CN110029170A - 一种肿瘤样本免疫检查点相关基因的mRNA检测引物组、试剂盒和方法 - Google Patents
一种肿瘤样本免疫检查点相关基因的mRNA检测引物组、试剂盒和方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110029170A CN110029170A CN201910406714.5A CN201910406714A CN110029170A CN 110029170 A CN110029170 A CN 110029170A CN 201910406714 A CN201910406714 A CN 201910406714A CN 110029170 A CN110029170 A CN 110029170A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- seq
- tumor sample
- detection
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种肿瘤样本免疫检查点相关基因的mRNA表达检测引物组、试剂盒和方法，属于肿瘤检测和治疗技术领域，所述引物组包括分别检测GBP5基因、ICAM1基因、CAMK2D基因、IRF1基因、CD44基因、CCL2基因和CD274基因的引物对；所述试剂盒，包括所述的引物组、cDNA合成逆转录液和荧光定量PCR反应液。所述引物组及试剂盒能够准确的检测免疫检查点相关基因GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44、CCL2和CD274的表达水平，能够准确反映肿瘤局部免疫应答状态，为肿瘤样本的免疫治疗提供依据。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤检测和治疗技术领域，尤其涉及一种肿瘤样本免疫检查点相关基因的mRNA表达检测引物组、试剂盒和方法。
背景技术
肿瘤是目前棘手的公共卫生问题。相较于其他疾病，目前肿瘤临床的治疗有效率仍然较低。肿瘤患者的生存质量差且预后不佳，并为个人家庭乃至整个社会造成沉重负担。目前仍然缺乏有效的技术手段对肿瘤进行精准评估，从而无法有的放矢为患者进行精准个体化治疗。目前存在的靶向药物，如PD-1单抗类药物，虽然有望为患者带来治疗收益，但仅对部分存在免疫应答的患者有效，并且其治疗费用高昂，亟需技术手段对患者进行用药前评估，以进行精准治疗，节约宝贵的治疗时间及社会经济成本。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种瘤样本免疫检查点相关基因的mRNA表达检测引物组、试剂盒和方法；所述引物组及试剂盒能够准确的检测免疫检查点相关基因GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44、CCL2和CD274的表达水平，能够准确反映肿瘤局部免疫应答状态，为肿瘤样本的免疫治疗提供依据。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种肿瘤样本免疫检查点相关基因的mRNA表达检测引物组，包括分别检测GBP5基因、ICAM1基因、CAMK2D基因、IRF1基因、CD44基因、CCL2基因和CD274基因的引物对。
优选的，所述检测GBP5基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；所述检测ICAM1基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；所述检测CAMK2D基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；所述检测IRF1基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；所述检测CD44基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示；所述检测CCL2基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示；所述检测CD274基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示。
本发明提供了一种肿瘤样本免疫检查点相关基因的mRNA表达检测试剂盒，包括所述的引物组、cDNA合成逆转录液和荧光定量PCR反应液。
优选的，所述试剂盒还包括检测管家基因ACTB的引物对。
优选的，所述检测管家基因ACTB的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：15和SEQ IDNO：16所示。
优选的，所述cDNA合成逆转录液包括Oligo dT、随机引物、dNTP、反转录缓冲液、RNA酶抑制剂、逆转录酶和DEPC水。
优选的，荧光定量PCR反应液包括SYBR Green的Taq酶预混液、ROX Reference DyeII和去离子水。
本发明还提供了一种非疾病治疗目的的检测肿瘤样本存在免疫应答的方法，包括以下步骤：
1)提取待检测肿瘤样本以及同一来源的非肿瘤样本的RNA；
2)利用所述试剂盒进行待检测肿瘤样本以及同一来源的非肿瘤样本的免疫检查点相关基因GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44、CCL2和CD274的表达量；
3)计算步骤2)中获得的待检测肿瘤样本免疫检查点相关基因GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44、CCL2和CD274的表达量与同一来源的非肿瘤样本免疫检查点相关基因GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44、CCL2和CD274的表达量的差异表达倍数；
4)将所述GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44和CCL2基因的权重设置为2分；待检测肿瘤样本未检测到表达计0分，表达差异倍数小于2计1分，表达差异倍数大于等于2计2分；将所述CD274基因权重设置为5分，待检测肿瘤样本未检测到表达计0分，表达差异倍数小于2计3分，表达差异倍数大于等于2计5分；上述7个基因的评分总和计为IFN-γ分数；当IFN-γ分数≥9分，判定待检测肿瘤样本的肿瘤区域存在T细胞免疫应答；当IFN-γ分数＜9分，判定待检测肿瘤样本的肿瘤区域不存在T细胞免疫应答。
本发明的有益效果：本发明提供的肿瘤样本免疫检查点相关基因的mRNA表达检测的引物组和试剂盒能够准确的检测免疫检查点相关基因GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44、CCL2和CD274的表达水平；而GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44、CCL2基因是II型干扰素诱导表达基因，并且与PD-L1的表达呈正相关；本发明利用上述7个基因表达水平进行加权获取免疫检查点相关基因的表达评分，所述表达评分能够反映患者肿瘤免疫应答水平、PD-L1表达水平以及患者预后情况，并可用于患者免疫检查点抑制剂(PD-1/PD-L1单抗类药物)用药的指导评估。
附图说明
图1为胃腺癌和肺腺癌IFN-γ分数与PD-L1的表达水平的关系图；
图2为几种IFN-γ评分参照基因的表达水平与患者的肿瘤恶性程度、预后的相关分析图；
图3为几种IFN-γ评分参照基因表达水平与胶质瘤预后的关系。
具体实施方式
本发明提供了一种肿瘤样本免疫检查点相关基因的mRNA表达检测引物组，包括分别检测GBP5基因、ICAM1基因、CAMK2D基因、IRF1基因、CD44基因、CCL2基因和CD274基因的引物对。
在本发明中，所述检测GBP5基因的引物对的核苷酸序列优选的如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；所述检测ICAM1基因的引物对的核苷酸序列优选的如SEQ ID NO：3和SEQID NO：4所示；所述检测CAMK2D基因的引物对的核苷酸序列优选的如SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6所示；所述检测IRF1基因的引物对的核苷酸序列优选的如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；所述检测CD44基因的引物对的核苷酸序列优选的如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示；所述检测CCL2基因的引物对的核苷酸序列优选的如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示；所述检测CD274基因的引物对的核苷酸序列优选的如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示。在本发明中，所述GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44、CCL2基因是II型干扰素诱导表达基因，并且与PD-L1的表达呈正相关，利用上述7种基因的表达能够很好的预测肿瘤组织PD-L1的表达水平，这种方法与仅仅通过PD-L1基因(CD274)qPCR结果来确定PD-L1的表达水平(可能产生假阴性结果)相比，结果的可靠性更高。
本发明提供了一种肿瘤样本免疫检查点相关基因的mRNA表达检测试剂盒，包括所述的引物组、cDNA合成逆转录液和荧光定量PCR反应液。在本发明中，所述试剂盒优选的还包括检测管家基因ACTB的引物对；所述检测管家基因ACTB的引物对的核苷酸序列优选的如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示。在本发明中，所述cDNA合成逆转录液包括Oligo dT、随机引物、dNTP、反转录缓冲液、RNA酶抑制剂、逆转录酶和DEPC水；所述反转录缓冲液优选为5×的反转录缓冲液。本发明对所述cDNA合成逆转录液的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规的cDNA合成逆转录液即可，在本发明具体实施过程中，所述cDNA合成逆转录液来源于TAKARA，PrimerScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，RR047A)。在本发明中，所述荧光定量PCR反应液优选的包括SYBR Green的Taq酶预混液、ROX Reference Dye II和去离子水；本发明中，所述Taq酶预混液优选为2×的Taq酶预混液。本发明对所述荧光定量PCR反应液的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规的荧光定量PCR反应液即可，在本发明具体实施过程中，所述荧光定量PCR反应液来源于TAKARA，SYBR Premix qPCR Kit，RR820A)。
本发明还提供了一种非疾病治疗目的的检测肿瘤样本存在免疫应答的方法，包括以下步骤：1)提取待检测肿瘤样本以及同一来源的非肿瘤样本的RNA；2)利用所述试剂盒进行待检测肿瘤样本以及同一来源的非肿瘤样本的免疫检查点相关基因GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44、CCL2和CD274的表达量；3)计算步骤2)中获得的待检测肿瘤样本免疫检查点相关基因GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44、CCL2和CD274的表达量与同一来源的非肿瘤样本免疫检查点相关基因GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44、CCL2和CD274的表达量的差异表达倍数；4)将所述GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44和CCL2基因的权重设置为2分；待检测肿瘤样本未检测到表达计0分，表达差异倍数小于2计1分，表达差异倍数大于2计2分；将所述CD274基因权重设置为5分，待检测肿瘤样本未检测到表达计0分，表达差异倍数小于2计3分，表达差异倍数大于2计5分；上述7个基因的评分总和计为IFN-γ分数；当IFN-γ分数≥9分，判定待检测肿瘤样本的肿瘤区域存在T细胞免疫应答；当IFN-γ分数＜9分，判定待检测肿瘤样本的肿瘤区域不存在T细胞免疫应答。
在本发明中，首先提取待检测肿瘤样本以及同一来源的非肿瘤样本的RNA。在本发明中，所述待检测肿瘤样本优选为患者肿瘤石蜡组织切片，所述同一来源的非肿瘤样本优选为待检测肿瘤样本患者的癌旁组织。本发明对所述RNA的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的RNA提取方法即可。
本发明在获得待检测肿瘤样本以及同一来源的非肿瘤样本的RNA后，利用所述试剂盒进行待检测肿瘤样本以及同一来源的非肿瘤样本的免疫检查点相关基因GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44、CCL2和CD274的表达量。在本发明中，首先将所述RNA逆转录获得cDNA；然后对获得的cDNA进行荧光定量PCR检测获得基因的上述表达量。在本发明的具体实施过程中，所述RNA逆转录的体系以20μL计，包括RNA 10μL(含RNA 100～1000ng)和cDNA合成逆转录液10μL。所述cDNA合成逆转录液优选的包括以下体积的组分：0.5μL Oligo dT、0.5μL随机引物、4μL逆转录缓冲液、2μL dNTP、0.5μL RNA酶抑制剂、1μL反转录酶和1.5μL DEPC水。在本发明中，所述荧光定量PCR的反应体系以20μL计，包括2μL上述步骤获得的cDNA产物(含cDNA 1～10ng)、1.6μL扩增引物对和18μL荧光定量PCR反应液；所述荧光定量PCR反应液优选的包括10μL SYBR Green的Taq酶预混液(2×)、0.4μL ROX Reference Dye II和6μL去离子水。在本发明中，所述荧光定量PCR的程序优选的如下：
Stage 1:Initial denaturation Reps:1
95℃ 30s
Stage 2:PCR Reps:40
95 ℃ 5s
60℃ 34s
Dissociation stage Reps:1
95℃ 15s
60℃ 60s
95℃ 15s
本发明在所述荧光定量PCR结束后，获得免疫检查点相关基因GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44、CCL2、CD274以及管家基因ACTB的Ct值，利用Ct值，通过2-ΔΔCt法计算获得的待检测肿瘤样本免疫检查点相关基因GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44、CCL2和CD274的表达量与同一来源的非肿瘤样本免疫检查点相关基因GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44、CCL2和CD274的表达量的差异表达倍数。
本发明在获得所述差异表达倍数后，将所述GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44和CCL2基因的权重设置为2分；待检测肿瘤样本未检测到表达计0分，表达差异倍数小于2计1分，表达差异倍数大于2计2分；将所述CD274基因权重设置为5分，待检测肿瘤样本未检测到表达计0分，表达差异倍数小于2计3分，表达差异倍数大于2计5分；上述7个基因的评分总和计为IFN-γ分数；当IFN-γ分数≥9分，判定待检测肿瘤样本的肿瘤区域存在T细胞免疫应答；当IFN-γ分数＜9分，判定待检测肿瘤样本的肿瘤区域不存在T细胞免疫应答。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
样品来源15例胃腺癌，来源于上海芯超生物科技有限公司，组织库。
使用患者肿瘤组织和癌旁组织(各取约0.1g组织)，分别提取两者RNA，将获得的RNA，将RNA溶解于10μL DEPC水中。
对RNA样本逆转录获得cDNA：
cDNA合成逆转录液：包含0.5μL Oligo dT、0.5μL随机引物、4μL逆转录缓冲液、2μLdNTP、0.5μL RNA酶抑制剂、1μL反转录酶、1.5μL DEPC水。
将10μL RNA样本与10ul上述cDNA合成逆转录液混合室温放置5min。
对样本进行荧光定量PCR检测：
荧光定量PCR液：包含10μL SYBR Green的Taq酶预混液(2×)、0.8μL正向引物、0.8μL反向引物、0.4μL ROX Reference Dye II和6μL去离子水。
针对8种基因一共有八种荧光定量PCR液，分别用于检测GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44、CCL2、CD274及管家基因ACTB，每种荧光定量PCR液除使用引物不同，其余组分相同。
将2μL cDNA样本与18μL荧光定量PCR液混合，PCR条件如下：
Stage 1:Initial denaturation Reps:1
95℃ 30s
Stage 2:PCR Reps:40
95℃ 5s
60℃ 34s
Dissociation stage Reps:1
95℃ 15s
60℃ 60s
95℃ 15s
通过荧光定量PCR获得GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44、CCL2、CD274及管家基因的Ct值，通过2-ΔΔCt法获取每个基因肿瘤组织与癌旁组织差异表达倍数。GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44、CCL2六个基因的权重为2分，肿瘤组织未检测到表达计0分，表达差异小于2倍计1分，表达差异大于2倍计2分。CD274基因权重为5分，肿瘤组织未检测到表达计0分，表达差异小于2倍计3分，表达差异大于2倍计5分。根据以上七个基因评分总和，获得最后IFN-γ分数。IFN-γ分数大于或等于9分，判定为肿瘤区域存在T细胞免疫应答，可支持使用免疫检查点抑制剂药物。
荧光定量PCR计算获得的IFN-γ分数见表1。
表1胃腺癌荧光定量PCR计算获得的2IFN-γ分数
实施例2
样品来源15例肺腺癌，来源于上海芯超生物科技有限公司，组织库。
使用患者肿瘤组织，癌组织和癌旁组织，分别提取两者RNA，将获得的RNA，将RNA溶解于10μL DEPC水中。
对RNA样本逆转录获得cDNA：
cDNA合成逆转录液：包含0.5μL Oligo dT、0.5μL随机引物、4μL逆转录缓冲液、2μLdNTP、0.5μL RNA酶抑制剂、1μL反转录酶、1.5μL DEPC水。
将10μL RNA样本与10ul上述cDNA合成逆转录液混合室温放置5min。
对样本进行荧光定量PCR检测：
荧光定量PCR液：包含10μL SYBR Green的Taq酶预混液(2×)、0.8μL正向引物、0.8μL反向引物、0.4μL ROX Reference Dye II和6μL去离子水。
针对8种基因一共有八种荧光定量PCR液，分别用于检测GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44、CCL2、CD274及管家基因ACTB，每种荧光定量PCR液除使用引物不同，其余组分相同。
将2μL cDNA样本与18μL荧光定量PCR液混合，PCR条件如下：
Stage 1:Initial denaturation Reps:1
95℃ 30s
Stage 2:PCR Reps:40
95℃ 5s
60℃ 34s
Dissociation stage Reps:1
95℃ 15s
60℃ 60s
95℃ 15s
通过荧光定量PCR获得GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44、CCL2、CD274及管家基因的Ct值，通过2-ΔΔCt法获取每个基因肿瘤组织与癌旁组织差异表达倍数。GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44、CCL2六个基因的权重为2分，肿瘤组织未检测到表达计0分，表达差异小于2倍计1分，表达差异大于2倍计2分。CD274基因权重为5分，肿瘤组织未检测到表达计0分，表达差异小于2倍计3分，表达差异大于2倍计5分。根据以上七个基因评分总和，获得最后IFN-γ分数。IFN-γ分数大于或等于9分，判定为肿瘤区域存在T细胞免疫应答，可支持使用免疫检查点抑制剂药物。
荧光定量PCR计算获得的IFN-γ分数见表2。
表2肺腺癌荧光定量PCR计算获得的2IFN-γ分数
实施例1和实施例2中所述GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44、CCL2、CD274及管家基因ACTB的的PCR引物见表3，表3中的引物序列皆为5’->3’。
表3免疫检查点相关基因及管家基因ACTB的的PCR引物
实施例1和实施例2中胃腺癌和肺腺癌IFN-γ分数与PD-L1的表达水平的关系见图1，可见IFN-γ分数与PD-L1表达水平呈正相关，IFN-γ分数越高则其对应的PD-L1表达水平更高且提示肿瘤局部T细胞反应活跃。此外，IFN-γ分数较单一PD-L1表达水平更为稳定可靠，且避免了由于PD-L1低表达或取材因素导致的PD-L1假阴性结果。
为了检测本发明提供的IFN-γ分数与恶性肿瘤程度、PD-L1表达情况、预后判定等情况，本发明还进行了系列数据分析，结果如图2和图3。
图2中A-E的数据来源于TCGA数据库，数据内容为RNA-seq数据，其中：
OD，oligodendroglioma代表少突胶质细胞瘤；
OA，oligoastrocytoma代表少突星形细胞瘤；
AST，astrocytoma代表星形细胞瘤；
GBM，glioblastoma multiforme代表多形性胶质母细胞瘤；
上述四种胶质瘤恶性程度由低到高。
图2中的A结果表明IFN-γ评分随肿瘤恶性程度升高而增加。
图2中B-C为同一组织分型原发与继发肿瘤之间IFN-γ评分以及CD274(PD-L1)表达差异比较，在恶性程度最高的GBM中，继发肿瘤IFN-γ评分及PD-L1表达较原发肿瘤升高。
图2中D为IFN-γ评分作为预后判定指标的潜在价值。
图2中E为IFN-γ评分与PD-L1表达的相关性分析，结果显示，在几种胶质瘤中，IFN-γ评分与PD-L1表达呈显著正相关。
图2中F数据来源于IVY GAP数据库；数据内容为RNA-seq数据。
不同肿瘤组织区域IFN-γ评分与PD-L1表达以及相关性分析。
LE,leading edge；代表前沿
IT,infiltrating tumor；代表浸润肿瘤
CT,cellulartumor；代表肿瘤体
CTpnz,perinecrotic zone；代表围坏死区域
CTpan,pseudopalisading cells aroundnecrosis.代表坏死周围的假性细胞
各部分依次由外到内，结果显示越靠近肿瘤中心PD-L1表达及IFN-γ评分越高，且两者呈显著相关。
图3为几种IFN-γ评分参照基因表达水平与胶质瘤预后的关系。
图3的数据来源TCGA数据库；数据内容为RNA-seq数据；
图3中A为统计IFN-γ评分参照基因在胶质瘤中表达水平变化；结果表明IFN-γ评分参照基因随肿瘤恶性程度升高，表达升高，并与PD-L1(CD274)表达趋势相近。
图3中B的结果表明IFN-γ评分参照基因高表达患者，预后不良。
上述图2和图3中所用到的统计方法如下：
Unpaired Student’s t test
Pearson’s correlation coefficient
*p<0.05；**p<0.01.All values are shown as mean±SEM。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 复旦大学
<120> 一种肿瘤样本免疫检查点相关基因的mRNA检测引物组、试剂盒和方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgaaaaggc tgaagcgcaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcctgttcc tgcatctgtt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcccaagtt gttgggcata 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggagtccagt acacggtgag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tatcaaccct gccaaacgca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acaaactctt ggctgctgag 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccaagaggaa gtcatgtggg g 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacttccact gggatgtgcc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agcacaatcc aggcaactcc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctggtatgag ctgaggctgc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccgagaggct gagactaacc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggggcattga ttgcatctgg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cctgcagggc attccagaaa 20
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agtgcagcca ggtctaattg t 21
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agcgagcatc ccccaaagtt 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gggcacgaag gctcatcatt 20
Claims (8)
1.一种肿瘤样本免疫检查点相关基因的mRNA表达检测引物组，其特征在于，包括分别检测GBP5基因、ICAM1基因、CAMK2D基因、IRF1基因、CD44基因、CCL2基因和CD274基因的引物对。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述检测GBP5基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；所述检测ICAM1基因的引物对的核苷酸序列如SEQID NO：3和SEQ ID NO：4所示；所述检测CAMK2D基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；所述检测IRF1基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8所示；所述检测CD44基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示；所述检测CCL2基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示；所述检测CD274基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示。
3.一种肿瘤样本免疫检查点相关基因的mRNA表达检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组、cDNA合成逆转录液和荧光定量PCR反应液。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测管家基因ACTB的引物对。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述检测管家基因ACTB的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述cDNA合成逆转录液包括Oligo dT、随机引物、dNTP、反转录缓冲液、RNA酶抑制剂、逆转录酶和DEPC水。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，荧光定量PCR反应液包括SYBR Green的Taq酶预混液、ROX Reference Dye II和去离子水。
8.一种非疾病治疗目的的检测肿瘤样本存在免疫应答的方法，包括以下步骤：
1)提取待检测肿瘤样本以及同一来源的非肿瘤样本的RNA；
2)利用权利要求2～7任意一项所述试剂盒进行待检测肿瘤样本以及同一来源的非肿瘤样本的免疫检查点相关基因GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44、CCL2和CD274的表达量；
3)计算步骤2)中获得的待检测肿瘤样本免疫检查点相关基因GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44、CCL2和CD274的表达量与同一来源的非肿瘤样本免疫检查点相关基因GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44、CCL2和CD274的表达量的差异表达倍数；
4)将所述GBP5、ICAM1、CAMK2D、IRF1、CD44和CCL2基因的权重设置为2分；待检测肿瘤样本未检测到表达计0分，表达差异倍数小于2计1分，表达差异倍数大于等于2计2分；将所述CD274基因权重设置为5分，待检测肿瘤样本未检测到表达计0分，表达差异倍数小于2计3分，表达差异倍数大于等于2计5分；上述7个基因的评分总和计为IFN-γ分数；当IFN-γ分数≥9分，判定待检测肿瘤样本的肿瘤区域存在T细胞免疫应答；当IFN-γ分数＜9分，判定待检测肿瘤样本的肿瘤区域不存在T细胞免疫应答。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910406714.5A CN110029170B (zh) | 2019-05-16 | 2019-05-16 | 一种肿瘤样本免疫检查点相关基因的mRNA检测引物组、试剂盒和方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910406714.5A CN110029170B (zh) | 2019-05-16 | 2019-05-16 | 一种肿瘤样本免疫检查点相关基因的mRNA检测引物组、试剂盒和方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110029170A true CN110029170A (zh) | 2019-07-19 |
| CN110029170B CN110029170B (zh) | 2020-06-02 |
Family
ID=67242301
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910406714.5A Active CN110029170B (zh) | 2019-05-16 | 2019-05-16 | 一种肿瘤样本免疫检查点相关基因的mRNA检测引物组、试剂盒和方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110029170B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112195224A (zh) * | 2020-10-23 | 2021-01-08 | 漯河医学高等专科学校 | 基因组合的检测试剂在肺癌患者免疫治疗中的应用 |
| CN114774532A (zh) * | 2022-04-13 | 2022-07-22 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 一种口腔正畸时辰施力生物标志物及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105671181A (zh) * | 2016-03-23 | 2016-06-15 | 王义明 | 用于检测肺癌的基因标志物、引物、探针及试剂盒 |
| CN106755330A (zh) * | 2016-11-29 | 2017-05-31 | 上海芯超生物科技有限公司 | 癌症相关基因表达差异检测试剂盒及其应用 |
-
2019
- 2019-05-16 CN CN201910406714.5A patent/CN110029170B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105671181A (zh) * | 2016-03-23 | 2016-06-15 | 王义明 | 用于检测肺癌的基因标志物、引物、探针及试剂盒 |
| CN106755330A (zh) * | 2016-11-29 | 2017-05-31 | 上海芯超生物科技有限公司 | 癌症相关基因表达差异检测试剂盒及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| QIAN JIAWEN等: "The IFN-γ/PD-L1 axis between T cells and tumor microenvironment:hints for glioma anti-PD-1/PD-L1 therapy", 《JOURNAL OF NEUROINFLAMMATION》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112195224A (zh) * | 2020-10-23 | 2021-01-08 | 漯河医学高等专科学校 | 基因组合的检测试剂在肺癌患者免疫治疗中的应用 |
| CN114774532A (zh) * | 2022-04-13 | 2022-07-22 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 一种口腔正畸时辰施力生物标志物及其应用 |
| CN114774532B (zh) * | 2022-04-13 | 2024-06-14 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 一种口腔正畸时辰施力生物标志物及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110029170B (zh) | 2020-06-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2664180C2 (ru) | Маркеры ответа опухолевых клеток на противораковую терапию | |
| US20220364183A1 (en) | Gene Panels for Molecular Subtype and Survival Risk Assessment of Lung Adenocarcinoma and Diagnostic Products and Applications Thereof | |
| CN109797219A (zh) | 检测abracl表达水平的试剂的应用和试剂盒 | |
| WO2021164492A1 (zh) | 一组结肠癌预后相关基因的应用 | |
| US20110256545A1 (en) | mRNA expression-based prognostic gene signature for non-small cell lung cancer | |
| CN110029170A (zh) | 一种肿瘤样本免疫检查点相关基因的mRNA检测引物组、试剂盒和方法 | |
| TWI780781B (zh) | 微衛星不穩定性檢測方法及系統 | |
| US11466327B2 (en) | Use of the expression of specific genes for the prognosis of patients with triple negative breast cancer | |
| CN110358829A (zh) | 检测重组人肽基脯氨酰顺反异构酶-h表达水平的试剂的应用和试剂盒 | |
| CN110273000A (zh) | 检测锌指蛋白468表达水平的试剂的应用和试剂盒 | |
| KR102602133B1 (ko) | 자궁경부암의 전이 진단용 키트 | |
| CN109652539A (zh) | 一种针对egfr t790m位点突变进行检测的试剂盒 | |
| RU2818352C1 (ru) | Способ оценки резистентности злокачественных новообразований к радиационной терапии и набор тестов для его реализации | |
| KR102546809B1 (ko) | 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단을 위한 정보 제공 방법 | |
| EP3037550A1 (en) | Determination of the risk of distant metastases in surgically treated patients with non-small cell lung cancer in stage i-iiia | |
| CN110305959A (zh) | 检测锌指蛋白517表达水平的试剂的应用和试剂盒 | |
| CN110358833A (zh) | 检测Tudor结构域蛋白2表达水平的试剂的应用和试剂盒 | |
| CN110423813A (zh) | 检测NudC结构域蛋白1表达水平的试剂的应用和试剂盒 | |
| CN110373464A (zh) | 检测Derlin1蛋白表达水平的试剂的应用和试剂盒 | |
| CN110358831A (zh) | 检测跨膜蛋白41a表达水平的试剂的应用和试剂盒 | |
| CN110358826A (zh) | 检测人源全长重组蛋白1表达水平的试剂的应用和试剂盒 | |
| CN110305960A (zh) | 检测锌指蛋白622表达水平的试剂的应用和试剂盒 | |
| CN110358832A (zh) | 检测ph结构域家族a成员6表达水平的试剂的应用和试剂盒 | |
| CN110423815A (zh) | 检测线粒体内膜转位酶17a表达水平的试剂的应用和试剂盒 | |
| CN110358828A (zh) | 检测e3 sumo化蛋白转移酶nse2表达水平的试剂的应用和试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |