CN110068604A - 一种新型多孔二氧化铪纳米薄层快速检测痕量磷酸蛋白的电化学传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新型多孔二氧化铪纳米薄层快速检测痕量磷酸蛋白的电化学传感器，在玻碳电极表面修饰两层薄层，所述薄层分别是金纳米粒子薄层和多孔二氧化铪纳米粒子薄层。本发明的优点是：1)不仅巧妙的利用金纳米粒子的高导电性能、大的比表面积等性质，更主要利用金纳米粒子增加电极表面分散性，且对金属氧化有具有一定的静电吸附作用，为下一步二氧化铪纳米粒子的聚合提供了良好的条件，克服了金属氧化物难以聚合在玻碳电极表面的缺点；2)巧妙的利用新型金属氧化物二氧化铪的路易斯酸性和碱性，使磷酸基团在其表面进行特异性可逆性的吸附和释放，实现了磷酸蛋白的在线富集并检测，同时克服了非磷酸蛋白的干扰。

Description

一种新型多孔二氧化铪纳米薄层快速检测痕量磷酸蛋白的电 化学传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种基于金纳米粒子信号放大作用的新型多孔二氧化铪纳米薄层快速检测痕量磷酸蛋白的电化学传感器制备方法。
背景技术
蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式之一，它参与和调控生物体内的许多生命活动，如分子识别、信号转导、免疫反应等许多生物过程。然而人类许多疾病的发病机制离不开异常的磷酸化，例如癌症，糖尿病，麻风病和阿尔茨海默病等。因此对蛋白质磷酸化过程、磷酸蛋白以及相关酶的活性，尤其是磷酸化位点的研究至关重要。质谱法由于具有高通量、超高灵敏度、识别磷酸化位点等优势而被广泛应用在磷酸蛋白组学的研究中，但是磷酸化的化学计量、丰度和电离效率通常处于较低的状态，且磷酸化是一个动态的可逆过程，这就要求在质谱检测前必须要对磷酸蛋白进行充分的富集，但经过富集和洗脱后再用质谱检测的整个操作流程不仅费时复杂且繁琐的步骤易增加结果的误差。
目前，固定化金属离子亲和层析(IMAC)和金属氧化物亲和色谱(MOAC)是在磷酸蛋白的富集过程中应用最广泛的技术，然而IMAC方法富集磷酸蛋白的结果易受吸附剂、偶联的螯合剂、吸附和洗脱条件、酸性残基的数量等多个因素的影响。但由于金属氧化物因其在不同的pH值条件下分别表现出路易斯酸性和碱性，能很好的实现对磷酸蛋白特异性富集与洗脱，同时也在很大程度上减少了非磷酸蛋白的吸附。所以将电化学传感器的快速简单特点与金属氧化物特异性富集磷酸蛋白的优点充分结合，来实现磷酸蛋白的快速检测，这种方法不仅简单、快速，而且具有很好的特异性强、准确度和灵敏度。
发明内容
本发明利用了金纳米粒子大的表面积、高导电性能、增加电极表面分散性和对金属氧化物有很好的静电吸附作用等优点和新型金属氧化物对目标物的特异性吸附性，制备了一种基于金纳米粒子信号放大作用的新型多孔二氧化铪纳米薄层快速检测痕量磷酸蛋白的电化学传感器并提供了实际样品中磷酸蛋白的检测方法。
原理如下：(1)在玻碳电极表面恒电位沉积金纳米粒子，可以增大表面积、电极表面分散性和静电吸附作；
(2)二氧化铪属于两性物质，有很好的稳定性和生物相容性，对目标物的特异性和吸附性也非常强，电化学聚合容易且均匀，通过在含八水氧氯化铪、氯化钾和十六烷基三甲基溴化铵的混合液中进行循环伏安扫描，而此混合溶液在较低的电位下，电极表面发生如下反应：
2H2O+2e-→H2↑+2OH-
O2+2H2O+4e-→4OH-
2HfOCl2→2Cl-+HfO2 +
HfO2++H2O→Hf(OH)2 2+
Hf(OH)2 2++2OH-→Hf(OH)4
Hf(OH)4→HfO2+2H2O
此反应过程中会有氢气气泡的放出，从而在电极表面形成动态模板，出现多孔的状态。此多孔结构能大大的增大电极表面的比表面积，从而富集更多的磷酸蛋白，提高灵敏度，降低该方法的检出限，最终得到新型多孔二氧化铪纳米粒子薄层，用于对目标物的特异性吸附。
(3)在吸附时，由于二氧化铪在低pH值的条件下表现出路易斯酸性，带有正电荷，会对磷酸蛋白上的磷酸基团有较强的亲和作用，使磷酸蛋白特异性吸附在修饰有二氧化铪的电极表面，用K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]作为电化学传感器中的探针，通过测量峰的电流值，可以实现对磷酸蛋白的定量检测。
一种新型多孔二氧化铪纳米薄层快速检测痕量磷酸蛋白的电化学传感器，在玻碳电极表面修饰两层薄层，所述薄层分别是金纳米粒子薄层和多孔二氧化铪纳米粒子薄层。
优选的，金纳米粒子薄层使用的是3mL25mmol/L氯金酸溶液，多孔二氧化铪纳米粒子薄层使用的是3mL 5mmol/L HfOCl2溶液。
HfOCl2溶液在-1.1-0.7的电位下会在电极表面发生如下反应：
2H2O+2e-→H2↑+2OH-
O2+2H2O+4e-→4OH-
2HfOCl2→2Cl-+HfO2+
HfO2++H2O→Hf(OH)2 2+
Hf(OH)2 2++2OH-→Hf(OH)4
Hf(OH)4→HfO2+2H2O
此反应过程中会有氢气气泡的放出，从而在电极表面形成动态模板，出现多孔的状态。多孔的好处是能增大电极表面的比表面积，从而富集更多的磷酸蛋白，提高灵敏度，降低该方法的检出限。
一种基于金纳米粒子信号放大作用的新型多孔二氧化铪纳米薄层快速检测痕量磷酸蛋白的电化学传感器制备方法，所述电化学传感器包含工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极为玻碳电极，参比电极为饱和氯化钾电极，对电极为铂柱电极，包括如下步骤：
(1)电极预处理
(2)恒电位沉积金纳米粒子
将步骤(1)中处理好的玻碳电极浸于3mL 25mmol/L氯金酸溶液中，在-0.2V电压下，沉积60s，得到金纳米粒子修饰的电极；
(3)电聚合二氧化铪
将步骤(2)中修饰金纳米粒子的电极浸于3mL含有0.1mol/L KCl、1mmol/L CTAB的5mmol/L Cl2H16HfO9溶液中，在-1.1V～0.7v范围内电沉积6圈，扫描速度为20mV/s，采样间隔为0.5s，得到二氧化铪纳米粒子修饰的电极；
(4)滴涂巯基己醇
将步骤(3)中聚合了二氧化铪纳米粒子的电极表面滴涂10μL的1mmol/L的巯基己醇，孵育1h来封闭电极表面空余的活性位点，之后用双蒸水清洗3～5次，吹干，得到巯基己醇修饰的电极，放置于4℃备用。
进一步，步骤(1)电极预处理是玻碳电极表面依次使用1.0μm，0.3μm，0.05μm的氧化铝粉末进行抛光，用双蒸水完全冲洗后，在含有0.2mol/L KNO3的5mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中采用循环伏安法在-0.2～0.6V范围内扫描多圈，直至获得稳定的电化学响应，然后在空气中干燥，备用。
抛光是降低电极表面的粗糙度，以获得光亮、平整、干净的玻碳电极。抛光三次目的是将玻碳电极表面处理干净，保证后续金纳米粒子和金属氧化物二氧化铪修饰的准确性与平行性。
进一步，步骤(2)中，先将1g的氯金酸固体用100mL双蒸水稀释到25mmol/L，3mL25mmol/L的电沉积溶液在使用之前氮吹10min除去溶解氧，设置恒定电压为-0.2V、采样间隔为0.5s、等待时间为1s、沉积时间为60s。这一步目的是在电极表面沉积金纳米粒子，因为金纳米粒子具有高导电性能、大的比表面积等优越的性能，能够降低改该方法的检出限，同时金纳米粒子能够增加电极表面的分散性，且对金属氧化有具有一定的静电吸附作用，为下一步二氧化铪纳米粒子的聚合提供了良好的条件，克服了金属氧化物难以修饰在玻碳电极表面的缺点。
进一步，步骤(3)中，先将八水氧氯化铪、氯化钾和十六烷基三甲基溴化铵固体用双蒸水稀释成含有0.1mol/L KCl、1mmol/L CTAB的5mmol/L Cl2H16HfO9溶液，将含有0.1mol/L KCl、1mmol/L CTAB的5mmol/L Cl2H16HfO9的电沉积溶液在使用之前氮吹6～10min除去溶解氧，在-1.1V～0.7范围内电沉积6圈，扫描速度20mV/s。
进一步，步骤(4)中，将10mmol/L的巯基己醇用双蒸水稀释成1mmol/L，涡旋使其混合均匀，然后用移液枪取10μL的1mmol/L巯基己醇滴涂到步骤(3)中的处理好的二氧化铪纳米粒子修饰的电极表面，孵育1h，之后用双蒸水清洗3～5次，吹干，得到巯基己醇修饰的电极，放置于4℃备用。
进一步，所述的二氧化铪金属纳米粒子修饰电极检测磷酸蛋白的方法包括如下步骤：
(1)本发明检测方法：
在室温即25℃下，在修饰好有金属氧化物二氧化铪纳米粒子电极上吸附浓度范围为3.94×10-8mol·L-1～3.94×10-5mol·L-1的β-酪蛋白溶液，平衡时间2h，将上述吸附有β-酪蛋白的电极用0.02％吐温20和水淋洗多次，最后将电极置于含有0.2mol/L KNO3的5mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中进行差分脉冲伏安法扫描，扫描电压范围为-0.2～0.6V，电位增量，脉冲幅度，脉冲宽度，脉冲间隔和等待时间分别为0.01V，0.1V，0.5s，1s和2s。
(2)β-酪蛋吸附量的测定：
随着越来越多的β-酪蛋与二氧化铪磷酸位点特异性结合，还原峰电流值逐渐降低；β-酪蛋浓度(3.94×10-8mol/L～3.94×10-5mol/L)的对数值与峰电流值呈良好的线性关系：y＝-13.959lgc+113.23，其线性相关系数R2＝0.9913，最低检出限(LOD)为4.1×10- 8g/mL(S/N＝3)。
(3)MALDI-TOF-MS检测验证
为进一步验证所构建检测β-Casein传感器的可行性以及准确性。用pH11、15％的氨水将玻碳电极上的β-Casein洗脱下来，时间为4h，将洗脱液用2％的醋酸调节pH到7.5-8.5之间，按照体积比40：1的比例向洗脱液中加入胰蛋白酶溶液，充分混匀，置于37℃水浴摇床中，酶解12h，将得到的酶解液进行MALDI-TOF-MS测定分析。结果如图1，可以明显看出三个平行酶解液的出峰位置基本一致，表明此检测方法有很好的平行性。通过质谱的验证说明磷酸蛋白能够很好的吸附在电极表面，同时也说明所构建的传感器具有很好的准确性。
本发明的优点是：
(1)首先在玻碳电极表面修饰一层金纳米粒子薄层，利用了金纳米粒子的高导电性能和大比表面积，而且充分利用了金纳米粒子能增加电极表面分散性和对金属氧化物的静电吸附作用，为下一步二氧化铪纳米粒子的聚合提供了良好的条件，克服了金属氧化物难以聚合在玻碳电极表面的缺点；
(2)巧妙的利用了二氧化铪新型金属氧化物。铪(Hf)是元素周期表中第IVB的第三个元素，具有与钛和锆相似的特征与性质，但其在磷酸蛋白质组学中的应用还鲜有报道；本发明开发了一种新型金属氧化物来富集磷酸蛋白；
(3)巧妙的利用了金属氧化物的稳定性和二氧化铪的路易斯酸碱性，使磷酸基团能够稳定的在其表面特异性结合，克服了非磷酸蛋白的干扰，而且磷酸基团也能在其表面发生可逆性的吸附和释放反应，大大简化了吸附和洗脱步骤。金属氧化物因其表面金属原子和氧原子的价态表现出两种不同的化学性质，在不同的pH值下分别表现出路易斯酸性和碱性，即在酸性条件下表现为路易斯酸性带正电能够与带负电的磷酸基团有效结合，同时磷酸基团会以一种桥连双齿作用而特异性吸附在金属氧化物表面，从而使磷酸肽吸附在金属氧化物上，避免了非磷酸蛋白的干扰。
(4)首次将金属氧化物二氧化铪修饰在玻碳电极表面，并充分利用了水在较低的电位下能在阴极电位上发生还原反应产生氢气气泡，从而在电极表面形成动态的模板，制备出多孔的二氧化铪纳米粒子薄层，进一步增加了二氧化铪纳米粒子薄层的比表面积，提高检测方法的灵敏度。
(5)巧妙的将金属氧化物能特异性富集磷酸蛋白的特点与电化学传感器的简单快速检测的优点结合在一起，突破了前处理过程繁琐、仪器昂贵、操作费时、测试成本高等传统检测方法的缺陷，实现了痕量磷酸蛋白的快速在线富集并检测，为实际样品中痕量磷酸蛋白的检测供了一种新颖、快速和准确的分析检测方法。
附图说明
构成本发明创造的一部分的附图用来提供对本发明创造的进一步理解。
图1三个平行的β-酪蛋白洗脱液质谱图
图2五支不同修饰电极在5mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中的循环伏安图。(a)裸电极；(b)金纳米粒子/裸电极(c)二氧化铪纳米粒子/金纳米粒子/裸电极；(d)巯基己醇/二氧化铪纳米粒子/金纳米粒子/裸电极；(e)β-酪蛋白/巯基己醇/二氧化铪纳米粒子/金纳米粒子/裸电极；
图3为本发明创造实施β-酪蛋白含量的对数值与电流值的关系图。
具体实施方式
本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。下面结合附图说明和具体实施例对本发明做进一步详细描述。
实施例1
(1)电极预处理
玻碳电极表面依次使用1.0μm，0.3μm，0.05μm的氧化铝粉末进行抛光，用双蒸水完全冲洗后，在含有0.2mol/L KNO3的5mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中采用循环伏安法在-0.2～0.6V范围内扫描多圈，直至获得稳定的电化学响应，然后在空气中干燥，备用。
(2)恒电位沉积金纳米粒子
将1g的氯金酸固体用100mL双蒸水稀释到25mmol/L，3mL 25mmol/L的电沉积溶液在使用之前氮吹10min除去溶解氧，设置恒定电压为-0.2V、采样间隔为0.5s、等待时间为1s、沉积时间为60s。
(3)电聚合二氧化铪纳米粒子
将八水氧氯化铪、氯化钾和十六烷基三甲基溴化铵用双蒸水稀释成含有0.1mol/LKCl、1mmol/L CTAB的5mmol/L HfOCl2溶液，含有0.1mol/L KCl、1mmol/L CTAB的5mmol/LHfOCl2的电沉积溶液在使用之前氮吹6min除去溶解氧，在-1.1V电沉积6圈，扫描速度20mV/s。
(4)滴涂巯基己醇
10mmol/L的巯基己醇用双蒸水稀释成1mmol/L，涡旋使其混合均匀，然后用移液枪取10μL的1mmol/L巯基己醇滴涂处理好的二氧化铪修饰的电极表面，孵育1h，之后用双蒸水清洗3次，吹干，得到巯基己醇修饰的电极，放置于4℃备用。
实施例2
(1)电极预处理
玻碳电极表面依次使用1.0μm，0.3μm，0.05μm的氧化铝粉末进行抛光，用双蒸水完全冲洗后，在含有0.2mol/L KNO3的5mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中采用循环伏安法在-0.2～0.6V范围内扫描多圈，直至获得稳定的电化学响应，然后在空气中干燥，备用。
如图1所示，循环伏安法是监控修饰电极表面电子转移过程的有效的方法。曲线a表示在裸电极表面有一对典型的氧化还原峰。曲线b表示修饰了金纳米粒子的电极，峰电流增加，这是因为金纳米粒子有较高导的电性能，而且金纳米粒子又可以增大表面积。曲线c是修饰了二氧化铪纳米粒子的循环伏安曲线，峰电流明显降低，二氧化铪纳米粒子为金属氧化物，本身为半导体，不利于电荷传递，阻碍了铁氰化钾探针在氧化还原过程中的阻力，从而降低电流值。曲线d展示的是修饰巯基己醇后的循环伏安曲线，可以明显观察峰电流值进一步降低，这可以说明巯基己醇充分的封闭了二氧化铪纳米粒子/金纳米粒子/裸电极表面空余的活性位点。曲线e展示的是β-酪蛋白吸附在修饰有二氧化铪纳米粒子的循环伏安曲线，可以观察到峰电流值降低程度更大，这是因为β-酪蛋白属于大分子物质，会明显阻碍电子的转移，同时也说明β-酪蛋白已经成功的特异性吸附在修饰有二氧化铪纳米粒子的电极表面。
(2)恒电位沉积金纳米粒子
将1g的氯金酸固体用100mL双蒸水稀释到25mmol/L，3mL 25mmol/L的电沉积溶液在使用之前氮吹10min除去溶解氧，设置恒定电压为-0.2V、采样间隔为0.5s、等待时间为1s、沉积时间为60s。
(3)电聚合二氧化铪纳米粒子
将八水氧氯化铪、氯化钾和十六烷基三甲基溴化铵用双蒸水稀释成含有0.1mol/LKCl、1mmol/L CTAB的5mmol/L HfOCl2溶液，含有0.1mol/L KCl、1mmol/L CTAB的5mmol/LCl2H16HfO9的电沉积溶液在使用之前氮吹8min除去溶解氧，在0.837V电沉积6圈，扫描速度20mV/s，在这个电位成绩效果最好。
(4)滴涂巯基己醇
10mmol/L的巯基己醇用双蒸水稀释成1mmol/L，涡旋使其混合均匀，然后用移液枪取10μL的1mmol/L巯基己醇滴涂处理好的二氧化铪修饰的电极表面，孵育1h，之后用双蒸水清洗4次，吹干，得到巯基己醇修饰的电极，放置于4℃备用。
实施例3
(1)电极预处理
玻碳电极表面依次使用1.0μm，0.3μm，0.05μm的氧化铝粉末进行抛光，用双蒸水完全冲洗后，在含有0.2mol/L KNO3的5mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中采用循环伏安法在-0.2～0.6V范围内扫描多圈，直至获得稳定的电化学响应，然后在空气中干燥，备用。
(2)恒电位沉积金纳米粒子
将1g的氯金酸固体用100mL双蒸水稀释到25mmol/L，3mL 25mmol/L的电沉积溶液在使用之前氮吹10min除去溶解氧，设置恒定电压为-0.2V、采样间隔为0.5s、等待时间为1s、沉积时间为60s。
(3)电聚合二氧化铪纳米粒子
将八水氧氯化铪、氯化钾和十六烷基三甲基溴化铵用双蒸水稀释成含有0.1mol/LKCl、1mmol/L CTAB的5mmol/L Cl2H16HfO9溶液，含有0.1mol/L KCl、1mmol/L CTAB的5mmol/L Cl2H16HfO9的电沉积溶液在使用之前氮吹10min除去溶解氧，在0.7V电沉积6圈，扫描速度20mV/s。
(4)滴涂巯基己醇
10mmol/L的巯基己醇用双蒸水稀释成1mmol/L，涡旋使其混合均匀，然后用移液枪取10μL的1mmol/L巯基己醇滴涂处理好的二氧化铪修饰的电极表面，孵育1h，之后用双蒸水清洗5次，吹干，得到巯基己醇修饰的电极，放置于4℃备用。
实施例4
实际样品中磷酸蛋白的测试：
分别利用本发明所述实施例1-3得到的传感器对实际样品(脂脂牛奶、小鼠血液、小鼠肝脏组织)中的磷酸蛋白进行分析测定。采用所制备传感器利用差分脉冲伏安法对牛奶原液、稀释10倍和稀释20倍后的牛奶进行测定，读取电流值平均值分别为：72.9、76.2、90.9μA；小鼠血液原液、稀释10倍和稀释20倍后的电流值分别74.2、80.9、89.6μA；鼠肝脏组织的电流值为89.9μA，然后带入公式y＝-13.959lgc+113.23，计算出相应的磷酸蛋白的含量分别为：0.7682、0.4482、0.03918mg/mL；0.6283、0.2037、0.0495mg/mL；0.0465mg/mL，采用MALDI-TOF质谱法对上述实际样品进行验证实验，其检测结果与差分脉冲伏安法的结果具有很好的一致性，说明利用本发明的制备方法构建的电化学传感器具有较高的准确度。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种新型多孔二氧化铪纳米薄层快速检测痕量磷酸蛋白的电化学传感器，其特征在于，在玻碳电极表面修饰两层薄层，所述薄层分别是金纳米粒子薄层和多孔二氧化铪纳米粒子薄层。
2.根据权利要求1所述一种新型多孔二氧化铪纳米薄层快速检测痕量磷酸蛋白的电化学传感器，其特征在于，金纳米粒子薄层使用的是3mL25mmol/L氯金酸溶液，多孔二氧化铪纳米粒子薄层使用的是3mL5mmol/L Cl2H16HfO9溶液。
3.根据权利要求1或2所述一种新型多孔二氧化铪纳米薄层快速检测痕量磷酸蛋白的电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)电极预处理；
(2)恒电位沉积金纳米粒子
将步骤(1)处理好的玻碳电极浸于3mL25mmol/L氯金酸溶液中，在-0.2V电压下，沉积60s，得到金纳米粒子修饰的电极；
(3)电聚合二氧化铪纳米粒子
将步骤(2)修饰金纳米粒子的电极浸于3mL5mmol/L Cl2H16HfO9，所述Cl2H16HfO9含0.1mol/L KCl和1mmol/L CTAB，在-1.1V～0.7v范围内电沉积6圈，扫描速度为20mV/s，采样间隔为0.5s，得到二氧化铪纳米粒子修饰的电极；
(4)滴涂巯基己醇
将步骤(3)聚合了二氧化铪纳米粒子的电极表面滴涂10μL的1mmol/L的巯基己醇，孵育1h来封闭电极表面空余的活性位点，之后用双蒸水清洗3～5次，氮气吹干，得到巯基己醇修饰的电极，放置于4℃备用。
4.根据权利要求3所述的一种新型多孔二氧化铪纳米薄层快速检测痕量磷酸蛋白的电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)电极预处理是玻碳电极表面依次使用1.0μm，0.3μm，0.05μm的氧化铝粉末进行抛光，用双蒸水完全冲洗后，在含有0.2mol/L KNO3的5mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中采用循环伏安法在-0.2～0.6V范围内扫描多圈，直至获得稳定的电化学响应，然后在空气中干燥，备用。
5.根据权利要求3所述的一种新型多孔二氧化铪纳米薄层快速检测痕量磷酸蛋白的电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，先将1g的氯金酸固体用100mL双蒸水稀释到25mmol/L得到电沉积溶液，取3mL25mmol/L的电沉积溶液，在使用之前氮吹10min除去电沉积溶液溶解氧，设置恒定电压为-0.2V、采样间隔为0.5s、等待时间为1s、沉积时间为60s。
6.根据权利要求3所述的一种新型多孔二氧化铪纳米薄层快速检测痕量磷酸蛋白电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，先将八水氧氯化铪、氯化钾和十六烷基三甲基溴化铵固体用双蒸水稀释成含有0.1mol/L KCl和1mmol/L CTAB的5mmol/L Cl2H16HfO9溶液，含有0.1mol/L KCl和1mmol/L CTAB的5mmol/L Cl2H16HfO9的电沉积溶液在使用之前氮吹6～10min除去溶解氧，在-1.1V～0.7范围内电沉积6圈，扫描速度20mV/s。
7.根据权利要求3所述的所述的一种新型多孔二氧化铪纳米薄层快速检测痕量磷酸蛋白的电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，将10mmol/L的巯基己醇用双蒸水稀释成1mmol/L，涡旋使其混合均匀，然后用移液枪取10μL的1mmol/L巯基己醇溶液滴涂到步骤(3)中的处理好的二氧化铪纳米粒子修饰的电极表面，孵育1h，之后用双蒸水清洗3～5次，吹干，得到巯基己醇修饰的电极，放置于4℃备用。
8.权利要求1-7任一权利要求所述的制备方法得到的电化学传感器用于生物学中磷酸蛋白的检测。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060246225A1 (en) * 2003-05-20 2006-11-02 Thomas Moritz Sample carrier based on a porous film with metal oxide particles, the production and utilization thereof, especially for selective detection of phosphorylated/sulphatized biopolymers
WO2010036520A1 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Mesoporous metal oxide materials for phosphoproteomics
CN102183561A (zh) * 2011-02-21 2011-09-14 常熟理工学院 球腔微电极阵列生物传感器及其制备方法
US20130260050A1 (en) * 2010-12-14 2013-10-03 Institute Of Microbiology As Cr, V.V.I. Method of Surface Modification for the Purpose of Enrichment of Phosphorylated Peptides for Analysis by Desorption/Ionization Mass Spectrometry Techniques
CN103559970A (zh) * 2013-10-11 2014-02-05 苏州英芮诚生化科技有限公司 一种碳纳米管包覆金属氧化物晶体的超顺磁性纳米复合材料及制备方法和应用
CN109142515A (zh) * 2018-10-25 2019-01-04 天津科技大学 一种用于检测痕量磷酸蛋白的石英晶体微天平传感器及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060246225A1 (en) * 2003-05-20 2006-11-02 Thomas Moritz Sample carrier based on a porous film with metal oxide particles, the production and utilization thereof, especially for selective detection of phosphorylated/sulphatized biopolymers
WO2010036520A1 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Mesoporous metal oxide materials for phosphoproteomics
US20130260050A1 (en) * 2010-12-14 2013-10-03 Institute Of Microbiology As Cr, V.V.I. Method of Surface Modification for the Purpose of Enrichment of Phosphorylated Peptides for Analysis by Desorption/Ionization Mass Spectrometry Techniques
CN102183561A (zh) * 2011-02-21 2011-09-14 常熟理工学院 球腔微电极阵列生物传感器及其制备方法
CN103559970A (zh) * 2013-10-11 2014-02-05 苏州英芮诚生化科技有限公司 一种碳纳米管包覆金属氧化物晶体的超顺磁性纳米复合材料及制备方法和应用
CN109142515A (zh) * 2018-10-25 2019-01-04 天津科技大学 一种用于检测痕量磷酸蛋白的石英晶体微天平传感器及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
高飞飞: "基于纳米材料构建新型磷酸化肽传感器的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊） 工程科技I辑》 *

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