CN110035778B - 用于替代器官或特定器官功能的生活装置、方法及其用途 - Google Patents

Abstract

描述了用于患者的器官替代或器官辅助治疗的装置和方法。

Description

用于替代器官或特定器官功能的生活装置、方法及其用途

相关申请

本申请文件根据35U.S.C.§119(e)要求于2016年9月6日提交的美国临时专利申请序列号62/383,928的申请日权益，该申请在此通过引用加入。

本文所引用的所有专利、专利申请和专利公开以及其它参考文献均通过引用整体加入本文中。这些出版物的公开内容通过引用整体加入本文中以更全面地描述在本文所述和所要求的发明之日时本领域技术人员已知的本领域的技术状况。

联邦政府资助的研究或开发

本发明在由美国国家科学基金会(National Science Foundation,NSF)授予的批准号CMMI–1548261的政府支持下做出。政府对本发明享有一定权利。

背景技术

1.技术领域

本文描述了用于替代器官或特定器官功能的装置、其制备或使用方法。

2.背景信息

目前，在大多数情况中，末期器官衰竭的唯一治疗方案是来自活人供体的移植。在过去数十年中，可用捐助者的数量保持不变，而需求却在稳步上升。目前正在研究器官供体短缺的若干解决方案，诸如，将已死亡供体器官去细胞化并用患者特异性细胞再细胞化(Du,C.et al.Functional Kidney Bioengineering with Pluripotent Stem-Cell-Derived Kidney Progenitor Cells and Decellularized Kidney Scaffolds.AdvancedhealthcareMaterials,doi:10.1002/adhm.201600120(2016)；以及Ko,I.K.etal.Bioengineered transplantable porcine livers with re-endothelializedvasculature.Biomaterials 40,72-79,doi:10.1016/j.biomaterials.2014.11.027(2015))。还有，用于异种移植的生长器官已经重新出现(Yang,L.et al.Genome-wideinactivation of porcine endogenous retroviruses(PERVs)。Science 350,1101-1104,doi:10.1126/science.aad1191(2015)；和Perkel,J.M.Xenotransplantation makes acomeback.Nat.Biotechnol.34,3-4,doi:10.1038/nbt0116-3(2016))。最后，在体外分化的小型类器官(Freedman,B.S.et al.Modelling kidney disease with CRISPR-mutantkidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.Nat Commun6,8715,doi:10.1038/ncomms9715(2015)；Morizane,R.et al.Nephron organoidsderived from human pluripotent stem cells model kidney development andinjury.Nat.Biotechnol.33,1193-1200,doi:10.1038/nbt.3392(2015)；Takasato,M.etal.Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and modelhuman nephrogenesis.Nature 526,564-568,doi:10.1038/nature15695(2015)；和Xia,Y.et al.The generation of kidney organoids by differentiation of humanpluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells.Nat Protoc 9,2693-2704,doi:10.1038/nprot.2014.182(2014))对于复制细胞异质性的器官是一个有希望的开始，但是其尺寸有限，结构紊乱，并且不能使用现有技术灌注血液。

治疗学已经从基于小分子发展到基于核酸、蛋白质、细胞，然而基于组织的治疗仍然局限于薄组织(诸如皮肤)或中空结构(诸如膀胱)。由于细胞异质性、缺少可灌注的脉管系统、患者特异性细胞源以及何时的构建方法，实体器官(例如，心脏、肾脏、肝脏、肺或脑)组织替代仍然只是设想(allusive)。

此外，使用组织作为治疗剂的实际挑战在于难以将人体的流体(血液、尿液等)与所制造的组织结合，必须要有新型的流体处理装置和设计。

例如，Humes的美国专利8,048,419描述了基于体外细胞的治疗装置和递送系统，其提供了用于治疗性递送活细胞所生产的生物活性分子的方法。然而，该专利及其它Humes专利和申请所描述的装置受限于其结构，细胞类型，更重要地，受限于其功能。

因此，需要器官移植和器官辅助的替代性解决方案。

发明内容

描述了一种能够容纳可调节血液并用作完全或部分器官替代物的活的灌注的组织构建物的设备及其制造方法。被容纳在该设备中的活组织构建物可被植入哺乳动物患者(人、狗、猫等)体内并用作完全或部分器官替代物。这种器官移植的解决方案不依赖于活人供体或动物来去取代或替代器官功能。

某些实施方式涉及一种用于患者的器官替代或器官辅助的设备，其包含：(a)限定内部空腔的外壳；(b)布置在外壳中的包含活细胞的可编程哺乳动物构建物，所述组织构建物在使用时适合于和能够进行以下中的至少一个：选自因患者器官的疾病或功能障碍而排出的患者体液的至少一种基本成分或细胞产物的过滤、再吸收、代谢、浓缩、改变或免疫调节和将该至少一种基本成分或细胞产物输送回患者体液中的一种或多种的类器官(organ-like)功能，或者将同一种或另一种基本成分或细胞产物中的至少一个生产、分泌和输送到患者体液中；和(c)用于连通患者与布置在外壳中的组织构建物的患者接口装置(patientinterface device)。组织构建物包含一个或多个组织模型(tissue pattern)，每个组织模型包含一种或多种预定细胞类型的多个活细胞；贯穿一个或多个组织模型的通道网络，所述贯穿通道是与组织模型一起3D-打印的；以及任选地，至少部分围绕一个或多个组织模型以及脉管通道网络的胞外基质组合物。一种或多种细胞类型的活细胞可为来自患者的细胞。活细胞可包括以下中的至少一种：肾近端小管细胞，亨利氏袢细胞、肾远端小管细胞、集合管细胞、系膜细胞、肾微血管细胞、肾细胞祖细胞、多能或多效干细胞、其它内皮细胞系细胞、内皮细胞、有孔肾小球内皮细胞或来源于iPSC的患者特异性细胞系。组织构建物可选自活细胞、类器官、拟胚体、内皮萌芽、自体组织、同种异体组织、异种组织和3D打印的组织构建物。组织构建物可包括嵌入式脉管系统。组织构建物可以是带有嵌入式脉管系统的管状组织构建物。管状组织构建物可以是肾单位、肠、乳导管、汗腺、结肠、食管、胃、耳咽管、气道上皮、附睾、细精管、尿道、肝胆管、胰管、胆总管、脑脊髓室和液管、腮腺、口腔粘膜、输卵管、输精管或淋巴。管状组织构建物可为带有嵌入式脉管系统的人近端小管。组织构建物可为上皮组织构建物。组织构建物可包括与细胞肾小球过滤单位和患者接口装置整合的具有贯穿脉管网络的组织构建物。细胞肾小球过滤单位可包括来源于iPSC的中间中胚层细胞。细胞肾小球过滤单位可包括来源于iPSC的足细胞。组织构建物可包括具有类肾单位功能的可灌注肾组织。患者接口可包括体外回路，外壳与体外回路相连。体外回路可包括第一管和第二管，其中所述第一管构造用于与患者的器官连通并允许患者的体液从患者的器官通过该第一管流到组织构建物，且所述第二管构造用于与患者的血管或生物管路(bioduct)连通并允许患者的体液从组织构建物通过该第二管流到患者中。所述设备可包括介于组织构建物与在使用时存在的体液之间的多孔屏障。多孔屏障可为产生超滤液的过滤器。多孔屏障可以是滤血器。多孔屏障可以是细胞过滤器。设备可适合于在将滤液返回患者体液之前从体液去除免疫原。设备还可包括至少一个泵以模拟患者的血压和流速。设备可构造为使组织构建物能暴露于一种或多种生物剂、生物剂梯度、压力和/或氧张力梯度。外壳可被构造和设置尺寸以供患者携带或穿戴。设备可构造为植入患者体内。患者接口可包括入口岐管和出口岐管，所述入口岐管位于外壳的入口侧并用于将体液分配到贯穿通道网络的多个入口，且出口岐管位于外壳的出口侧并用于从贯穿通道网络的多个出口手机体液。贯穿通道网络可包括第一通道、第二通道和第三通道，所述第一通道用于传递向组织构建物的动脉血供应，第二通道用于传递离开组织构建物的静脉血，且第三通道用于传递组织构建物从动脉血供应中提取的物质。出口岐管可包括至少三个部分，第一部分与贯穿通道网络的第一通道相连，第二部分与贯穿通道网络的第二通道相连，且第三部分与贯穿通道网络的第三通道相连。组织构建物可至少部分被生物可相容物质所围绕，其中生物可相容物质可为液体、凝胶、糊状形式或为基质。生物可相容物质可为胞外基质物质。生物可相容物质可包括以下中的一种或多种：明胶、纤维蛋白、matrigel、胶原、弹性蛋白、藻酸盐、PEG水凝胶、透明质酸和明胶甲基丙烯酸酯。

一些其它实施方式涉及用于需要肾治疗或辅助的患者的肾替代或辅助治疗的设备，其包括：(a)限定内部空间的外壳；(b)布置在外壳中的可编程哺乳动物组织构建物，所述组织构建物包含：多个近端上皮小管,多个内皮小管、多个活细胞和生物可相容物质；其中上皮小管和内皮小管彼此紧邻并且至少部分被胞外基质物质所围绕；近端上皮小管适合于和能够再吸收因患者肾脏疾病或功能障碍而排出的患者体液的至少一种基本成分并将所再吸收的至少一种基本成分或细胞产物输送回患者体液；并且近端上皮小管和内皮小管能够生产、分泌和输送同一种或另一种基本成分或细胞产物中的至少一个到患者体液中；和(c)用于流体连通患者与布置在外壳中的组织构建物的患者接口。组织构建物还可包含多个肾小球毛细血管。多个肾小球毛细血管可与可编程组织构建物整合在一起并形成细胞过滤器。生物可相容物质可为液体、凝胶、糊状的形式或为基质。生物可相容物质可以是胞外基质物质。生物可相容物质可包括以下中的一种或多种：明胶、纤维蛋白、matrigel、胶原、弹性蛋白、藻酸盐、PEG水凝胶、纤维素、粘多糖、蛋白多糖、透明质酸和明胶甲基丙烯酸酯。活细胞可包括以下中的至少一种：肾近端小管细胞、亨利氏袢细胞、肾远端小管细胞、集合管细胞、系膜细胞、肾微血管细胞、肾细胞祖细胞、多能或多效干细胞、其它内皮细胞系细胞、内皮细胞、有孔肾小球内皮细胞或来源于iPSC的患者特异性细胞系。

一些其它实施方式涉及治疗患有范康尼氏综合征的患者的方法，输送方法包括用本文所述设备治疗患者。

又另一个实施方式涉及从与患者的哺乳动物病症或疾病的诊断或治疗相关的哺乳动物体液中体外提取毒性物质的方法，其中通过将哺乳动物血液或血浆通过本文所述设备而从血液循环中完全或部分清除掉毒性物质。

另外的实施方式涉及治疗需要器官替代或器官辅助的患者的方法，其包括：(a)提供如权利要求1-39中任一项所述的设备，所述设备具有适合于患者与设备之间的体液交换的体外回路；(b)将从患者抽取的体液通过设备；和(c)将所抽取的体液作为再调节体液重新插入回到患者体内；由此治疗需要器官替代或器官辅助的患者。

一些其它实施方式涉及治疗需要器官替代或器官辅助的患者的方法，其包括：(a)将如权利要求1-36中任一项所述的设备植入患者体内，所述设备适合于患者与设备之间的体液交换；(b)将来自患者的体液通过设备；和(c)将通过的体液作为再调节体液返回到患者中；由此治疗需要器官替代或器官辅助的患者。

又另一个实施方式涉及用于患者的器官替代或器官辅助治疗的设备，其包括：(a)提供限定内部空腔的外壳；(b)将包含多个活细胞的活的可编程哺乳动物组织构建物布置在外壳中；其中组织构建物在使用时适合于和能够进行以下中的至少一种：选自因患者器官的疾病或功能障碍而排出的患者体液的至少一种基本成分或细胞产物的过滤、再吸收、代谢、浓缩、改变或免疫调节以及将所述至少一种基本成分或细胞产物输送回患者体液中的一种或多种的类器官功能；或生产、分泌和输送同一种或另一种基本成分或细胞产物中的至少一个到患者体液中；和(c)提供用于流体连通患者与布置在外壳中的组织构建物的患者接口。活的可编程哺乳动物组织构建物可通过打印带有嵌入式脉管系统的活的可编程哺乳动物组织构建物或者通过模塑通道而被布置到外壳中。打印包括：(a)沉积一个或多个载有细胞的细丝以形成一个或多个组织模型，每个载有细胞的细丝包含多个活细胞，每个组织模型包含一种或多种预定细胞类型；(b)沉积一个或多个牺牲细丝以形成贯穿一个或多个组织模型的脉管模型，每个牺牲细丝包含短效油墨；(c)任选地，用胞外基质组合物至少部分围绕一个或多个组织模型脉管模型，(d)去除短效油墨以在胞外基质组合物中产生脉管通道，由此形成具有贯穿血管网络的组织构建物。该方法还包括：(e)沉积大孔物质层以形成基底层；(f)在基底层上3D打印具有短效芯的管状多层结构；(g)将额外的大孔物质浇注在3D打印的中空管状多层结构上；(h)交联大孔物质；(i)去除短效芯以产生中空管状多层结构；(j)将来源于iPSC的中间中胚层细胞接种在3D打印的中空管状多层结构上；(k)在3D打印的中空管状多层结构中将iPSC分化为足细胞以产生足细胞层；由此产生细胞肾小球过滤单位。该方法还可包括整合具有贯穿脉管网络的组织构建物和细胞肾小球过滤单位和患者接口装置的步骤。在该方法中，沉积步骤可在基板上进行。多个活细胞可来源于患者的细胞或同种异体来源。多个活细胞可为工程化iPSC。多个活细胞可包括以下中的至少一种：肾近端小管细胞、亨利氏袢细胞、肾远端小管细胞、集合管细胞、系膜细胞、肾微血管细胞、肾细胞祖细胞、多能或多效干细胞、其它内皮细胞系细胞、内皮细胞、有孔肾小球内皮细胞或来源于iPSC的患者特异性细胞系。组织构建物可选自活细胞、类器官、拟胚体、内皮萌芽、自体组织、同种异体组织、异种组织和3D打印的组织构建物。组织构建物可包括嵌入式脉管系统。组织构建物可为与细胞肾小球过滤单位和单位和患者接口装置整合的具有嵌入式脉管系统的管状组织构建物。组织构建物可为肾单位、肠、乳导管、汗腺、结肠、食管、胃、耳咽管、气道上皮、附睾、细精管、尿道、肝胆管、胰管、胆总管、脑脊髓室和液管、腮腺、口腔粘膜、输卵管、输精管或淋巴。

一些其它实施方式涉及制造构造为植入患者体内用于患者的器官替代或器官辅助治疗的设备的方法，所述方法包括：(a)提供限定内部空腔的外壳；(b)将包含多个活细胞的可编程哺乳动物组织构建物不值到外壳中；其中组织构建物在使用时适合于和能够进行以下中的至少一种：选自因患者器官的疾病或功能障碍而排出的患者体液的至少一种基本成分或细胞产物的过滤、再吸收、代谢、浓缩、改变或免疫调节以及将所述至少一种基本成分或细胞产物输送回患者体液中的一种或多种的类器官功能；或生产、分泌和输送同一种或另一种基本成分或细胞产物中的至少一个到患者体液中；(c)提供用于当设备植入患者体内时流体连通患者与布置在外壳中的组织构建物的患者接口。组织构建物可在布置到外壳中之前在体外产生。可允许组织构建物在布置到外壳中之前在体外成熟。

附图说明

本专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。带有彩色附图的本专利或专利申请公开文本的复制本将通过请求和支付必要费用由官方提供。

图1描绘了所描述的设备的示例性实施方式。

图2描绘了所描述的设备的另一个示例性实施方式。

图3描绘了：(A)肾单位示意图，突出显示了盘绕的近端小管，(B,C)3D盘绕的可灌注近端小管构建中的不同步骤的对应示意图和图像，其中首先将短效油墨打印在明胶-纤维蛋白原胞外基质(ECM)上(i)，将额外的ECM浇注在打印特征上(ii)，排空短效油墨以产生开放小管(iii)，和将PTEC细胞接种在小管中并长时间灌注(iv)；(D)通过共焦显微镜获取的打印的盘绕近端小管的3D透视图，其中肌动蛋白被染成红色而核为蓝色；白色虚线表示下面显示的截面图的位置，其中PTEC细胞在3D上围绕开放空腔，比例尺＝500μm，(E)(d)中以白色方框指示的区域的较高倍图，比例尺＝200μm，(F)盘绕的肾近端小管的3D透视图其中被上皮衬里围绕的开放空腔在芯片上定向灌注，并且Na/K ATP酶被染成红色，乙酰化微管蛋白为橙色，突出显示了原纤毛，核为蓝色，比例尺＝50μm。

图4描绘了：(A)在第6周获取的成熟3D PT构建物的相衬图像，比例尺＝500μm，(B)在第6周获取的3D PT构建物的相衬图像，比例尺＝250μm，(C)在第5周获取的小管中PTEC的TEM图像，比例尺＝5μm，(D)在涂有ECM的2D培养皿上在无灌注条件下生长的PTEC的TEM图像，比例尺＝5μm，(E)在自然组织上看到的柱状上皮的示意图，其中PTEC紧密地堆积在一起并且在顶面、紧密连接和固体基底膜上显示密集刷状缘，(F)从3D PT构建物(3DP)以及三种2D对照物(2DP＝在ECM上2D有灌注的PTEC，2D＝在ECM上2D无灌注的PTEC，培养皿＝无灌注的裸组织培养皿)，*p<0.001，**p<0.02，(G)低倍(比例尺＝50μm)和较高倍(比例尺＝20μm)下的SEM图像，显示了3D PT中的PTEC融合层，白色箭头突出显示了以1个/细胞的密度存在的原纤毛，(H)部分小管的3D透视图，显示了顶面，其突出显示了原纤毛(红色)，比例尺＝20μm，(I)PT图像，以绿色突出显示了存在Na/K ATP酶，比例尺＝100μm，(J)3D PT图像，以黄色突出显示了存在AQP1，比例尺＝100μm，(K)(K)中图像的高倍图，以红色突出显示了肌动蛋白，以黄色显示AQP1，比例尺＝20μm。

图5描绘了：(A)第6周时PTEC顶面上的刷状缘的TEM图像，比例尺＝1μm，(B)第6周时PTEC基面的TEM图像，突出显示了存在工程化胞外基质(ECM)、细胞分泌的基底膜蛋白(BM)、基底外侧的交错结合(BI)和白色箭头指示的膜中的圆形内陷，比例尺＝1μm，(C)第6周时的PTEC，显示了细胞所分泌的基底膜蛋白，即层连蛋白(红色的主要蛋白)和胶原IV(绿色)，比例尺＝10μm，(D)PTEC和生物打印小管之间的紧密连接(白色箭头)，比例尺＝500nm，(E)PT中被染色的细胞连接蛋白K钙粘蛋白(magenta)，比例尺＝10μm，(F)微绒毛长度和(G)微绒毛密度，其通过以下的TEM图像定量：3D PT构建物(3DP)以及三种2D对照物(2DP＝在ECM上2D有灌注的PTEC，2D＝在ECM上2D无灌注的PTEC，培养皿＝无灌注的裸组织培养皿)，p<0.001。

图6描绘了：(A)3D近端小管中的白蛋白摄取测定。比较在若干条件在喂食FITC标记的人血清白蛋白2小时的PTEC的荧光强度的流式细胞仪数据，包括在裸(蓝色)和涂有ECM(绿色)塑料培养皿上的2D对照物以及灌注65日的3D PT(洋红色)。(B)比较与(A)中所示相同PTEC样品的megalin的荧光强度的流式细胞仪数据，(C)对FITC标记的白蛋白(红色)染色的3D PT构建物的荧光图像；(D)megalin(蓝色)，和(E)组合，比例尺＝20μm。

图7描绘了环孢霉素A-诱导的细胞毒性：(A-D)明视场图像，(E–H)3D透视图，和(I–L)用不同浓度的环孢霉素A给药24小时的打印和灌注的3D PT，其中肌动蛋白(绿色)和核(蓝色)被染色，分别为比例尺＝200μm(A–H)和比例尺＝20μm(I–L)，(M)在用环孢霉素A给药之后获取的扩散透过率测量结果，*p<0.003，**p<0.02，(N)在用环孢霉素A给药之后针对2D对照物(在裸培养皿上)测量的细胞活力(所示的所有种群在统计学上显著不同，p<0.005)。

图8描绘了多路复用的3D近端小管：(A)彼此相邻打印的6个PT的SEM图像，比例尺＝500μm。[注：在从打印样品上切下的薄干切片上获得图像。]，(B)在背景中显示的较大3DPT内获取的高倍图像，比例尺＝50μm。如这里所示，多个PT可平行打印并衬有生长至融合的PTEC细胞。

图9描绘了多种PTEC系的工程化胞外基质(ECM)和基因表达谱：(A)ECM成分的示意图及其根据不同刺激的凝胶化和交联，(B)涉及三种细胞系(原代PTEC、PTEC-TERT1和A498癌肾细胞系)的肾上皮功能、输送、胞吞作用、激素反应、损伤反应和细胞分化的33种选定基因的相对mRNA水平。PTEC-TERT1细胞在转录上与原代PTEC相似，并且与A498肾癌上皮细胞系不同。

图10描绘了3D近端小管成熟过程：(A)成熟(完全融合)小管的照片，(B)第0日的PTEC载量，比例尺＝500μm，(c)PTEC载量的较高倍视图，比例尺＝300μm，(d)在冲掉非贴壁细胞之后第1日贴壁到小管上的PTEC，比例尺＝200μm，(e)第2日生长到小管中的PTEC的低倍视图，比例尺＝500μm，(f)第4日的图像，其中细胞从菌落或簇生长，比例尺＝100μm，(g)第4日的图像，其中细胞接近融合，比例尺＝100μm，(h)第38日，成熟小管的图像，比例尺＝500μm，(i)第38日，融合小管的较高倍视图，比例尺＝100μm，(j)小管图像，由于其盘绕架构，其约为自身±350μm，比例尺＝100μm，(k)PT模型构建和成熟的时间轴。

图11描绘了3D近端小管灌注液分析。通过小管灌注的培养基中所含的(A)IL-6、(B)IL-8和(C)MCP-1随时间的相对浓度。浅灰色条表示小管的生长期。在第12日，小管接近融合，从培养基中去除FBS，融合小管的轮廓以深灰色条显示。注意在达到融合和去除了FBS之后，细胞因子水平稳定。

图12描绘了衬有PTEC细胞和嵌入到载有成纤维细胞的胞外基质的3D近端小管。3DPT的相称图像生长为融合上皮，其中成纤维细胞在周围的ECM中茁壮成长，比例尺＝100μm.

图13描绘了打印和灌注的3D近端小管中的PTEC表征。(A)针对Na⁺/K⁺ATP酶(绿色)和乙酰化微管蛋白(红色)染色的PTEC的3D重建，其中明显可见Na⁺/K⁺ATP酶的基底外侧表达，并且在顶面可看见两个原纤毛，比例尺＝10μm，和(B)原纤毛的TEM图像，比例尺＝1μm。(C)小管的横截面，显示了LTL(洋红色)的顶部表达和Na/K ATP酶(绿色)的基部表达，比例尺＝15μm，(d)小管的横截面，显示了OCT2(黄色)和胶原IV(红色)的基部表达，比例尺＝15μm。

图14描绘了扩散透过率测量结果。悬浮在细胞培养基中的FITC-标记的菊粉(4.5kDa)被灌注通过衬有融合PTEC的3D PT，并在不同时间捕获荧光图像：(A)t＝0min，和(B)对于衬有细胞的通道，t＝15min，和(C,D)对于由裸3D PT(无PTEC)组成的对照样品，分别为t＝0min和15min，其中FITC-标记的菊粉快得多地扩散到周围的ECM中，比例尺＝100μm。(E)带有或不带近端小管上皮的3D PT通道的扩散透过率测量值，*p>0.001。

图15描绘了对于用10μM环孢霉素A给药的打印和灌注的3D近端小管所观察到的伤害。(A)第4周时健康的近端小管的明视场图像，比例尺＝100μm，(B)在与环孢霉素A接触24小时之后小管的明视场图像，比例尺＝100μm，(C)在与环孢霉素A接触后24小时小管的活细胞(绿色)和死细胞(红色)染色，显示总细胞中<5％死亡，比例尺＝100μm，(D)在这些条件下观察到的最严重、但是很不常见的损害，其中肌动蛋白(绿色)和核(蓝色)倍染色，比例尺＝20μm.

图16描绘了环孢霉素A研究的扩散透过率测量结果。FITC标记的葡聚糖(70kDa)溶液通过衬有融合PTEC的3D PT灌注，并且在不同时间捕获荧光图像：(A)t＝0min，和(B)对于衬有细胞的通道，t＝45min，和(C,D)对于由裸3D PT(无PTEC)构成的对照样品，分别为t＝0min和5min，其中FITC-标记的葡聚糖快得多地扩散到周围的ECM中，比例尺＝200μm。

图17A描绘了用三层独立可寻址的可灌注管构建的我们的PT模型的照片。插图显示了有3个销钉连接至3个用荧光染料灌注的独立的管。这种多层模型是一个3D演示，展示生物打印如何能够与微流体结合以便接合脉管层和近端小管。

图17B描绘了被加载到胞外基质所围绕的两个通道中的细胞。具体而言，在内皮通道中，内皮细胞，诸如GMEC或HUVEC，在灌注下被加载到通道中并在其中成熟。在上皮通道中，上皮细胞，诸如PTEC，在独立控制的灌注下被加载到通道中并在其中成熟。该图证明了生物打印通道在可灌注芯片上能够足够接近以交换蛋白质和其他生物信号分子。通道之间的距离可低至20um或更少，这里显示的是～300um的间隔。

图17C描绘了图17B中图像的后退视图(backed out view)，其中显示了大孔架构。结合上皮和内皮小管的许多不同架构是可行的。在该构造中，一个小管是弯曲的，而其他是直的。在其他实施方式中，它们可以都是直的、弯曲的，或者在三维上与平面穿插交织。

图18描绘了在用100μM环孢霉素A给药24小时之后所打印和灌注的近端小管的3D透视图。PT分别用鬼笔环肽(phalloidin)和苯基吲哚(dapi)染色以使肌动蛋白细丝和细胞核可视化。

图19描绘了所提出的活的整合过滤-再吸收体外(Living IntegratedFiltration-Reabsorption Extracorporeal，LIFE)装置系统中血流的示意图。LIFE装置将模拟生理流动构造，其中血浆流动通过肾小球，随后通过近端小管。随后，血浆中的营养物将被PT再吸收并输送到血流中，后者将再次流动通过肾小球。

图20描绘了3D肾小球模型设计和制造步骤的示意图：(A)在体内，肾小球毛细血管(C)是通过足细胞(P)稳定的紧凑通道，并且由被密封在鲍氏囊(BC)中的肾小球膜(M)支撑，(21B)生物打印的肾小球毛细血管的三个不同层：内皮、足细胞和大孔支架所支撑的可降解凝胶，和(21C)制造生物打印肾小球毛细血管的方法。

图21描绘了：(A)iPSc定向分化为足细胞的时间轴的示意图。BMP7，(B)SEM图像，其显示了来源于iPSC的足细胞表现出初代和二代细胞过程，(C)先前使用的带有微通道的微流体装置的示意图schematic of the previously used microfluidic装置，其复制了肾小球的尿液和毛细血管隔室，(D)由来源于iPSC的足细胞(上部，绿色)和人肾小球内皮细胞(下部，洋红色)形成的组织-组织接口的3D重构共焦图像。

图22描绘了显示3D脉管化近端小管(PT)模型的设计规则和制造步骤的示意图。(A)在体内，管周毛细血管网围绕盘绕的小管片段，(B)透过性水凝胶内的两个并排通道，是的能够在PT和脉管系统之间经由扩散、渗透和主动细胞输送进行分子和流体交换，(C)双层小管网络的3D生物打印方法(蓝色小管表示近端小管，红色小管是脉管；分隔这两个网络的薄凝胶层是高透过性的，因此允许分子有效地通过其扩散)。

图23描绘了图表，其说明LIFE装置中的血液流动(可被灌注培养基或其他类生物流体替代)。灌注液的主流被泵驱使以如下顺序流动通过装置的每个部分：入球微动脉，肾小球毛细血管，鲍氏囊隔室，近端小管，随后是到集合管的出口。在装置构造中，细胞是在薄膜片上，而不是被ECM物质所3D围绕。

附图详细说明和目前优选的实施方式

2013年11月5日提交的美国临时专利申请61/900,029；2014年11月4日提交的国际专利申请PCT/US2014/063810均通过引用以其整体加入本文。

2015年3月3日提交的美国临时专利申请；和2015年11月3日提交的美国临时专利申请62/250,338；2016年3月3日提交的国际专利申请PCT/US2016/020601通过引用以其整体加入本文。

2015年5月5日提交的美国临时专利申请62/157,286；和2016年5月4日提交的国际专利申请PCT/US2016/030710，通过引用以其整体加入本文。

2016年2月11日提交的美国临时专利申请62/294,118通过引用以其整体加入本文。

描述了一种能够容纳生物可相容和活的(例如，人或动物)成分的设备，其可用体液灌注以重新调节患者的血液。设备可适合于体外使用，或者可以是带有硬壳(即，“外壳”)或根本没有壳子的可植入设备。

因此，一些实施方式涉及用于患者的器官替代或器官辅助治疗的设备。设备可包括限定内部空腔的外壳、布置在外壳中的包含活细胞的可编程哺乳动物(例如，人或动物，例如，猫、狗、马、牛等)组织构建物和用于患者和布置在外壳中的组织构建物之间的体液联通的患者接口。当体液与可编程(外部)哺乳动物组织接触时，可在流体上实施多种不同组织功能，包括过滤、再吸收、代谢、浓缩、排泄、改变组成、调理或免疫调节或任何其它器官功能。

术语“外壳”是指适合于和尺寸设为包含活组织构建物的任何中空结构。外壳可具有任何合适的形状，诸如球形、立方体、长方体、圆柱形、胶囊形、芸豆形或任何其他合适的形状。示例性装置在图1和图2中显示。如图1和图2所示，外壳限定了内部空间，并且可包含组织构建物。

术语“组织构建物”是指任何活细胞或组织，包括但不限于活细胞，其可来源于患者、单一或混合种群类器官、拟胚体、内皮萌芽、自体组织、同种异体组织、异种组织、打印组织构建物等。组织构建物可为人组织构建物。组织构建物可为动物(例如，猫、狗、马、牛等)组织构建物。组织构建物可为3D打印的组织构建物；然而，组织构建物不限于3D打印组织构建物。术语“可编程哺乳动物组织构建物”涉及具有程序化结构和功能的哺乳动物组织构建物的设计和组装。组织构建物可选自活细胞、类器官、拟胚体、内皮萌芽、自体组织、同种异体组织、异种组织和3D打印组织构建物。自体的、同种异体的或异种的组织可以是患者(例如，人或动物)-特异性的、现成非定制的或来自另一个动物物种。

术语“患者”是指人或动物(例如，猫、狗、马、牛等)受试者。

组织构建物可为管状组织构建物。示例性的管状组织构建物包括但不限于肾单位、肠、乳导管、汗腺、结肠、食管、胃、耳咽管、气道上皮、附睾、细精管、尿道、肝胆管、胰管、胆总管、脑脊髓室和液管、腮腺、口腔粘膜、输卵管、输精管或淋巴。

在某些实施方式中，管状组织构建物是人近端小管或具有嵌入式脉管系统的小管。

在一些其他实施方式中，组织构建物是上皮组织构建物。

在某些实施方式中，这些组织构建物包含嵌入式脉管系统。3D打印的组织构建物和类器官以及它们的制造方法先前在以下文献中描述：2016年5月4日提交的PCT公开WO2015/069619及其相应的美国专利申请序列号15/146,613；2016年5月4日提交的申请PCT/US2016/030710，题为"Tubular Tissue Construct and a Method of Printing"；2016年2月11日提交的美国临时申请62/294,118，题为"Mixed Population Organoids andMethods of Producing the Same"，以上文献通过引用以其整体全部加入。

术语“拟胚体”是指成形为三维球体、椭球体或其他三维形状的包含多能或多效干细胞的多个细。术语“类器官”是指其细胞已经历了一定程度分化的拟胚体。我们承认类器官与拟胚体之间的区别仍属未知，并且这些术语的使用应视为可互换的。

组织构建物可包含一个或多个组织模型、贯穿一个或多个组织模型的通道网络以及任选的至少部分围绕一个或多个组织模型和脉管通道网络的胞外基质组合物，其中每个组织模型包含一种或多种预定细胞类型的多个活细胞，并且贯穿通道是与组织模型一起3D-打印的。在替代性实施方式中，通道可为模制的；例如，可用基质浇注以产生纤维或销钉的阵列，其中销钉随后被去除。

适合于放置在所描述的设备的外壳中的组织构建物在使用中适合于和能够进行以下中的至少一种：

(a)选自因患者器官的疾病或功能障碍而排出的患者体液的至少一种基本成分或细胞产物的过滤、再吸收、代谢、浓缩、改变或免疫调节以及将所述至少一种基本成分或细胞产物输送回患者体液中的一种或多种的类器官功能；和/或

(b)生产、分泌和输送同一种或另一种基本成分或细胞产物中的至少一个到患者体液中。

一种或多种类型的活细胞可为来源于患者的细胞。

来源于患者的细胞可包括但不限于以下中的至少一种：肾近端小管细胞、亨利氏袢细胞、肾远端小管细胞、集合管细胞、系膜细胞、肾微血管细胞、肾细胞祖细胞、多能或多效干细胞、其它内皮细胞系细胞、内皮细胞、有孔肾小球内皮细胞或来源于iPSC的患者特异性细胞系。

在某些实施方式中，组织构建物可至少部分被生物可相容物质所围绕。在某些实施方式中，生物可相容物质可以是胞外基质物质。胞外基质物质可包含多种组分，包括但不限于以下中的一种或多种：明胶、纤维蛋白、胶原I或任何其它胶原类型、藻酸盐、PEG水凝胶，和明胶甲基丙烯酸酯。

所描述的设备还包括包含体外回路的患者接口。体外回路可包括用于连通患者器官、血管和/或生物管路的管子。例如，在某些实施方式中，体外回路可包括：(i)第一管，其构造为连通患者的器官并且允许患者的体液从患者的器官通过该第一管流到组织构建物；和(ii)第二管，其构造为连通患者的血管或生物管路并允许患者的体液从组织构建物通过该第二管流到患者中。

在某些实施方式中，设备构造为使得组织构建物能暴露于一种或多种生物剂、生物剂梯度、压力和/或氧张力梯度。

在某些实施方式中，所描述的设备的外壳构造为和尺寸设为供患者携带或穿戴。因此，在某些实施方式中，所描述的设备可以是能够替代组织或器官-水平功能(例如，过滤、再吸收、代谢、浓缩、改变或免疫调节)的体外装置。体外装置或设备的优点在于，在需要的情况下，与移除植入装置所需的劳力相比，其容易从循环系统中取出。

在某些替代性实施方式中，设备可构造为植入患者体内作为器官替代或辅助。

如上所述，设备也可包含患者结构。患者接口可包含入口岐管和出口歧管，所述入口歧管位于外壳的入口侧并用于将体液分配至贯穿通道网络的多个入口，所述出口歧管位于外壳的出口侧并用于从贯穿通道网络的多个出口收集体液。贯穿通道网络可包括用于连通对组织构建物的动脉血供应的第一通道、用于连通离开组织构建物的静脉血的第二通道和用于连通组织构建物从动脉血供应中提取的物质的第三通道。出口岐管可包含至少三个部分，与贯穿通道网络的第一通道相连的第一部分，与贯穿通道网络的第二通道相连的第二部分，和与贯穿通道网络的第三通道相连的第三部分。诸如血液或尿液的体液可通过通道灌注，在这里细胞组分调节交换。

令人惊讶地，装置适合于和能够再吸收因患者器官的疾病或功能障碍而不期望地排出的患者体液的基本成分或细胞产物并且用这些基本成分和/或细胞产物重新调节生理流体。另外，装置能够产生并随后分泌同一种或不同的基本成分或细胞产物到血液或体液中。

在某些实施方式中，体外装置能够再吸收患者体液的基本成分并用这些基本成分重新调节生理流体，所述患者体液是由于患者器官的疾病或功能障碍、诸如因例如范康尼氏综合征而不期望地排除的。装置再吸收和直接递送这些基本成分到血流或体液中。另外，装置适合于产生并随后分泌同一种或不同的基本成分或细胞产物到血流或体液中。

术语“基本成分(essential component)”是指代谢的各种小分子、离子、水喝蛋白质。基本成分包括但不限于，例如，葡萄糖、氨基酸、尿酸、磷酸盐、碳酸氢盐、白蛋白、激素等。在某些疾病条件下，这些基本成分被通入尿液中而不是被再吸收回到患者血液中。

在一些其他实施方式中，装置还可用于直接递送治疗有效量的治疗剂，诸如药物(例如，抗凝剂、免疫调节剂等)到患者的血流或体液中。

在某些实施方式中，所描述的设备的患者接口还可包含锚定元件，所述锚定元件将装置锚定于在体外循环体液(诸如血液)并形成"体外回路"的管子的内表面上。术语“体外回路”表示位于体外的任何管子或导管，其可连接到哺乳动物的循环系统或体液隔室中，并通过自然(例如，心脏)或人工(例如，机械泵)循环提供穿过该管子或导管的体液(诸如血液或流体)的流动。在某些实施方式中，所描述的装置的外壳与体外回路相连。

术语“锚定元件(anchoring element)”是指如下结构：其可被插入到体外循环系统血管或导管的空腔中，并且一旦被插入则可通过钩子、倒钩或支架锚定与管子或导管的内表面。在示例性的实施方式中，锚定元件可以是血凝块过滤器型结构。多种血凝块防迁移过滤器是本领域中已知的。锚定元件的一个实例是被称为“

腔静脉过滤器”的防迁移过滤器。可用的

腔静脉过滤器在美国专利4,817,600和5,059,205中详细描述，其全部公开内容通过引用加入本文。

在一些其他实施方式中，所描述的设备可包含位于组织构建物与在使用时存在的体液之间的多孔屏障。例如，多孔屏障可以是过滤器，诸如产生超滤液的滤血器。

在某些实施方式中，装置可包括带有孔的半渗膜过滤器，优选孔径足以允许基本成分和细胞产物扩散通过其中，但仍然足够小以至于排除了细菌从其中通过。孔优选设计为允许细胞所产生的或者再吸收的基本成分直接扩散到血流中，防止细胞迁移到组织构建物外部进入系统循环中。

在某些替代性实施方式中，装置包含细胞过滤器。

在某些实施方式中，设备适合于在将过滤液返回到患者体液中之前从体液去除过敏原。

在一些其他实施方式中，所描述的设备还可包含至少一个泵以模拟患者的血压和流速。

还公开了复杂性更高的装置，其中管外空间中的细胞也可介导交换或调节免疫系统。例如，在上皮化或内皮化小管中、周围或附近包封β胰岛、类器官、滤泡细胞或一般细胞球体可介导交换。在一些实施方式中，装置中的生物可相容的活的成分可构成带有或不带外壳的可植入治疗剂。

在一些其他实施方式中，所描述的装置能够容纳呈细胞性结合到动脉血流中的类器官(图2中上方的大管)以及其下的分别排入收集袋和肾静脉的集合管和脉管系统。该装置将能够过滤和再吸收。在前面的实施方式中，该装置可在体外，但是具有在使用或不使用硬外壳的情况下植入的能力。

在某些实施方式中，组织构建物可为与细胞肾小球过滤单位和患者接口装置(例如，微流体平台)整合的具有贯穿血管网络的组织构建物。重要地，流体可在装置的隔室之间流动，并且可被泵、心脏压力、空气压力或重力流所驱动。

术语“与……整合”表示邻接或接近以使得可以通过纯流体界面、通过多孔凝胶或通过任何类型的多孔网从脉管网络中的细胞到肾小球或上皮网络的细胞进行流体交换。在某些实施方式中，肾小球细胞也可位于那些装置内部的衬有血管细胞的微流体装置、膜或通道的顶上、附近或内部。

术语“微流体平台”是指如下的任何平台：通过该平台，使用任何类型的泵、重力供给的压力或者空气压力系统来灌注培养基、血液或任何其他生理流体以控制流动。

在以下的实施例2中更详细的描述和在图19中示意性显示了示例性的与细胞肾小球过滤器在微流体平台上整合的具有贯穿血管网络的组织构建物及其制造方法。

在一些实施方式中，细胞肾小球过滤单位可包含来源于iPSC的中间中胚层细胞。

在一些其它实施方式中，细胞肾小球过滤单位可包含来源于iPSC的足细胞。

所描述的装置可用于治疗多种疾病和病症或者用于多种病症的疾病建模中。

在某些实施方式中，所描述的装置可用于肾替代或辅助治疗。例如，生物物质基质中的上皮小管和内皮小管或开放通道可紧邻放置(介于约2μm和约500μm之间)。来自输尿管或来自患者排出废物的尿液可通过近端小管被灌注到装置中。患者在诸如范康尼氏综合征的疾病中流失的尿液中通过的基本成分将在我们的装置中被近端小管再吸收，并经由脉管系统或基底侧访问小管输送回学院中。

图1显示了示例性的装置，其中近端小管紧邻血管并且通过歧管系统(未示出)灌注。

一些其它实施方式涉及在需要肾替代或辅助治疗的患者中用于肾替代或辅助治疗的设备。设备包括限定内部空间的外壳；布置在外壳中的可编程哺乳动物组织构建物；以及用于流体连通患者与布置在外壳中的组织构建物的患者接口。在该实施方式中，组织构建物可包括多个近端上皮小管、多个内皮小管和任选地例如液体、凝胶、糊状形式或基质形式的生物可相容物质(例如，胞外基质物质，其包括例如以下中的一种或多种：明胶、gelma、纤维蛋白、matrigel、胶原、藻酸盐、PEG水凝胶、透明质酸和明胶甲基丙烯酸酯)；其中上皮小管和内皮小管彼此紧邻，并且至少部分被胞外基质物质所围绕；近端上皮小管适合于和能够再吸收由于患者肾脏的疾病或功能障碍而排出的患者体液的至少一种基本成分，并将再吸收的至少一种基本成分或细胞产物输送回到患者体液中；和近端上皮小管和内皮小管能够生产、分泌和输送同一种或另一种基本成分或细胞产物中的至少一个到患者体液中。组织构建物还可包含多个肾小球毛细血管或肾脏的其他结构元件。

例如，所描述的装置可用于治疗范康尼综合征或范康尼氏综合征，其是肾脏的肾近端小管再吸收不足的综合征。该装置可因多种先天性或后天性疾病、通过毒性(例如，来自毒性重金属)或通过不良药物反应引起。其导致多种代谢小分子被通入尿液而不是从小管液中被再吸收(例如，葡萄糖、氨基酸、尿酸、磷酸盐和碳酸氢盐)。范康尼综合征影响近端小管，即，近曲小管(PCT)，其是在通过肾小球和近直管(直肠)过滤之后处理流体的小管的第一部分，其通向亨利式袢的降支。

不同形式的范康尼综合征能影响近端小管的不同功能，并且导致不同的适应症。碳酸氢盐的流失导致2型或近端肾小管酸中毒。磷酸盐的流失导致骨病佝偻病和骨软化(甚至在维生素D和钙水平充足的情况下)，这是因为对于儿童骨发育和甚至对成人的持续骨代谢来说磷酸盐都是必需的。

一些其它实施方式涉及使用所描述的装置用于肝脏辅助(加入类似肝脏的器官)、胰岛素生产(加入β胰岛)或激素生产(甲状腺或胸腺的成分)。

一些其它实施方式涉及从与患者的哺乳动物病症或疾病的诊断或治疗相关的哺乳动物体液中体外提取毒性物质的方法，其中通过将哺乳动物血液或血浆通过所描述的设备来从血液循环中完全或部分清除掉所描述的毒性物质。

一些其它实施方式涉及治疗需要器官替代或器官辅助的患者的方法，其包括：(a)提供具有适合于患者与设备之间的体液交换的体外回路的所描述的设备；(b)将从患者抽取的体液通过该设备，由此重新调节体液；和(c)将所抽取的体液作为重新调节的体液重新插入到患者体内；由此治疗需要器官替代或器官辅助的患者。

一些其它实施方式涉及治疗需要器官替代或器官辅助的患者的方法，其包括：(a)将适合于患者与设备之间的体液交换的所描述的设备植入患者体内；(b)将来自患者的体液通过设备，由此重新调节体液；和(c)将重新调节的体液返回到患者；由此治疗需要器官替代或器官辅助的患者。术语“重新调节的体液”是指已通过具有器官水平功能(诸如过滤、再吸收、代谢、浓缩、排出、组成改变、调理或免疫调节或任何其他器官功能)的所描述的装置处理的体液。

在某些实施方式中，装置可适合于自体治疗，客观分析结果，将数据存储到本地或中央存储单元，和为患者及医疗保健专业人士提供全面接口以分析和观察结果并将这些结果与治疗程序中的进展相关联。这种自我治疗可根据实时监测和变化的方案来适应患者需求的特定情况。

一些其它实施方式涉及制造用于患者的器官替代或器官辅助治疗的设备的方法。所述方法包括：(a)提供限定内部空腔的外壳；(b)将可编程组织构建物布置在外壳；和(c)提供用于流体连通患者与布置在外壳中的组织构建物的患者接口。所述组织构建物在使用时适合于和能够进行以下中的至少一种：选自因患者器官的疾病或功能障碍而排出的患者体液的至少一种基本成分或细胞产物的过滤、再吸收、代谢、浓缩、改变或免疫调节以及将所述至少一种基本成分或细胞产物输送回患者体液中的一种或多种的类器官功能；或生产、分泌和输送同一种或另一种基本成分或细胞产物中的至少一个到患者体液中

在某些实施方式中，将人工来源的哺乳动物组织构建物布置到外壳中是通过打印进行的，并且可包括：沉积一个或多个载有细胞的细丝以形成一个或多个组织模型，其中每个载有细胞的细丝包含多个活细胞，每个组织模型包含一种或多种预定细胞类型；沉积一个或多个牺牲细丝以形成贯穿一个或多个组织模型的脉管模型，每个牺牲细丝包含短效油墨；任选地，用胞外基质组合物至少部分围绕一个或多个组织模型和脉管模型，和去除短效油墨以在胞外基质组合物中产生脉管通道，由此在组织构建物中形成贯穿脉管网络。

在替代性实施方式中，通道可为模制的，例如，可产生纤维或销钉的阵列，当浇注了基质之后，去除销钉。

在某些实施方式中，可使用基板来沉积组织构建物成分；在替代性实施方式中，可使用包含嵌入式打印的无基板方法。也可摄像在外壳中沉积可编程哺乳动物组织构建物的其他方法。例如，可通过使用销钉拔出法(pin pull-out)以进行将可编程哺乳动物组织构建物布置到外壳中的步骤以产生血管和上皮网络。先前在以下文献中描述了一些打印三维活器官、产生带有或不带嵌入式脉管系统的类器官、拟胚体、内皮萌芽的替代性方法：2016年5月4日提交的PCT公开WO 2015/069619及其相应的美国专利申请序列号15/146,613；2016年5月4日提交的申请PCT/US2016/030710，题为“Tubular Tissue Construct andMethod of Printing；”2016年2月11日提交的美国临时专利申请62/294,118，题为“MixedPopulation Organoids and Methods of Producing the Same,”上述文献通过引用以其整体全部加入。在某些实施方式中，多个活细胞来源于患者的细胞或来自同种异体来源(例如，工程化iPSC)。来源于患者的细胞包括但不限于以下中的至少一种：肾近端小管细胞、亨利氏袢细胞、肾远端小管细胞、集合管细胞、系膜细胞、肾微血管细胞、肾细胞祖细胞、多能或多效干细胞、其它内皮细胞系细胞、内皮细胞、有孔肾小球内皮细胞或来源于iPSC的患者特异性细胞系。

组织构建物可选自活细胞、类器官、拟胚体、内皮萌芽、自体组织、同种异体组织、异种组织和3D打印的组织构建物。组织构建物可包括嵌入式脉管系统。组织构建物可为管状组织构建物，诸如肾单位、肠、乳导管、汗腺、结肠、食管、胃、耳咽管、气道上皮、附睾、细精管、尿道、肝胆管、胰管、胆总管、脑脊髓室和液管、腮腺、口腔粘膜、输卵管、输精管或淋巴。

一些其它实施方式涉及制造构造为植入患者体内以用于患者的器官替代或器官辅助治疗的设备的方法。上述方法包括将完全活的器官/组织构建物移植到患者中。在该实施方式中，器官/组织构建物可在体外制成，在如本文上述的设备中成熟，随后将其移植到体内。在某些实施方式中，器官/组织构建物可与外壳一起植入。在替代性实施方式中，器官可不带外壳植入。在一种情况中，器官/组织构建物能够替代任何器官功能。上述方法包括：(a)提供限定内部空腔的外壳；(b)将包含活细胞的可编程哺乳动物活组织构建物布置到外壳中；(c)提供用于流体连通患者与布置在外壳中的组织构建物的患者接口；和(d)将设备植入患者体内。组织构建物在使用时适合于和能够进行以下中的至少一种：(i)选自因患者器官的疾病或功能障碍而排出的患者体液的至少一种基本成分或细胞产物的过滤、再吸收、代谢、浓缩、改变或免疫调节以及将所述至少一种基本成分或细胞产物输送回患者体液中的一种或多种的类器官功能；或(ii)生产、分泌和输送同一种或另一种基本成分或细胞产物中的至少一个到患者体液中。

在某些实施方式中，组织构建物可在布置到外壳中之前在体外产生。可允许组织构建物可为在布置到外壳中之前在体外成熟。

在某些实施方式中，通过如上所述地打印带有嵌入式脉管系统的构建物将组织构建物布置到外壳中。

在某些实施方式中，通过结合iPSC定向分化技术、微流体和3D生物打印，组织构建物可包含在宏观尺度上显示肾过滤和再吸收的互相连接的3D肾小球和近端小管模型(实施例2)。

一些其它实施方式涉及构建密集堆积的、可灌注的血管和近端小管的制造方法，所述血管和近端小管分别有融合的内皮和上皮限定，并且被嵌入到包含足细胞或其他关注细胞的胞外基质内。

本文所述的装置和方法可用于肾研究、药物开发和细胞尺度和生物尺度上的疾病建模上。重要的是，本文所述的装置和方法提供了建立替代过滤和再吸收肾功能的体外活医学装置的基本步骤。

通过引用以其整体加入的是以下专利文献和专利公开：美国专利6,582,955；5,741,334；6,561,997；6,913,588；7,048,856；7,540,963；8,048,419；U.S.Pat.Pub.Nos.2008/0112995；2006/0286078；2003/0118559；2004/0024342；2004/0124147；2006/0213836；2007/0269489；和PCT公开WO 2006/138537；WO 2003/020104；WO2000/064510；WO 2004/024300；和WO 2007,092735.

实施例

实施例1

对概括了自然功能的人组织和最终的器官进行工程化以用于药物筛选、疾病建模和再生医学是一项重大挑战。由于处方药^1,2,3的使用增多，慢性和急性肾损伤的发病率飙升。尽管在临床中观察到约25％的急性肾衰竭是药物引发的²，但在临床前体外或动物研究中预测肾毒性仍然很困难。实际上，肾毒性仅占临床前药物测试失败的2％，但它导致三期临床试验中近20％的失败^3,4,5。因此，在临床上需要既能在纵向临床前测试中预测人类药物毒性也能用作工程化人肾单位以及最终的肾脏的模块化构建模块的改进的肾组织模型。

尽管肾损伤能发生在许多部位，包括肾脉管网络、肾小球、肾小管间质和集合管，盘绕的近端小管(PT)是最经常受损的部位(图3(A))¹。PT负责65–80％的营养物吸收和从肾滤液到血液的吸收，因此，循环药物及其代谢物通常在PT中在细胞内和细胞间空间中高浓度积累。不幸的是，与其体内对应物相比，在传统的2D细胞培养基中生长的近端小管细胞通常缺乏或迅速流失关键的表型和功能方面，诸如细胞急性、顶部刷状缘和显著的受体介导的输送，阻碍了准确的体内肾毒性纵向预测⁶。重现近端小管细胞体内表型和功能的体外模型能得到更有预测性的肾毒性模型。

朝向这个目标，已开发了数种肾PT模型⁷。已在生物模拟基底膜涂层或者中空纤维上培养了近端小管细胞^8,9,10,11，改进了其增殖和自体组构能力并保持了分化状态^12,13,14。也尝试进行研究以重新创建肾的复杂3D微环境。例如，已显示分化的近端小管细胞在薄凝胶中组装为3D结构^15,16，并且最近已制成了来源于诱导多能干细胞的肾脏类器官，其包含多种肾单位特征^{17,18,19,20,21}。尽管新出现的组织复杂性令人信服，肾脏类器官仍限制于仅1毫米的尺寸并且缺乏可寻址的入口和出口。因此，这些类器官中的近端小管不能被直接探知，也不能容易地收集和分析它们的灌注液。迄今，仅在肾芯片(kidney-on-a-chip)装置上实现了灌注，所述肾芯片由接种在多孔膜上的单一近端小管细胞层组成²²。尽管其为平面排列，这些装置中的近端小管细胞经历了受控的剪应力环境²³，这显著增强了其分化状态以及其对肾毒性药物的反应。然而，这些现有模型中的每个均缺少一种或多种特有特征，即，实现真实生物模拟PT模型所需的3D盘绕、开放空腔架构、以生理学剪应力灌注和长寿命⁷,²⁴。

一种适合生产复杂空腔组织架构的新出现的方法是3D生物打印，我们首先利用了这种方法来血管化人组织^25,26。这里，我们报告了结合生物打印、3D细胞培养和器官芯片概念的方法以生产包含可灌注开放空腔的3D盘绕的肾近端小管(PT)，所述可灌注开放空腔具有可编程架构，其能支持关外细胞异质性。这些3D盘绕的PT由开放空腔架构限定，所述开放空腔架构由近端小管上皮细胞(PTEC)限定，嵌入到胞外基质中，并且被容纳在可灌注组织芯片中，在这里其经受生理学剪应力。PTEC形成了融合的上皮单层，其显示原纤毛并表达Na⁺/K⁺ATP酶、水通道蛋白1(AQP1)和K钙粘蛋白。此外，可通过收集小管灌注液分析PTEC产生的细胞因子。其3D集合和所收集的灌注液的独特组合得到了分化程度更高的极化PTEC表型，相对于灌注和未灌注的2D对照物，其发展了增强刷状缘、基底膜蛋白质沉积、基底外侧交错接合、增强的细胞高度、megalin表达和白蛋白摄取。通过直接成像上皮和量化上皮的扩散透过率，分析肾毒素环孢霉素A的作用。就我们所知，这是具有可寻址开放空腔并且可纵向保持的生物打印3D盘绕近端小管的第一次示范。

方法

胞外基质制备和流变学

ECM包括明胶网络和纤维蛋白。为制备ECM成分，首先通过如下方式制备15wt/v％明胶溶液(A型，300Bloom，来自猪皮，Sigma)：将明胶粉末添加到DPBS(1倍的Dulbelco's磷酸盐缓冲盐水，不含钙和镁)的温热溶液(70℃)中。通过于70℃搅拌12h使明胶完全溶解，随后使用1M NaOH将pH调节到7.5。将溶液无菌过滤并以4℃等分存储以备后期用于浇注(<3个月)。通过如下方式制备纤维蛋白原溶液(50mg/mL)：将冻干牛血浆蛋白(Millipore)于37℃溶解在不含钙镁的无菌DPBS中。将溶液不搅拌于37℃保持至少45min以允许完全溶解。转谷氨酰胺酶(TG)溶液(60mg/mL)如下制备：将冻干粉末(Moo Gloo)溶解在不含钙镁的DPBS中并轻轻混合20秒。随后将溶液于37℃保持20min，并在使用前无菌过滤。如下制备CaCl₂储备溶液(250mM)：将CaCl₂粉末溶解在不含钙镁的DPBS(Corning)中。为制备凝血酶储备溶液，将冻干凝血酶(Sigma Aldrich)使用无菌DPBS以500U/mL重建并于-20℃存储。凝血酶等分试样解冻后即用。

使用具有以下参数的受控应力流变仪(DHR-3,TA Instruments,New Castle,DE)进行油墨流变性测量：40mm直径，2°锥形和平板几何形状。剪切存储(G′)和流失(G″)模量以1Hz频率和0.01的振荡应变(γ)测量。通过将包含凝血酶的预混合ECM溶液快速放置到保持在37℃的Peltier板上来进行时间扫描。

油墨配方

可灌注PT模型的3D生物打印需要两种油墨。一种油墨用于产生灌注芯片垫片，其由双组份硅树脂弹性体(SE 1700,DOW Chemical)组成，其中基材与催化剂之比为(以重量计)，所述油墨使用离心混合器均化2min(2000rpm,AE-310,Thinky Corp,Japan)。硅树脂油墨在与催化剂混合之后2小时内打印。这种油墨被装载在注射器(EFD Inc.,EastProvidence,RI)中，在打印前于室温去除任何气泡。另一种油墨是用于打印小管的短效油墨，其由在去离子超滤(DIUF)水中的38wt％Pluronic F127(Sigma)和100U/mL凝血酶组成。短效油墨通过添加Risk Reactor染料染成粉色，用于图3中的可视化。为制备这种油墨，将在水中的40wt％Pluronic F127溶液使用Thinky混合器均化，直到粉末完全溶解，随后于4℃存储。在使用前，将2000U/mL凝血酶溶液以1:20的比率添加到短效(Pluronic)油墨中，并使用Thinky混合器均化。随后将短效油墨于4℃装载在注射器中(EFD Inc.,EastProvidence,RI)，并离心以去除任何气泡。在打印前，将该油墨于室温平衡至少15min。

可灌注3D近端小管构建物的生物打印

使用定制设计的多材料3D生物打印机构建3D PT构建物，所述生物打印机配有四个独立可寻址的打印头，所述打印头被安装在3轴运动控制的龙门架上，构造体积为725mm×650mm×125mm(AGB 10000,Aerotech Inc.,Pittsburgh,PA USA)。油墨被容纳在独立的注射器筒内，不同尺寸(即，直径50mm–410 1m)的喷嘴通过鲁尔锁(luer-lock)(EFD Inc.,East Providence,RI,USA)连接到注射器筒上。通过如下方式将油墨通过沉积物喷嘴挤出：施加10-90psi的空气压力(800Ultra分配系统，EFD Inc.,East Providence,RI,USA)对应于mm/s至5cm/s的打印速度。我们首先通过将硅树脂油墨通过锥形410mm喷嘴沉积到50mm×75mm载玻片上来打印定制的灌注芯片垫片。使用定制MATLAB脚本产生垫片设计，其生成用于最终垫片结构的G-code。在打印之后，将灌注芯片垫片于80℃在烘箱中固化>1h并在使用前于室温存储。

在灌注芯片内进行3D PT的构图需要浇注ECM和打印短效油墨的组合。首先，通过结合10mg/mL纤维蛋白原、7.5wt％明胶、2.5mM CaCl₂和0.2wt％TG产生ECM溶液。随后在使用前将该溶液于37℃平衡15–20min以改善ECM的透明度²⁵。接下来，将溶液以500:1的比率与凝血酶快速混合，得到最终凝血酶浓度为1U/mL。接着，于37℃在两分钟之内进行纤维蛋白原到纤维蛋白凝胶的聚合。为此，必须在ECM溶液与凝血酶混合之后立即将其浇注到灌注芯片的基底上。随后使基底ECM层在氮气下稍微干燥以使其形成平整表面。使用最细00/m喷嘴以盘绕细丝(小管)的形式将短效Pluronic F127油墨(with 100U/mL凝血酶)打印在基底ECM层上。使用定制Python脚本(MeCode)标明G-code形式的工具路径。在短效油墨打印之后直接将通过硅树脂垫片接合的金属中空灌注销钉与打印油墨接触。随后通过如上所述地将ECM溶液在打印小管上方浇注到垫片壁高±1-2mm以形成ECM顶层。如果在ECM中加入了细胞，诸如HNDF(图12)，其可在平衡期之后、在凝血酶混合和随后的浇注之前直接混入。在浇注了ECM顶层之后，用载玻片覆盖构建物以防止蒸发或污染，于37℃保持1h以允许纤维蛋白聚合终止和TG交联网络。随后将构建物冷却至4℃并保持15–20min以液化打印的短效油墨，使用冷细胞培养基将其冲洗掉，留下开放导管，后者用作所需的嵌入到ECM中的管状网络，其中在所述ECM中，在管外的ECM空间中含有或不含细胞。

使用该方法，我们还以逐层构建的方式生产了3D架构。例如，图16中所示三层结构中的每个独立层均使用包含先前所述物质和方法的改进打印规则构建。在用短效油墨打印了第一小管之后，将ECM层浇注在打印物上并允许其于37℃凝胶化20min，随后在最近凝胶化的层上方用短效油墨打印下一个近端小管层。这种连续构建加入了3D几何并允许在构建之后独立地成功评价所有通道。通过通道灌注水基风险反应染料(risk reaction dye)，并用UV光激发以可视化。

为完成3D组织芯片组装过程，将每个PT构建物放置在机加工不锈钢底座上并在顶部放置厚的丙烯酸盖子。盖子和底部通过四个螺栓夹紧在一起，在打印硅树脂垫片周围形成密封。接下来，将无菌双堵头蠕动泵管(PharMed BPT,0.25mm内径)用培养基充满并连接到无菌过滤器出口，所述无菌过滤器与10ml注射器筒(EFD Nordson)相连，其用作培养基储器。已在温育器里于37℃平衡>3h的PTEC培养基(设计用于生长，因此ATCC配方加1％FBS、1％抑肽酶和1％抗-抗)，向培养基储器中添加5％CO₂，将来自储器的管子连接到芯片出口(金属中空灌注销钉)。随后使用注射器对筒中的培养基施加轻微压力，迫使其进入和完全充满所连接的管子。在将管子连接到回路之前将其用培养基充满防止了向系统中引入气泡。为完成灌注回路，将来自储器的硅树脂管连接到芯片上金属灌注销钉入口。在灌注芯片入口和出口处添加软管封口夹以防止在与蠕动泵脱离时不受控制的流动，这种流动会损害上皮或允许气泡进入系统。通过培养基储器顶部的无菌过滤器，培养基储器始终与大气条件处于平衡。

细胞培养

根据ATCC的说明培养人永生化PTEC(RPTEC/TERT1,ATCC CRL-4031)，并将最多20代用于所有PT模型。对于基因表达分析，使用人原代RPTEC(Cell Science)、永生化PTEC(RPTEC-TERT1,Evercyte)和A498(ATCC HTB-44)肾癌细胞并根据供应商的说明培养。根据供应商的说明培养人新生儿皮肤成纤维细胞(HNDF)、GFP表达(Angio-Proteomie)并使用最多15代。

基因表达分析

根据供应商的说明在96孔板中生长人原代RPTEC(Cell Science)、永生化RPTEC-TERT1(Evercyte)和A498(ATCC HTB-44)肾癌细胞，在融合后第3日通过用100μl/孔1x RNA溶解混合物(QuantiGene Sample Processing Kit,QS0101)替换培养基来收集。随后将40/l溶解产物与捕获mRNA的磁珠组(Panomics QuantiGene Plex Set 12631,catalognumber312631)混合，温育过夜，处理以进行支链DNA扩增，并根据生产商的说明分析(Panomics QuantiGene Plex Assay kit,QP1015)。使用PPIB探针作为标准化的管家基因。荧光强度(FI)数据作为三个生物复制体的平均值和标准偏差来表达。

培养基灌注液的细胞因子分析

在细胞接种后的25天时间内从小管收集培养基灌注液，并在分析前于-80℃存储。对于细胞因子分析，将上清液在冰上融解，在样品稀释缓冲液(BioRad catalog#M60-009RDPD)中稀释两边，并通过基于Luminex技术的ELISA使用Bio-Plex Pro^TM人趋化因子IL-6(Set#171BK29MR2),IL-8(Set#171-BK31MR2)和MCP-1(Set#171-BK36MR2)和Bio-Plex200Systems(BioRad)根据生产商的说明分析。数据报告为技术上一式三份的平均细胞因子浓度平均值和标准偏差。

上皮化和纵向培养

将每个3D PT构建物在细胞加载/接种之前在温育器里用PTEC培养基灌注数小时。将PTEC(PTEC/TERT1,ATCC)从其培养皿中胰蛋白酶消化并在培养基中浓缩至～2×10⁷细胞/mL。随后将细胞悬浮液通过出口加载到灌注芯片中(图10,B和C)。将加载后的构建物横向放置在温育其中数小时，并在多个半小时时间间隔过程中翻转180°以使得小管壁均匀接种，随后在小管中没有流动地温育过夜。下一天，未贴壁细胞在重力流动下流出。随后开始新鲜培养基的灌注，剩余细胞开始丛生，随后从那些群落开始生长(图10F)，直到在接种后3周左右其达到融合(图10K)。在生长期间，用根据ATCC指南制备的PTEC培养基加1％抑肽酶(EMD Millipore，用于减缓ECM的分解)、1％胎牛血清(FBS)和1％抗菌剂-抗真菌剂(Gibco)喂养PTEC。在成熟之后，去除FBS，PTEC挤入紧密上皮单层(Movie S2)。在接种后第1日，将PTEC暴露于1.l/min的连续单相流，根据小管横截面，这相当于在0.1和0.5dynes/cm²之间变化的剪应力。经由蠕动泵在闭环回路中进给培养基，每两日更换。

白蛋白摄取研究

评价打印3D PT模型以及2D对照物的白蛋白摄取。第一种对照物由在组织培养物塑料培养皿上生长的PTEC组成，而第二种对照物由在我们的ECM上生长的PTEC组成。在每种情况中，PTEC均生长至融合，并允许其在无血清培养基中成熟。与FITC轭合的人血清白蛋白(HSA-FITC,Abcam ab8030)以50lg/mL悬浮在培养基中。所有样品用HSA-FITC在其培养基中温育2h(在灌注的情况下，其通过开放空腔灌注)。在暴露之后，所有样品用3倍体积洗涤，随后用10倍胰蛋白酶进行胰蛋白酶消化以收集独立细胞。固定细胞并用megalin的第一和第二抗体复染(表2列出了所用的具体抗体；该列表是非限制性的；许多其他染色也是可行的，这只是初步表征的短列表)。

表2：示例性的免疫染色剂

通过流式细胞仪(BD LSR Fortessa)分析来自哪些样品的细胞和裸细胞，从n＝10,000细胞/样品收集数据。为获得PTEC中HSA-FITC和megalin的图像，在清洗步骤后使用福尔马林固定样品而不是胰蛋白酶消化。对于那些样品进行megalin复染，并且使用共焦显微镜(Zeiss LSM710)拍照。

环孢霉素A测试

探究了CysA对2D对照物和生物打印3D PT的作用。在2D中，将细胞以96-孔形式接种在组织培养物塑料培养皿上并生长至融合。根据ATCC的指南用培养基喂养它们。将CysA(Sigma-Aldrich,SML1018)以不同浓度悬浮在其培养基中并与细胞一起温育24h。在暴露后24小时，在吩嗪硫酸盐(MTS)存在下使用(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓)进行活力测定。该测定在PTEC上通过如下方式完成：在早期融合时，在细胞达到融合当日将CysA给予细胞，在晚期融合时，通过在细胞达到融合之后数日给予CysA。值得注意的是，每种情况的毒性结果相似(图7N)。对于3D PT，在达到融合(～3周时间)通过成熟小管的开放空腔供给不同浓度的CysA，其中最少有10天的时间培养基中不包含血清。在CysA暴露之后24小时，进行FITC-葡聚糖泄露测试(如下所述)，以评估和量化对PTEC屏障功能的扰动。紧接着，使用10％缓冲福尔马林将PT固定1h，并复染肌动蛋白和DAPI(表2列出了所用的具体染色剂)。

扩散透过率测量

为评价3D中上皮的屏障功能，通过如下方式量化扩散透过率：将PTEC培养基灌注到包含25og/mL FITC-轭合的70kDa葡聚糖(FITC-Dex,Sigma产品46945)的开放空腔中，速率为15 DL/min进行3min，随后是1 iL/min进行～30–45min。整个实验在活细胞成像下进行，小管和周围的ECM均在视野中(图16)。使用宽视野荧光显微镜(Zeiss Axiovert 40CFL)检测FITC-Dex的扩散方式。在管制之前和30-45分钟的时间段内每3-5分钟捕获荧光图像。通过使用以下方程量化荧光强度随时间的变化来计算FITC-Dex的扩散透过率³⁴；

P_d是扩散透过系数，I₁是初始时间段的平均强度，I₂是t～30–45min的平均强度，I_b是背景强度(在灌注FITC-Dex之前获取的图像)，和d是通道直径。其他研究者已报告了PTEC能再吸收葡聚糖³⁹，这导致扩散透过率测量值略高。

我们还使用低分子量化合物菊粉(4.5kDa)使用与上述相同的方法研究了我们的衬有上皮的小管的屏障性质，所述低分子量化合物菊粉既不会被PTEC再吸收也不会被其在体内分泌。具体而言，将菊粉-FITC(Sigma产品F3272)以100bg/mL溶解在温热的PTEC培养基中，并以如下速率灌注到开放空腔中：20/L/min进行3min，随后1.5iL/min进行～15min。整个实验在活细胞成像下进行，小管和周围的ECM均在视野中(图14)。使用宽视野荧光显微镜(Leica)检测FITC-菊粉的扩散方式。在灌注之前和在15分钟时间段内每3-5分钟用门控光源和运动控制平台捕获荧光图像以收集技术上一式三份的测量结果。

电子显微镜

对于透射电子显微镜(TEM)，2D或3D架构或在移植之前从标准活检样品上获取的健康人肾组织中的PTEC使用在0.1M甲次砷酸钠缓冲液(pH 7.4)中的2.5戊二醛、1.25％多聚甲醛和0.03％苦味酸固定至少数小时。移除小型样品(1mm×1mm)并在0.1M甲次砷酸盐缓冲液中洗涤，并在1％四氧化锇(OsO₄)(EMS)和1.5％铁氰化钾(KFeCN₆)(Sigma)中浸浴1h，在水中洗涤三次，并在1％乙酸双氧铀水溶液(EMS)中温育1h，然后在水中洗涤两次，随后在不同等级的醇中脱水(每个10min；50％、70％、90％，2×10min 100％)。随后将样品置于氧化丙烯(EMS)1h并在氧化丙烯与TAAB Epon(Marivac Canada Inc.St.Laurent,Canada)的1:1混合物温育过夜。下一日，将样品嵌入在TAAB Epon中，并于60℃聚合48h。在ReichertUltracut-S切片机上切割超薄部分(约60nm)，放置在用柠檬酸铜染色的铜网上，并在JEOL1200EX透射电子显微镜中检查，用AMT 2k CCD相机记录图像。使用ImageJ软件进行图像分析。

对于扫描电子显微镜(SEM)，将3D的灌注PTEC使用10％缓冲福尔马林固定1h。将样品切成薄片(～1mm厚)以暴露围绕开放空腔的细胞。使用PBS分两次洗掉固定物，随后在不同等级的乙醇中脱水(每个20min；30％,50％,70％,90％,3×20min 100％)。随后将样品在50％乙醇和50％六甲基二硅氮烷(HMDS)中放置30min，随后在100％HMDS中放置30min，重复三次。所有步骤在闭合的密封玻璃容器中进行。在用HMDS最终洗涤之后，取出样品并放置在开放容器中，在通风橱中在N₂下干燥。使用导电碳带将干燥样品固定在铝销座(aluminumpin mounts)上，用金溅射镀膜，并用Tescan Vega SEM成像。

免疫染色

免疫染色然后共焦显微镜用于评价2D和3D模型中蛋白质的细胞定位。在免疫染色之前，将每个构建物用PBS洗涤，然后使用10％缓冲福尔马林固定20min至1h。使用在PBS中几次洗涤数小时来出去固定物，随后在PBS中用1wt％牛血清白蛋白(BSA)封闭过夜。将细胞蛋白质的第一抗体或所关注的生物标记物以表2中所列出的稀释度在0.5wt％BSA和0.125wt％Triton X-100的溶液中与构建物一起温育1天。使用针对PBS溶液或0.5wt％BSA和0.125wt％Triton X-100在PBS中的溶液的清洗步骤1天，完成未结合第一抗体的去除。第二抗体以表2中所列出的稀释度在0.5wt％BSA和0.125wt％Triton X-100在PBS中的溶液中与构建物一起温育1天。将样品用NucBlue或ActinGreen复染2h，随后在成像之前在PBS中洗涤1天。

图像绘制和分析

相衬显微镜使用具有1.25X至40X的物镜的倒置Leica DM IL镜。共焦显微镜使用直立型Zeiss LSM 710，水浸物镜的范围为5X至40X，采用405、488、514、561和633nm波长的光谱激光。z-轴图像重建在ImageJ中进行，使用z-投影功能，使用最大像素强度设定。亮度的任何升高均匀地在全部z-投影图像上进行。3D图像重建和旋转动画(Movie S3)使用Imaris软件进行。温育器系统中的新的CytoSMART(Lonza)用于捕获实时成像(Movie S2)。量化扩散透过率的图像分析使用定制MATLAB脚本采用先前所报告的方法进行³⁴。TEM图像分析使用ImageJ软件进行，以便对每个条件下的至少三个独立样品测量细胞高度(n≥50)、微绒毛密度(n≥25)和微绒毛长度(n≥150)。

统计学分析

数据表达为平均值±标准偏差。统计学分析使用MATLAB进行，统计学显著性在p<0.05的值下确定，该值通过ANOVA使用Tukey的多重成对比较测试确定。用星号表示不同的显着性水平(p值)，并且在每个图例中提供具体的p值。

结果

芯片上3D近端小管的打印、接种和纵向培养

我们的生物打印方法用于构建肾单位的3D盘绕近端小管片段，如图3A中所示²⁶。首先，如图3B-C中所示，将硅树脂垫片打印到载玻片上，这区分了3D组织芯片的外边界。随后在垫片中均匀沉积一层工程化胞外基质(ECM)，其由明胶-纤维蛋白水凝胶组成²⁵。接下来，将短效油墨(以粉色显示)打印到ECM层上。术语“短效油墨”是指所打印的物质最终将被液化并从最终的3D PT构建物上去除。在打印之后，将短效油墨连接至中空金属销钉，通过垫片壁接合，将额外的ECM浇注在打印结构上。随后将3D组织模型容纳在可灌注芯片中，在此冷却至4℃以液化和随后去除短效油墨，得到嵌入在ECM中的开放的盘绕管状通道。最后，经由外部蠕动泵将细胞培养基灌注通过芯片上的3D盘绕的管状架构。要注意，我们的方法可创建具有精确受控尺寸、弯曲度和位置的无数构造的3D近端小管。例如，如果需要多个小管以提高测定的统计学相关性或者提供底部访问通道，它们可彼此并排打印并且独立灌注或通过单个入口一起灌注。

ECM和短效油墨的组成和流变性质可特别地调节以用于我们的生物构建方法。ECM由纤维蛋白原、明胶和两种酶(凝血酶和转谷氨酰胺酶)组成²⁵。双酶方案能够迅速固化打印特征周围的ECM，通过凝血酶对纤维蛋白原的作用制备纤维蛋白。第二种酶转谷氨酰胺酶提供了明胶与纤维蛋白的较慢交联，能够在组装过程中无缝整合上下ECM层(图9A)。此外，ECM的弹性模量(～3.5kPa)模拟了健康肾脏皮质的弹性模量(～4kPa)²⁷；基质的刚度和组成对于组织特异性细胞功能的保留都是重要的^12,28。短效油墨由聚乙烯-聚丙烯-聚乙烯三嵌段共聚物(

F127)组成，其在临界胶束浓度以上在水中在室温下形成粘弹性凝胶。当可灌注组织芯片冷却到4℃使，这种油墨显示凝胶至留的转换，使得能在这些条件下将其从ECM中去除^26,29。短效油墨还包含高浓度的凝血酶(100U/mL)。当在浇注过程中用ECM围绕该幽默是，可溶的纤维蛋白原快速转变为不溶的纤维蛋白，在空腔周围形成纤维蛋白模板，并且有利于所需的细胞培养基的长期灌注。

在引入细胞之前，我们用细胞培养基于37℃对3D组织芯片灌注过夜以去除任何残留的短效油墨或酶，并且在37℃和5％CO₂条件下在温育器里平衡基质。随后我们引入PTEC-TERT1细胞，其由人近端小管细胞组成，通过稳定表达人端粒酶逆转录酶(TERT)的催化亚基而永生化³⁰。PTEC-TERT1被开发作为维持原代PTEC细胞形态和功能特性的细胞模型，与因端粒缩短而体外寿命有限的原代细胞相比具有额外的复制优势^16,30。已证实了PTEC-TERT1的基因组稳定性多达90次群体倍增³⁰。我们通过对33个关键PTEC基因进行基因表达分析并将其与原代PTEC和肾癌细胞系A498比较来进一步分析PTEC-TERT1(图9B)。mRNA水平证明了PTEC-TERT1细胞在转路上接近于原代肾PTEC细胞。鉴于在药物开发和安全性平台中需要可扩展的稳定细胞系统，我们使用PTEC-TERT(在本文中称为PTEC)优化了我们的3D PT模型。

为了用融合的PTEC单层围绕盘绕小首先将细胞从组织培养物塑料培养皿上用胰蛋白酶消化下来，浓缩，并灌注到打印结构的开放空腔中。细胞在小管中在没有流动的条件下温育过夜以促进对ECM的贴壁，随后在第1日稍微冲洗以去除任何未贴壁细胞。提供了其在小管中的成熟过程的时间顺序(图10)。要注意，PTEC在小管中生长至融合，经过约3周的时间3D围绕开放空腔。此外，由于PTEC主动参与了体内和体外的促炎细胞因子的产生^1,31，我们测量了小管灌注液中IL6、IL-8和MCP1随时间的积累。细胞因子谱显示了在生长和成熟阶段中不同的浓度，显示小管在融合后稳定(图11)。此外，在去除血清之后IL-6浓度的降低与先前报道的在原代人PTEC中白蛋白对IL-6产生的诱导作用相一致³²。

为提高复杂性水平，可将支持细胞(诸如成纤维细胞或免疫细胞)悬浮在围绕打印小管的ECM中^25,26。如图12中所示，成纤维细胞可在ECM的管外空间中在小管附近存活。尽管可打印150μm至700μm范围内的小管直径，我们在～1μL/min的流速下对直径为400μm至550μm的PT进行了测定和定量测量。低倍和较高倍数的成熟PT的图像(图3D-F)显示了PTEC围绕空腔并采用立方形态，正如对其体内表型所预期的。通过在闭环系统中灌注培养基纵向保持这些工程化3D盘绕PT。每2日更换培养基，小管长时间保持存活；最长测试时间超过两个月(65天)。

3D近端小管形成极化上皮

在将PTEC接种在小管中并生长至成熟之后，使用光学显微镜、扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)的组合表征所打印和灌注的3D PT(图2和3)。具体而言，相差显微镜中的低倍(图4A)和高倍(图4B)视图显示，PTEC在整个小管中生长，以柱状形式堆积在一起。小管横截面的TEM图像进一步显示PTEC组装为紧密堆积的柱状肾小管上皮(图4C-D)。如图4E中示意性显示的，自然上皮在基面上形成基底膜，并在顶面上形成面向开放空腔的微绒毛的刷状缘，细胞为柱状形态。从TEM图像，我们量化了3D近端小管内柱状细胞形态(图4C)与在无灌注情况下在ECM上2D生长相同时间的相同细胞(图4D)相比的细胞高度的增长。重要的是，我们的打印和灌注的3D PT构建物中的PTEC相对于在我们的ECM上的无灌注的平面对照物(图4F)显示了两倍的细胞高度增长。此外，在我们的3D PT构建物中观察到的14.1±2.4μm的细胞高度接近健康人近端小管中的数值(20.3±4.1μm)。

3D PT顶面的SEM图像(图4G)显示了融合细胞层的形成和原纤毛的存在(1根/细胞，类似于在体内观察到的)。初级纤毛是感觉细胞器，其延伸到开放空腔中并相应于剪应力；其对于保持上皮细胞表型是重要的，并且当在缺乏剪应力的情况下2D分离和培养时经常会丢失²²。也使用免疫荧光通过染色乙酰化微管蛋白(在图2h和S6中的3D透视图中显示为红色)而在我们的PT中观察原纤毛。此外，我们确认了上皮标记物Na⁺/K⁺ATP酶的表达(图4H-I)，以及其恰当地亚细胞定位于基底外侧血浆膜(图13A)，这再次类似于体内PTEC表型。近端小管-特异性(相对于远端小管)水通道的水通道蛋白1(AQP1)在我们的小管整体中也是占优的(图4J)，较高倍数的AQP1染色在膜表面具有斑点图案(图4K)，如其他人已经显示的³³。我们还观察到欧洲百脉根(lotus tetragonolobus)植物凝血素(LTL)的适当表达(图13C)和器官阳离子转运蛋白(OCT2)的基础表达(图13D)。

细胞急性是载体运输所需的基础特征。我们通过使用SEM首次表征了我们的3D PT的顶面来探索PTEC极性(图5A)。在顶面上，存在微绒毛并形成比2D中更明显的刷状缘(比较图4C和7A与图4D)。在基面(图5B)，基底外侧的交错接合(BI)是突出的。这些BI延伸了体内外侧及基部便捷的表面积。相反，2D对照物中的PTEC细胞(图4D)缺乏BI。图5B中白色箭头指示的侧膜中圆形内陷的存在显示了主动运输机制存在于侧表面处。此外，在ECM形态和通过PTEC沉积的基底膜(BM)蛋白之间存在明显不同。对于BM蛋白组成的进一步研究显示在成熟3D PT构建物中，PTEC沉积了层粘连蛋白和胶原IV(图5C)。观察到相邻细胞之间的紧密结合(图5D)以及细胞-细胞结合蛋白的存在，诸如图5E中的K钙粘蛋白，其以特有的鹅卵石图案连接。最后，通过图像分析量化了刷状缘的性质。我们发现3D打印和灌注的PT中的平均微绒毛长度比2D未灌注者长～200％，比2D灌注对照物长～40％(图5F)。同时，打印和灌注的3DPT构建物的微绒毛密度也显著高于所有2D对照条件(所有2D对照物在统计学上是相似的)(图5G)。再一次，在我们的3D PT构建物中观察到的微绒毛长度(1.24±0.3μm)和密度(4.13±0.5μm)接近健康人近端小管中的长度和密度，它们分别为2.89±0.6μm和7.81±1.0/μm。

当健康和融合时，PTEC应形成近防漏屏障以抵抗某些蛋白质(如低分子量菊粉)的交通。为评价其屏障功能³⁴，我们通过成熟PT的开放空腔灌注了FITC-标记的菊粉(4.5kDa)并使用宽视野荧光显微镜测量随时间的染料强度。从这些数据，我们测定了扩散透过率并将该值与没有上皮衬里的3D小管中进行的对照测量相比(图14)。我们观察到这两个样品之间扩散透过系数的显著下降(大于一个数量级)，显示打印和灌注的3D PT构建物中的上皮屏障是紧密和有功能的。

白蛋白摄取

PTEC细胞的受体介导的内吞作用对于体液稳态是必需的。从肾小球滤液再吸收血浆蛋白部分依赖于位于刷状缘中的megalin-cubilin复合物 ^35,36,37 ，可通过监控PTEC的白蛋白摄取来体外建模。我们测试了在灌注的3D PT构建物或2D对照物上生长的PTEC摄取FITC-标记的人血清白蛋白(HSA)的能力。在暴露于FITC-HSA 2h之后，收集PTEC，对megalin表达染色，并通过流式细胞仪分析。白蛋白摄取的结果提供在图6A中。2D对照物中的大量细胞表现出与非荧光对照物相似的荧光强度，而灌注的3D PT构建物中内衬的细胞显示了FITC-HSA强度的显著增加。Megalin(白蛋白的一种转运蛋白)的结果显示了其表达也在3D PT中最高(图6B)。通过流式细胞仪分析的群体荧光强度的平均值如下提供：

平均强度	白蛋白	Megalin
			2D在塑料培养皿上	201	571
2D在打印基质上	310	1127
			3D打印的(灌注的)	1452	1670

与2D对照物不同，我们发现增强的megalin表达与灌注3D PT中优异的白蛋白功能性摄取强烈相关，显示它们的3D架构和灌注类似地改进了上皮功能，这可归因于增强的细胞极性和刷状缘(图5)。最后，FITC-HSA(Figure 6C)、megalin(图6D)及其组合(图6E)的图像显示了作为3D PT衬里的PTEC中白蛋白和megalin的重叠分布。因此，我们的工程化3D PT构建物相对于2D对照物显示优异的白蛋白摄取功能。

药物毒性测试

环孢霉素A，一种通常在移植手术后给予以防止排异的药物，其是已知会损伤近端小管细胞的肾毒素。为研究其对灌注3D PT模型的作用，我们将该模型暴露于多种浓度的环孢霉素A(CysA)，并通过将肌动蛋白细丝染色来监控细胞形态改变和细胞骨架组构。小管的明视野图像(图7A-D)和相应的肌动蛋白染色的3D透视图(图7E-L)显示了CysA-诱导损伤的剂量依赖性表现。在10μm CysA下观察到细胞-细胞结合的微小破坏和肌动蛋白的改变(图7J)，而在50μm CysA下，明显可见没有细胞的离散区域(图7G,7K)，那些区域在100μm CysA变得更明显(图7D,7H,7L，和20)。我们还注意到细胞层在50μm和100μm CysA下收紧和弯曲(图7G,7K,图18，和图19)。最后，我们通过量化经处理小管中FITC-葡聚糖(70kDa)的扩散透过率来评估CysA-诱导的上皮屏障功能破坏(图16)。如图7M中所示，暴露于50和100μm CysA分别将上皮屏障透过率提高了几乎四倍和六倍。我们还发现在用50和100μm CysA处理之后，在2D培养物塑料培养皿上生长的PTEC的相应细胞活力降低了40％和60％(图7N)。总之，这些结果表明3D PT构建物可用于定性(免疫染色)和定量(扩散透过率测量)评价肾毒性。

讨论

近年来生物打印的进展使得能够将普遍和互相连接的通道整合在胞外基质中^26,38。我们先前显示了这些通道可衬有内皮细胞并进行灌注以产生带有嵌入式脉管系统的组织^25,26。通过结合生物打印、3D细胞培养和器官芯片技术，我们展示了在芯片上构建可灌注盘绕3D近端小管的可定制平台。我们的可编程地定义小管尺寸和几何形状(包括盘绕)的能力客服了销钉拔出法(pin pullout)的限制，后者仅能生产在凝胶中的直型小管³¹。我们的基于纤维蛋白原和明胶的酶交联的工程化ECM²⁵相对于现有基质促进了PTEC的粘附改进，允许细胞形成能持续>60日的融合层。这样的上皮在体内显示了类似于天然PTEC的若干形态特征和功能标记物。与基于细胞单层的肾芯片装置^19,36不同，我们的可灌注3D PT能够收集几十万细胞用于分析，远超过通过流式细胞仪精确采样所需(～10,000细胞)。

我们的3D PT模型可用于说明药物引发的小管损伤的机理，包括细胞-细胞结合的削弱、细胞从单层中凸出以及细胞死亡。未来，我们将研究接种在其直径(～60μm)和曲线更接近地模拟体内PT的打印3D小管中的PTEC的形态和功能，以测定是否能实现进一步的上皮结构和功能的改进。我们还设想建立更复杂的3D肾脏模型，其中多个小管和脉管网络彼此并排构体以促进底部访问和相邻通道之间相互作用的研究(图S1和S10)。通过在胞外空间加入多种细胞类型(图12)，我们引入了研究细胞-细胞相互作用所需的额外复杂性。最后，我们计划探索来源于iPSC的肾足细胞在我们的可灌注的3D PT构建物中的接种和成熟。

总之，我们已报告了在定制灌注芯片上构建和表征嵌入到胞外基质中的3D盘绕的肾近端小管。这些可灌注的3D PT促进了相对于在2D对照物上生长的相同细胞具有改进的表型和功能特征的组织样上皮。我们的生物打印方法开启了产生更好地重现体内微环境的3D器官芯片的新途径，其能够推动药物筛选、机械药物研究、疾病模型和最终的再生医学。

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实施例2

背景和显著性：

在美国有约3100万人(成年人口的10-11％)患有慢性肾病(CKD)。此外，在美国每年有超过650,000名患者接受末期肾病(ESRD)治疗，每年递增5％。尽管慢性和末期肾病的紧迫性和普遍性，也仅有两种可用治疗：移植和透析。尽管移植是比较好的治疗，但是需要新肾脏的患者(>100,000)和供体器官的数量(～17,000)之间的差距每年持续增长～8％。透析依赖于50年前发明的相同技术，其具有感染、凝血、知名出血和其他适应症的高风险，导致透析患者在12个月的死亡率为约25％。目前每周三次在血液透析中心4小时治疗的范例也降低了患者的生活质量，并且引起贫血、高血压、抑郁症和药物需求(磷酸盐结合剂和抗高血压药)。已经假设，如果目前的简写治疗能够被连续透析策略(注入可穿戴或植入的人工肾)取代，那么这些缺点中的许多可以得到显著改善。

一些先前的研究调查了创建活的肾组织，包括用于免疫耐受性异种移植的遗传编辑动物组织、人肾支架的再细胞/去细胞化和生长肾脏类器官。然而，这些现有技术中的每种均受到关键限值，包括：(1)缺少患者特异性细胞以减少器官排异，(2)不能有效地将适当细胞置于肾单位的复杂亚结构中，和(3)缺少整合的小管和可灌注的脉管系统，这些结合起来限制了这种系统的可扩展性和适用性。

研究的目的是开发辅助肾功能(例如，过滤、再吸收等)的生物装置。

在人生理学尺度上开发完全整合的肾过滤-再吸收装置需要以下能力：(1)为肾小球和近端小管微环境开发稳定的、充分表征的肾特异性细胞来源，(2)产生促进过滤的肾小球隔室，其连接至(3)嵌入到ECM中的可灌注紧密堆积3D近端小管，其促进适当的细胞表型并且使得能够再吸收。

为此目的，可结合iPSC生物学、微流体和3D生物打印以组装具有类肾单位功能的可灌注肾组织。具体而言，基于在微流体装置中在合成多孔膜上形成足突的来源于iPSC的足细胞的最新进展(Musah S.,et al.,Nature Biomedical Engineering,1(5),pp.s41551-017(2017)))和生物打印可灌注PT(如上面的实施例1中所述)，可生产在体外概括肾生理功能的活的整合过滤-再吸收体外(LIFE)装置(图19)。

具体而言，图19显示了所提出的LIFE系统中流体流动地示意图。LIFE装置将模拟生理流动构造，其中血浆流动通过肾小球，随后将滤液灌注通过PT。随后，滤液中的营养物被PT再吸收并输送到血流中，将其导回身体中。LIFE装置的主要目的是用细胞过滤器(肾小球部分)和细胞再吸收(近端小管部分)组件替代现有的透析技术。

第1部分：显示生理过滤速率的3D肾小球模型的设计、制造和表征。

具有生理功能的肾小球模型需要三个关键要素：通过嵌入到(3)高透过率的工程化胞外基质(ECM)中的(2)3D可灌注通道中的内皮稳定的(1)完全分化的足细胞。

根据Musah等人所描述的规则(Musah et al.,Nature Medical Engineering,1,Article number:0069:1-12(2017))，将在3D生物打印的可灌注通道中进行iPSC到足细胞的定向分化，随后接种内皮细胞以产生肾小球毛细血管。

与常规2D膜系统相比，揭示了3D微生理环境将显著提高细胞表型和转运蛋白表达。还有，将开发新型多孔ECM以支持小管并且使得能够有效地流体过滤和输送。

1.1：嵌入在多孔胞外基质中的脉管系统的3D生物打印。

在体内，肾小球毛细血管是由肾小球膜制成的曲折和紧密堆积的通道(图21A)。由于其复杂性和尺寸规模，这样的架构难以直接通过生物打印复制。该研究的目的是构建物理支持肾小球毛细血管的高透过性支架(图21B)。具体而言，可产生生物可相容和可交联的水凝胶基大孔基质，其中来自肾小球毛细血管的流体可容易地流动通过空间的间隙空间。这些多孔基质将通过水凝胶泡沫浇注或者直接发泡写入生成。

为在这些大孔基质中产生脉管通道，将使用生物打印-浇注-排出方法。该方法依赖于首先在规定的脉管架构中打印热可逆短效油墨(Pluronic F-127)(Wu,W.,et al.,Advanced物质s,23(24)(2011))，随后用多孔介质围绕打印特征，并最终通过将结构冷却至4℃来去除短效油墨，在该温度下油墨液化并且可被冲洗掉，离开开放的、互相连接的圆柱形通道，该通道可衬有内皮。

图21C提供了构建过程中三个关键步骤的示意性说明。

步骤(i)将包括沉积一层大孔物质。大孔物质的实例包括大孔聚合物、大孔生物物质(诸如，胶原、纤维蛋白等)或大孔结构的明胶、桥具体、藻酸盐等。

步骤(ii)将包括使用定制的芯-壳型喷嘴将中空的管状结构打印到该基底层上，所述喷嘴具有短效油墨内芯和细胞粘附性水溶胶外壳。美国临时申请序列号62/431,653，题为“3D printing core-shell filament and method of printing a core-shellfilament；”美国临时专利申请序列号62/431,723，2016年12月8日提交，题为“Core-shellnozzle for three-dimensional printing and method of use；”和美国临时专利申请62/535,557，2017年7月21日提交，题为“Methods of producing tubular multi-layeredconstructs,”描述了使用多芯-壳方法的生物打印方法，其通过引用以其整体加入本文。

步骤(iii)将包含将额外的大孔基质浇注在打印特征周围并交联、无缝湛河到物质底层。在交联之后，将去除短效芯，在大孔基质中产生开放空腔。我们将打印水凝胶(诸如明胶-纤维蛋白原混合物)壳工程化以通过金属蛋白酶过程随时间降解，以使得最终所接种的足细胞将基底膜蛋白直接沉积在大孔支架上，形成连续的肾小球组织。在降解之后，足细胞和多孔支架之间的直接接触将导致高透过率接口，这对于复制生理肾过滤过程是重要的。

1.2：在灌注通道内将iPSC直接分化为足细胞

我们计划在构建通道内直接分化iPSC为足细胞。尽管许多实验室已致力于开发机械过滤器以实现人体内的过滤，这些合成和细胞过滤器的使用寿命有限，并且由于结垢需要频繁更换，这会限制可植入机械肾的寿命。相反，人肾能够保持高过滤效率(～130升/天)达数十年，这可归因于细胞肾小球有效地清除体内积累的大分子和废物的能力。因此，我们假设制造细胞肾小球过滤器将保持在芯片上最少结构的耐久性。然而，为构建该装置，需要产生容易扩增和规模化的足细胞来源，其是肾小球中的关键功能细胞。不幸的是，从成人肾脏分离出来的足细胞难以分离、难以扩增，并且通常不猛保持纯肾小球表型。

在这里，来源于iPSC的足细胞和内皮将在芯片上使用，其中足细胞将在灌注通道内衍生并且内皮细胞将随后接种。在芯片上进行定向iPSC分化，如图21B中对于足细胞系所示–依赖于Musah等人开发的有效(>90％)和化学定义的方案(Musah et al.,NatureMedical Engineering,1,Article number：0069：1-12(2017))，其指导iPSC分化为表达成熟表型标记的足细胞(Morizane,et al.,Nature biotechnology,33(11),p.1193(2015))(图21A-B)。如前所示，来源于iPSC的足细胞在其2D微流体装置中与内皮形成足部过程(主要和次要)(图21C-D)。然而，其原始装置中的2D板几何形状(相对于本文所提出的3D通道结构)限制了膜的总表面积，这导致了低过滤速率。

依靠Musah等人开发的有效(>90％)和化学定义的方案。(Musah等，NatureMedical Engineering，1，Article number：0069：1-12(2017))用于指导iPSC分化为表达成熟表型标记的足细胞(Morizane，et al。，Nature biotechnology，33(11)，p.1193(2015))(图21A-B)。如前所示，来源于iPSC的足细胞在其2D微流体装置中与内皮形成足部过程(主要和次要)(图21C-D)。然而，其原始装置中的2D板几何形状(相对于本文提出的3D通道结构)限制了膜的总表面积，导致低的过滤速率。

来源于iPSC的中间中胚层细胞将被直接接种到如上所述的打印3D通道结构中用于定向分化。将通过改变水凝胶组成、基底膜涂层、小分子诱导(图21A，第3阶段)和灌注应力来优化分化效率。在成熟足细胞在水凝胶基质上形成融合单层之后，随后将肾小球微血管内皮细胞(GMEC)接种在空腔中，这样它们可扩增并将其肾小球基底膜(GBM)直接沉积在足细胞层上。最终的三层结构：足细胞交错结果过程、GBM和有孔内皮(见图21B)将近似模拟体内生理过滤膜。

1.3表征肾小球模型的肾小球过滤速率(GFR)和肾清除率

当完成了我们的3D打印肾小球模型(上面的1.1-1.2)之后，将开发表征其两项基本肾功能GFR和肾清除率的检测平台。在肾小球中，GFR直接受血压调节。为模拟这种体内机制，将在系统中的灌注出口之后建立微流量阀，调节我们的生物过滤膜的跨膜压降(～40mmHg或5.3kPa)(Johnson,Richard J.,et al.,Comprehensive Clinical NephrologyE-Book.Elsevier Health Sciences(2014))。在该试验中，我们将通过实施改变灌注培养基体积来调节压降和监控所得的GFR。

为检测肾清除率，将具有不同分子量的荧光标记的化合物流入我们的3D肾小球模型中，使用共焦显微镜测量其随时间的分布。为量化肾清除率，将比较过滤器前后人血清白蛋白(流体动力学半径，R_h～3.5nm)、菊粉(R_h～1.5nm)和葡萄糖(R_h～0.4nm)的化合物浓度。

替代性方法：

在某些实施方式中，可在引入(GMEC)内皮细胞之前用基底膜蛋白(诸如层粘连蛋白或胶原IV)来涂布完全分化的足细胞。或者，可将肾小球系膜样细胞包含在芯-壳打印油墨中以帮助促进基底膜沉积和支持内皮粘附的细胞-细胞相互作用。

由于所提出的顺序衬里策略，可以使细胞均具有朝向空腔壁的相同极化，导致在足细胞支架和足细胞-内皮接口处的两个独立的基底膜层。这样，可以重新定向足细胞计划，因此促进了足细胞-内皮接口处的基底膜沉积以模拟体内构造。

第2部分：显示生理再吸收率的3D血管化近端小管(PT)模型的设计、制造和表征。

肾脉管系统对于持续肾再吸收来说非常重要。因此，将使用生物打印来构建双层小管网络，产生脉管化PT模型，所述生物打印能够快速和可编程地构建高复杂性架构。此外，为实现生理再吸收水平，将使用多元化打印方法以按比例放大近端小管的表面积。

肾脉管系统在肾功能中具有不可缺少的作用，包括持续再吸收、免疫细胞浸润、血压调节和激素分泌。该研究的目的是在可灌注芯片上建立靠近PT的脉管。通道通常被嵌入在高透过性的水凝胶中，并独立灌注。此外，我们分别用GMEC和近端小管上皮细胞(PTEC)作为脉管和PT的衬里。为验证我们的血管化PT的再吸收功能，将监控PT和脉管系统之间的多种化合物的水输送和运输，包括人血清白蛋白(HSA)、葡萄糖和菊粉(作为阴性对照物)。

2.1：嵌入到水凝胶中的脉管化近端小管的3D生物打印。

如上面的实施例1中所述打印靠近近端小管的脉管(图5A-C)。具体而言，使用多层打印策略来堆叠两个独立可寻址的小管网络，它们通过薄水凝胶层垂直隔开。垂直堆叠的几何形状允许PT和脉管网络之间的最大接触面积。将确定最小化这两层网络之间分离的条件以允许有效的流体和分子交换。

构建的四个主要步骤如图22C中所述。首先，将一层明胶-纤维蛋白原(Gelbrin)水凝胶沉积在用作基底层的基板上。我们将使用最终将被排空的短效油墨在基底层上打印PT结构(图22C中的蓝色小管)在打印之后，将少量Gelbrin浇注在打印特征周围，产生另一个平整的打印表面。随后我们将在这个新的表面上打印脉管(图22C中的红色小管)，并将Gelbrin浇注在其上面。最后，通过排出短效油墨产生PT和脉管系统的开放空腔。我们将近端小管上皮细胞(PTEC)和肾小球微血管内皮细胞(GMEC)分别接种到PT和脉管通道中。在这里，我们使用Gelbrin作为基质，因为其是细胞贴壁ECM，有利于PTEC的许多相关转运蛋白的表达，如我们先前的工作所示。

2.2：3D脉管化PT模型的再吸收率的表征

将在细胞水平和宏观水平评价我们的3D PT模型的再吸收功能。在细胞水平上，将使用免疫化学、聚酶链反应(PCR)和流式细胞仪进行系统分析以表征细胞形态、蛋白质表达和细胞表面标记物。例如，将测量PTEC的多种转运蛋白(诸如Na⁺/K⁺ATP酶、AQP1、megalin和SGLT2)的表达水平。还将研究数种上皮标记物(LTL、ZO1、K-钙粘蛋白和E-钙粘蛋白)、原纤毛、微绒毛和基底膜蛋白沉积(层粘连蛋白和Col IV)。类似于这些对于PTEC的测量，也将通过研究表型健康内皮细胞的数种标记物(包括CD-31、vWF和VE-钙粘蛋白)来表征内皮的功能和表型。

除了提供细胞输送功能的基本验证和理解的典型生物标记物表征之外，本文所述的脉管化PT模型还允许我们在宏观尺度上进行生理再吸收测试。为实现该测定，我们计划开发试验平台,其中将通过PT或脉管通道给予荧光标记的葡萄糖、人血清白蛋白(HSA)、脲、菊粉或其他哟啊呜，随后监控两个通道中灌注液中那些化合物的浓度。具体而言，将进行使用共焦显微镜的活细胞拍照以监控那些分子的移动。同时来自通道出口的灌注物将使用与显微镜培养器适配的定制成分收集器收集。为量化我们的脉管化PT模型的再吸收性能，将比较这些化合物的测量浓度。例如，在体内葡萄糖和HSA大部分被再吸收到PT末端，因此其在脉管系统中的浓度远高于PT中。相反，大部分菊粉和脲应当始终留在PT中，因为紧密的细胞屏障阻碍了它们(Johnson,Richard J.,et al.,Comprehensive Clinical NephrologyE-Book.Elsevier Health Sciences(2014))。

第3部分：结合了所开发的3D肾小球和近端模型的活的整合过滤-再吸收体外(LIFE)装置的设计、制造和表征。

将产生整合了3D肾小球和近端小管模型的微流体平台LIFE(living integrated过滤-再吸收Extracorporeal)。此外，将设计研究以测定LIFE系统是否模拟了其中血浆流动通过肾小球随后通过PT的生理流动构造。还有，设计研究以测定血浆中的营养物是否已被PT再吸收并被输送到血流中，后者随后将再次流动通过肾小球。

3D肾小球(过滤)和脉管化PT(再吸收)模型是建造我们提出的LIFE装置的两个必要组件。因此，在本实施例2的第1部分和第2部分中，提出了对两个子系统进行实质性表征。该研究将聚焦于使用定制微流体平台整合这两个关键组件并表征该LIFE系统的多种肾功能。

3.1：LIFE装置设计和构建。

当完成上述第1部分和第2部分中所述的研究之后，将产生整合了3D肾小球和近端小管模型的微流体平台以制造LIFE装置。

如图23中所示，LIFE系统将会模拟肾单位的生理流动构造，其中血浆流动通过肾小球，随后通过PT，并且进入集合管。在PT中，血浆中的营养物被PT再吸收并输送到血流中，后者将再次流动通过肾小球，随后将从装置的出口收集未被再吸收的化合物和流体。

具体而言，图23所显示的图表说明了LIFE装置中血液(灌注培养基)的流动。灌注液的主流受泵驱动以如下顺序流动通过装置的每个部分：入球微动脉、肾小球毛细血管、鲍氏囊隔室、近端小管以及随后的集合管出口。在肾小球毛细血管部分中，可通过调整微流阀来调节内部液体静压力，从而像在体内一样过滤20％的灌注液。其余80％的灌注液通过出球微动脉离开，随后流入近端小管之后的脉管系统中。

3.2：LIFE装置的肾功能和稳定性表征。

为表征LIFE装置的肾功能和稳定性，将监控临床上通过装置灌注的储器培养基(reservoir media)中HSA、葡萄糖、菊粉和脲的浓度(图23)。在人体内，HAS和葡萄糖被浓缩，而脲和菊粉将被主动从血浆中去除。因此，希望在LIFE装置中观察到定性类似的趋势。还有，特定分子实体的浓缩和去除将通过以下方式证实，通过分析来自装置出口的流体废物来测量那些化合物的浓度。这两项互补测量类似于采样血液或尿液测试，并且将提供LIFE装置随时间的效率和特异性的见解。

最后，将进行LIFE装置的稳定性评价。

在常规培养中长期保持原代细胞系和表型或者甚至器官芯片系统仍是开放性的挑战。另外，在体内和体外肾小球内，足细胞都是终末分化的，因此不能分裂或修复。因此，LIFE装置中的长期细胞行为和肾功能将要被观察至少一个月。这个时间跨度比典型的急性肾损伤(AKI)持续时间长约3-5倍，并且对于评价体外装置的应用是非常重要的。另外，我们计划通过调节装置内流速来模拟超灌注和低灌注状态；这将允许我们得出延长装置寿命的最佳操作范围。

在某些实施方案中，如果观察到从PT出来的废液仍含有相当大量的蛋白质和葡萄糖，则LIFE装置将能够将一部分流体引导回储库以保存重要的培养基组分。

在整个说明书中，已经给出了关于本发明的优选和替代实施方式的各种指示。然而，前面的详细描述被认为是说明性的而不是限制性的，并且本发明不限于所提供的任何一个实施例。应当理解，所附权利要求，包括所有等同物，旨在限定本发明的精神和范围。

Claims (58)

1.用于患者的器官替代或器官辅助治疗的设备，包括：

(a)限定内部空腔的外壳；

(b)布置在外壳中并且至少部分被生物可相容物质围绕的包括活细胞的可编程哺乳动物组织构建物，所述组织构建物在使用时适合于和能够进行以下中的至少一种：

选自因患者器官的疾病或功能障碍而排出的患者体液的至少一种基本成分或细胞产物的过滤、再吸收、代谢、浓缩、改变或免疫调节和将所述至少一种基本成分或细胞产物输送回患者体液中的一种或多种的类器官功能；或者

产生、分泌或输送同一种或另一种基本成分或细胞产物中的至少一个到患者体液中；和

(c)用于流体连通患者与布置在外壳中的组织构建物的患者接口装置。

2.如权利要求1所述的设备，其中组织构建物包含：

一个或多个组织模型，每个组织模型包含一种或多种预定细胞类型的多个活细胞；

贯穿一个或多个组织模型的通道网络，所述贯穿通道是与组织模型一起3D-打印的；和

任选地，至少部分围绕一个或多个组织模型和脉管通道网络的胞外基质组合物。

3.如权利要求1-2中任一项所述的设备，其中所述活细胞包括以下中的至少一种：肾近端小管细胞、亨利氏袢细胞、肾远端小管细胞、集合管细胞、系膜细胞、肾微血管细胞、肾细胞祖细胞、多能或多效干细胞、其它内皮细胞系细胞、内皮细胞或有孔肾小球内皮细胞。

4.如权利要求1-2中任一项所述的设备，其中所述组织构建物选自下组：活细胞、类器官、拟胚体、内皮萌芽、同种异体组织、异种组织和3D打印组织构建物。

5.如权利要求1-2中任一项所述的设备，其中所述组织构建物包括嵌入式脉管系统。

6.如权利要求1-2中任一项所述的设备，其中所述组织构建物是带有嵌入式脉管系统的管状组织构建物。

7.如权利要求6所述的设备，其中所述管状组织构建物是肾单位、肠、乳导管、汗腺、结肠、食管、胃、耳咽管、气道上皮、附睾、细精管、尿道、肝胆管、胰管、胆总管、脑脊髓室和液管、腮腺、口腔粘膜、输卵管、输精管或淋巴。

8.如权利要求6所述的设备，其中所述管状组织构建物是具有嵌入式脉管系统的人近端小管。

9.如权利要求6所述的设备，其中所述管状组织构建物是上皮组织构建物。

10.如权利要求1-2中任一项所述的设备，其中所述组织构建物包括具有与细胞肾小球过滤单位和患者接口装置整合的贯穿脉管网络的组织构建物。

11.如权利要求10所述的设备，其中所述细胞肾小球过滤单位包括来源于iPSC的中间中胚层细胞。

12.如权利要求10所述的设备，其中细胞肾小球过滤单位包括来源于iPSC的足细胞。

13.如权利要求1-2中任一项所述的设备，其中所述组织构建物包括具有类肾单位功能的可灌注肾组织。

14.如权利要求1-2中任一项所述的设备，其中所述患者接口包括体外回路，外壳与该体外回路相连。

15.如权利要求14所述的设备，其中所述体外回路包括：

第一管，其构造为与患者的器官连通并允许患者的体液从患者器官通过该第一管流到组织构建物；和

第二管，其构造为与患者的血管或生物管路相连并允许患者的体液从组织构建物通过该第二管流到患者中。

16.如权利要求1-2中任一项所述的设备，其中所述设备包括在组织构建物和当使用时存在的体液之间的多孔屏障。

17.如权利要求16所述的设备，其中所述多孔屏障是产生超滤液的过滤器。

18.如权利要求16所述的设备，其中所述多孔屏障是滤血器。

19.如权利要求16所述的设备，其中所述多孔屏障是细胞过滤器。

20.如权利要求1-2中任一项所述的设备，其中所述设备适合于在将滤液返回到患者体液之前从体液中去除免疫原。

21.如权利要求1-2中任一项所述的设备，还包括至少一个泵以模拟患者血压和流速。

22.如权利要求1-2中任一项所述的设备，其中所述设备构造为使得组织构建物能够暴露于一种或多种生物剂、生物剂梯度、压力和/或氧张力梯度。

23.如权利要求1-2中任一项所述的设备，其中所述外壳被构造和设置尺寸以供患者携带或穿戴。

24.如权利要求1-2中任一项所述的设备，其中所述设备构造为植入患者体内。

25.如权利要求2所述的设备，其中所述患者接口包括入口岐管和出口岐管，所述入口岐管位于外壳的入口侧并用于将体液分配到贯穿管道网络的多个入口，所述出口岐管位于外壳的出口侧并用于从贯穿通道网络的多个出口收集体液。

26.如权利要求25所述的设备，其中所述贯穿通道网络包括第一通道、第二通道和第三通道，所述第一通道用于传递向组织构建物的动脉血供应，第二通道用于传递离开组织构建物的静脉血，且第三通道用于传递组织构建物从动脉血供应中提取的物质。

27.如权利要求26所述的设备，其中所述出口岐管包括至少三个部分，第一部分与贯穿通道网络的第一通道相连，第二部分与贯穿通道网络的第二通道相连，且第三部分与贯穿通道网络的第三通道相连。

28.如权利要求1所述的设备，其中所述生物可相容物质为液体、凝胶、糊状的形式或为基质。

29.如权利要求1所述的设备，其中所述生物可相容物质是胞外基质物质。

30.如权利要求1所述的设备，其中所述生物可相容物质包括以下中的一种或多种：明胶、纤维蛋白、matrigel、胶原、弹性蛋白、藻酸盐、PEG水凝胶、透明质酸和明胶甲基丙烯酸酯。

31.用于需要肾治疗或辅助的患者的肾替代或辅助治疗的设备，包括：

(a)限定内部空间的外壳；

(b)布置在外壳中的可编程哺乳动物组织构建物，所述组织构建物包括：

多个近端上皮小管；

多个内皮小管，

多个活细胞，和

生物可相容物质；

其中上皮小管和内皮小管彼此紧邻，并且至少部分被生物可相容物质所围绕；

近端上皮小管适合于和能够再吸收因患者肾脏疾病或功能障碍而排出的患者体液的至少一种基本成分，并且将所再吸收的至少一种基本成分或细胞产物输送回患者体液；和

近端上皮小管和内皮小管能够生产、分泌和输送同一种或另一种基本成分或细胞产物到患者体液中；和

(c)用于流体连通患者与布置在外壳中的组织构建物的患者接口。

32.如权利要求31所述的设备，其中所述组织构建物还包括多个肾小球毛细血管。

33.如权利要求32所述的设备，其中所述多个肾小球毛细血管与可编程组织构建物整合在一起并形成细胞过滤器。

34.如权利要求31所述的设备，其中所述生物可相容物质为液体、凝胶、糊状的形式或为基质。

35.如权利要求31所述的设备，其中所述生物可相容物质为胞外基质物质。

36.如权利要求31所述的设备，其中所述生物可相容物质包括以下中的一种或多种：明胶、纤维蛋白、matrigel、胶原、弹性蛋白、藻酸盐、PEG水凝胶、纤维素、粘多糖、蛋白多糖和明胶甲基丙烯酸酯。

37.如权利要求36所述的设备，其中所述粘多糖是透明质酸。

38.如权利要求31所述的设备，其中所述活细胞包括以下中的至少一种：肾近端小管细胞、亨利氏袢细胞、肾远端小管细胞、集合管细胞、系膜细胞、肾微血管细胞、肾细胞祖细胞、多能或多效干细胞、其它内皮细胞系细胞、内皮细胞或有孔肾小球内皮细胞。

39.权利要求1-38中任一项所述的设备用于制备治疗患有范康尼氏综合征的患者的装置的用途。

40.权利要求1-38中任一项所述的设备用于制备从与患者的哺乳动物病症或疾病的诊断或治疗相关的哺乳动物体液中体外提取毒性物质的装置的用途。

41.权利要求1-38中任一项所述的设备用于制备治疗需要器官替代或器官辅助的患者的装置的用途，其中：

(a)所述设备具有适合于患者与设备之间的体液交换的体外回路；

(b)所述设备用于使从患者抽取的体液通过该设备；和

(c)所述设备还用于将所抽取的体液作为再调节的体液重新插入回到患者体内。

42.如权利要求1-38中任一项所述的设备用于制备治疗需要器官替代或器官辅助的患者的装置的用途，其中：

(a)所述设备适合于患者与设备之间的体液交换；

(b)所述设备用于将来自患者的体液通过设备；和

(c)所述设备还用于将通过的体液作为再调节的体液返回到患者体内。

43.如权利要求41-42中任一项所述的用途，其中所述设备整合了具有贯穿脉管网络和细胞肾小球过滤单位的组织构建物与患者接口装置。

44.制备用于患者的器官替代或器官辅助治疗的设备的方法，包括：

(a)提供限定内部空腔的外壳；

(b)将包含多个活细胞的活的可编程哺乳动物组织构建物布置在外壳中并且用生物可相容物质至少部分地围绕所述活的可编程哺乳动物组织构建物；

其中所述组织构建物在使用时适合于和能够进行以下中的至少一种：

选自因患者器官的疾病或功能障碍而排出的患者体液的至少一种基本成分或细胞产物的过滤、再吸收、代谢、浓缩、改变或免疫调节以及将所述至少一种基本成分或细胞产物输送回患者体液中的一种或多种的类器官功能；或者

生产、分泌和输送同一种或另一种基本成分或细胞产物中的至少一个到患者体液中；和

(c)提供用于流体连通患者与布置在外壳中的组织构建物的患者接口。

45.如权利要求44所述的方法，其中通过打印带有嵌入式脉管系统的活的可编程哺乳动物组织构建物来将所述活的可编程哺乳动物组织构建物布置到外壳中，其中所述打印包括：

(a)沉积一个或多个载有细胞的细丝以形成一个或多个组织模型，每个载有细胞的细丝包含多个活细胞，且每个组织模型包含一种或多种预定细胞类型；

(b)沉积一个或多个牺牲细丝以形成贯穿一个或多个组织模型的脉管模型，每个牺牲细丝包括短效油墨；

(c)任选地，用胞外基质组合物至少部分围绕一个或多个组织模型和脉管模型，

(d)去除短效油墨以在胞外基质组合物中产生脉管通道，由此形成具有贯穿脉管网络的组织构建物。

46.如权利要求45所述的方法，还包括：

(e)沉积大孔物质层以形成基底层；

(f)在基底层上3D打印具有短效芯的管状多层结构；

(g)将额外的大孔物质浇注在3D打印的中空管状多层结构上；

(h)交联大孔物质；

(i)去除短效芯以产生中空管状多层结构；

(j)将来源于iPSC的中间中胚层细胞接种在3D打印的中空管状多层结构中；

(k)将iPSC在3D打印的中空管状多层结构中分化为足细胞以产生足细胞层；

由此产生细胞肾小球过滤单位。

47.如权利要求44-45中任一项所述的方法，其中整合了具有贯穿脉管网络和细胞肾小球过滤单位的组织构建物与患者接口装置。

48.如权利要求45所述的方法，其中所述沉积步骤是到基板上。

49.如权利要求44-45中任一项所述的方法，其中所述多个活细胞来自同种异体来源。

50.如权利要求44-45中任一项所述的方法，其中所述多个活细胞为工程化iPSC。

51.如权利要求44-45中任一项所述的方法，其中所述多个活细胞包括以下中的至少一种：肾近端小管细胞、亨利氏袢细胞、肾远端小管细胞、集合管细胞、系膜细胞、肾微血管细胞、肾细胞祖细胞、多能或多效干细胞、其它内皮细胞系细胞、内皮细胞或有孔肾小球内皮细胞。

52.如权利要求44-45中任一项所述的方法，其中所述组织构建物选自下组：活细胞、类器官、拟胚体、内皮萌芽、同种异体组织、异种组织和3D打印的组织构建物。

53.如权利要求44-45中任一项所述的方法，其中所述组织构建物包括嵌入式脉管系统。

54.如权利要求44-45中任一项所述的方法，其中所述组织构建物是与细胞肾小球过滤单位和单位和患者接口装置整合的具有嵌入式脉管系统的管状组织构建物。

55.如权利要求54所述的方法，其中所述组织构建物是肾单位、肠、乳导管、汗腺、结肠、食管、胃、耳咽管、气道上皮、附睾、细精管、尿道、肝胆管、胰管、胆总管、脑脊髓室和液管、腮腺、口腔粘膜、输卵管、输精管或淋巴。

56.制造设备的方法，所述设备构造为植入患者体内并用于患者的器官替代或器官辅助治疗，所述方法包括：

(a)提供限定内部空腔的外壳；

(b)将包含多个活细胞的可编程哺乳动物组织构建物布置在外壳中并且用生物可相容物质至少部分地围绕所述活的可编程哺乳动物组织构建物；

其中所述组织构建物在使用时适合于和能够进行以下中的至少一种：

选自因患者器官的疾病或功能障碍而排出的患者体液的至少一种基本成分或细胞产物的过滤、再吸收、代谢、浓缩、改变或免疫调节以及将所述至少一种基本成分或细胞产物输送回患者体液中的一种或多种的类器官功能；或者

生产、分泌和输送同一种或另一种基本成分或细胞产物中的至少一个到患者体液中；

(c)提供当设备被植入患者体内时用于流体连通患者与布置在外壳中的组织构建物的患者接口。

57.如权利要求56所述的方法，其中所述组织构建物在布置到外壳中之前在体外产生。

58.如权利要求56-57中任一项所述的方法，其中允许所述组织构建物在布置到外壳中之前在体外成熟。

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