CN110050698B - 一种通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，通过获取无菌种胚、胚性愈伤组织诱导、不定根的生长和鬼臼毒素的诱导生产等步骤，建立了一套耦合细胞工程和发酵工程的手段生产鬼臼毒素的方法。本方法操作简单，产量高，且愈伤组织不继代褐化程度低；通过桃儿七内生菌粉红粘帚霉fhnzm发酵液及一些植物生长调节剂处理不定根，有效提高了鬼臼毒素含量。

Description

一种通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法

技术领域

本发明涉及农业和工业生物技术领域，具体的是一种通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法。

背景技术

桃儿七(Sinopodophyllum hexandrum Royle)是小檗科桃儿七属草本植物，国家三级保护植物，主要分布在我国西部2800米以上的林缘及灌丛中。由于自然资源的匮乏和濒危，被收录入《中华珍稀濒危植物名录》和《中国植物红皮书》。

桃儿七在民间主要用于痛疖肿毒、风湿性骨痛、气管炎等症，现代药学研究表明，其根及根茎中主要含有木脂素类、黄酮类、皂苷、多糖等成分，其中木脂素类的鬼臼毒素含量最高。鬼臼毒素具有广泛的药学活性，如0.5％鬼臼毒素酊在治疗尖锐湿疣方面具有起效快、治愈率高、安全性好等特点，1990年世界卫生组织推荐其为一线药物，1994年我国《国家基本药物》皮肤类抗病毒唯一入选药物。鬼臼毒素还是合成抗癌药物GP7、VP-16、VM-26、NK611 等及抗艾滋病药物的前体物质。

关于鬼臼毒素的来源主要是通过採挖野生桃儿七，从其根和根茎中提取，近年来，随着野生资源的锐减及封山育林等生态保护政策的实施，野生资源已经很难采挖。桃儿七人工驯化栽培已有很多报道，但栽培周期长、产量低、药材收购价格低，农民没有种植的积极性。通过桃儿七组培苗胚根及愈伤组织生产鬼臼毒素有零星报道，但桃儿七生根困难、胚根数量少、产量低、而且此法对桃儿七种子的消耗量很大；愈伤组织培养虽然可以通过愈伤的继代增加产量，但是愈伤组织生长缓慢、继代后容易褐化、最多继代2次，限制了此法的有效应用。通过桃儿七内生菌生产鬼臼毒素已有报道，但是内生菌发酵生产鬼臼毒素含量低、菌种稳定性差、随着菌种的传代生产鬼臼毒素的能力丧失。

发明内容

本发明的目的是针对以上技术问题，提供一种通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法。

本发明提供的一种通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，是一种耦合细胞工程和发酵工程高效生产鬼臼毒素的方法，具体包括以下步骤：

(1)获取无菌种胚

将新鲜采集的桃儿七种子，除去虫蛀和霉烂种子，清洗干净后水选，用少许浓硫酸表面消毒、腐蚀种皮，0.5％的碳酸钠室温浸泡20小时除去油质、蜡质等疏水成分，80mg/L的赤霉素(GA4+7)4℃浸泡28小时，0.2％的升汞表面消毒6分钟。用无菌水反复冲洗，用灭过菌的滤纸吸干种子表面水分，将种子切开，取带胚的半粒种子待用。

作为优选，用灭过菌的尖嘴钳将种胚从种脐部的萌发孔中挤出待用。

(2)胚性愈伤组织诱导

将上述种胚接种于愈伤组织诱导培养基，在黑暗条件下，培养温度23℃，培养40天左右，至明显看到带有不定根根原基的胚性愈伤组织，获得外植体。

胚性愈伤组织诱导培养基配方1如下:MS基本培养液、蔗糖50g/L、酸水解酪蛋白1g/L、琼脂5g/L、生物素0.2mg/L、吲哚乙酸(IAA)2-4mg/L、玉米素(ZT)2-4mg/L、油菜素内酯(BR)0.01-0.05mg/L、毒莠啶(PIC)2mg/L

作为优选，吲哚乙酸(IAA)浓度为3mg/L，玉米素(ZT)浓度为3mg/L，油菜素内酯(BR)浓度为0.03mg/L。

胚性愈伤组织诱导培养基配方2如下:MS基本培养液、蔗糖50g/L、酸水解酪蛋白1g/L、琼脂5g/L、生物素0.2mg/L、吲哚乙酸(IAA)2-4mg/L、玉米素(ZT)2-4mg/L、油菜素内酯(BR)0.01-0.05mg/L、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)2mg/L。

作为优选，吲哚乙酸(IAA)浓度为3mg/L，玉米素(ZT)浓度为3mg/L，油菜素内酯(BR)浓度为0.03mg/L。

胚性愈伤组织诱导培养基配方3如下:MS基本培养液、蔗糖50g/L、酸水解酪蛋白1g/L、琼脂5g/L、生物素0.2mg/L、吲哚乙酸(IAA)2-4mg/L、玉米素(ZT)2-4mg/L、油菜素内酯(BR)0.01-0.05mg/L、独脚金内酯(GR24)0.2-0.8mg/L。

作为优选，吲哚乙酸(IAA)浓度为3mg/L，玉米素(ZT)浓度为3mg/L，油菜素内酯(BR)浓度为0.03mg/L，独脚金内酯(GR24)0.5mg/L。

(3)不定根的生长

将上述外植体转接入不定根生长培养基，在黑暗条件下，温度20℃，培养40天。不定根长度5+1cm。

不定根生长培养基配方如下:1/2MS基本培养液、蔗糖20g/L、琼脂5g/L、萘乙酸(NAA)浓度为0.2mg/L、吲哚乙酸(IAA)浓度为0.2mg/L。

(4)鬼臼毒素的诱导生产

上述不定根接入鬼臼毒素诱导培养基，在黑暗条件下，温度20℃，培养7天，收集不定根，洗净烘干后，用体积比1:1的甲醇/氯仿混合液超声提取1h,(功率250，频率70Khz),过滤，挥干，甲醇定容，即为鬼臼毒素提取液。

鬼臼毒素诱导培养基配方1如下:1/2MS基本培养液、蔗糖20g/L、粉红粘帚菌发酵液接种量为体积比20％。

作为优选，所述粉红粘帚霉为fhnzm(Clonostachys rosea)，保藏号为CGMCCNo.17070，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

粉红粘帚霉发酵液的制备方法：将粉红粘帚霉接入PDA培养基，30℃，160r/min振荡培养，培养9d后取样，培养物经虑纸过滤，滤液3 000r/min离心15min，上清液经0.22 μm滤膜过滤，收集滤液-20℃保存备用。

PDA培养基配方如下：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1 000m L，121℃灭菌25min。

鬼臼毒素诱导培养基配方2如下:1/2MS基本培养液、蔗糖20g/L、茉莉酸甲酯(MEJA)的浓度为3mg/L。

鬼臼毒素诱导培养基配方3如下:1/2MS基本培养液、蔗糖20g/L、冠菌素(COR) 的浓度为0.01-0.1mg/L。

作为优选，冠菌素(COR)的浓度为0.05mg/L。

本发明的有益效果是：将桃儿七胚从萌发孔中挤出，降低了胚的损伤，降低了褐化率，提高了愈伤诱导的效率，通过愈伤诱导培养基培养后，70-95％的外植体可以培养出胚性愈伤组织，因愈伤组织的分割继代常会造成生长缓慢和严重的褐化，本技术直接诱导胚性愈伤组织向不定根方向发育，避免了愈伤组织的褐化。不定根数量多、产量大、可进行水培生产，能够解决产量的问题，不定根的生长培养促进了不定根的伸长和生物量的增加，此步骤可以有效的放大为工厂化水培培养，有效的降低了成本，较愈伤组织培养无法有效放大，只能在无菌条件下生长具有明显的优越性。鬼臼毒素的诱导培养周期短，操作简便，成本低、可以有效放大，不仅促进了鬼臼毒素的积累，还提高了不定根对病虫害的抗性。桃儿七内生菌粉红粘帚霉发酵生产可以在低成本的条件下将发酵液直接施用于放大培养的不定根，操作简单，有效促进鬼臼毒素的积累和含量的提高。

本发明提供的方法是培养桃儿七愈伤不定根、发酵真菌诱导子形成发酵产物，耦合细胞工程和发酵工程的手段生产鬼臼毒素的方法。通过愈伤组织直接生产不定根，操作简单，产量高，愈伤组织不继代褐化程度低；通过桃儿七内生菌粉红粘帚霉fhnzm发酵液及一些植物生长调节剂处理不定根，有效提高了鬼臼毒素含量。

保藏说明：

菌种名称：粉红粘帚霉

拉丁名：Clonostachys rosea

菌株编号：fhnzm

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2019年01月14日

具体实施方式

以下实施例可以进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

以下实施例所使用的桃儿七种子，均采自兰州市兴隆山海拔2300米以上，经鉴定为桃儿七种子，均为新鲜种子。实验中用到的试剂均为化学纯，可通过商业途径购买获得。

以下实施例中使用的粉红粘帚霉为fhnzm(Clonostachys rosea)，保藏号为CGMCCNo.17070，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

实施例1无菌种胚的获得

将新鲜桃儿七种子，除去虫蛀和霉烂种子，水洗后用少许浓硫酸腐蚀种皮至颜色发黑，用0.5％的碳酸钠室温浸泡20小时除去油质、蜡质等疏水成分，80mg/L的赤霉素(GA4+7) 4℃浸泡28小时，0.2％的升汞表面消毒6分钟。

实验组将上述预处理的种子，用灭过菌的滤纸吸干种子表面水分，用灭过菌的尖嘴钳将种胚从种脐部的萌发孔中挤出，接种于MS培养基；对照组种子预处理方式与前述相同，仅取出种胚采用如下方法：用解剖刀将种子切开，将带有胚的半粒种子接种于MS培养基。两组共同培养，观察萌发、污染、褐化情况。

实验结果如下，实验组：没有发现褐化和污染现象，操作简单，种子损失少，操作速度快；对照组：操作过程中常发生种胚切断的问题，造成种子损失较为严重，培养过程中由于种胚的损伤及胚乳内生菌的问题造成一定程度的褐化和污染，胚乳中萌发抑制物的存在对发芽率也存在一定的抑制作用。

实验结果表明，实验组所采用的方法，即将种胚从萌发孔中挤出的方法为优选方法。

实施例2不同激素对胚性愈伤组织诱导的影响

以种胚为外植体，在黑暗条件下，培养温度23℃，培养40天左右，至明显看到不定根根原基，获得胚性愈伤组织。胚性愈伤组织诱导培养基配方:MS基本培养液、蔗糖50g/L、酸水解酪蛋白1g/L、琼脂5g/L、生物素0.2mg/L、pH6.5，并添加不同激素进行培养，不同激素的配比参见表一。

表一胚性愈伤组织诱导培养基

培养结束后，观察外植体生长状态，计算愈伤组织诱导率，并对不定根原基数计数统计，结果见表二。

表二胚性愈伤组织诱导结果

实验组	外植体生长状态	愈伤组织诱导率	平均不定根原基数
				1	20天左右外植体明显膨大	愈伤诱导率80％	10
2	20天左右外植体明显膨大	愈伤诱导率90％	13
				3	20天左右外植体明显膨大	愈伤诱导率95％	9.2
4	25天左右外植体明显膨大	愈伤诱导率70％	6
				5	25天左右外植体明显膨大	愈伤诱导率80％	8.5
6	25天左右外植体明显膨大	愈伤诱导率85％	4
				7	20天左右外植体明显膨大	愈伤诱导率83％	6
8	20天左右外植体明显膨大	愈伤诱导率90％	6.7
				9	20天左右外植体明显膨大	愈伤诱导率80％	5.8
10	30天左右外植体明显膨大	愈伤诱导率80％	10.6
				11	30天左右外植体明显膨大	愈伤诱导率84％	10
12	30天左右外植体明显膨大	愈伤诱导率85％	4

对照组：对照组与实验组1-12所用的基本培养基和培养条件相同，区别在于激素的使用和搭配，对照组使用如下激素组合：6-BA2.0mg/L+2,4-D1.5mg/L+TDZ 0.2mg/L，愈伤诱导率70％，没有观察到不定根根原基的分化。

上述实验组1-12都能诱导出带有根原基的胚性愈伤组织，而对照组诱导的胚性愈伤组织没有根原基的分化。随着生长素IAA，细胞分裂素ZT，油菜素内酯BR浓度的增加，愈伤组织的诱导率增加，但不定根原基数量减少，说明高浓度的上述三种激素的组合抑制不定根的形成。油菜素内酯BR浓度对愈伤不定根发生的影响表现出明显的低促高抑现象。毒莠啶PIC和独脚金内酯GR24的使用，加速了愈伤组织的发生，但高浓度的GR24对愈伤组织的诱导率有影响，可能是抑制了细胞分裂素的原因。2,4-D虽然也具有促进愈伤和不定根的作用，但诱导效率不及PIC和GR24，可能是因为2，4-D诱导的愈伤组织胚性较差。正是 IAA、ZT、BR分别于PIC、2，4-D、GR24的组合保证了高效的愈伤诱导率和不定根诱导率。通过以上试验，优选的愈伤组织诱导培养基配方为：吲哚乙酸(IAA)浓度为3mg/L，玉米素(ZT)浓度为3mg/L，油菜素内酯(BR)浓度为0.03mg/L，毒莠啶(PIC)2mg/L的组合；或为吲哚乙酸(IAA)浓度为3mg/L，玉米素(ZT)浓度为3mg/L，油菜素内酯(BR)浓度为 0.03mg/L，2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)2mg/L；或为吲哚乙酸(IAA)浓度为3mg/L，玉米素(ZT)浓度为3mg/L，油菜素内酯(BR)浓度为0.03mg/L，独脚金内酯(GR24)0.5mg/L 的组合。

实施例3不定根的生长

将实施例2获得的带有根原基的愈伤组织转接入不定根生长培养基，在黑暗条件下，温度20℃，培养40天，不定根长度5+1cm。此时将不定根分为两组，一组继续在无菌条件下不含琼脂的液体1/2MS培养基(蔗糖20g/L)中生长；另一组用清水将不定根洗净，在开放的水培瓶中培养，根浸入0.2g/L的氮磷钾含量比例为20:20:20的水溶性肥料中(附加0.1g/L 的蔗糖)，愈伤组织用灭过菌的草炭土覆盖。

不定根生长培养基配方如下:1/2MS基本培养液、蔗糖20g/L、琼脂5g/L、萘乙酸(NAA)浓度为0.2mg/L、吲哚乙酸(IAA)浓度为0.2mg/L。

实验结果表明，无菌条件组织培养方式和开放的水培培养方式，不定根都能生长，证明不定根的生长可以在低成本的工业化水培条件下有效放大。

实施例4粉红粘帚霉fhnzm发酵液制备

将粉红粘帚霉fhnzm接入PDA培养基，30℃，160r/min振荡培养，培养9d后取样，培养物经虑纸过滤，滤液3 000r/min离心15min，上清液经0.22μm滤膜过滤，收集滤液-20℃保存备用。高效液相色谱法检测鬼臼毒素含量。

PDA培养基配方：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1 000m L，121℃灭菌25min。色谱条件：色谱柱：Shim-pack GIST C18柱(4.6mm×250mm,5.0μm)，流动相：甲醇-水(50:50),流速1ml/min，检测波长290nm，柱温30℃。

实验结果表明，粉红粘帚霉fhnzm发酵液不含有鬼臼毒素。

实施例5不定根鬼臼毒素的诱导及含量测定

将实施例3获得的长度5cm的不定根接入1/2MS基本培养液、蔗糖浓度为20g/L，并添加不同的物质诱导鬼臼毒素(如下表)，在黑暗条件下，温度20℃，培养7天，分别收集不定根，洗净烘干，用体积比1:1的甲醇/氯仿混合液超声提取1h,(功率250，频率70Khz),过滤，挥干，甲醇定容，高效液相色谱法检测鬼臼毒素含量(色谱条件：色谱柱：Shim-pack GISTC18柱(4.6mm×250mm,5.0μm)，流动相：甲醇-水(50:50),流速1ml/min，检测波长 290nm，柱温30℃)。

表三鬼臼毒素诱导试验结果

根据上述实验，添加鬼臼毒素诱导物后，鬼臼毒素的含量得到了明显提高，其中实验组 1、2、3、4组分别较对照组提高了51.05％、63.40％、62.70％、75.06％，实验组5虽然其鬼臼毒素含量高于实验组4，但随着冠菌素浓度的增加，不定根褐化严重，因此，通过以上实验，优选的鬼臼毒素诱导培养基为：1/2MS基本培养液、蔗糖20g/L、粉红粘帚菌发酵液接种量为体积比20％；1/2MS基本培养液、蔗糖20g/L、茉莉酸甲酯(MEJA)的浓度为3 mg/L；1/2MS基本培养液、蔗糖20g/L、冠菌素(COR)的浓度为0.05mg/L。

Claims (10)

1.一种通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）获取无菌种胚：将新鲜的桃儿七种子消毒，取出无菌种胚；

（2）胚性愈伤组织诱导：将上述种胚接种于胚性愈伤组织诱导培养基，黑暗条件下，23℃培养40天左右，至明显看到带有不定根根原基的胚性愈伤组织，获得外植体；

胚性愈伤组织诱导培养基配方: MS基本培养液、蔗糖50g/L、酸水解酪蛋白1g/L、琼脂5g/L、生物素0.2 mg/L、吲哚乙酸2-4mg/L、玉米素2-4mg/L、油菜素内酯0.01-0.05 mg/L、毒莠啶2 mg/L；

（3）不定根的生长：将上述外植体转接入不定根生长培养基，黑暗条件下，20℃培养40天，至不定根长度5cm；

不定根生长培养基配方：1/2MS基本培养液、蔗糖20g/L、琼脂5g/L、萘乙酸浓度为0.2mg/L、吲哚乙酸浓度为0.2mg/L；

（4）鬼臼毒素的诱导生产：将上述不定根接入鬼臼毒素诱导培养基，黑暗条件下，20℃培养7天，收集不定根，洗净烘干后，用体积比1:1的甲醇/氯仿混合液超声提取1h，过滤，挥干，甲醇定容，即为鬼臼毒素提取液；

鬼臼毒素诱导培养基配方： 1/2MS基本培养液、蔗糖20g/L 、粉红粘帚霉发酵液接种量为体积比20%；

其中粉红粘帚霉为fhnzm，保藏号为CGMCC No.17070，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心；

粉红粘帚霉发酵液制备：将粉红粘帚霉接入PDA培养基，30℃，160r/min振荡培养，培养9 d后取样，培养物经滤纸过滤，滤液3000 r/min离心15 min，上清液经 0.22 μm 滤膜过滤，收集滤液-20℃保存备用。

2.根据权利要求1所述的通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步骤(1)无菌种胚的取出方法是将种胚从种脐部的萌发孔中挤出。

3.根据权利要求1所述的通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步骤（2）中吲哚乙酸为3mg/L，玉米素为3mg/L，油菜素内酯为0.03mg/L。

4.根据权利要求1所述的通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步骤（2）胚性愈伤组织诱导培养基配方中的毒莠啶2 mg/L用2,4-二氯苯氧基乙酸2 mg/L代替。

5.根据权利要求1所述的通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步骤（2）胚性愈伤组织诱导培养基配方中的毒莠啶2 mg/L用独脚金内酯0.2-0.8 mg/L代替。

6.根据权利要求1所述的通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步骤（4）鬼臼毒素诱导培养基配方中的粉红粘帚霉发酵液接种量为体积比20%替换为茉莉酸甲酯3 mg/L。

7.根据权利要求1所述的通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步骤（4）鬼臼毒素诱导培养基配方中的粉红粘帚霉发酵液接种量为体积比20%替换为冠菌素0.01-0.1 mg/L。

8.根据权利要求4所述的通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步骤（2）中吲哚乙酸为3mg/L，玉米素为3mg/L，油菜素内酯为0.03mg/L。

9.根据权利要求5所述的通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步骤（2）中吲哚乙酸为3mg/L，玉米素为3mg/L，油菜素内酯为0.03mg/L，独脚金内酯为0.5mg/L。

10.根据权利要求7所述的通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，其特征在于所述步骤（4）中冠菌素为0.05mg/L。