CN110051652B - Plga/fk506载药纳米微球及其制备方法和应用 - Google Patents

Plga/fk506载药纳米微球及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种PLGA/FK506载药纳米微球及其制备方法和应用。本发明的载药纳米微球的制备方法如下：先将非离子型表面活性剂加入到去离子水中形成水相，将PLGA、FK506依次溶解于有机溶剂中形成油相，然后将油相逐滴缓慢加入到水相旋涡中心，经高速搅拌、超声处理后获得O/W型乳液；再将获得的O/W型乳液在室温条件下慢速搅拌使有机溶剂完全挥发，获得纳米微球悬浊液，最后离心、洗涤、干燥获得目标产物，产物粒径优选为100～200nm。本发明制得的PLGA/FK506载药纳米微球载药量达17.64％，包封率达77.08％，有利于提高载药微球的主动靶向性能，实现药物缓释和较强的抑制瘢痕细胞生长的作用。

Description

PLGA/FK506载药纳米微球及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种生物纳米材料在生物医药领域的应用，具体涉及一种具有主动靶向瘢痕抑制作用的PLGA/FK506载药纳米微球及其制备方法和应用。
背景技术
瘢痕的形成是目前创伤愈合的一大难题，发生在各类体外创伤、烧伤和手术后。瘢痕的产生是周围神经修复和创伤愈合中无法分离的重要过程，但目前普遍研究认为瘢痕的出现对周围神经修复过程有不利影响，会对神经轴突再生及再生轴突穿越神经吻合口的过程造成阻碍，不仅大大降低了神经再生的速度和质量，还会导致神经断端肿胀，纤维化发生，严重时更会引起疼痛及相关机能的丧失，进而会影响生活质量。因此如何抑制瘢痕细胞是一个急需迫切解决的问题。目前用以抑制瘢痕细胞没有一种较好的解决方法，用于治疗瘢痕的药物目前普遍具有各种毒副作用，影响人体其他正常机能而影响临床领域中的应用。
载药纳米微球是新世纪以来靶向治疗中的一大研究热门，有别于传统药物治疗体系，这是一种将药物分散或是包裹在材料中形成多孔或是微囊型微球的药物制剂，粒径大小从纳米到微米应有尽有，其中具有生物相容性和生物可降解性的材料的研究权重最高。由于使用生物相容材料对药物进行包裹，可以让一些在体内环境中不稳定或生物相容性较差的药物通过载药纳米微球制剂的靶向作用被输送到特定的组织或器官内，这可以让病灶保持有效药物浓度并将药物扩散范围控制在一定区域内，而不像传统医药为了达到所需的血药浓度而摄入大量药物，这大大避免高浓度的药物在其他正常组织内有可能诱发的毒副作用，并且减少给药量，降低治疗成本。此外通过载药微球的缓释作用可以长时间在保持目标区间有效药物浓度，达到持续性治疗的效果，是一种优秀的新兴给药体系。
聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)材料是一种安全可靠的生物可降解材料，由一定比例的单体乳酸(LA)和羟基乙酸(GA)随机共聚而成，并且集合了PLA的吸附特性和PGA的机械强度，可以制备不同需求的材料。由于自身具有水解性，PLGA材料制剂可以降解为人体内源性物质LA和GA，人体对其有一定的耐受力，因此PLGA具有较低的生物毒性，PLGA载药体系的反复给药不会造成降解产物在体内的积聚，会通过代谢过程排出体外，而这些物质的最终降解产物是CO2和H2O，因此认为PLGA材料体系具有良好的生物可降解性和相容性，被大量用于载药微球的制备过程，并且可以根据不同的LA/GA比获得不同的生物降解性能，是一种性能优异的药物递送载体。
但是目前许多纳米微球的降解性能与药物释放速率尚不能与神经修复的速度相匹配、制备载药纳米微球的较差的药物包封率不能达到疗效要求等问题，使靶向治疗技术仍难以在临床上得以推广。
基于上述理由，特提出本申请。
发明内容
针对现有技术存在的问题或缺陷，本发明的目的在于提供一种药物包封率高、载药量大，且具有主动靶向瘢痕抑制作用的PLGA/FK506载药纳米微球及其制备方法和应用。
为了实现本发明上述其中一个目的，本发明采用的技术方案如下：
一种PLGA/FK506载药纳米微球的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将适量非离子型表面活性剂加入到去离子水中，溶解均匀后形成浓度为10～15mg/mL的溶液，作为水相；
(2)按配比将聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、他克莫司(FK506)依次加入到有机溶剂中，溶解完全后形成均匀混合液，作为油相；
(3)在冰浴、搅拌条件下，将步骤(2)获得的油相逐滴加入到步骤(1)所述水相旋涡中心，滴加完毕后，得到分散液；然后将所得分散液进行高速剪切处理，形成初乳；再将所述初乳继续在冰浴条件下超声分散1～5min，获得O/W型乳液；
(4)撤掉冰浴，将步骤(3)获得的O/W型乳液在室温条件下恒温搅拌2～4h，获得纳米微球悬浊液，然后高速离心收集产物、再将产物洗涤多次后真空干燥，获得所述PLGA/FK506载药纳米微球。
进一步地，上述技术方案，步骤(1)所述非离子型表面活性剂可以为PluronicF127或Pluronic F108。
进一步地，上述技术方案，步骤(2)所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物与他克莫司的质量比为50～70：10～30。
进一步地，上述技术方案，步骤(2)所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物与有机溶剂的用量比为(50～70)质量份：(2～3)体积份，其中：所述质量份与体积份之间是以mg：mL作为基准。
进一步地，上述技术方案，步骤(2)所述有机溶剂可以为三氯甲烷、二氯甲烷、无水乙醇中的任一种或两种。
更进一步地，上述技术方案，步骤(2)所述有机溶剂优选为二氯甲烷或优选为由二氯甲烷与乙醇组成的混合有机溶剂，其中：所述二氯甲烷与乙醇的体积比更优选为1：1。
进一步地，上述技术方案，步骤(3)所述油相和水相的体积比为20～40：(1～5)。
进一步地，上述技术方案，步骤(3)所述油相的滴加速度为3～10s/滴，优选为6s/滴。
进一步地，上述技术方案，步骤(3)所述的高速剪切的转速为10000～15000r/min，时间为1～5min。
进一步地，上述技术方案，步骤(4)所述高速离心转速为10000～15000r/min，离心时间为15～25min。
本发明的第二个目的在于提供上述所述PLGA/FK506载药纳米微球的制备方法制备得到的PLGA/FK506载药纳米微球。
进一步地，上述技术方案，上述所述PLGA/FK506载药纳米微球的平均粒径优选为100～200nm。
本发明的第三个目的在于提供上述所述方法制备得到的PLGA/FK506载药纳米微球的应用，可用于制备抑制靶向瘢痕的药物。
本发明上述涉及的非离子型表面活性剂Pluronic F127或Pluronic F108可有效避免分散相的融合，并增大水相对有机相的承载能力，缩小水油比，有利于提高载药纳米微球的载药量及包封率。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明将高分子聚合物PLGA包覆FK506药物以后，纳米微球结构为球状，微球平均粒径尺寸可低至134.6nm，较小的尺寸可使载药微球能明显延缓药物的释放，具有良好的缓释效果。
(2)由于载药纳米微球体系的靶向治疗的可能性，本发明FK506可以通过局部部位的药物控释和缓释，降低其他区域的药物浓度，甚至使药物只存在于目标区域，进而减少其免疫抑制作用影响人体免疫系统在体内发挥正常作用的可能性，提升作为瘢痕抑制药物的正面作用。
(3)本发明制得的PLGA/FK506载药纳米微球载药量达17.64％，包封率达77.08％，有利于提高载药微球的主动靶向性能，实现药物缓释和较强的抑制瘢痕细胞生长的作用。
(4)本发明制备条件温和，工艺简单，易操作。
附图说明
图1是本发明PLGA/FK506载药纳米微球的制备工艺流程图。
图2中a、b分别为对比例1制备的不同批次的PLGA空白微球和实施例1制备的不同批次的PLGA/FK506载药纳米微球的曲线对比图。
图3中a和b分别为PLGA/FK506载药微球在不同倍率条件下的扫描电镜(SEM)图片；c和d为PLGA空白微球在不同倍率条件下的扫描电镜(SEM)图片。
图4为FK506药物的浓度与峰面积对应的标准曲线。
图5为本发明应用实施例1采用的瘢痕细胞的光学显微镜照片。
图6为本发明应用实施例1中MTT细胞实验测试结果图。
图7为本发明应用实施例2中MTT细胞实验测试结果图。
图8为本发明应用实施例3中MTT细胞实验测试结果图。
图9为本发明应用实施例4中MTT细胞实验测试结果图。
具体实施方式
下面结合实施案例和附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施案例。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
本发明将以FK506/PLGA载药纳米微球材料体系做为研究对象，观察分析PLGA载药纳米微球在抑制瘢痕生长中应用的可能。通过O/W单一乳化溶剂挥发技术制备PLGA载药纳米微球，通过DLS粒径分析研究粒径分布，SEM观察微球表面形貌等方式测定微球制备状况，测定载药微球的载药率和包封率并通过MTT细胞实验检测空白和载药微球的细胞毒性并通过对不同浓度微球的使用研究载药纳米微球和对瘢痕细胞抑制的关系。
实施例1
本实施例的一种PLGA/FK506载药纳米微球的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)采用电子天平精密称取125mg Pluronic F127加入到10mL的去离子水中，溶解均匀后形成浓度为12.5mg/mL的PF127水溶液，作为水相；
(2)采用电子天平依次精密称取60mg PLGA材料、20mg FK506药物，然后将称量好的PLGA、FK506依次加入到2mL三氯甲烷(有机溶剂)中，溶解完全后形成均匀混合液，作为油相；
(3)精确量取步骤(1)配制的30mL PF127水相于圆底烧瓶中，在冰水浴条件下以1000rpm的转速将步骤(2)所得油相以5s/滴的速度缓慢滴加至水相漩涡中心，滴加完毕后，得到分散液；然后将所得分散液以12500r/min的剪切速度进行高速剪切处理2min，形成初乳，再将所得初乳在冰水浴条件下超声2次，每次超声1min，使所述初乳分散成更小且均匀的乳化液滴，制成O/W型乳液；
(4)撤掉冰浴，将步骤(3)获得的O/W型乳液在室温条件下恒温磁力搅拌(400rpm，25℃)3h，使三氯甲烷溶剂挥发固化PLGA材料成球；然后通过高速离心(13800rpm，20℃)20分钟收集纳米微球，并用去离子水离心洗涤2次；最后使用真空干燥机冷冻干燥12h，得到PLGA/FK506载药纳米微球，置于干燥器用封口胶密封保存，备用。
本发明上述实施例1步骤(4)在冷冻干燥前先称取干燥的1.5mL EP管质量并记为M1，真空干燥后再称取带有干燥微球的EP管质量为M2，所制得纳米微球质量即可通过M＝M2-M1计算得出。产率计算公式如下：
Figure GDA0002906412830000051
经计算，本实施例制备的PLGA/FK506载药纳米微球的产物质量为3.0mg，因此可以计算得出PLGA/FK506载药纳米微球的产率约为3.75％。
实施例2
本实施例的一种PLGA/FK506载药纳米微球的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)采用电子天平精密称取100mg Pluronic F108加入到10mL的去离子水中，溶解均匀后形成浓度为10mg/mL的PF108水溶液，作为水相；
(2)采用电子天平依次精密称取55mg PLGA材料、30mg FK506药物，然后将称量好的PLGA、FK506依次加入到由2.5mL二氯甲烷有机溶剂中，溶解完全后形成均匀混合液，作为油相；
(3)精确量取步骤(1)配制的30mL PF108水相于圆底烧瓶中，在冰水浴条件下以1500rpm的转速将步骤(2)所得油相以6s/滴的速度缓慢滴加至水相漩涡中心，滴加完毕后，得到分散液；然后将所得分散液以15000r/min的剪切速度进行高速剪切处理4min，形成初乳，再将所得初乳在冰水浴条件下超声3次，每次超声1min，使所述初乳分散成更小且均匀的乳化液滴，制成O/W型乳液；
(4)撤掉冰浴，将步骤(3)获得的O/W型乳液在室温条件下恒温磁力搅拌(600rpm，25℃)2.5h，使有机溶剂挥发固化PLGA材料成球；然后通过高速离心(13000rpm，20℃)25分钟收集纳米微球，并用去离子水离心洗涤1次；最后使用真空干燥机冷冻干燥12h，得到PLGA/FK506载药纳米微球，置于干燥器用封口胶密封保存，备用。
实施例3
本实施例的一种PLGA/FK506载药纳米微球的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)采用电子天平精密称取150mg Pluronic F108加入到10mL的去离子水中，溶解均匀后形成浓度为15mg/mL的PF127水溶液，作为水相；
(2)采用电子天平依次精密称取50mg PLGA材料、10mg FK506药物，然后将称量好的PLGA、FK506依次加入到由1.25mL二氯甲烷和1.25mL无水乙醇组成的混合有机溶剂中，溶解完全后形成均匀混合液，作为油相；
(3)精确量取步骤(1)配制的30mL PF108水相于圆底烧瓶中，在冰水浴条件下以800rpm的转速将步骤(2)所得油相以5s/滴的速度缓慢滴加至水相漩涡中心，滴加完毕后，得到分散液；然后将所得分散液以13500r/min的剪切速度进行高速剪切处理3min，形成初乳，再将所得初乳在冰水浴条件下超声5次，每次超声1min，使所述初乳分散成更小且均匀的乳化液滴，制成O/W型乳液；
(4)撤掉冰浴，将步骤(3)获得的O/W型乳液在室温条件下恒温磁力搅拌(1000rpm，25℃)2h，使二氯甲烷溶剂挥发固化PLGA材料成球；然后通过高速离心(15000rpm，20℃)25分钟收集纳米微球，并用去离子水离心洗涤1次；最后使用真空干燥机冷冻干燥12h，得到PLGA/FK506载药纳米微球，置于干燥器用封口胶密封保存，备用。
实施例4
本实施例的一种PLGA/FK506载药纳米微球的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)采用电子天平精密称取120mg Pluronic F127加入到10mL的去离子水中，溶解均匀后形成浓度为120mg/mL的PF127水溶液，作为水相；
(2)采用电子天平依次精密称取70mg PLGA材料、30mg FK506药物，然后将称量好的PLGA、FK506依次加入到由2mL二氯甲烷和0.5mL无水乙醇组成的混合有机溶剂中，溶解完全后形成均匀混合液，作为油相；
(3)精确量取步骤(1)配制的30mL PF127水相于圆底烧瓶中，在冰水浴条件下以1500rpm的转速将步骤(2)所得油相以6s/滴的速度缓慢滴加至水相漩涡中心，滴加完毕后，得到分散液；然后将所得分散液以15000r/min的剪切速度进行高速剪切处理4min，形成初乳，再将所得初乳在冰水浴条件下超声3次，每次超声30s，使所述初乳分散成更小且均匀的乳化液滴，制成O/W型乳液；
(4)撤掉冰浴，将步骤(3)获得的O/W型乳液在室温条件下恒温磁力搅拌(500rpm，25℃)2.5h，使有机溶剂挥发固化PLGA材料成球；然后通过高速离心(13000rpm，20℃)25分钟收集纳米微球，并用去离子水离心洗涤1次；最后使用真空干燥机冷冻干燥12h，得到PLGA/FK506载药纳米微球，置于干燥器用封口胶密封保存，备用。
对比例1
本实对比例的一种PLGA空白微球的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)采用电子天平精密称取125mg Pluronic F127加入到10mL的去离子水中，溶解均匀后形成浓度为12.5mg/mL的PF127水溶液，作为水相；
(2)采用电子天平精密称取60mg PLGA材料加入到2mL二氯甲烷(有机溶剂)中，溶解完全后形成均匀混合液，作为油相；
(3)精确量取步骤(1)配制的30mL PF127水相于圆底烧瓶中，在冰水浴条件下以1000rpm的转速将步骤(2)所得油相以5s/滴的速度缓慢滴加至水相中，滴加完毕后，得到分散液；然后将所得分散液以12500r/min的剪切速度进行高速剪切处理3min，形成初乳，再将所得初乳在冰水浴条件下超声2次，每次超声1min，使所述初乳分散成更小且均匀的乳化液滴，制成O/W型乳液；
(4)撤掉冰浴，将步骤(3)获得的O/W型乳液在室温条件下恒温磁力搅拌(400rpm，25℃)3h，使二氯甲烷溶剂挥发固化PLGA材料成球；然后通过高速离心(13800rpm，20℃)20分钟收集纳米微球，并用去离子水离心洗涤2次；最后使用真空干燥机冷冻干燥12h，得到PLGA/FK506载药纳米微球，置于干燥器用封口胶密封保存，备用。
发明人将本实施例1获得的PLGA/FK506载药纳米微球和对比例1获得的空白微球进行了DLS粒径测试、扫描电镜(SEM)测试、载药率和包封率等一系列测试。测试结果如下。
(一)DLS粒径测试方法和测试结果具体如下：将实施例1制备的PLGA/FK506载药纳米微球和对比例1制备的PLGA空白微球分别称取一定量，然后通过超声分散，在5mL去离子水中形成均匀悬浮液，再从分散液中吸取1滴于干净的10mL离心试管并加5mL去离子水，再次超声分散。最后用分散液洗涤石英比色皿后加入大概1/3比色皿的分散液，放入DLS测试仪中，在电脑上设置并确定参数无误后即可进行测试，每个样进行3次测试，并将3次测试结果进行统计，计算平均值。其中，图2中a、b分别为对比例1制备的不同批次的PLGA空白微球和实施例1制备的不同批次的PLGA/FK506载药纳米微球的曲线对比图。由图2的DLS测试数据可以看出，PLGA空白微球和PLGA/FK506载药纳米微球的粒径分布集中，且粒径测试峰值均分布在300～400nm之间。通过DLS测试结果发现纳米微球的平均粒径大于测得的粒径尺寸，但在测试结果中除了图上峰值处并没有其他相应强度，可能是测试前分散不够彻底，有少量团聚现象影响实验结果。
采用上述相同的DLS测试方法测得，本发明上述实施例2、实施例3制备的PLGA/FK506载药纳米微球尺寸均匀，微球的平均粒径均分布在100～200nm之间。可以发现，乳液中有机相挥发时搅拌速度对微球尺寸有较大影响，搅拌速度越慢则成球粒径越小且越均匀，另外，较小的PLGA浓度更容易形成尺寸较小的微球，这与现有技术中的相关描述基本一致(参见邵文尧,何彩云,冯艳玲,等.乳化-溶剂挥发法制备聚乳酸载药微球[J].功能材料,2015(3):3121-3126.)
(二)SEM测试方法和测试结果具体如下：
取少量对比例1冷冻干燥后的PLGA空白纳米微球和实施例1制备的PLGA/FK506载药纳米微球分别附着在导电胶上制样并标记，其中一号样为载药纳米微球，二号样为空白微球。通过30s镀金增强材料导电性便于在SEM中获得更好的形貌特征，随后放入SEM观察室中观察。在低放大倍率时找到样品后，即可放大倍数挑选合适的区域进行观察和拍照。最终结果如图3所示。图3中a和b分别为PLGA/FK506载药微球在不同倍率条件下的扫描电镜(SEM)图片；c和d为PLGA空白微球在不同倍率条件下的扫描电镜(SEM)图片。
通过对SEM测试结果的观察与分析可以发现，PLGA微球成球效果不佳，且尺寸分布并非和DLS粒径测试的一样均匀，这解释了DLS测试中平均尺寸大于测得粒径的原因。从SEM照片可以发现，虽然PLGA空白微球的主要尺寸分布集中在纳米尺度，也有少部分微球为微米尺寸，但由于微米球比例较小，因此在DLS粒径分析时没有相应的数值，至通过平均分子量偏大的形式体现。通过在高倍数下的图像，可以发现很多纳米尺寸的材料并未完全成球，形状大致为球但有塌陷导致表面不平整的纳米颗粒，这可能是因为在制备过程中材料的损失，使得PLGA浓度小于预先设计的30mg/mL，使得溶剂挥发过程中PLGA塌陷无法良好成球，并且形成纳米液滴的有机相二氯甲烷挥发速度过快，在PLGA尚未完全成球时挥发完全，未能及时固化成球。PLGA/FK506载药纳米微球成球优异，表面形貌特征良好，可以发现微球表面光滑并为完整球形。可能是由于形成大球的乳液滴由于所含有机相较多，有较多时间挥发并溶解其中的PLGA质量较大，因此可以成球良好。
(三)PLGA/FK506载药纳米微球的载药率和包封率测试
测试方法如下：取一定量干燥后的PLGA并向其加入甲醇溶液，制成1mg/mL的溶液，待溶解一段时间后高速离心分离未溶解材料，取上清液用于测试。打开紫外分光光度仪，调整参数并用装有一定量甲醇的石英比色皿对仪器校准以消除误差，随后将上清液加入石英比色皿后放入紫外分光光度仪测试277nm下的吸光度。将测得的吸光度与事先测得的FK506药物标准曲线(如图4所示)比对，通过分析即可获得上清液的药物浓度，可以通过计算获得载药率和包封率。
各实施例制备的PLGA/FK506载药纳米微球的载药率和包封率的计算结果如表1所示。
表1实施例1-4制备的PLGA/FK506载药纳米微球平均粒径、载药率和包封率结果表。
Figure GDA0002906412830000101
应用实施例1
将本发明实施例1制备的PLGA/FK506载药纳米微球应用于瘢痕细胞培养。通过对比不同条件下的瘢痕细胞(瘢痕细胞的光学显微镜照片如图5所示)在一定时间段内的增殖状况，可以判断细胞生长的趋势，以此为依据即可获得材料对细胞的影响，进而判断PLGA载药微球材料体系对瘢痕细胞是否有抑制作用。
分别取一定量的干燥的载药和空白PLGA纳米球，置于紫外照射下进行灭菌处理，加入一定量的无菌PBS溶液制成悬浮液后通过超声分散制成不同浓度的微球悬浮液。取3块96孔板并依次设置为1、3、5天三个不同的时间点作为实验组，每个时间点各设置5组空白对照，载药和空白微球分别设置3种不同浓度作为组内对照，以研究不同质量微球对瘢痕细胞生长的影响，每种浓度4个平行，以此为分组标记后以2000个/孔的数量往各孔中加入100uL带细胞的全培养液，放入恒温细胞培养箱过夜使细胞贴壁生长。第二天，用细胞显微镜确认细胞贴壁生长后用移液枪从各孔中吸出10uL培养液，空白对照中加入10uL无菌PBS溶液，其他实验组各加入10uL对应的不同浓度的微球悬浮液，使最终微球浓度分别达到4ug/100uL、20ug/100uL、100ug/100uL，记录当前时间点为开始时间。随后将96孔板放入37℃、CO2恒温细胞培养箱中培养。随后在固定的时间点取出对应的细胞培养板，按1/10的比例往其中加入一定量MTT后，再放回CO2细胞培养箱中放置4小时以便充分反应，随后取出细胞培养板，吸走全部培养液，再向各孔中加入150uL二甲基亚砜(DMSO)，放于摇床上晃荡至甲瓒完全溶解于溶剂并呈均匀紫色液体后放于酶标仪内进行测试，在电脑上选择待测孔的区域和550nm的吸收波长后即可开始测试各孔吸光值，以excel输出形式保存测试结果以便后续对比分析，完成测试的细胞培养板废弃处理。最后将数据整理为图标用以分析两种材料对瘢痕细胞的作用。细胞实验的相关操作需要在细胞室内无菌操作，并时刻注意消毒灭菌，以防染菌对实验结果造成不必要的影响。结果如图6所示。
从图6可看出，通过对培养一段时间后细胞数量变化趋势的分析可以得知，载药纳米微球与空白微球相比，具有抑制瘢痕细胞生长的作用，但是抑制作用和空白微球相比不明显。这可能是载药率较低的原因。同时可以从柱状图中得出，随着载药微球的浓度越高，对细胞生长的抑制作用越明显。
应用实施例2
将本发明实施例2制备的PLGA/FK506载药纳米微球应用于瘢痕细胞培养，并采用MTT测试手段分析该材料对瘢痕细胞的抑制作用，测试结果如图7所示。
应用实施例3
将本发明实施例3制备的PLGA/FK506载药纳米微球应用于瘢痕细胞培养，并采用MTT测试手段分析该材料对瘢痕细胞的抑制作用，测试结果如图8所示。
应用实施例4
将本发明实施例4制备的PLGA/FK506载药纳米微球应用于瘢痕细胞培养，并采用MTT测试手段分析该材料对瘢痕细胞的抑制作用，测试结果如图9所示。
由图7-9可知，本发明实施例2-4制备的PLGA/FK506载药纳米微球对瘢痕细胞的抑制作用优于实施例1。
综上所述，通过对培养一段时间后MTT实验数据分析得知，空白微球和载药微球对瘢痕细胞的影响均有一定抑制作用，但随着载药率的提高和时间的增加，载药纳米微球与空白微球相比，具有显著抑制瘢痕细胞生长的作用。

Claims (5)

1.一种具有瘢痕抑制作用的PLGA/FK506载药纳米微球的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)将适量非离子型表面活性剂加入到去离子水中，溶解均匀后形成浓度为10～15mg/mL的溶液，作为水相；
(2)按配比将聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA、他克莫司FK506依次加入到有机溶剂中，溶解完全后形成均匀混合液，作为油相；所述有机溶剂为二氯甲烷、或二氯甲烷与无水乙醇组成的混合有机溶剂；
(3)在冰浴、搅拌条件下，将步骤(2)获得的油相逐滴加入到步骤(1)所述水相旋涡中心，滴加完毕后，得到分散液；然后将所得分散液进行高速剪切处理，形成初乳；再将所述初乳继续在冰浴条件下超声分散1～5min，获得O/W型乳液；所述油相的滴加速度为5～6s/滴，所述的高速剪切的转速为13500～15000r/min，剪切处理时间为3～4min；
(4)撤掉冰浴，将步骤(3)获得的O/W型乳液在室温条件下恒温搅拌2～4h，获得纳米微球悬浊液，然后高速离心收集产物、再将产物洗涤多次后真空干燥，获得所述PLGA/FK506载药纳米微球；
其中：
步骤(1)所述非离子型表面活性剂为Pluronic F127或Pluronic F108；
步骤(2)所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物、他克莫司与有机溶剂的用量比为(50～70)质量份：(10～30)质量份：(2～3)体积份，其中：所述质量份与体积份之间是以mg：mL作为基准。
2.根据权利要求1所述的具有瘢痕抑制作用的PLGA/FK506载药纳米微球的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述水相和油相的体积比为20～40：(1～5)。
3.根据权利要求1或2所述的具有瘢痕抑制作用的PLGA/FK506载药纳米微球的制备方法制备得到的PLGA/FK506载药纳米微球。
4.根据权利要求3所述的具有瘢痕抑制作用的PLGA/FK506载药纳米微球，其特征在于：所述PLGA/FK506载药纳米微球的平均粒径为100～200nm。
5.权利要求1～2任一项所述方法制备的具有瘢痕抑制作用的PLGA/FK506载药纳米微球或权利要求3～4任一项所述的具有瘢痕抑制作用的PLGA/FK506载药纳米微球在制备抑制瘢痕药物中的应用。
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