CN110036106A - 用于体外调节细胞培养物的化学微环境的组合物、装置和方法 - Google Patents

用于体外调节细胞培养物的化学微环境的组合物、装置和方法 Download PDF

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弗朗切斯科·泽贝托
盖斯顿·卡斯特拉尼
斯蒂法诺·萨尔维奥利
比阿特丽斯·法博尼
伊莎贝拉·兹罗尼
玛丽亚·孔特
克劳迪·弗兰切斯基
丹妮拉·萨尔瓦多
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Abstract

本发明涉及组合物，该组合物包含含有能够在培养环境下重新创建体内存在的细胞微环境的功能性酶的聚合物基质或凝胶。本发明还涉及用于包含此类组合物(特别是水凝胶)的细胞培养物的装置，以及其用于调节细胞培养物的化学微环境或模拟体内细胞的生理或病理环境的用途。该组合物和本文所述的装置也可以用于在体外评估化合物对确定的细胞系或原代细胞的治疗性效果。

Description

用于体外调节细胞培养物的化学微环境的组合物、装置和 方法
技术领域
本发明涉及包含基质的组合物，该基质含有能够在培养环境下重新创建体内存在的细胞微环境的功能性酶。本发明还涉及用于包含此类组合物(特别是水凝胶组合物)的细胞培养物的装置，还涉及其用于调节细胞培养物的化学微环境或模拟体内细胞的生理或病理环境的用途。该组合物和本文所述的装置也可以用于在体外评估化合物对确定的细胞系或原代细胞的治疗性效果。
背景技术
氧水平和机械性能是细胞生长的基本参数，这些参数调节属于细胞的所有功能和决策。需要在体外细胞培养物中完美地调节这类性能。通常用20％氧气进行体外细胞培养，该氧气浓度并不是体内组织中存在的氧气浓度，其相当于根据组织和环境的约5％。葡萄糖梯度、氧梯度和pH梯度在细胞培养物和关键解剖区域(如干细胞小生境、实体瘤瘤块、衰老组织)的典型环境之间具有相当大的差异。现有技术中没有公开这种装置，该装置以简单、廉价且可调节的方式重新创建组织和体内细胞环境中存在的主要生理环境(最初的氧梯度、葡萄糖和pH)，这些条件在常规的体外培养技术下是无法获得的，除非使用方法复杂且成本高昂的特定仪器(例如低氧性通风橱)。
在生理环境下，氧气的分压相对于所涉及的器官或组织在24和160mmHg之间变化。相反，在病理环境下，特别是在肿瘤环境下，组织内的氧含量急剧下降，或者在最急剧的情况下为零，将这两种情况分别定义为低氧和缺氧，它们与生理学上的同义词-常氧条件区分开。这种强烈下降的两个主要原因是：血管广泛破坏而无法维持将足够的氧气输入组织，和频繁形成对器官有害的血红蛋白中间体(如羧基血红蛋白和高铁血红蛋白)；在这种情况下，分压在从细胞内细胞色素周围的0.02mmHg到与毛细血管中氧水平相关的45mmHg的范围。
在生理和病理两种环境下的体外培养环境和体内真实环境之间的差异代表了所有临床前实验、药物发掘过程、疾病研究、再生医学、药物实验和个体化治疗中存在的难题。
专利申请US2015362483描述了用于体外模拟体内病理和生理细胞环境的方法。该方法需要具有机械组件的装置，昂贵且难以管理，该装置显然不能在通常用于细胞生长的培养板水平上重复。对细胞外基质中的代谢物和可溶性分子的浓度和梯度的测微检查达不到再现生理环境的要求。
因此，对于该难题需要提供用于在体外有效地模拟生理性或病理性细胞环境的新的方法、组合物和装置，而它们没有表现出现有技术中所记载技术方案的缺点。
发明内容
本发明基于采用包含基质的组合物，该组合物特别是以水凝胶的形式，该基质含有能够在培养环境下重新创建在体内存在的细胞微环境的功能性酶。
本发明的作者不仅已经表明可以通过本文所述的组合物和水凝胶来调节细胞培养环境，而且还表明成功创造的环境与组织(正常组织和肿瘤组织两者)中存在的那些环境相似。本发明的结果是有利的，因为使用包含组合物和水凝胶的装置允许在体外再现特定的生理环境并进行细胞代谢相关的研究，例如环境对健康细胞和肿瘤细胞两者的代谢、细胞信号传导、基因表达的影响；此外，它允许评估肿瘤生长因子，并且基于此设计更加有效的治疗性策略。根据本发明的装置代表了用于临床前研究的独特系统，如同体内系统一样可靠，并具有体外系统的所有优点。在评估其开发为新的治疗性策略的潜力的新药实验中，本发明装置的应用可以具有在真实肿瘤微生理环境中开展该新药实验的优势。此外，利用计算机方法，可以通过考虑人体组织中天然存在的浓度梯度来开发药物递送的新策略，并在这些仿生系统中测试它们。
首先，本发明涉及用于体外细胞培养物的组合物，其具有以下特征：它们包含基质，特别是聚合物或蛋白质基质，该基质含有一种或多种能够催化氧还原的酶，以调节在所述细胞培养物中的氧梯度。
其次，本发明涉及用于在体外培养细胞的装置，该装置包括用于细胞的容器和根据本文所述实施方式中任一项的组合物。
另外，本发明涉及用于模拟体内细胞的生理或病理环境的体外方法，其具有以下特征：在用于细胞的容器中培养细胞系(或原代细胞)的步骤，其中已经将根据本文所述实施方式中任一项的组合物或水凝胶沉积在该容器中。另外，本发明涉及用于调节细胞培养物的化学微环境的方法，其具有以下特征：在用于细胞的容器中培养细胞系(或原代细胞)的步骤，在该容器中已经沉积了根据本文所述实施方式中任一项的组合物。
另外，本发明涉及用于评估药物或化合物对确定的生理或病理环境的影响的方法，其包括：在用于细胞的容器中培养细胞系的步骤，其中已经将根据本文所述实施方式中任一项的组合物沉积在该容器中，和将所述药物或化合物添加至所述细胞系的步骤。
另外，本发明涉及用于制备以水凝胶形式的组合物的方法，包括以下步骤：
a)制备包含一种或多种易于催化氧还原的酶的溶液；
b)添加交联助剂；
c)将溶液凝胶化。
附图说明
图1：图1示意性地示出了根据本发明的装置的操作。
图2：由活性基质的网格改良以重新创建肿瘤微环境的培养板的原型的照片。
图3：细胞MCF10A和MCF7在对照平板和用非活性(不含酶)蛋白质基质改良的平板上的生长曲线。该曲线显示了所用基质的生物相容性和无毒性。
图4.以位于与产生低氧的活性凝胶相距几十微米的UME(Pt 10μm)记录的电流分析，对于PBS，E＝-0.7V vs Ag/AgCl。在约4秒时，加入浓度为1mM的葡萄糖。
图5.以UME在活性基质条带(用于产生缺氧)上得到的扫描曲线，方向垂直于活性条带，并且电极保持在与其上放置有活性基质的平板相距恒定高度处。对于1mM葡萄糖的PBS溶液，E＝-0.7V vs Ag/AgCl(3M KCl)。
图6.UME(Pt 10μm)在用以彼此相距1-1.5mm放置的活性基质条带改良的平板上得到的扫描曲线。对于1mM葡萄糖的PBS溶液，E＝-0.7V vs Ag/AgCl(3M KCl)。
图7.在存在1mM葡萄糖的PBS溶液、电位＝-0.6V、最大速度为50μm/s、Pt UME10μm和参比电极Ag/AgCl(3M KCl)下进行的凝胶附近的接近曲线。
图8：通过采用赤藓红B针对对照平板和用非活性(仅BSA)和活性(含有Gox和CAT)蛋白质基质改良的平板上的细胞MCF10A的活力的生长曲线。该曲线显示了所用基质的生物相容性和无毒性。此外，突出了对活性平板中存在的化学梯度的生长的影响。
图9：通过采用赤藓红B针对对照平板和用非活性(仅BSA)和活性(含有Gox和CAT)蛋白质基质改良的平板上的细胞MCF10A的活力的生长曲线。该曲线显示了所用基质的生物相容性和无毒性。此外，突出了对活性平板中存在的化学梯度的生长的影响。
图10.在含有酶的活性水凝胶(左侧)的存在下将细胞MCF10A培养24小时的光学图像。
图11.在非活性水凝胶(左侧)的存在下将细胞MCF10A培养24小时的光学图像。
图12.取决于细胞MCF10A与水凝胶的距离的细胞生长密度，将酶存在下的凝胶和对照凝胶相比较。细胞密度的过程在对照平板中是均匀的，与存在梯度的那些相反，其中观察到在低氧区域附近是低密度区域。
图13.在非活性水凝胶(左侧)存在下将细胞MCF10A培养24小时的光学图像。
图14.在非活性水凝胶(左侧)存在下将细胞MCF10A培养24小时的光学图像。
图15.取决于细胞MCF10A与水凝胶的距离的细胞生长密度，将酶存在下的凝胶与对照凝胶进行汇合度比较。细胞密度的过程在对照平板中是均匀的，与存在梯度的那些相反，其中观察到在低氧区域附近是低密度区域。
图16.在含有酶的活性水凝胶(左侧)存在下将细胞MCF7培养24小时的光学图像。
图17.在非活性水凝胶(左侧)存在下将细胞MCF7培养24小时的光学图像。
图18.取决于细胞MCF7与水凝胶的距离的细胞生长密度，在酶存在下的凝胶与对照凝胶之间的比较。细胞密度的过程在对照平板中是均匀的，与存在梯度的那些相反，其中观察到在低氧区域附近是较高密度的区域。
图19.由细胞MCF10和MCF7表达的一些感兴趣蛋白质的蛋白质印迹，其中细胞MCF10和MCF7是培养在用活性凝胶网格(相邻条带之间距离为2mm或3mm的条带)或对照网格改造后的平板中的。
具体实施方式
本发明涉及包含基质的组合物，所述基质含有能够在培养环境下重新创建体内存在的细胞微环境的功能性酶。特别地，它涉及用于在体外培养细胞物中使用的聚合物基质和水凝胶，其具有以下特征：它们包含一种或多种能够催化细胞培养物中的氧还原的酶，从而调节氧梯度。
在本说明书中，在术语“用于在细胞培养物中使用(to be used in cellculture)”下，是指适合用于细胞培养物，特别是真核细胞培养物、更特别是人细胞培养物。在属于该定义的范围内，则将生物相容性组合物或水凝胶更详细地表示为不形成对细胞有毒的产物。
在本说明书中，在术语“基质(matrix)”和“聚合物基质(polymeric matrix)”下，是指能够掺混或吸收/吸附活性酶的水凝胶、基质胶、聚合物的化合物，此外在“多种基质(matrixes，基质)”下，是指一旦沉积在合适的基底(例如培养板的塑料)上，能够与该基质中的酶牢固连接的多种物质，使得该基质可以发挥其功能以产生梯度，在术语“多种基质(matrixes，基质)”下，是指由自身含有酶的这些物质所产生的组合物。在使用凝胶(例如基于蛋白质的凝胶)或能够吸收/吸附/共价结合酶的物质的情况下，采用术语“基质(matrix)”，在所述多种基质由聚合物结构组成的情况下，采用“聚合物基质(polymericmatrixes)”。
在本文所述的组合物和水凝胶的基质中包含的酶可以是消耗O2而不形成对细胞有毒的产物的酶，本文所述的基质甚至可以包含除去/消耗由第一酶产生的有毒产物的第二酶。此外，在细胞培养物中的酶应该是在将细胞培养例如12小时、24小时、48小时或72小时的充足时间时期内有活性的，换言之，酶在水凝胶内部不应该是以变性形式，而是以它们的催化活性形式。
如在本发明的发明内容和实施例和实验数据部分中所解释的，酶消耗氧的活性允许调节体外细胞培养物中的氧梯度。
基质可以是基于酶和基质之间的相互作用的不同原理制备的，例如与戊二醛交联、在聚合物基质中捕获、通过以物理或静电方式相互作用吸附。前两种方法是最常用于固定酶的方法。交联是基于在两个或更多个分子之间形成共价键的过程，而在聚合物基质中捕获纯粹是基于机械和静电原理。用于交联的试剂的实例是例如戊二醛(GDA)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺基)酯BS3、N-羟基琥珀酰亚胺、甲醛、与UV组合使用的光反应剂。
根据一个优选的实施方式，该组合物是以水凝胶形式，例如用于捕获酶，可以使用硅酮水凝胶、聚丙烯酰胺、纤维素、纤维素衍生物、胶原、羧甲基纤维素、藻酸盐、壳聚糖、琼脂、polimacon(一种含硅水凝胶)、透明质酸、聚甲基丙烯酸甲酯、水凝胶肽-模拟物，其中利用交联助剂使酶结合至基质上或在基质交联后以机械方式捕获。
催化氧还原的酶的实例是葡萄糖氧化酶(GOx)、漆酶、NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶、乳酸氧化酶、细胞色素氧化酶、使用氧作为底物的任何氧化酶和氧化还原酶。
根据优选的实施方式，组合物(优选以水凝胶的形式)将包括葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶。葡萄糖氧化酶-GOx-是氧化还原酶家族的酶，其催化以下反应：
过氧化氢是一种反应性强的对细胞有毒的分子，基于该原因将上述反应与生物系统中的另一种非常重要的氧化还原酶-过氧化氢酶-CAT-偶联，该酶转化水中产生的ROS物质。两个反应的净值是将两个氧分子转化为水分子和氧分子两种分子，而该氧分子将返回至葡萄糖氧化酶循环。水凝胶在葡萄糖存在下消耗氧，葡萄糖作为细胞代谢的基础底物存在于细胞培养装置中。该优选的实施方式具有几个优点。溶液中的葡萄糖氧化酶将倾向于快速凝胶化。葡萄糖氧化酶将例如是从真菌黑曲霉(Aspergilus Niger)或其它来源纯化出的一种葡萄糖氧化酶，而过氧化氢酶可以是例如从牛肝中纯化出的。葡萄糖氧化酶使用氧气来氧化葡萄糖，这种反应除了提供在天然和生理上存在于细胞培养装置中的“牺牲性”底物的使用外，还允许甚至调节局部葡萄糖的浓度及其梯度(参见图1所示的图)。甚至可以以相同的方式来调节pH，由于葡萄糖氧化的产物是酸。可以在同一制剂中同时使用多种氧化酶(oxidase)和多种酶(enzyme)，从而以独立的调节性方式来改变葡萄糖、氧气和pH的局部浓度。
以相同的方式，可以使用其它过氧化物酶的酶来催化性地除去在氧还原反应中所产生的过氧化氢，例如可以使用辣根过氧化物酶(HRP)。
可以通过使用主方程(master equation)的模拟或通过有限元模拟(finiteelement simulation)来提供制剂中使用的酶浓度，以便在细胞培养环境中获得特定的局部浓度和梯度。根据一个实施方式，水凝胶可以进一步包含牛血清白蛋白(BSA)。在凝胶形成中，使用牛血清白蛋白(BSA)溶液作为保护性基质带来避免凝胶化过程中酶变性的好处。此外，以较高浓度存在的BSA进入水凝胶网，该BSA构成并在BSA分子之间以及BSA分子和酶分子之间产生许多交联：以这种方式可以将酶的浓度降低或升高至装置所需要的数量而不存在如果酶以非常低浓度存在时不被固定在凝胶中的风险，此外，BSA的存在降低了酶中分子间交联的可能性，而酶中分子间交联可能通过抑制酶活性而将其变性。
本发明还涉及适合于在体外培养细胞的装置，该装置包括用于细胞的容器和上述的组合物和水凝胶(特别是含有根据本文所述实施方式中任一项的活性酶的聚合物基质)。利用该装置，可以使用任何适合于培养细胞系的容器，例如培养皿或市场上可获得的其它容器。该装置可以提供将水凝胶作为单个层或多个层沉积在用于细胞的容器底部。
根据装置的一个实施方式，采用封装在(磁性或非磁性)微球中的具有酶活性组分的聚合物基质。
根据一个实施方式，水凝胶可以是利用包括以下步骤的方法制备的：
a)制备包含一种或多种能够催化氧还原的酶的溶液；
b)添加交联助剂；
c)将溶液凝胶化。
优选地，该方法将包括加入BSA，随后加入交联助剂，例如戊二醛(GDA)。优选地将酶和BSA在与细胞培养物相容的缓冲液(例如PBS)中混合。例如，首先制备包含葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的混合物，随后加入BSA，再后加入交联助剂，例如GDA。
本发明还涉及调节细胞培养物的化学微环境的体外方法和/或模拟体内细胞的生理或病理环境的方法。这类方法还将包括至少一个其中将细胞系或原代细胞铺板并培养在装置(例如培养皿)中的步骤，其中将组合物(优选为如本文所述的水凝胶)沉积在该装置中。根据一个实施方式，将采用肿瘤或上皮细胞。可以采用的特定细胞系的实例是如实验部分中更详细显示的MCF7和MCF10A。
如前面在说明书中所示的，本文所述的包含聚合物基质的组合物、水凝胶和装置可以有利地用于体外方法，以用于筛选候选化合物，例如作为药物以评估化合物对确定的细胞系的作用。
提供以下实施例以易于理解本发明，并且它们并不旨在并绝不应该以任何方式解释为限制所附权利要求中描述的本发明。
在本专利申请中所示的实验中使用的所有细胞系都是可以在市场上购买和可获得的细胞系。
实施例
1.1含有GOx和CAT的水凝胶
葡萄糖氧化酶-GOx-是氧化还原酶家族的一种酶，其催化以下反应：
过氧化氢是一种反应性强的对细胞有毒的分子，基于该原因将上述反应与生物系统中的另一种非常重要的氧化还原酶-过氧化氢酶-CAT-偶联，该酶转化水中产生的ROS物质。两个反应的净值是将两个氧分子转化为水分子和氧分子两种分子，而该氧分子将返回至葡萄糖氧化酶循环。水凝胶在葡萄糖存在下消耗氧，葡萄糖作为细胞代谢的基础底物存在于细胞培养装置中。这些酶是蛋白质，并且如此它们具有不同的反应性官能团，如氨基酸基团((-NH2)和羧基基团(-COOH))，它们可以易于与合适的试剂如戊二醛共价结合(图1)。戊二醛是一种无色小分子，在室温下为液体，并且在水和醇中均以任何比例溶解；在结构上它是具有五个碳原子的直链二醛，正是醛基使其具有这些高反应性特征。对最佳浓度进行评估，从而在分子内反应(低浓度的酶)方面有利于酶和GDA之间的相互作用，并且避免酶从凝胶(低浓度的GDA)中逃逸同时避免由于大量交联(高浓度的GDA)而使酶变得不溶。酶活性与GDA的使用浓度成反比，由于大量交联使酶的活性构象变形。戊二醛是一种有毒物质，但是在先前研究以及我们的实验中，观察到它在使用浓度下不会对细胞培养产生问题；此外，它是一种固定助剂，但是如在一些评估细胞移动而进行的视频中观察到的，随着时间推移，可以表明在这些浓度下不具有这种固定功能，并且细胞本身可以在凝胶中自由移动而不会被卡住。在凝胶形成中，使用牛血清白蛋白(BSA)溶液作为保护性和胶凝化基质是避免在凝胶化过程中酶变性的基础。此外，以较高浓度存在的BSA进入水凝胶网，并且GDA在BSA分子之间以及BSA分子和酶分子之间产生许多交联：以这种方式可以将酶的浓度降低或升高至装置所需要的数量而不存在如果酶以非常低浓度存在时不被固定在凝胶中的风险，此外，BSA的存在降低了酶中分子间交联的可能性，而酶中分子间交联可能通过抑制酶活性而将其变性。
1.2电化学探针显微镜以用于评估氧浓度梯度
为了评估由我们装置中的凝胶所产生的氧浓度的梯度，我们使用了扫描电化学显微镜，这是一种用于在测微级上评估化学反应的强大工具，并且可用于表征细胞培养物的微环境。通过使用超微电极(UME)，可以检测电化学反应，如氧化还原反应。将探针(UME)连接到具有三个发动机和三个压电元件的系统，随后该探针可以在三个笛卡尔(Cartesian)轴X、Y和Z上移动并定位。这样的系统允许在空间中求解由UME测量的反应，并且它允许展示出立体图像，还允许探测基底的局部化学反应性。首先，通过接近(一种接近基底的方式)，负反馈模式和我们分析情况下的电流随着接近而逐渐减小：随d→0电流→0，其中d是探针与由特定情况下的塑料或玻璃制成的基底之间的距离。以这种方式，可以为我们的电极选择理想的位置，非常接近凝胶以测量其功能，但不能过近，以避免机械损坏电极。此时，通过进行平行于基底的扫描，以基底产生-探针收集(SG-TC)模式，电极在表面附近移动，浸入溶液中，记录针对基底上每个位置处流到UME的电流；观察到的是电流的变化，电流变化反映了UME测量的物质的浓度变化。电流曲线和电流二维图像可以是根据探针位置获得的。成功评估这种氧梯度的事实是能够将酶浓度与重新创建的梯度相关联并且评估将位于装置基底的特定位置的细胞暴露于何种氧气浓度(即，测量每单个细胞的微环境)的基础，通过建立参数以便创建类似于肿瘤模型或生理/病理组织或者所希望模仿的小生境(例如，干细胞小生境)的模型的体外模型。
2.1制备含有GOx和CAT的水凝胶
试剂表
在制备过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶的溶液之后，将它们以1:1的比例混合在含有BSA的溶液中，加入等于总终体积1.38％的量的戊二醛(25％的水溶液)。对于制备White(一种水凝胶)，仅使用具有与戊二醛相同百分比的BSA。仅在使用凝胶之前加入戊二醛，因为溶液倾向于迅速凝胶化。葡萄糖氧化酶(X型)源自黑曲霉(Aspergillus Niger)真菌，而过氧化氢酶源自牛肝。使用的所有化合物均购自西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)。
2.2用于测量的SECM仪器
用于测量氧梯度的仪器是探针扫描电化学显微镜“CH Instrument Texas”，型号CHI B910。
2.3分析含有GOx和CAT的基底中的细胞生长
为了评估我们的水凝胶影响细胞生长的方式，按以下培养MCF7和MCF10A：
i)在含有酶的水凝胶存在下，
ii)在不含酶的水凝胶存在下(White)
iii)不存在水凝胶
并通过采用细胞活力的比色标志物在24小时、48小时和72小时时进行细胞计数。i)和ii)之间的比较是评估细胞是否经受酶产生的梯度的基础，进行ii)和iii)之间的比较以评估凝胶的基本组成是否会在某些程度上对细胞有毒。
将细胞铺板在每个腔室上并培养；在24小时、48小时和72小时的时间时期内进行细胞活力的比色测定(每天多个孔)，从而获得细胞生长曲线。对MCF10A和MCF7两者进行重复实验。
按以下几个步骤进行铺板：
-分裂(10cm培养皿)
-将1ml培养基放入falcon 15中
-除去培养基并用5ml PBS润洗
-加入1ml胰蛋白酶*并在培养箱中保持5分钟
-收集具有胰蛋白酶的细胞并将它们置于falcon15中
-用2ml培养基收集残留在培养皿上的细胞
-加入3ml培养基并离心
-除去上清液并将“沉淀物”重新混悬在几毫升的培养基中(取决于可用的细胞数量)
-细胞计数
-在64腔室中以1:2的细胞:PBS进行稀释(在该步骤中采用约20μL的细胞混悬液)
-以1:2的PBS:赤藓红B溶液进行稀释
-将10μl如此制备的溶液置于Burker检测室中，并在光学显微镜下进行计数。
通过以下公式计算总细胞：
M×V×10-4×F.D.PBS×F.D.EB
其中M是Burcker检测室的细胞的细胞计数平均值，V是将细胞沉淀物重新混悬的体积，F.D.是稀释系数。
-铺板
一旦完成计数，就可以决定铺板多少细胞
-取出适量的细胞溶液并将其混悬在足够的培养基(nml)中
-重新分布于多孔或所用培养皿(3.5cm宽)的所有腔室中。
*胰蛋白酶有利于肽键的断裂，从而允许细胞在培养皿上贴壁。
在铺板后，通过总是按照术语“分裂”和“细胞计数”在24小时、48小时和72小时时对多孔的6个腔室中的每一个腔室中的细胞进行计数；唯一变化的是所使用的PBS和胰蛋白酶的量，由于培养皿的宽度为3.5cm而不是10cm，因而将适当地比较用量。在其它多孔中，在水凝胶和White的存在下将细胞铺板，并且用配备有微量培养器的光学显微镜以18/24小时的时间推移监测细胞，以评估相对于凝胶的细胞移位。
2.4相对于氧梯度的细胞生长密度
制备了几个平板(培养皿)，随后可以将细胞MCF10A和MCF7铺板在该平板上。在培养2天后，在细胞达到汇合之前将其固定，以便在所有时间点进行相对计数，并评估在与凝胶不同距离处的生长。
3.结果分析
图3：细胞MCF10A和MCF7在对照平板和用非活性(不含酶)蛋白质基质改良的平板上的生长曲线。该曲线显示了所用基质的生物相容性和无毒性。
通过细胞培养和利用赤藓红B的细胞活力测试，测试了用于掺混产生梯度的酶的蛋白质水凝胶的生物相容性和无毒性。在培养24小时、48小时和72小时时进行细胞计数，并且细胞生长不受培养板表面上基质存在的影响。
通过扫描电化学显微镜将氧梯度表征为测微分辨率。
图4中的曲线显示了以等于-0.7V(相对于Ag/AgCl，3M KCl)的氧还原电位记录的电流分析，工作电极是SECM的UME，它与培养皿上的活性凝胶保持几十微米的距离。记录的电流与氧浓度成正比。在曲线开始约4秒后，将浓度为1mM的葡萄糖加入至PBS(分析溶液)中；在这种添加完成后，在活性基质水平上，葡萄糖氧化反应开始，其与氧气被还原为过氧化氢(通过过氧化氢酶将其转化为水和氧气)有关。总的来说，氧气被消耗，并且如从曲线中观察到，在加入葡萄糖后电流急剧下降，这是由于氧浓度突然降低(20秒后记录的电流对应于等于零的局部氧浓度)，需要注意的是，在由微电极分析的特定定位中，电流和随后的氧浓度在时间上保持稳定。
图4.以位于与产生低氧的活性凝胶相距几十微米的UME(Pt 10μm)记录的电流分析，对于PBS，E＝-0.7V vs Ag/AgCl。在约4秒时，加入浓度为1mM的葡萄糖。
图5显示了扫描曲线，其中UME保持在距离凝胶表面≈25μm的高度处，并且沿着垂直于凝胶条带的方向且平行于平板平面的线在厚度为几百微米的凝胶条上进行扫描，在该平板平面上放置有活性基质。从图中可以看出，活性基质条带的附近被标记为低氧，并且根据体内发现的且由不同毛细血管和血管之间存在的距离引起的梯度结构，由此产生的浓度的梯度具有几百微米的长度。
图5.通过UME在活性基质条带(用于产生缺氧)上的扫描曲线所检测的氧浓度，检测方向垂直于活性条带，并且电极保持在与其上放置有活性基质的平板相距恒定高度处。对于1mM葡萄糖的PBS溶液，E＝-0.7V vs Ag/AgCl(3M KCl)。
图6显示了利用平行于培养板表面的UME在垂直于以彼此相距1-1.5mm放置的四条活性基质条带的方向上得到的扫描曲线。表面改良重新创建低氧区域和相关的氧梯度，该相关的氧梯度具有与体内发现的且由于毛细血管分布产生的结构相类似的结构。
图6.UME(Pt 10μm)在用以彼此相距1-1.5mm放置的活性基质条带改良的平板上得到的扫描曲线。对于1mM葡萄糖的PBS溶液，E＝-0.7V vs Ag/AgCl(3M KCl)。
图7显示了通过将UME在垂直于活性凝胶的方向上从一个活性凝胶接近另一个活性凝胶而记录的接近曲线(电流被转换成氧浓度)。可以注意到，氧浓度的梯度甚至在垂直于板表面的方向上的中间扩散，这样的特征证明了梯度的3D结构概念。应注意的是，在接近结束时，在距凝胶不到几十微米处，得到的O2浓度为零。
图7是在存在1mM葡萄糖的PBS溶液、电位＝-0.6V、最大速度为50μm/s、Pt UME10μm和参比电极Ag/AgCl(3M KCl)下进行的凝胶附近的接近曲线。
一旦将由装置重新创建的氧梯度表征化后，我们在这类改造后的平板中对细胞MCF10A和MCF7进行了培养。图8和图9分别显示了细胞MCF10A和MCF7的生长曲线，观察到在平板表面中心存在活性材料条带改善了细胞生长。
图8：通过采用赤藓红B针对对照平板和用非活性(仅BSA)和活性(含有Gox和CAT)蛋白质基质改良的平板上的细胞MCF10A的活力的生长曲线。该曲线显示了所用基质的生物相容性和无毒性。此外，突出了对活性平板中存在的化学梯度的生长的影响。
图9：通过采用赤藓红B针对对照平板和用非活性(仅BSA)和活性(含有Gox和CAT)蛋白质基质改良的平板上的细胞MCF7的活力的生长曲线。该曲线显示了所用基质的生物相容性和无毒性。此外，突出了对活性平板中存在的化学梯度的生长的影响。
图10显示了在用活性水凝胶(在图像的左侧可见)改造后的平板中培养细胞MCF10A 48小时后拍摄的光学图像。观察到细胞以响应于凝胶附近的培养基中存在的氧梯度的梯度密度生长。在用非活性的对照凝胶改良的平板中不存在这种梯度(图11)。
图10.在含有酶的活性水凝胶(左侧)的存在下将细胞MCF10A培养24小时的光学图像。
图11.在非活性水凝胶(左侧)的存在下将细胞MCF10A培养24小时的光学图像。
图12显示了取决于与活性凝胶和对照凝胶的距离并且在图5中所示的氧梯度或不存在梯度下的细胞密度(图10和11)。
图12.取决于细胞MCF10A与水凝胶的距离的细胞生长密度，将酶存在下的凝胶和对照凝胶相比较。细胞密度的过程在对照平板中是均匀的，与存在梯度的那些相反，其中观察到在低氧区域附近是低密度区域。
图13显示了在用活性水凝胶(在图像左侧可见)改造后的平板中培养至MCF10A汇合拍摄的光学图像。观察到细胞以响应于凝胶附近的培养基中存在的氧梯度的梯度密度生长。在用非活性的对照凝胶改良的平板中不存在这种梯度(图14)。
图13.在非活性水凝胶(左侧)存在下将细胞MCF10A培养24小时的光学图像。
图14.在非活性水凝胶(左侧)存在下将细胞MCF10A培养24小时的光学图像。
图15.取决于细胞MCF10A与水凝胶的距离的细胞生长密度，将酶存在下的凝胶与对照凝胶进行汇合度比较。细胞密度的过程在对照平板中是均匀的，与存在梯度的那些相反，其中观察到在低氧区域附近是低密度区域。
图16显示了在用活性水凝胶(在图像的左侧可见)改造后的平板中培养细胞MCF748小时后拍摄的光学图像。观察到细胞以响应于凝胶附近的培养基中存在的氧梯度的梯度密度生长。在用非活性对照凝胶改良的平板中不存在这种梯度(图17)。应注意的是，在MCF7肿瘤细胞的情况下，在该氧(也即低氧区域)附近细胞密度增加(这种情况与将肿瘤组织的细胞暴露至其中的情况类似)。
图16.在含有酶的活性水凝胶(左侧)存在下将细胞MCF7培养24小时的光学图像。
图17.在非活性水凝胶(左侧)存在下将细胞MCF7培养24小时的光学图像。
图18显示了取决于与活性凝胶和对照凝胶的距离并且在图5中所示的氧梯度或不存在梯度下的细胞密度(图16和17)。
图18.取决于细胞MCF7与水凝胶的距离的细胞生长密度，在酶存在下的凝胶与对照凝胶之间的比较。细胞密度的过程在对照平板中是均匀的，与存在梯度的那些相反，其中观察到在低氧区域附近具有较高密度的区域。通过蛋白质印迹研究了在对照平板和改造后的平板中培养的正常细胞和肿瘤细胞的一些感兴趣蛋白质的表达(图19)，并且该结果证明了我们的装置在调节细胞微环境的有效性，并且还注意到这类环境对细胞表型的影响，特别是对蛋白质HIF-1α的作用，该蛋白质HIF-1α在低氧环境下是有活性的(在许多肿瘤组织的细胞中发现了HIF-1α)。在用网格图案的活性凝胶或对照凝胶改良的平板培养细胞，该活性凝胶或对照凝胶具有彼此相距2mm或3mm的条带。
图19.由细胞MCF10和MCF7表达的一些感兴趣蛋白质的蛋白质印迹，其中细胞MCF10和MCF7是培养在用活性凝胶网格(相邻条带之间距离为2mm或3mm的条带)或对照网格改造后的平板中的。

Claims (24)

1.一种用于在体外细胞培养物中使用的组合物，所述组合物包含基质，其特征在于，所述基质包含一种或多种能够催化氧还原的酶，以调节在所述细胞培养物中的氧梯度。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述基质是聚合物或蛋白质基质。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述酶选自葡萄糖氧化酶(GOx)、NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶、乳酸氧化酶、细胞色素氧化酶或漆酶。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，还包含过氧化氢酶。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中通过交联助剂(交联剂)将所述酶与所述基质共价结合。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述交联助剂选自戊二醛(GDA)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺基)酯、N-羟基琥珀酰亚胺、甲醛、光反应剂。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中通过机械和/或静电相互作用将所述酶捕获在聚合物基质中。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物是水凝胶。
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述水凝胶选自硅酮水凝胶、聚丙烯酰胺、纤维素、纤维素衍生物、胶原、羧甲基纤维素、藻酸盐、壳聚糖、琼脂、polimacon、透明质酸、聚甲基丙烯酸甲酯、水凝胶肽-模拟物。
10.根据权利要求8或9所述的组合物，其中所述水凝胶的所述基质还包含牛血清白蛋白(BSA)。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述水凝胶的所述聚合物基质包含与戊二醛共价结合的葡萄糖氧化酶(GOx)、过氧化氢酶和牛血清白蛋白(BSA)或由与戊二醛共价结合的葡萄糖氧化酶(GOx)、过氧化氢酶和牛血清白蛋白(BSA)组成。
12.一种用于体外培养细胞的装置，包含用于细胞的容器和根据权利要求1至11中任一项所述的组合物。
13.根据权利要求12所述的装置，其中所述容器是培养皿。
14.根据权利要求12或13所述的装置，其中将所述组合物沉积在所述容器的底部以形成一个或多个层。
15.一种调节细胞培养物的化学微环境和/或模拟体内细胞的生理或病理环境的体外方法，其特征在于，在用于细胞的容器中培养细胞系或原代细胞的步骤，其中已经将根据权利要求1至11中任一项所述的组合物沉积在所述容器中。
16.根据权利要求15所述的方法，还包括测量由所述组合物产生的氧梯度的步骤，特别是其中通过扫描电化学显微镜来进行所述测量。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述细胞培养物是癌细胞。
18.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述细胞是上皮细胞。
19.一种评估药物或化合物对生理或病理环境的影响的体外方法，包括在用于细胞的容器中培养细胞系的步骤，其中已经将根据权利要求1至10中任一项所述的组合物沉积在所述容器中，和
将所述药物或化合物添加至所述细胞系的后续步骤。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其中将所述组合物的所述基质封装在微球中。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述微球是磁性的。
22.一种制备以水凝胶形式的根据权利要求8至11中任一项所述的组合物的方法，包括以下步骤：
a)制备包含一种或多种能够催化氧还原的酶的溶液；
b)添加交联助剂；
c)将所述溶液凝胶化。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述交联助剂是戊二醛(GDA)。
24.根据权利要求22或23所述的方法，包括其中添加BSA的另一步骤。
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