CN110066337A - 一种抗TNF-α抗体 - Google Patents

Abstract

一种抗TNF‑α抗体，其是通过构建未经过抗原免疫刺激的天然兔源噬菌体抗体文库，以TNF‑α重组蛋白作为靶点，经过3轮筛选富集，获得了特异性结合TNF‑α的单链抗体。该抗体可作为特异性捕获TNF‑α抗体、TNF‑α信号抗体等应用。同时构建成功的天然抗体库，还可直接应用于更多的靶点筛选。

Description

一种抗TNF-α抗体

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种抗TNF-α抗体。

背景技术

2018年诺贝尔化学奖颁发给了噬菌体展示技术发明科学家Smith和Winter，噬菌体展示技术自发明以来，已成功应用于抗体药物开发。Winter利用此技术研发出了第一个全人的抗体药物，也就是大名鼎鼎的遥望阿达木单抗，用于治疗类风湿性关节炎、强制性脊柱炎、银屑病等，累计销售额已高达上千亿美金。

相比传统的杂交瘤融合技术制备单克隆抗体，噬菌体展示技术制备单克隆抗体可不经过动物免疫，直接从构建的文库中获得抗原特异性结合抗体。同时，噬菌体展示技术可直接获得抗体的基因序列，快速实现抗体的改造和大规模重组表达。噬菌体展示技术将抗体的重链和轻链可变区基因融合展示在噬菌体表面，通过在体外模拟抗体免疫系统的特异性靶标结合作用，将展示在噬菌体表面的重链和轻链在体外与固定化抗原进行筛选。经过几轮的吸附-洗杂-洗脱-扩增的淘选，最终富集出特异性与抗原相互作用的噬菌体。经过测序分析最终获得抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列。理论上，通过构建一个超大库容的噬菌体抗体文库，可获得任意抗原相互作用的抗体。

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子，并参与正常炎症反应和免疫反应。在许多病理状态下产生增多，包括败血症、恶性肿瘤、心脏衰竭和慢性炎性疾病。在重症类风湿关节炎患者的血液及关节中都可发现肿瘤坏死因子增多。临床结果证实TNF-α的拮抗剂可有效治疗TNF-α增高的一些疾病，如类风湿关节、银屑病等。抗体由于其高特异性和高稳定性，可作为拮抗剂应用。目前最典型的针对TNF-α的抗体拮抗剂阿达木单抗早已成功入市，应用于相关疾病治疗。

发明内容

本发明构建了天然兔源噬菌体抗体文库，并从中成功筛选到抗TNFα抗体。

更具体地，本发明公开了抗TNFα抗体，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No:2所示，重链可变区序列氨基酸序列为SEQ ID No:4所示。

更具体地，本发明中公开的抗TNFα抗体为单链抗体。

更具体地，本发明中公开的抗TNFα抗体是通过从天然兔源噬菌体文库筛选获得的，噬菌体展示技术可直接获得抗体的基因序列，快速实现抗体的改造和大规模重组表达，由此大大提高了效率。

本发明还公开了一种DNA序列，编码上述抗TNFα抗体的DNA序列，且编码抗TNF-α抗体轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID No:1所示；编码抗TNF-α抗体重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID No:3所示。

本发明还公开了一种载体，包含上述编码抗TNF-α抗体轻链可变区核苷酸序列及编码抗TNF-α抗体重链可变区的核苷酸序列。

本发明还公开了一种细胞系，该细胞系表达上述的抗TNF-α抗体，或包含上述DNA基因序列，或包含上述载体序列。

本发明还公开了一种基因工程菌，该基因工程菌表达上述抗TNF-α抗体，或包含上述DNA序列，或包含上述载体。

本发明还公开了一种多肽，该多肽包含上述抗TNF-α抗体氨基酸序列。

本发明还公开了一种融合蛋白，该融合蛋白包含了上述抗TNF-α抗体氨基酸序列。

本发明还公开了检测或治疗试剂盒，该试剂盒包括了上述TNF-α抗体，或上述DNA序列，或上述载体，或上述细胞系，或上述基因工程菌，或上述多肽，或上述融合蛋白。

同时，本发明还公开了抗TNFα抗体的制备方法：TNF-α重组蛋白表达；天然兔源噬菌体文库构建；抗TNF-α抗体单链抗体筛选与获得。

通过本发明方法获得的抗TNFα抗体，与抗原特异性结合效果最优，稳定性好，筛选效率高等优点。

附图说明

图1为TNF-α重组蛋白纯化电泳结果图；

图2为兔脾脏PCR扩增的抗体重、轻链可变区基因电泳结果图；

图3为天然兔源噬菌体文库经三轮筛选后的Elisa检测结果图；

图4为单链抗体表达电泳结果图；

图5为抗体与抗原特异性检测结果图。

具体实施方式

实施例一：TNF-α重组蛋白表达

(1)TNF-ɑ基因合成

将人TNF-ɑ(NP_000585.2)基因Val77-Leu233片段在通用生物系统(安徽)有限公司全基因合成，无缝连接在pET-24a(+)载体上。

(2)TNF-α重组蛋白表达

将pET-24a(+)-TNF-ɑ质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布在含有Kan抗性的LB平板上37℃培养12小时。挑取3-5个单菌落放入25ml LB(Kan)培养基中37℃振荡培养至OD600＝0.8左右转接到200ml LB(Kan+)培养基中，37℃继续振荡培养至OD600＝0.8-1.0，加入IPTG(终浓度为0.5mM)在18℃继续振荡培养16小时，5000g离心10分钟收集菌体。

(3)TNF-α重组蛋白纯化

将菌体在裂解缓冲液(50mM Tris-Hcl,pH8.0,500mM NaCl)中重悬，经超声破碎后裂解菌体，16000g离心30分钟分离上清沉淀。上清利用Ni柱亲和纯化，在50mM Tris-Hcl,pH8.0,500mM NaCl，500mM咪唑中洗脱下目的蛋白。将目的蛋白透析至PBS(1mM EDTA)中，浓缩至0.5mg/ml-80℃冻存。蛋白表达纯化电泳图见图1。

实施例二：天然兔源噬菌体文库构建

(1)总RNA提取

未经免疫的兔子采集新鲜脾脏(康大生物提供)，共40只。将脾脏加液氮在研钵中碾磨，直到形成很细的粉末状，取适量加入Trizol(康为世纪公司)2.5ml中，迅速充分混匀，用匀浆机打碎几次。室温静置5min后，每个样品取1ml依次分别加入到2个1.5mlEP管中。加200μL氯仿(国药公司)到1.5mlEP管中,盖紧样品管盖。用手用力摇晃试管1min，后静置5min。每管取上清约350μL，两管上清并为一管，得到大约700μL上清。加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置20-30min。样品11000rpm，4℃离心10min，弃上清。加入700μL 75％乙醇，洗涤沉淀二次。4℃，7000rpm离心5min，弃上清。室温晾干，加入80μL DEPC水完全溶解，得到脾脏总RNA。

(2)RNA反转录

总RNA使用微量分光光度计定量后，按照反转录酶试剂盒操作说明(义翘神州公司)，以50μL反转录体系进行反转录。

(3)抗体重轻链可变区PCR

抗体重轻链可变区PCR引物来源于文献Thi Thu Ha Nguyen等(Construction ofRabbit Immune Antibody Librarie)抗体重轻链可变区通过如下PCR反应获得相应的基因片段：94℃预变性2min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，72℃充分延申5min，30个循环。抗体重链和轻链重叠PCR(overlaping)条件为：94℃预变性5min，98℃15s，58℃30s，72℃1min，共5个循环；之后98℃15s，68℃1min，72℃5min，共5个循环。抗体重轻链可变区PCR电泳结果见图2。

(4)噬菌粒载体构建

将PCR获得的抗体重轻链拼接片段和pCom3x表达载体使用sfiI分别酶切消化后，按照T4连接酶使用说明书(义翘神州公司)进行过夜连接。

(5)载体电转化

将感受态菌XL1-blue取出于4℃化冻，同时将电击杯放入4℃预冷10分钟。将电转仪电压调为1800V/mm,将混有感受态的质粒加入到电转杯中，冰浴半分钟，之后电击5ms，迅速加入2YT培养基，然后取出电击感受态细胞。如此重复多次后将感受态合并收集，置于37℃，250rpm培养复苏1小时。取100uL菌液，稀释铺板，计算库容。

(6)天然文库扩增

复苏后的菌液加入含氨苄、四环素和2％葡萄糖的2YT培养基，继续培养1小时。之后加入辅助噬菌体，37℃静置共孵育后，37℃，250rpm培养复苏1.5小时。随后，离心去除上清，加入含氨苄、四环素和卡那抗生素的2YT培养基，30℃，250rpm过夜培养扩增。

(7)文库浓缩

收集过夜培养上清，加入4％PEG8000(生工生物公司)和3％Nacl，混匀后冰浴1小时，之后4℃，13000g离心40分钟，去除上清，加入浓缩前总体积5％的PBS无菌缓冲液进行溶解。最后再加入终体积7％的DMSO混匀，于-80℃冻存。

实施例三：抗TNF-α抗体单链抗体筛选与获得

(1)抗原包被

将TNF-α表达蛋白用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释至10μg/mL，按照每孔100μL加入可拆卸96#酶标版中(生工生物)，共包被4*8孔，于4℃过夜放置，次日取出，扣干孔内液体，加入PBST洗液洗两遍扣干，随后加入2％BSA溶液进行室温封闭1小时，用PBST洗液再次洗两次，扣干。

(2)文库筛选

取1mL浓缩文库，加入3％脱脂奶粉混匀，37℃静置孵育30分钟。向1*8孔包被了TNF-α蛋白的酶标板中每孔加入100uL孵育后文库，37℃，60rpm孵育1.5小时。扣干文库溶液，每孔加入330μL PBST洗液，静置1分钟后，扣干；接着继续加入330μL PBST洗液，静置1分钟后，扣干，如此重复6次。最后一次将PBST洗液扣干后，每孔加入100μL洗脱液(0.1M甘氨酸，pH2.2)，37℃静置孵育10分钟，吸出洗脱液，加入2M-tris(pH8.0)中和至pH中性。

(3)筛选文库扩增

中和后的洗脱液与XL1-blue菌液(OD约1.0)混匀，37℃感染30分钟，随后37℃250rpm培养1小时，37℃静置共孵育后，37℃，250rpm培养复苏1.5小时。随后，离心去除上清，加入加入含氨苄、四环素和卡那抗生素的2YT培养基，30℃，250rpm过夜培养扩增。次日收集过夜培养上清，加入4％PEG8000(生工生物公司)和3％Nacl，混匀后冰浴1小时，之后4℃，13000g离心40分钟，去除上清，加入浓缩前总体积5％的PBS无菌缓冲液进行溶解。最后再加入终体积7％的DMSO混匀，于-80℃冻存。至此完成一轮文库筛选和扩增，再次重复文库筛选和筛选文库过程两次，获得经过三轮筛选扩增的文库。

(4)文库检测

将第三轮扩增文库分别稀释1倍、10倍、100倍、1000倍，100μL每孔加入包被的TNF-α酶标板中和2％BSA封闭的空白板中，室温孵育1小时后，PBST洗液洗两遍扣干。加入anti-M13HRP标记二抗(leading biology)，室温孵育40分钟，PBST洗液洗三遍扣干。加入TMB显色液，室温显色20分钟后，加入2M硫酸终止显色，酶标仪OD450nm读取吸光值，结果见图3。

(5)单克隆菌液表达

第三轮检测阳性文库适当稀释后，侵染XL1-blue大肠杆菌并进行涂板。次日从平皿板中挑取单克隆菌落进行培养。培养的菌液留存一份作为测序备份，剩下的菌液通过辅助噬菌体的孵育，加入含氨苄、四环素和卡那抗生素的2YT培养基，30℃，250rpm过夜培养扩增。

(6)单克隆菌液表达样品检测

96#酶标板50ng每孔包被TNF-ɑ，共1块板，对照为2％BSA封闭的空白板。进行封闭、洗板拍干后，加入10倍稀释的表达样品，室温孵育1小时后，PBST洗液洗两遍扣干。加入anti-M13HRP标记二抗，室温孵育40分钟，PBST洗液洗三遍扣干。加入TMB显色液，室温显色20分钟后，加入2M硫酸终止显色，酶标仪OD450nm读取吸光值。最终检测结果显示D03和F08位置单克隆样品为阳性。将D03和F08进行测序，测序结果显示两个单克隆序列相同。

(7)单链抗体表达

选择D03菌液作为模板，PCR扩增scFv片段。将scFv片段与C-his表达载体无缝连接，转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，37℃继续振荡培养至OD600＝0.8-1.0，加入IPTG(终浓度为0.5mM)在18℃继续振荡培养16小时，5000g离心10分钟收集菌体。将菌体在裂解缓冲液(50mM Tris-Hcl,pH8.0,500mM NaCl)中重悬，经超声破碎后裂解菌体，16000g离心30分钟分离上清沉淀。上清利用Ni柱亲和纯化，在50mM Tris-Hcl,pH8.0,500mM NaCl，500mM咪唑中洗脱下目的蛋白。将目的蛋白透析至PBS(1mM EDTA)中，-80℃冻存。电泳结果见附图4。

(8)抗体生物素标记

按照生物素标记试剂盒(thermo)说明书操作步骤，以抗体与生物素摩尔比1：10的标记浓度进行单链抗体标记。

(9)抗体与抗原特异性检测

分别5μg/mL、0.5μg/mL、0.05μg/mL包被TNF-α蛋白，同时以相同浓度包被C端带有his标签的FGL1蛋白(leading biology)作为对照。进行封闭、洗板拍干后，加入5μg/mL倍稀释的表达样品，室温孵育1小时后，PBST洗液洗两遍扣干。加入avidin HRP标记二抗(leading biology)，室温孵育40分钟，PBST洗液洗三遍扣干。加入TMB显色液，室温显色20分钟后，加入2M硫酸终止显色，酶标仪OD450nm读取吸光值。结果显示，单链抗体与TNF-α特异性结合，与FGL1蛋白。排除了非特异结合和his标签结合的可能。同时，单链抗体在0.05μg/mL低包被浓度下，依然能够检测到显示信号。检测结果见图5。

由此，所获得的抗TNF-α抗体能与抗原特异性结合，效果最优。该包括抗TNF-α抗体包含轻链可变区和重链可变区，其轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID No:1所示，重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID No:3所示，相应地轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No:2所示，重链可变区序列氨基酸序列为SEQ ID No:4所示。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于发明的保护范围。

序列表

<110> 艾柏森（江苏）生物科技有限公司

<120> 一种抗TNF-α抗体

<130> 2019

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 324

<212> DNA

<213> 轻链可变区核苷酸序列()

<400> 1

gagctcgatc tgacccagac tccagcctcc gtgtctgcag ctttgggagg cacagtcacc 60

atcaattgcc aggccagtga agacattaac aactacttat cctggtatca gcagaaacca 120

gggcagcctc ccaagctcct gctctatggt gcatccaatc tggaatctgg ggtcccatcg 180

cggttcaaag gcagtagata tgggacagag ttcactctca ccatcagtgg cgtgcagcgt 240

gaggatgctg ccacctacta ctgtctaggc agttatagtc ctactgatgc tgctttcggc 300

ggaggaacca agctggagat caaa 324

<210> 2

<211> 108

<212> PRT

<213> 轻链可变区氨基酸序列()

<400> 2

Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Leu Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Leu

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly

50 55 60

Ser Arg Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Arg

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Ser Pro Thr Asp

85 90 95

Ala Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 366

<212> DNA

<213> 重链可变区核苷酸序列()

<400> 3

cagcagcagc tgatggagtc cgggggagac ctggtcaagc ctgagggatc cctgacactc 60

acctgcacag cctctggatt ctccttcagt ggctattatt acgtgtgctg ggtccgccag 120

gctccaggga gggggctgga gtgggtcgca tgtattgatg ctggtagtgg tggtagccct 180

tactacgcga gctgggcgaa aggccgattc accatctcca aaacctcgtc gaccacggtg 240

actctgcaaa tgaccagtct gacagccgcg gacacggcca cctatttctg tgcgagagat 300

gatgttggtt ggtataattc aaactttgac ttgtggggcc caggcaccct ggtcactgtc 360

tcttca 366

<210> 4

<211> 122

<212> PRT

<213> 重链可变区氨基酸序列()

<400> 4

Gln Gln Gln Leu Met Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Glu Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Tyr Val Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Val Ala Cys Ile Asp Ala Gly Ser Gly Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Ser

50 55 60

Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val

65 70 75 80

Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe

85 90 95

Cys Ala Arg Asp Asp Val Gly Trp Tyr Asn Ser Asn Phe Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

Claims (9)

1.一种抗TNF-α抗体，其特征在于，所述TNF-α单链抗体包括轻链可变区和重链可变区，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No:2所示，重链可变区序列氨基酸序列为SEQ ID No:4所示。

2.根据权利要求1所述的抗TNF-α抗体，其特征在于，所述抗TNF-α抗体为单链抗体。

3.根据权利要求1所述的抗TNF-α抗体，其特征在于，所述抗TNF-α抗体是从天然兔源噬菌体文库筛选获得的。

4.一种DNA序列，其特征在于编码权利要求1所述的抗TNF-α抗体的DNA序列，包括编码轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No:2的轻链可变区的核苷酸序列，编码重链可变区序列氨基酸序列为SEQ ID No:4重链可变区的核苷酸序列；优选地所述抗TNF-α抗体轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID No:1所示，重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID No:3所示。

5.一种载体，其特征在于含权利要求4所述的DNA序列。

6.一种细胞系，其特征在于，所述细胞系表达权利要求1所述的抗TNF-α抗体，或包含权利要求4所述的DNA序列，或包含权利要求5所述的载体。

7.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达权利要求1所述的抗TNF-α抗体，或包含权利要求4所述的DNA序列，或包含权利要求5所述的载体。

8.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含如权利要求1所述的抗TNF-α抗体氨基酸序列。

9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含由权利要求1所述的抗TNF-α抗体，或包含权利要求4所述的DNA序列，或包含权利要求5所述的载体，或权利要求6所述的细胞系，或权利要求7所述的基因工程菌，或权利要求8所述的融合蛋白。