步骤：为受试者开展治疗，而不管疾病诊断如何。
23C.示例1C的方法，其中该方法用于体内或体外的高吞吐量药物筛选。
24C.示例1C的方法，其中该方法用于实验室动物的工业规模药物筛选。
25C.一种确定施用用于控制疾病进展的药物的受试者如何对该药物做出应答的方法，其中该药物能够更改白细胞与内皮分子的粘附，所述方法包括以下步骤：
对从受试者获得的含有药物的至少一种血液样品在体外进行至少一次白细胞粘附功能测定；以及
基于测定结果，确定受试者如何对药物做出应答。
26C.示例25C的方法，其中该方法用于个性化药品。
27C.示例25C的方法，其中该方法用于区分药物应答者和药物无应答者。
28C.示例25C的方法，其中该方法用于测试许多受试者，用于受试者分层(患者分组)。
29C.示例25C的方法，其中该方法用于高吞吐量药物。
体内或体外筛选。
30C.示例25C的方法，其中该方法用于实验室动物的工业规模药物筛选。
31C.示例25C的方法，其中该方法包括以下步骤：根据测定结果，确定用于控制疾病进展的给受试者的药物的有效最小治疗剂量，同时使由药物引起的不希望的副作用最小化。
32C.示例31C的方法，其中药物剂量允许在体内恢复白细胞与内皮细胞的最小的相互作用，从而最小化或预防诸如进行性多灶性白质脑病(PML)之类的病理。
33C.示例25C的方法，包括以下步骤：根据测定结果，优化用于控制疾病进展的给受试者的药物给药方案，例如，通过更改药物剂量或改变连续药物施用之间的时间长度。
34C.一种优化摄取用于控制疾病进展的药物的受试者的给药方案的方法，其中该药物能够更改白细胞与内皮分子的粘附，所述方法包括以下步骤：对从受试者获得的含有该药物的至少一种血液样品在体外进行至少一次白细胞粘附功能测定；并且基于测定结果，优化给受试者的药物给药方案以控制疾病进展。
35C.示例34C的方法，包括以下步骤：根据测定结果，确定用于控制疾病进展的给受试者的药物的有效最小治疗剂量，同时使由药物引起的不希望的副作用最小化。
36C.示例34C的方法，其中药物剂量允许在体内恢复白细胞与内皮细胞的最小的相互作用，从而最小化或预防诸如进行性多灶性白质脑病(PML)之类的病理。
37C.示例34C的方法，包括以下步骤：根据测定结果，优化用于控制疾病进展的给受试者的药物给药方案，例如，通过更改药物剂量或改变连续药物施用之间的时间长度。
38C.示例34C的方法，其中每次进行测定时，相应地优化给药方案或最小有效药物剂量。
39C.示例34C的方法，其中该方法提供药物有效性的准确评估，而不管血清药物浓度如何。
40C.一种确定用于控制疾病进展的给受试者的最小有效药物剂量的方法，其中该药物能够更改白细胞与内皮分子的粘附，所述方法包括以下步骤：
(1)在预定时间段内对受试者施用已知量的药物；
(2)在步骤(1)之后，对从受试者获得的含有药物的血液样品在体外进行白细胞粘附功能测定；以及
(3)基于测定结果，重复步骤(1)和(2)，直到可以确定用于控制疾病进展的给受试者的最小有效药物剂量为止。
41C.示例40C的方法，包括：使由药物引起的不希望的副作用最小化。
42C.示例40C的方法，包括以下步骤：根据测定结果，优化用于控制疾病进展的给受试者的药物给药方案。
43C.示例40C的方法，其中使用IC50或IC99测试受试者的药物敏感度以获得最小有效药物剂量。
44C.示例40C的方法，其中最小有效药物剂量允许在体内恢复白细胞与内皮细胞的最小的相互作用，从而最小化或预防诸如进行性多灶性白质脑病(PML)之类的病理。
45C.示例1C的方法，其中该方法需要执行白细胞粘附功能测定以识别白细胞粘附异常，基于白细胞粘附异常的性质来选择合适的药物，以及确定药物对白细胞粘附异常的影响。
46C.示例45C的方法，包括以下步骤：1.对从受试者获得的血液样品进行白细胞粘附功能测定，以识别白细胞异常；2.选择可能用于此类异常的合适候选药物(或多于一种候选药物)；3.在体外以各种剂量用该合适候选药物处理血液样品；4.执行进一步的白细胞粘附功能测定，以测试候选药物对白细胞异常的影响；5.为受试者选择最佳或最有效的药物；6.对受试者施用药物；7.在给药后的不同时间点从受试者中采集血液；以及8.执行白细胞粘附功能测定以确认受试者的药物效果。
47C.示例45C的方法，其中确定药物在人受试者的效果需要进行以下步骤：1.从受试者收集血液；2.执行第一次白细胞粘附功能测定以获得基线；3.对受试者施用药物；以及4.在药物给药后的不同时间点进行白细胞粘附功能测定以确定药物效果。
48C.示例45C的方法，其中确定药物在动物模型/实验动物受试者(小鼠、灵长类动物等)中的效果需要进行以下步骤：1.从受试者收集血液；2.执行第一次白细胞粘附功能测定以获得基线；3.以不同剂量对受试者施用药物(每个剂量将是独立测定)；以及4.在给药后的不同时间点执行白细胞粘附功能测定以确定药物效果。
49C.示例45C的方法，其中使用以下步骤在体外执行药物效果的确定：1.从受试者收集血液；2.使用不同剂量的药物处理血液；3.在药物处理开始后的不同时间点执行白细胞粘附功能测定，以确定药物效果以及达到这种效果所需的时间。
50C.前述示例中任一示例的方法，其中药物直接干扰白细胞与内皮分子的结合。
51C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中药物间接干扰白细胞与内皮分子的结合。
52C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中该药物可以靶向、结合、缔合或以其他方式干扰白细胞粘附分子或白细胞的其他结合分子。
53C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中药物可以靶向、结合、缔合或以其他方式干扰内皮分子。
54C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中药物可以靶向、结合、缔合或以其他方式干扰白细胞粘附分子或其他结合分子和内皮分子。
55C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中药物可以通过对白细胞粘附途径的另一部分或分子施加其作用而间接影响白细胞和内皮分子之间的粘附/相互作用。
56C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中药物可以：调节基因的表达，该表达影响白细胞粘附(例如，药物可以作用于细胞内信号传导途径以调节基因的表达，该表达影响白细胞粘附)；影响基因产物(RNA或蛋白质)的翻译后修饰，该翻译后修饰影响白细胞粘附；调节基因产物的运输或易位，该运输或易位影响白细胞粘附；和/或调节基因产物从细胞内存储的释放，该释放影响白细胞粘附。
57C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中白细胞是嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、CD4T淋巴细胞、CD8T淋巴细胞、T调节细胞、B淋巴细胞、树突细胞、单核细胞或自然杀伤细胞。
58C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中白细胞粘附分子或白细胞的其他结合分子是选择素、整合素、趋化因子或趋化因子受体。
59C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中内皮分子是选择素、细胞粘附分子(CAM)、趋化因子或趋化因子受体。
60C.示例1C-49中任一示例的方法，其中该白细胞粘附分子是PSGL-1、L-选择素、α1整合素、α2整合素、α3整合素、α4整合素、α5整合素、α6整合素、α7整合素、α8整合素、α9整合素、α10整合素、α11整合素、αD整合素、αE整合素、αV整合素、αX整合素、CD11a(αL整合素)、CD11b(αM整合素)、β1整合素、β2整合素、β4整合素、β5整合素、β6整合素、β7整合素、β8整合素、CD44、ESL-1、CD43、CD66、CD15或ALCAM。
61C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中内皮分子是E-选择素、P-选择素、VCAM-1、ICAM-1、ICAM-2、MadCAM-1、PECAM、GlyCAM-1、JAM-A、JAM-B、JAM-C、JAM-4、JAM-L、CD34、CD99、VAP-1、L-VAP-2、ESAM、E-LAM、钙粘蛋白或透明质酸。
62C.示例59C的方法，其中该趋化因子和趋化因子受体选自由以下各项组成的组：趋化因子CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL26、CX3CL1、XCL1和XCL2；趋化因子受体CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR11、CX3CR1和XCR1。
63C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中药物可以调节细胞因子或趋化因子的活性。
64C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中该药物可以更改粘附分子或趋化因子的翻译后修饰，更改粘附分子的蛋白质膜转位，调节粘附分子从细胞内存储的释放，作用于细胞内信号传导途径以调节粘附分子或趋化因子基因的表达，或调节粘附分子的动员。
65C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中药物减弱白细胞α4整合素活化。
66C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中药物干扰白细胞α4整合素与其内皮分子之间的相互作用。
67C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中药物干扰白细胞表达的PSGL-1(P-选择素糖蛋白配体-1)与其内皮分子(即，P-选择素和/或E-选择素)之间的相互作用。
68C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中药物干扰白细胞2整合素与其内皮分子之间的相互作用。
69C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中该药物干扰细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和/或血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)与其/白细胞粘附分子之间的相互作用。
70C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中药物是干扰α4β7整合素和MAdCAM-1之间的结合的抗体。
71C.示例70C的方法，其中药物是那他珠单抗。
72C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中药物是干扰α4β7整合素和MAdCAM-1的抗体。
73C.示例72C的方法，其中药物是维多珠单抗。
74C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中药物是干扰CD11a(αL)和ICAM-1的抗体。
75.示例74C的方法，其中药物是依法利珠单抗(Efalizumab)或奥度莫单抗(Odulimomab)。
76C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中药物是干扰CD11b(αM)和ICAM-1之间的结合的抗体。
77C.示例76的方法，其中药物是UK279,276。
78C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中药物是干扰β2整合素与其内皮分子之间的结合的抗体。
79C.示例78C的方法，其中药物是厄利珠单抗(Erlizumab)或罗维珠单抗(Roverlizumab)。
80C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中药物是干扰β整合素与其内皮分子之间的结合的抗体。
81C.示例80C的方法，其中药物是依曲利珠单抗(Etrolizumab)。
82C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中药物是类固醇，诸如糖皮质激素(皮质类固醇)。
83.示例82C的方法，其中该药物是类固醇，诸如布地奈德、可的松、地塞米松、甲基强的松龙、泼尼松龙或强的松。
84C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中药物是非甾体抗炎药(NSAID)。
85C.示例84C的方法，其中药物是塞来昔布、艾托考昔、布洛芬、酮洛芬、萘普生和舒林酸。
86C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中药物是免疫选择性抗炎衍生物(ImSAID)。
87C.示例86C的方法，其中药物是亚下颌腺肽-T(SGP-T)或苯丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸(FEG)。
88C.示例1C-49C中任一示例的方法，其中药物是来自植物的生物活性化合物。
89C.示例88C的方法，其中药物是白花丹素(来自白花丹)或鸡蛋花素(来自鸡蛋花)。
90C.示例1C-89C中任一示例的方法，其中该药物用于控制涉及异常白细胞募集的疾病。
91C.示例1C-89C中任一示例的方法，其中该药物用于控制涉及炎症的疾病。
92C.示例1C-89C中任一示例的方法，其中该药物用于控制自身免疫疾病的进展。
93C.示例1C-89C中任一项的方法，其中该药物用于控制免疫缺陷疾病的进展。
94C.示例1C-89C中任一示例的方法，其中该药物用于控制感染病的进展。
95C.示例1C-89C中任一项的方法，其中该药物用于控制多发性硬化、克罗恩病、哮喘、牛皮癣或类风湿性关节炎的进展。
96C.示例1C-89C中任一示例的方法，其中该药物用于控制由器官移植、中风、心肌梗塞或创伤性休克引起的疾病的进展。
97C.前述示例中任一示例的方法，其中血液样品是全血。
98C.前述示例中任一示例的方法，其中白细胞粘附功能测定结果是半定量和/或定量的。
99C.前述示例中任一示例的方法，其中白细胞粘附功能测定实现以下各项中的一项或多项：表征白细胞细胞募集；表征白细胞细胞追踪；以定量方式表征白细胞迁移行为。
100C.前述示例中任一示例的方法，其中白细胞粘附功能测定需要定量测定白细胞迁移。
101C.示例100C的方法，其中白细胞迁移包括检测、测量或观察白细胞细胞粘连、滚动、缓慢滚动、牢固粘附、爬行和/或经内皮迁移。
102C.前述示例中任一示例的方法，其中白细胞粘附功能测定需要检测、测量或观察白细胞平均速度、位移、加速度、减速度、方向性、停留时间和/或直线度。
103C.前述示例中任一示例的方法，其中白细胞粘附功能测定需要在现实生理条件下检测、测量或观察白细胞迁移。
104C.前述示例中任一示例的方法，其中该测定允许同时检测到不同的白细胞亚组。
105C.前述示例中任一示例的方法，其中白细胞粘附功能测定包括流动测定。
106C.前述示例中任一示例的方法，其中白细胞粘附功能测定允许视觉分析以表征白细胞迁移行为，表征白细胞细胞追踪或通过内皮粘附分子表征白细胞募集。
107C.前述示例中任一示例的方法，其中内皮分子的形式为与支持物或底物结合的重组蛋白。
108C.前述示例中任一示例的方法，其中在白细胞粘附功能测定中可以用作粘附底物(即，与支持物或底物结合)的内皮分子选自由以下各项组成的组：1.粘附分子；2.趋化因子；3.纯化抗原和人工抗原呈递细胞系统；4.可以调节细胞-细胞相互作用的其他分子；以及5.趋化因子受体。
109C.前述示例中任一示例的方法(只要它们是相关的)，其中白细胞粘附功能测定需要检测、测量或观察白细胞表达的PSGL-1(P-选择素糖蛋白配体-1)及其内皮分子(P-选择素和/或E-选择素)之间的相互作用。
110C.前述示例中任一示例的方法(只要它们是相关的)，其中LAFA需要定量评估α整合素粘附功能。
111C.前述示例中任一示例的方法(只要它们是相关的)，其中LAFA需要检测、测量或观察增加的白细胞α整合素表达和活性。
112C.前述示例中任一示例的方法(只要它们是相关的)，其中白细胞粘附功能测定需要测量、检测或观察白细胞α4整合素和内皮VCAM-1之间的相互作用。
113C.前述示例中任一示例的方法(只要它们是相关的)，其中白细胞粘附功能测定需要检测、测量或观察CD11a(αL整合素)和ICAM-1之间的相互作用。
114C.前述示例中任一项的方法(只要它们是相关的)，其中白细胞粘附功能测定需要检测、测量或观察CD11b(αM整合素)和ICAM-1之间的相互作用。
115C.前述示例中任一示例的方法(只要它们是相关的)，其中白细胞粘附功能测定需要检测、测量或观察α4β7整合素和MAdCAM-1之间的相互作用。
116C.前述示例中任一示例的方法(只要它们是相关的)，其中白细胞粘附功能测定需要检测、测量或观察细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和/或血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)与其白细胞粘附分子之间的相互作用。
117C.前述示例中任一示例的方法(只要它们是相关的)，其中白细胞粘附功能测定需要检测、测量或观察白细胞β7整合素与其内皮分子之间的相互作用。
118C.前述示例中任一示例的方法(只要它们是相关的)，其中白细胞粘附功能测定需要测量白细胞的一种或多种特异性亚组，诸如CD4、CD8和CD15细胞。
119C.前述示例中任一示例的方法(只要它们是相关的)，
其中白细胞粘附功能测定需要检测、测量或观察细胞因子或趋化因子(例如，THFα和IL-4)活化的原代内皮细胞(例如，HUVEC)或固定的内皮细胞系(例如，人微循环内皮细胞(HMEC))上的白细胞迁移行为。
120C.前述示例中任一示例的方法(只要它们是相关的)，其中白细胞粘附功能测定需要检测、测量或观察药物那他珠单抗对白细胞与TNFα活化的HUVEC相互作用的影响。
121C.前述示例中任一示例的方法(只要它们是相关的)，其中白细胞粘附功能测定需要检测、测量或观察那他珠单抗特异性结合到白细胞上的α4整合素。
122C.前述示例中任一示例的方法(只要它们是相关的)，其中白细胞粘附功能测定需要测量、检测或观察那他珠单抗对α4整合素功能的抑制作用。
123C.前述示例中任一示例的方法(只要它们是相关的)，其中白细胞粘附功能测定需要通过使用特异性膜标志物标记不同的白细胞亚组来同时检测、测量或观察不同的白细胞亚组。
124C.前述示例中任一示例的方法(只要它们是相关的)，其中该方法作为血液测试进行，在那他珠单抗输注后的不同时间点执行，测定结果用于确定那他珠单抗再给药的需要，并且在个体受试者中进行血液测试以确保药物有效性，从而便于开展个体受试者的最佳/个性化治疗方案。
125C.前述示例中任一示例的方法(只要它们是相关的)，其中该方法便于恢复免疫应答而不包括药物功效，从而允许每个给药循环的免疫应答足以有效地消除PML的风险。
126C.示例1C的方法，其中当白细胞粘附功能测定用于检测药物靶标的活化时，预测药物控制疾病进展的能力。
127C.示例1C的方法，其中该方法/测定用于预测该药物是否可以用于控制已知不能使用该药物治疗的其他疾病的进展。
128C.一种为受试者生成白细胞粘附谱的方法，所述方法包括以下步骤：
对从受试者获得的至少一种血液样品在体外进行至少一次白细胞粘附功能测定，以几乎同时定量评估不同白细胞亚组对一种或多种不同内皮分子的粘附功能；以及
使用测定结果：识别白细胞异常；确定个性化发病机制；识别疾病的新疾病标志物；识别疾病的早期症状；疾病预测；疾病预防；协助早期准确诊断；为受试者开发有效和个性化的治疗；监测受试者的健康(健康状况)；不论疾病如何，对受试者进行分组；无论疾病诊断如何，为受试者开展治疗。
129C.示例128C的方法，当对从单个受试者获得的血液样品进行时。
130C.示例128C的方法，当对从多个不同受试者获得的血液样品进行时。
131C.示例128C至130C中任一示例的方法，其中每个受试者是健康受试者。
132C.示例128C或示例130C的方法，其中每个受试者患有疾病。
133C.示例128C至132C中任一示例的方法，其中对加工的血液样品进行测定。
134C.示例128C至133C中任一示例的方法，其中白细胞粘附功能测定是用于通过一种或多种内皮粘附分子定量白细胞迁移行为、白细胞细胞追踪或白细胞募集的流动(细胞)测定。
135C.示例128C至134C中任一示例的方法，其中一种或多种内皮分子的形式为与支持物或底物结合的重组蛋白，或过表达一种或多种内皮细胞粘附分子的细胞系统。
136C.示例128C至135C中任一示例的方法，其中白细胞如示例57中所述。
137C.示例128C至135C中任一示例的方法，其中白细胞粘附分子或白细胞的其他结合分子如示例58C和60中所述。
138C.示例128C至135C中任一项的方法，其中一种或多种内皮分子如示例59和61C中所述。
139C.示例128C至138C中任一示例的方法，当测定不同白细胞亚组在可以预先涂覆有特异性内皮分子底物的各个流动通道中的粘附时，使得可以生成每个粘附分子在特异性白细胞亚组上的细胞迁移谱。
140C.示例128C至139C中任一示例的方法，其中该方法的测定包括以下步骤：识别药物靶标，然后基于药物靶标来选择用于控制疾病进展的适当药物。
141C.示例128C至140C中任一示例的方法，其中该方法的测定包括以下步骤：识别药物靶标，然后基于药物靶标和用于那些靶标的药物的参考数据库来选择用于控制疾病进展的适当药物。
142C.示例141C的方法，其中该方法的测定包括以下步骤：构建药物靶标和药物的数据库。
143C.示例128C至142C中任一示例的方法，其中该方法的测定包括以下步骤：一次测定多于一种药物靶标的步骤(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个药物靶标或更多个)。
144C.示例128C至143C中任一示例的方法，其中该方法是高吞吐量测定，一次测试多个药物靶标。
示例1D.一种方法：(a)预测受试者如何可能对用于控制疾病进展的药物做出应答，(b)确定药物是否可以用于控制或预防受试者的疾病进展，(c)选择用于预防或控制受试者的疾病进展的药物，或(d)识别用于预防或控制受试者的疾病进展的药物，其中该药物能够更改白细胞与内皮分子的粘附，所述方法包括以下步骤：
对从受试者获得的至少一种血液样品在体外进行至少一次白细胞粘附功能测定；以及
基于测定结果，(a)预测至少一个受试者如何可能对用于控制疾病进展的药物做出应答，(b)确定药物是否可以用于控制或预防受试者的疾病进展，(c)选择用于预防或控制受试者的疾病进展的药物，或(d)识别用于预防和/或控制受试者的疾病进展的药物。
2D.一种确定施用用于控制疾病进展的药物的受试者如何对该药物做出应答的方法，其中该药物能够更改白细胞与内皮分子的粘附，所述方法包括以下步骤：
对从受试者获得的含有药物的至少一种血液样品在体外进行至少一次白细胞粘附功能测定；以及
基于测定结果，确定受试者如何对药物做出应答。
3D.一种优化用于控制疾病进展的药物的受试者的给药方案的方法，其中该药物能够更改白细胞与内皮分子的粘附，所述方法包括以下步骤：
对从受试者获得的含有药物的至少一种血液样品在体外进行至少一次白细胞粘附功能测定；以及
基于测定结果，优化用于控制疾病进展的给受试者的药物给药方案。
4D.一种确定用于控制疾病进展的给受试者的最小有效药物剂量的方法，其中该药物能够更改白细胞与内皮分子的粘附，所述方法包括以下步骤：
(1)在预定时间段内对受试者施用已知量的药物；
(2)在步骤(1)之后，对从受试者获得的含有药物的血液样品在体外进行白细胞粘附功能测定；以及
(3)基于测定结果，重复步骤(1)和(2)，直到可以确定用于控制疾病进展的给受试者的最小有效药物剂量为止。
5D.一种用于执行示例1至4中任一示例的方法的流动测定或流动设备。
6D.一种为受试者生成白细胞粘附谱的方法，所述方法包括以下步骤：
对从受试者获得的至少一种血液样品在体外进行至少一次白细胞粘附功能测定，以便基本上同时定量评估不同白细胞亚组对一种或多种不同内皮分子的粘附功能；以及
使用测定结果：识别白细胞异常；确定个性化发病机制；识别疾病的新疾病标志物；识别疾病的早期迹象；疾病预测；疾病预防；协助早期准确诊断；为受试者开发有效和个性化的治疗；监测受试者的健康(健康状况)；不论疾病如何，对受试者进行分组；无论疾病诊断如何，为受试者开展治疗。
除非在上下文或用法中需要对该术语进行排他性解释，否则术语“包括”(comprise)和诸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”之类的术语的变体在本文中用于表示包含所述整体但不排除任何其他整体。
附录A
根据某些示例性示例(LAFA)的白细胞粘附功能测定方案
-VCAM-1测定
1.简介
以下方案可以与某些示例性示例一起使用以使用VCAM-1作为底物进行LAFA(VCAM-1测定)。白细胞粘附功能测定是可以用于评估白细胞在某些流动条件下与血液中的其他分子相互作用的能力的测定。通常，通过用一种或多种荧光染料来标记以在血液中显现白细胞，使得可以通过例如荧光显微镜检测它们。在一些示例性示例中考虑了该方案的合适变体。
为了在体外模拟血液微循环，可以使用微流体系统，其由微流体泵和微流体芯片/通道组成。粘合剂底物可以预涂覆在微流体通道的底部上，然后可以通过通道灌注血液样品，允许白细胞与预涂覆的粘附底物相互作用。然后，可以通过显微镜记录这些相互作用，然后可以通过合适的软件分析图像。结果，可以使用一系列细胞动力学参数描述细胞相互作用行为，从中可以评估白细胞与特异性粘附底物相互作用的能力。评估可以是定性的、半基本定量的、定量的或其组合。
2.试剂和材料
a)人VCAM-1蛋白(购自R&D system，目录号：ADP5)
从R&D接收小瓶后，将VCAM-1蛋白在HBSS缓冲液中重新配制为浓度为1mg/ml。然后,将VCAM-1溶液等分至每管2μl(0.5离心管)，并储存在-80℃冰箱中。需要时，将一份等分试样/管的VCAM-1解冻并在8小时内使用。不允许反复冻融。
b)Hanks平衡盐溶液(HBSS)(Sigma，目录号：H1387)
将一包HBSS粉末重新配制成1L水，并储存在4℃冰箱中。
c)微流体芯片：(Microfluidic ChipShop，目录号：01-0178-0152-01)
PMMA，盖子厚度(175μm)
直通道芯片(16个平行通道)，Mini Luer接口
宽度(1,000μm)/深度(200μm)/长度(18mm)
d)芯片入口
i.Mini Luer到Luer适配器：可以容纳高达70μl的血液
ii.Mini Luer到Luer适配器加上500μl的罐：可以容纳高达500μl的血液
e)MnCl2，(Sigma，目录号：450995)
制备0.5M原液，在全血中使用1:100稀释(最终浓度为5mM)。
f)荧光标志物
i.CD4-Alexa488(BD，目录号：557695)
ii.CD8-PE(BD，目录号：555635)
iii.CD15-APC(BD，目录号：551376)
iv.CD19-BV510(BD，目录号：562947)
3.微流体芯片制备
a.从-80℃冰箱中解冻出VCAM-1蛋白，并使用HBSS将其稀释至10μg/ml的浓度。
b.使用15μl的稀释的VCAM-1蛋白溶液预涂覆每个微流体通道，在4℃下，过夜。
c.始终将芯片上的第一通道留空，以便在InCell上自动对焦。
d.第二天，在用于LAFA之前，需要使用HBSS清洗通道一次。
4.采血
a.需要经由静脉穿刺施用7-10ml的全血，其包括EDTA管(用于FBE)2ml的全血和肝素锂管(用于LAFA)5ml的全血。
b.如果使用蝶形器进行采血，优选在EDTA管中收集2ml的血液，然后在肝素管中收集5ml的血液。如果使用注射器，则顺序无关紧要。
c.收集后，在室温(20℃)下，储存血液管。
d.避免剧烈摇晃血液管，因为它可能活化血细胞。
5.血液预处理和标记
a.对于每次测定，需要130μl的肝素化血液。
b.在一些实验中，在用于测定之前，血液需要在室温(RT)下用5mM Mn活化5分钟。
c.以下标志物可以单独或以任何组合添加到全血中，在室温下，孵育5分钟。
-CD4-Alexa488(2μl/100μl的全血)
-CD8-PE(1.5μl/100μl的全血)
-CD15-APC(3μl/100μl的全血)
-CD19-BV510(2μl/100μl的全血)
d.如果测试药物效果(例如，那他珠单抗)，则需要在测定前在10分钟内将药物在室温下加入血液中。在Mn实验中，需要在Mn处理后至少5分钟添加药物。
6.测定
a.将芯片放入InCell 2200的载玻片保持器中
b.将顶部和底部加热器调至39℃(载玻片为35.5℃)
c.将血液样品加载到芯片的入口
d.将芯片的出口连接到微流体泵
e.在InCell操作软件中打开方案
f.找到聚焦平面
g.以0.6ml/小时开始泵/血液灌注
-10毫升注射器
-16G针
h.开始记录
7.视频分析
a.打开斐济开源图像分析软件。如果您尚未使用斐济(https://imagej.net/Fiji/Downloads)，请在开始分析之前下载并安装适合您的操作系统的版本。
b.通过拖放到斐济来打开宏‘Re-order Hyperstack.ijm’。
c.通过拖放到斐济来打开宏‘Scale Crop Flatten Image.ijm’。
d.打开B&C窗口(Image>Adjust>Brightness/Contrast)。
e.打开TrackMate插件(Image>Adjust>Brightness/Contrast)并选择“TrackMate_Template.xml”。
f.关闭窗口空白(V)。
g.打开图像(Plugins>Bio-Formats>Bio-Formats Importer)，双击第一张图像，其余图像将自动加载。
h.勾选‘Group files with similar names’，按‘OK’。其他一切都应当未被攻击，View应当是‘Hyperstack’，Color模式应当是‘Default’。
i.勾选‘File name contains’并在相应的框中输入类型‘A*.tif’。
j.单击宏选项卡‘Re-order Hyperstack.ijm’，按Run。
k.单击宏选项卡‘Scale Crop Flatten Image.ijm’，按Run。
l.在B&C窗口中，按‘Auto’查看通道边缘。调整ROI以包括通道中心并排除通道边缘。按‘OK’。
m.选择要分析的通道(例如，Dapi)
n.在TrackMate窗口中，按绿色的‘left’箭头按钮直到灰化。这是TrackMate分析向导的开始面板。
o.按‘Refresh source’
p.按绿色‘right’箭头按钮或‘Please wait’按钮两次。
q.将阈值设置为
-Dapi为0.4
-FITC为1.0
-Cy3为3.0
-Cy5为3.0
r.按绿色‘right’箭头按钮或‘Please wait’按钮一次，等待检测结束。
s.按绿色‘right’箭头按钮或‘Please wait’按钮八次以完成向导的其余步骤。
t.按‘Analysis’按钮，将第一表(跟踪统计)保存为.csv文件。名称模式应当包括实验编号和通道(示例：Expt1_Dapi_Tracks.csv)。
u.丢弃第二表(轨迹统计中的链接)。
v.将第三表(轨迹统计中的点)保存为.csv文件。名称模式应当包括实验编号和通道(示例：Expt1_Dapi_Spots.csv)。
w.针对要分析的所有其他通道重复步骤m-v。
x.然后，可以在R中分析TrackMate.csv文件。
见图27
Re-order Hyperstack.ijm
Scale Crop Flatten Image.ijm
TrackMate_Template.xml
8.二次数据分析
a.打开R
b.打开由StickyCell开发的“FlowAnalysis_GUI_v6.R”。
c.转到“FlowAnalysis”窗口
d.从“Analysis Type”菜单中选择“Full”
e.单击“Browse Working Directory”以选择要分析的文件所在的文件夹。
f.单击“Browse Control”以选择一个Excel文件，从“Trackmate”导出
g.单击“Browse Patient”以选择从“Trackmate”导出的另一个Excel文件
h.按“Analyse”按钮。
i.所有参数将在同一文件夹中的子文件夹中生成。
见图27
FlowAnalysis_GUI_v6.R
本说明书中对“一个实施例”或“一实施例”的引用意味着结合该实施例描述的特定特征、结构或特点包括在本发明的至少一个实施例中。因此，在整个说明书中的各个地方出现的短语“在一个实施例中”或“在一实施例中”不一定都是指同一实施例。此外，特定特征、结构或特点可以以一种或多种组合以任何合适的方式组合。
根据法规，已经以或多或少特定于结构或方法特征的语言对本发明进行了描述。应当理解，本发明不限于所示或所述的具体特征，因为本文中所描述的方法包括使本发明生效的优选形式。因此，本发明在所附权利要求(如果有的话)的适当范围内以本领域技术人员适当解释的任何形式或修改要求保护。

Claims (23)

1.一种评估受试者对适于控制疾病进展的药物治疗做出的应答或潜在应答的方法，其中该药物能够更改白细胞募集、粘附和/或迁移，该方法包括以下步骤：
从受试者获得血液样品；
对血液样品进行至少一次白细胞功能测定(LAFA)，其中LAFA评估白细胞募集、粘附和/或迁移至以下各项中的至少一项或多项：至少一种内皮分子和至少一种细胞；以及
至少部分地基于至少一次LAFA的一个或多个结果，评估受试者对用于控制疾病进展的药物治疗做出的应答或潜在应答。
2.一种评估受试者对适于控制疾病进展的药物治疗做出的应答或潜在应答的方法，其中该药物能够更改白细胞募集、粘附和/或迁移，该方法包括以下步骤：
从受试者获得血液样品；
对血液样品进行至少一次白细胞功能测定(LAFA)，其中至少一次LAFA在实际生理条件下定量和/或半定量地评估白细胞募集、粘附和/或迁移至以下各项中的至少一项或多项：至少一种内皮分子和表达内皮分子的至少一种细胞；以及
至少部分地基于至少一次LAFA的一个或多个结果，评估受试者对用于控制疾病进展的药物治疗做出的应答或潜在应答。
3.根据权利要求1所属的方法，其中对以下一种或多种底物进行至少一次LAFA：VCAM-1、MAdCAM-1、P-选择素、E-选择素、IL-8、SDF1α和表达内皮分子的一种或多种细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中对以下两种或更多种底物进行至少一次LAFA：VCAM-1、MAdCAM-1、P-选择素、E-选择素、IL-8、SDF1α和表达内皮分子的一种或多种细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中对以下三种或更多种底物进行至少一次LAFA：VCAM-1、MAdCAM-1、P-选择素、E-选择素、IL-8、SDF1α和表达内皮分子的一种或多种细胞。
6.根据权利要求1-4中一项或多项所述的方法，其中至少一次LAFA测量以下参数中的一项或多项：所检测到的滚动白细胞的定量，所检测到的粘附白细胞的定量，所检测到的爬行白细胞的定量，所检测到的个体白细胞的平均速度，所检测到的个体白细胞的平均直线度，所检测到的个体白细胞的平均位移以及所检测到的个体白细胞的平均停留时间。
7.根据权利要求1-4中一项或多项所述的方法，其中至少一次LAFA测量以下参数中的两项或更多项：所检测到的滚动白细胞的定量，所检测到的粘附白细胞的定量，所检测到的爬行白细胞的定量，所检测到的个体白细胞的平均速度，所检测到的个体白细胞的平均直线度，所检测到的个体白细胞的平均位移以及所检测到的个体白细胞的平均停留时间。
8.根据权利要求1-4中一项或多项所述的方法，其中至少一次LAFA测量以下参数中的四项或更多项：所检测到的滚动白细胞的定量，所检测到的粘附白细胞的定量，所检测到的爬行白细胞的定量，所检测到的个体白细胞的平均速度，所检测到的个体白细胞的平均直线度，所检测到的个体白细胞的平均位移以及所检测到的个体白细胞的平均停留时间。
9.根据权利要求1-4中一项或多项所述的方法，其中至少一次LAFA测量以下参数中的六项或更多项：所检测到的滚动白细胞的定量，所检测到的粘附白细胞的定量，所检测到的爬行白细胞的定量，所检测到的个体白细胞的平均速度，所检测到的个体白细胞的平均直线度，所检测到的个体白细胞的平均位移以及所检测到的个体白细胞的平均停留时间。
10.根据权利要求1-9中一项或多项所述的方法，其中来自受试者的血液样品使用Mn2+进行处理，并且对Mn2+处理的血液样品进行至少一次LAFA，并且至少一次LAFA的一个或多个结果用于生成一个或多个参数，该一个或多个参数用于生成一个或多个指数。
11.根据权利要求1-10中一项或多项所述的方法，其中至少一种健康血液样品使用Mn2+进行处理，并且对至少一种健康的Mn2+处理的血液样品进行至少一次LAFA，并且至少一次LAFA的一个或多个结果用于生成一个或多个参数，该一个或多个参数用于生成一个或多个指数。
12.根据权利要求1-11中一项或多项所述的方法，其中来自受试者的血液样品的至少一次LAFA的一个或多个结果用作对照，该对照用于生成一个或多个参数，该一个或多个参数用于生成一个或多个指数。
13.根据权利要求1-12中一项或多项所述的方法，其中来自至少一个健康血液样品的至少一次LAFA的一个或多个结果用作对照，该对照用于生成一个或多个参数，该一个或多个参数用于生成一个或多个指数。
14.根据权利要求1-13中的一项或多项所述的方法，其中生成以下一个或多个指数中的一个或多个：受试者的相对直线度指数(RSTI)、相对速度指数(RSI)、以及相对停留时间指数(RDTI)。
15.根据权利要求1-14中一项或多项所述的方法，其中基于来自受试者血液的至少一次LAFA的一个或多个结果除以受试者的Mn2+处理的血液样品的至少一次LAFA的一个或多个结果，生成受试者血液的活化电位比。
16.根据权利要求1和15中一项或多项所述的方法，其中该疾病至少部分涉及以下各项中的一项或多项：异常白细胞募集、粘附和/或迁移；炎症的进展；自身免疫状态的进展；免疫缺陷状态的进展；以及感染状态的进展。
17.根据权利要求1和16中一项或多项所述的方法，其中疾病至少部分涉及多发性硬化(MS)。
18.根据权利要求1和17中一项或多项所述的方法，其中疾病至少部分涉及炎性肠病(IBD)。
19.根据权利要求1-18中一项或多项所述的方法，其中该至少一次LAFA的一个或多个结果用于对受试者进行分层并且评估受试者对用于控制疾病进展的药物治疗做出的应答或潜在应答。
20.根据权利要求1-19中一项或多项所述的方法，其中该至少一次LAFA的一个或多个结果用于对受试者进行分层并且预测受试者对用于控制疾病进展的药物治疗做出的应答或潜在应答。
21.根据权利要求1-20中一项或多项所述的方法，其中在静态或非静态条件下进行至少一次LAFA。
22.一种系统，其用于基于根据权利要求1-21中的一项或多项所述的方法来执行至少一次LAFA。
23.一种设备，其用于基于根据权利要求1-21中的一项或多项所述的方法来执行至少一次LAFA。
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