CN110023329A - 作为肽类三重glp1/胰高血糖素/gip受体激动剂的新化合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及三重GLP1/胰高血糖素/GIP受体激动剂及其医药用途，例如用于治疗代谢综合征的病症，包括糖尿病和肥胖，以及用于降低过量的食物摄入。

Description

作为肽类三重GLP1/胰高血糖素/GIP受体激动剂的新化合物

技术领域

本发明涉及其为三重(trigonal)GLP1/胰高血糖素/GIP受体激动剂的新化合物及其医药用途，例如用于治疗代谢综合征的病症，包括糖尿病和肥胖，以及用于减少过量的食物摄入。本发明的化合物在结构上来源于毒蜥外泌肽-4，并且在抗微生物防腐剂如间甲酚或苯酚的存在下在酸性条件下显示出高溶解度和稳定性，这使得它们特别适合于与其它抗糖尿病化合物组合。

背景技术

Bhat等(Diabetologia 2013,56,1417-1424)，Bhat等(Biochem Pharmacol.2013,85,1655-62)，Gault等(J Biol Chem.2013,288,35581-91)以及Finan等(Nat Med.2015,21,27-36)描述了胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)受体的三重激动剂(trigonal agonist)，例如通过在一个分子中将GLP-1、胰高血糖素和GIP的作用组合，尤其是由于胰高血糖素受体介导增加的饱腹感和能量消耗以及GIP受体介导增加的胰岛素分泌，其导致具有抗糖尿病作用的治疗原理和比纯GLP-1激动剂更优越的明显的体重降低效果。

GLP-1(7-36)-酰胺的氨基酸序列显示为SEQ ID NO:1。

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH₂

利拉鲁肽(Liraglutide)为市售的化学修饰的GLP-1类似物，其中除了其它修饰以外，脂肪酸与位置20处的赖氨酸连接，导致延长的作用持续时间(Drucker等,Nat.Rev.DrugDisc.2010,9,267-268；Buse等,Lancet 2009,374,39-47)。

利拉鲁肽的氨基酸序列显示为SEQ ID NO:2。

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基)EFIAWLVRGRG-OH

胰高血糖素为29-氨基酸肽，其当循环葡萄糖低时释放到血流中。胰高血糖素的氨基酸序列显示为SEQ ID NO:3。

HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT-OH

在低血糖期间，当血糖水平降至正常水平以下时，胰高血糖素向肝脏发信号以分解糖原并释放葡萄糖，引起血糖水平升高以到达正常水平。最近的出版物表明胰高血糖素还具有减少体脂肪量，减少食物摄取和增加能量消耗的有益效果(Heppner等,Physiology&Behavior 2010,100,545-548)。

GIP(葡萄糖依赖性促胰岛素多肽)为在食物摄取后从肠K细胞释放的42氨基酸肽。GIP和GLP-1是负责肠促胰岛素作用的两种源自肠内分泌细胞的激素，其负责对口服葡萄糖激发的胰岛素应答的70％以上(Baggio等Gastroenterology 2007,132,2131-2157)。

GIP的氨基酸序列显示为SEQ ID NO:5。

YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ-OH

已经在专利申请WO 2010/011439、WO 2010/148089、WO 2012/088116、WO 2013/192129、WO 2013/192130、WO 2014/049610和WO 2015/067716中描述了基于GLP-1或胰高血糖素的结构并结合和活化GLP-1、胰高血糖素和GIP受体的肽。已经在WO 2014/096145、WO2015/086731、WO 2015/086732、WO 2015/086733、WO 2015/155141和PCT/EP2016/063332中描述了基于毒蜥外泌肽-4的其它三特异性激动剂。已经显示其中描述的化合物导致改善的血糖控制，可能的胰岛和β-细胞保存以及增强的体重减轻。

专利申请WO 2014/096145 A1，WO 2014/096150 A1，WO 2014/096149 A1和WO2014/096148 A1中描述了结合并活化设计为毒蜥外泌肽-4的类似物且用脂肪酸侧链取代的GIP和GLP-1受体的肽。

毒蜥外泌肽-4为39氨基酸肽，由吉拉毒蜥(钝尾毒蜥(Heloderma suspectum))的唾液腺产生。毒蜥外泌肽-4是GLP-1受体的活化剂，而它显示GIP受体的低活性，并且不活化胰高血糖素受体(参见表1)。

表1：毒蜥外泌肽-4在渐增的浓度对人GLP-1、GIP和胰高血糖素受体的效力(以pM指示)并测量所形成的cAMP如方法中所述。

毒蜥外泌肽-4的氨基酸序列显示为SEQ ID NO:4。

HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH₂

毒蜥外泌肽-4共享以GLP-1观察到的许多葡萄糖调节作用。临床和非临床研究显示，毒蜥外泌肽-4具有几种有益的抗糖尿病特性，包括在胰岛素合成和分泌中的葡萄糖依赖性增强，胰高血糖素分泌的葡萄糖依赖性抑制，减缓胃排空，减少食物摄取和体重，和β细胞质量及β细胞功能的标记物的增加。

这些效果不仅对糖尿病患者有益，而且对肥胖患者也有益。肥胖患者具有患糖尿病、高血压、高脂血症、心血管疾病和肌肉骨骼疾病的较高风险。

相对于GLP-1，毒蜥外泌肽-4对二肽基肽酶-4(DPP4)的切割具有抗性，导致更长的半衰期和体内作用持续时间(Eng J.,Diabetes,1996,45(Suppl 2):152A(摘要554))。

当与GLP-1、胰高血糖素或胃泌酸调节素相比时，还显示毒蜥外泌肽-4对中性内肽酶(NEP)降解稳定得多(Druce等,Endocrinology,2009,150(4),1712-1722)。尽管如此，由于14位(Hargrove等,Regul.Pept.,2007,141,113-119)中的甲硫氨酸氧化以及28位天冬酰胺的脱酰胺和异构化(WO 2004/035623)，毒蜥外泌肽-4在化学上不稳定。

Bloom等(WO 2006/134340)公开了结合并活化胰高血糖素和GLP-1受体两者的肽可被构建为来自胰高血糖素和毒蜥外泌肽-4的杂合分子，其中N-端部分(例如残基1-14或1-24)来自胰高血糖素，而C端部分(例如残基15-39或25-39)来源于毒蜥外泌肽-4。这样的肽在10-13位包含胰高血糖素的氨基酸基序YSKY。Krstenansky等(Biochemistry,1986,25,3833-3839)显示胰高血糖素的这些残基10-13对其受体相互作用和活化腺苷酸环化酶的重要性。

与GLP-1，胰高血糖素和泌酸调节肽相比，毒蜥外泌肽-4具有有益的物理化学性质，如在溶液中和生理条件下的溶解度和稳定性(包括对酶如DPP4或NEP的降解的酶稳定性)，其导致体内作用持续时间更长。

尽管如此，由于在位置14的甲硫氨酸氧化以及在位置28的天冬酰胺的脱酰胺和异构化，毒蜥外泌肽-4也被证明是化学不稳定的。稳定性可通过取代位置14处的甲硫氨酸和避免已知易于经由天冬酰亚胺形成降解的序列(特别是在位置28和29处的Asp-Gly或Asn-Gly)而进一步改善。

发明内容

在本发明的化合物中，几个潜在的残基不同于胰高血糖素和WO 2006/134340中描述的肽。特别是已知有助于胰高血糖素原纤化的残基Tyr10和Tyr13(JS Pedersen等,Biochemistry,2006,45,14503-14512)被Leu替代。这种替代，特别是与23位的异亮氨酸和24位的谷氨酸的组合导致具有潜在改善的生物物理性质(如溶液中的溶解度或聚集行为)的毒性外泌肽-4衍生物。在毒蜥外泌肽-4类似物的13位上用脂族氨基酸替代芳族氨基酸导致对胰高血糖素和GIP受体均具有高活性、保持其对GLP-1受体的活性的肽。

天然毒蜥外泌肽-4为纯GLP-1受体激动剂，对胰高血糖素受体无活性，对GIP受体低活性。本发明化合物基于天然毒蜥外泌肽-4的结构，但与SEQ ID NO:4相比在14个或更多位置不同，其中这些不同有助于增强对胰高血糖素受体和GIP受体的激动剂活性。除其它取代外-位置14处的甲硫氨酸被在侧链中携带-NH₂基团的氨基酸替代，其进一步被亲脂性残基(例如与接头组合的脂肪酸)取代。此外，在位置13处用Leu，在位置19处用Gln，在位置20处用Aib或Lys氨基酸，在位置34处用Aib，在位置32处用Pro和在位置35和39处用Lys替代位置13、19、20、32、34、35和39处的毒蜥外泌肽-4氨基酸导致对胰高血糖素以及GIP受体的高活性，同时保持对GLP-1受体的高活性。这些肽还显示高的化学稳定性、溶解性和在酸性pH值(如pH4.5)的物理稳定性。

本发明的化合物具有式I:

H₂N-His-Aib-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Leu-X14-Glu-Glu-Gln-Arg-Gln-X20-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Ala-X29-Gly-X31-Pro-Ser-Aib-Lys-Pro-Pro-Pro-Lys-R¹ I

其中

X14表示具有官能化的-NH₂侧链基团的氨基酸残基，选自下组：Lys、Orn、Dab或Dap，其中所述-NH₂侧链基团通过如下官能化：-Z-C(O)-R⁵，其中

Z表示所有立体异构形式的接头和

R⁵为包含多至50个碳原子和选自N和O的杂原子的模块，

X20表示选自Aib和Lys的氨基酸残基，

X29表示选自D-Ala和Gly的氨基酸残基，

X31表示选自His和Pro的氨基酸残基，

R¹为NH₂或OH，

或其盐或溶剂合物。

本发明的化合物是GLP-1、胰高血糖素和GIP受体激动剂，如通过在方法中描述的测定系统中能够刺激细胞内cAMP形成的观察确定的。

根据本发明的化合物的另一个实施方案，特别是在位置14具有赖氨酸，其进一步用亲脂性残基取代，对GLP-1受体与GLP-1(7-36)酰胺的情况相比显示至少0.1％(即EC₅₀<700pM)，更优选1％(即EC₅₀<70pM)，更优选3.5％(即EC₅₀<20pM)和甚至更优选7％(即EC₅₀<10pM)的相对活性。此外，本发明的化合物对胰高血糖素受体与天然胰高血糖素的情况相比显示至少0.1％(即EC₅₀<500pM)，更优选0.5％(即EC₅₀<100pM)，更优选1％(<50pM)和甚至更优选5％(即EC₅₀<10pM)的相对活性。此外，本发明的化合物对GIP受体与天然GIP的情况相比显示至少0.1％(即EC₅₀<400pM)，更优选0.4％(即EC₅₀<100pM)，更优选1％(<40pM)和甚至更优选4％(即EC₅₀<10pM)的相对活性。

如本文使用的术语“活性”优选指化合物活化人GLP-1受体、人胰高血糖素受体和人GIP受体的能力。更优选地，如本文使用的术语“活性”指化合物刺激细胞内cAMP形成的能力。如本文使用的术语“相对活性”应理解为指化合物与另一种受体激动剂或与另一种受体相比以一定比例活化受体的能力。受体通过激动剂的活化(例如通过测量cAMP水平)如本文所述，例如，如实施例中所述来确定。

本发明的化合物优选具有对于hGLP-1受体为450pM或更少，优选200pM或更少，更优选100pM或更少，更优选50pM或更少，更优选25pM或更少，更优选10pM或更少，更优选8pM或更少，和更优选5pM或更少的EC₅₀，和对于人胰高血糖素受体为450pM或更少，优选200pM或更少，更优选100pM或更少，更优选50pM或更少，更优选25pM或更少，更优选10pM或更少，更优选8pM或更少，和更优选5pM或更少的EC₅₀，和对于人GIP受体为450pM或更少，优选200pM或更少，更优选100pM或更少，更优选50pM或更少，更优选25pM或更少，更优选10pM或更少，更优选8pM或更少，和更优选5pM或更少的EC₅₀。对于人GLP-1受体、人胰高血糖素受体和人GIP受体的EC₅₀可如本文方法中所述确定，并用于生成实施例中所述的结果。

式I化合物，特别是在位置14处具有赖氨酸(其被亲脂性残基进一步取代)的那些，与位置14处具有原始的甲硫氨酸(来自毒蜥外泌肽-4)或亮氨酸的衍生物相比，显示增加的胰高血糖素受体活化(还参见WO2014/056872)。此外，甲硫氨酸的氧化(体外或体内)不再是可能的。

式I化合物不仅对胰高血糖素受体显示高活性，而且对GIP受体上也显示高活性。对GIP受体的额外的高活性意欲用于与纯GLP-1受体激动相比对血糖控制增强的功效，和降低GLP-1相关副作用如胃肠道不适的可能性，因为GLP-1部分的贡献可被减少。额外的GIPR活性还意欲通过胰高血糖素受体活化来抵消潜在的葡萄糖增加，因此允许如在式I化合物中观察到的更高的胰高血糖素受体活性(Finan等Nat Med.2015,21,27-36)。

在一个实施方案中，本发明的化合物在抗微生物防腐剂如苯酚或间甲酚存在下在酸性和/或生理pH值(例如在pH 4至5，特别是pH 4.5的酸度范围和/或pH 6至8的更加生理性的范围，特别是在pH 7.4在25℃或40℃)具有高溶解性，在另一个实施方案中为至少1mg/ml和在一个具体的实施方案中为至少5mg/ml。

此外，本发明的化合物当在抗微生物防腐剂如苯酚或间甲酚存在下储存于溶液中时优选具有高稳定性。用于确定所述稳定性的优选的测定条件是在pH 4至5，特别是pH 4.5的酸度范围在溶液中在25℃或40℃储存28天。肽的稳定性通过层析分析确定，如方法中所述。优选地，在pH 4.5在溶液中在40℃28天后，纯度损失不大于20％，更优选不大于15％和甚至更优选不大于12％。

在一个实施方案中，本发明的化合物在抗微生物防腐剂如苯酚或间甲酚存在下，例如在pH 4至5的酸度范围在25℃，特别是pH 4.5在25℃在≥1mg/ml的浓度下显示5nm或更小的流体力学半径R_h，如通过如方法中所述的动态光散射所测定的。

本发明的化合物以硫磺素T作为荧光探针在抗微生物防腐剂如苯酚或间甲酚存在下在3mg/ml的浓度不显示荧光强度的增加，例如，在pH 4至5的酸度范围，特别是pH 4.5在37℃超过5小时，更优选超过10小时，更优选超过20小时，更优选超过30小时，更优选超过40小时和甚至更优选超过45小时，如通过如方法中所述的ThT测定法所测定的。

在一个实施方案中，本发明的化合物是对由中性内肽酶(NEP)和二肽基肽酶-4(DPP4)的切割更具抗性的，导致当与天然GLP-1和胰高血糖素相比时更长的半衰期和体内作用持续时间。

在一个实施方案中，本发明的化合物包括肽部分，其为39个氨基羧基酸的线性序列，特别是通过肽键，即羧酰胺键连接的α-氨基羧基酸。

在一个实施方案中，R¹为NH₂。

对于-Z-C(O)-R⁵基团的具体的优选实例列于下表2中，其选自

(S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基-、(S)-4-羧基-4-十八酰基氨基-丁酰基-、(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基)-丁酰基、(4S)-羧基-[2-(2-{2-[(4R)-5-羧基-4-十六酰基氨基-戊酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基氨基]-丁酰基、(4S)-羧基-[2-(2-{2-[(4R)-5-羧基-4-十六酰基氨基-戊酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基氨基]-丁酰基、(2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基、(2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-羧基-4-十八酰基氨基-丁酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基、[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-十八酰基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基氨基}-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基氨基}-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-。

进一步优选的是立体异构体，特别是这些基团的对映异构体，S-或R-对映异构体。表2中的术语"R"意指-Z-C(O)-R⁵在肽主链处的附接位点，例如Lys的ε-氨基基团。

表2

一个进一步的实施方案涉及式I化合物，其中

X14表示Lys，其中-NH₂侧链基团用基团-Z-C(O)R⁵官能化，其中

Z表示选自gGlu、gGlu-gGlu、gGlu-AEEAc-gAAA-、gGlu-gGlu-AEEAc、AEEAc-AEEAc-gGlu和AEEAc-AEEAc-AEEAc的基团；和

R⁵表示基团选自十五烷基或十七烷基。

一个进一步的实施方案涉及式I化合物，其中

X14表示Lys，其中-NH₂侧链基团用基团-Z-C(O)R⁵官能化，其中

Z表示选自gGlu、gGlu-gGlu、gGlu-AEEAc-gAAA-和gGlu-gGlu-AEEAc的基团；和

R⁵表示基团选自十五烷基或十七烷基。

一个进一步的实施方案涉及式I化合物，其中

X14表示Lys，其中-NH₂侧链基团通过如下官能化：(S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基-、(S)-4-羧基-4-十八酰基氨基-丁酰基-、(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基)-丁酰基-、(2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基、(2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-羧基-4-十八酰基氨基-丁酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基、[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-十八酰基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基氨基}-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基氨基}-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-，

R¹表示NH₂，

或其盐或溶剂合物。

一个进一步的实施方案涉及式I化合物，其中

X14表示Lys，其中-NH₂侧链基团通过如下官能化：(S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基-、(S)-4-羧基-4-十八酰基氨基-丁酰基-、(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基)-丁酰基-、(2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基、(2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-羧基-4-十八酰基氨基-丁酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基，

R¹表示NH₂，

或其盐或溶剂合物。

一个进一步的实施方案涉及式I化合物，其中

X14表示Lys，其中-NH₂侧链基团通过如下官能化：(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基)-丁酰基-，

X20表示Lys或Aib，

X29表示选自D-Ala和Gly的氨基酸残基，

X31表示选自His和Pro的氨基酸残基，

R¹表示NH₂，

或其盐或溶剂合物。

一个进一步的实施方案涉及式I化合物，其中

X14表示Lys，其中-NH₂侧链基团通过如下官能化：(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基)-丁酰基-、(S)-4-羧基-4-十八酰基氨基-丁酰基-，

X20表示Lys，

X29表示选自D-Ala和Gly的氨基酸残基，

X31表示选自His和Pro的氨基酸残基，

R¹表示NH₂，

或其盐或溶剂合物。

一个进一步的实施方案涉及式I化合物，其中

X14表示Lys，其中-NH₂侧链基团通过如下官能化：(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基)-丁酰基-、(S)-4-羧基-4-十八酰基氨基-丁酰基-，

X20表示Lys，

X29表示选自D-Ala和Gly的氨基酸残基，

X31表示His，

R¹表示NH₂，

或其盐或溶剂合物。

一个进一步的实施方案涉及式I化合物，其中

X14表示Lys，其中-NH₂侧链基团通过如下官能化：(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基)-丁酰基-、(S)-4-羧基-4-十八酰基氨基-丁酰基-，

X20表示Lys，

X29表示Gly，

X31表示选自His和Pro的氨基酸残基，

R¹表示NH₂，

或其盐或溶剂合物。

一个进一步的实施方案涉及式I化合物，其中

X14表示Lys，其中-NH₂侧链基团通过如下官能化：(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基)-丁酰基-、(S)-4-羧基-4-十八酰基氨基-丁酰基-，

X20表示Aib，

X29表示选自D-Ala和Gly的氨基酸残基，

X31表示选自His和Pro的氨基酸残基，

R¹表示NH₂，

或其盐或溶剂合物。

一个进一步的实施方案涉及式I化合物，其中

X14表示Lys，其中-NH₂侧链基团通过如下官能化：(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基)-丁酰基-、(S)-4-羧基-4-十八酰基氨基-丁酰基-，

X20表示Aib，

X29表示选自D-Ala和Gly的氨基酸残基，

X31表示Pro，

R¹表示NH₂，

或其盐或溶剂合物。

一个进一步的实施方案涉及式I化合物，其中

X14表示Lys，其中-NH₂侧链基团通过如下官能化：(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基)-丁酰基-，

X20表示Aib，

X29表示D-Ala，

X31表示选自His和Pro的氨基酸残基，

R¹表示NH₂，

或其盐或溶剂合物。

式I化合物的具体实例是SEQ ID NO:6-27的化合物，以及其盐或溶剂合物。

式I化合物的具体实例是SEQ ID NO:6,9和11的化合物，以及其盐或溶剂合物。

式I化合物的具体实例是SEQ ID NO:6的化合物，以及其盐或溶剂合物。

式I化合物的具体实例是SEQ ID NO:9的化合物，以及其盐或溶剂合物。

式I化合物的具体实例是SEQ ID NO:11的化合物，以及其盐或溶剂合物。

在另一方面，本发明涉及一种组合物，其包含与载体混合的本发明的化合物。在优选的实施方案中，所述组合物为药学上可接受的组合物且所述载体为药学上可接受的载体。本发明的化合物可为盐的形式，例如药学上可接受的盐或溶剂合物，例如水合物。在又一方面，本发明涉及医疗方法中，特别是在人类医学中使用的组合物。

式I化合物适于没有额外治疗有效剂的人体治疗。然而在另一个实施方案中，该化合物可与至少一个另外的治疗活性剂一起使用，如“组合治疗”中所述。

式I化合物特别适合治疗或预防由碳水化合物和/或脂质代谢紊乱引起的，与碳水化合物和/或脂质代谢紊乱相关的或伴有碳水化合物和/或脂质代谢紊乱的疾病或病症，例如用于治疗或预防高血糖、2型糖尿病、糖耐量受损、1型糖尿病、肥胖和代谢综合征。此外，本发明的化合物可适合治疗或预防退行性疾病，特别是神经退行性疾病。

所述的化合物用于，除其它外，防止体重增加或促进重量减少。“预防”意指当与缺乏治疗的情况相比时抑制或减少，且不一定意指暗示病症的完全停止。

本发明的化合物可引起食物摄入减少和/或能量消耗增加，导致对于体重的可观察到的效果。

独立于其对于体重的作用，本发明的化合物可对于循环胆固醇水平具有有益的作用，能够改善脂质水平，尤其是LDL，以及HDL水平(例如，增加HDL/LDL比例)。

因此，本发明的化合物可用于由多余的体重引起的或由多余的体重表征的任何病况的直接或间接治疗，如治疗和/或预防肥胖，病态的肥胖，肥胖相关的炎症，肥胖相关的胆囊疾病，肥胖诱导的睡眠呼吸暂停。它们也可用于治疗和预防代谢综合征、糖尿病、高血压、动脉粥样硬化性血脂异常、动脉粥样硬化、动脉硬化、冠心病、或中风。它们在这些病况中的作用可为它们对于体重的作用的结果或与它们对于体重的作用相关，或可独立于它们对于体重的作用。

医药用途包括延迟或防止2型糖尿病的疾病进展，治疗代谢综合征，治疗肥胖或防止超重，减少食物摄入，增加能量消耗，减轻体重，延迟从糖耐量受损(IGT)到2型糖尿病的进展；延迟2型糖尿病到需要胰岛素的糖尿病的进展。

具体实施方式

定义

本发明的氨基酸序列包含天然存在的氨基酸的常规的一字母和三字母编码，以及其它氨基酸的普遍接受的三字母编码，如Aib(α-氨基异丁酸)。

术语“天然毒蜥外泌肽-4”指具有序列HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH₂(SEQ ID NO:4)的天然毒蜥外泌肽-4。

本发明涉及如式I中限定的肽化合物。

本发明的肽化合物包含通过肽键，即羧酰胺键连接的氨基羧基酸的线性主链。除非另外指示，优选地，氨基羧基酸是α-氨基羧基酸和更优选L-α-氨基羧基酸。肽化合物优选包含39个氨基羧基酸的主链序列。

肽部分(式I)内的氨基酸可被认为是以常规的N端到C端方向从1到39连续编号。提及肽部分I中的“位置”应该相应地理解为应指天然毒蜥外泌肽-4和其它分子内的位置，例如在毒蜥外泌肽-4中，His处于位置1，Gly处于位置2，...，Met处于位置14，...和Ser处于位置39。

具有-NH₂侧链基团的氨基酸残基，例如Lys、Orn、Dab或Dap被官能化，其中-NH₂侧链基团的至少一个H原子被-Z-C(O)-R⁵替代，其中R⁵包含亲脂性部分，例如无取代的或例如被卤素(F、Cl、Br、J)、-OH和/或CO₂H取代的无环直链或支链(C₈-C₃₀)饱和或不饱和烃基，且Z包含立体异构形式的接头，例如包含一个或多个，例如1至5个，优选1，2或3个选自下组的氨基酸接头基团的接头：γ-谷氨酸(gGlu)、gAAA和AEEAc。优选的基团R⁵包含亲脂性部分，例如非环状直链或支链(C₁₂-C₂₀)饱和或不饱和烃基，例如十五烷基、十六烷基或十七烷基，其未被取代或被CO₂H，更优选十五烷基或十七烷基取代。在一个实施方案中，氨基酸接头基团选自gGlu、gGlu-gGlu、gGlu-gGlu-AEEAc、gGlu-AEEAc-gAAA、AEEAc-AEEAc-gGlu和AEEAc-AEEAc-AEEAc。在另一个实施方案中，氨基酸接头基团为gGlu。在另一个实施方案中，氨基酸接头基团为gGlu-gGlu。在另一个实施方案中，氨基酸接头基团为gGlu-gGlu-AEEAc。在另一个实施方案中，氨基酸接头基团为gGlu-AEEAc-gAAA。在另一个实施方案中，氨基酸接头基团为AEEAc-AEEAc-gGlu。在另一个实施方案中，氨基酸接头基团为AEEAc-AEEAc-AEEAc。

在另一方面，本发明涉及一种组合物，其包含与载体混合的如本文所述的本发明的化合物或其盐或溶剂合物。

本发明还涉及本发明的化合物用作药物，特别是用于治疗如本说明书中所述的病况的用途。

本发明还涉及一种组合物，其中所述组合物为药学上可接受的组合物，且所述载体为药学上可接受的载体。

肽合成

技术人员知道制备肽的多种不同方法。这些方法包括但不限于合成方法和重组基因表达。因此，制备肽的一种方式是在溶液中或在固体支持物上的合成和随后的分离和纯化。制备肽的不同方式是在其中已引入了编码肽的DNA序列的宿主细胞中的基因表达。或者，可在不利用细胞系统的情况下实现基因表达。上述方法也可以以任何方式组合。

制备本发明化合物的一个优选方式是在合适的树脂上的固相合成。固相肽合成为公认的方法论(参见例如：Stewart和Young,Solid Phase Peptide Synthesis,PierceChemical Co.,Rockford,Ill.,1984；E E.Atherton和R.C.Sheppard,Solid PhasePeptide Synthesis.A Practical Approach,Oxford-IRL Press,New York,1989)。通过将N-末端保护的氨基酸及其羧基末端附接于携带可切割接头的惰性固体支持物来起始固相合成。该固体支持物可为允许初始氨基酸偶联的任何聚合物，例如三苯甲基树脂、氯三苯甲基树脂、Wang树脂或Rink树脂，其中羧基(或Rink树脂的羧酰胺)与树脂的连接对酸敏感(当使用Fmoc策略时)。聚合物支持物在肽合成过程中在用于脱保护α-氨基基团的条件下必须是稳定的。

N-末端被保护的第一氨基酸与固体支持物偶联后，除去此氨基酸的α-氨基保护基团。然后将剩余的被保护的氨基酸一个接一个地偶联，或者与预先形成的二肽、三肽或四肽以肽序列所表示的顺序，使用适当的酰胺偶联试剂偶联，所述偶联试剂例如BOP、HBTU、HATU或DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)/HOBt(1-羟基苯并三唑)，其中BOP、HBTU和HATU与叔胺碱一起使用。或者，释放的N-末端可用除氨基酸外的基团，例如羧酸等官能化。

通常，氨基酸的反应性侧链基团用合适的封端基团保护。在所需的肽被组装后，这些保护基团被除去。在相同的条件下与从树脂切割所需的产物同时将它们去除。保护基团和引入保护基的步骤可见于Protective Groups in Organic Synthesis,第3版,Greene,T.W.和Wuts,P.G.M.,Wiley&Sons(New York:1999)。

在一些情况下，可为合意的是具有可选择性去除的侧链保护基团，而其它侧链保护基团保持完整。在此情况下，释放的官能度可被选择性地官能化。例如，赖氨酸可用ivDde([1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)-3-甲基丁基)保护基团(S.R.Chhabra等,Tetrahedron Lett.39,(1998)保护，所述保护基团对于非常亲核性的碱，例如DMF(二甲基甲酰胺)中的4％肼是不稳定的。因此，如果N末端氨基和所有侧链官能度用酸不稳定保护基团保护，则可使用DMF中的4％肼选择性去除ivDde基团，然后相应的游离氨基基团可例如通过酰化进一步修饰。可替换地，赖氨酸可偶联于保护的氨基酸，然后可将此氨基酸的氨基基团脱保护，产生另一个游离的氨基基团，其可被酰化或附接于其它氨基酸。或者，可在肽合成期间使用预官能化的构件例如(2S)-6-[[(4S)-5-叔丁氧基-4-[[(4S)-5-叔丁氧基-4-(十六酰基氨基)-5-氧代-戊酰基]氨基]-5-氧代-戊酰基]氨基]-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)己酸作为偶联配偶体将侧链(如表2中所述的)与赖氨酸一起引入。

最后，将肽从树脂切割。这可通过使用金氏混合物(King's cocktail)来实现(D.S.King,C.G.Fields,G.B.Fields,Int.J.Peptide Protein Res.36,1990,255-266)。然后可通过层析术(例如制备型RP-HPLC)纯化原料，如果需要的话。

效力

如本文所用，术语“效力”或“体外效力”为化合物在基于细胞的测定中激活GLP-1、胰高血糖素或GIP的受体的能力的量度。在数字上，它被表示为“EC50值”，它是在剂量反应实验中诱导响应(例如细胞内cAMP的形成)的半最大增加的化合物的有效浓度。

治疗用途

代谢综合征是一种医学病症的组合，当一起发生时，增加发生2型糖尿病和动脉粥样硬化性血管疾病例如心脏病和中风的风险。代谢综合征的定义医学参数包括糖尿病、葡萄糖耐量受损、空腹血糖升高、胰岛素抵抗、尿白蛋白分泌、中心性肥胖、高血压、甘油三酯升高、LDL胆固醇升高和HDL胆固醇降低。

肥胖为一种医学病况，其中多余的体内脂肪累积到可能对健康和预期寿命产生不利影响的程度，并由于其在成人和儿童中日益普遍，它已成为现代世界中主要的可预防死亡原因之一。它增加了多种其它疾病，包括心脏病、2型糖尿病、阻塞性睡眠呼吸暂停综合征、某些类型的癌症以及骨关节炎的可能性，它最常见的由多余的食物摄入量，能量消耗减少，以及遗传易感性的组合引起。

糖尿病(diabetes mellitus)，通常简称为糖尿病(diabetes)，是代谢疾病组，其中因为身体不产生足够的胰岛素，或者因为细胞对所产生的胰岛素没有反应，所以人体具有高的血糖水平。糖尿病的最常见类型是：(1)1型糖尿病，其中身体不能产生胰岛素；(2)2型糖尿病(T2DM)，其中身体不能正确使用胰岛素，与胰岛素缺乏随时间增加组合，和(3)妊娠糖尿病，其中女子由于怀孕而发生糖尿病。所有形式的糖尿病都会增加长期并发症的风险，所述并发症通常在多年后发生。这些长期并发症的大部分以血管损伤为基础，并可分为两大类，由大血管的动脉粥样硬化引起的“大血管”疾病和由小血管损伤引起的“微血管”疾病。大血管疾病病况的例子是缺血性心脏病、心肌梗塞、中风和周谓血管疾病。微血管疾病的实例是糖尿病视网膜病、糖尿病肾病以及糖尿病神经病。

GLP-1和GIP以及胰高血糖素的受体是7-跨膜、异源三聚G蛋白偶联受体家族的成员。它们在结构上彼此相关并且不仅具有显著水平的序列同一性，而且具有类似的配体识别机制和细胞内信号传导途径。

类似地，肽GLP-1、GIP和胰高血糖素共享高序列同一性/相似性的区域。GLP-1和胰高血糖素由共同的前体前原胰高血糖素(preproglucagon)产生，其以组织特异性的方式差异化处理以在肠内分泌细胞中产生例如GLP-1，并在胰岛的α细胞中产生胰高血糖素。GIP源自更大的proGIP激素原前体，并且从位于小肠中的K细胞合成和释放。

肽肠降血糖素激素GLP-1和GIP响应于食物而由肠内分泌细胞分泌，并且占膳食刺激的胰岛素分泌的高达70％。有证据表明，GLP-1分泌在葡萄糖耐量受损或2型糖尿病的受试者中降低，而在这些患者中对GLP-1的响应性仍然保留。因此，用合适的激动剂靶向GLP-1受体为治疗代谢病症(包括糖尿病)提供了一种有吸引力的方法。GLP-1的受体分布广泛，主要发现于胰岛、脑、心脏、肾脏和胃肠道。在胰腺中，GLP-1通过增加来自β细胞的胰岛素的分泌而以严格的葡萄糖依赖性方式起作用。这种葡萄糖依赖性显示GLP-1受体的活化不太可能引起低血糖症。GIP受体也广泛表达于外周组织包括胰岛、脂肪组织、胃、小肠、心脏、骨、肺、肾、睾丸、肾上腺皮质、垂体、内皮细胞、气管、脾脏、胸腺、甲状腺和脑。与其作为肠降血糖素激素的生物学功能一致，胰腺β细胞在人中表达最高水平的GIP受体。

有一些临床证据表明GIP受体介导的信号传导可在具有T2DM的患者中受损，但是GIP-作用的损伤被证明是可逆的，并且可随着糖尿病状态的改善而恢复。值得注意的是，由两种肠促胰岛素激素GIP和GLP-1刺激胰岛素分泌是严格的葡萄糖依赖性的，这确保了与低血糖的低风险相关的故障安全机制。

在β细胞水平，已显示GLP-1和GIP促进葡萄糖的敏感性、新生、增殖、胰岛素原的转录和肥大，以及抗细胞凋亡。对GLP-1和GIP受体都具有激动活性的肽可预期具有添加的或协同的抗糖尿病益处。GLP-1超出胰腺的其它相关作用包括胃排空延迟、饱腹感增加、食物摄入减少、体重减轻以及神经保护和心脏保护作用。在具有2型糖尿病的患者中，考虑到并发症像肥胖和心血管疾病的高比率，此类胰腺外作用可为特别重要。在胰腺外的外周组织中进一步的GIP作用包括增加的骨形成和减少的骨再吸收以及可能有益于治疗骨质疏松症和认知缺陷如阿尔茨海默氏病的神经保护作用。

胰高血糖素为29个氨基酸肽激素，其由胰腺α细胞产生，且当循环葡萄糖低时释放到血流中。胰高血糖素的重要生理作用是刺激肝脏中的葡萄糖输出，这是为胰岛素维持体内葡萄糖体内平衡提供了主要的反调节机制的过程。

然而，胰高血糖素受体也在肝外组织如肾脏、心脏、脂肪细胞、淋巴母细胞、脑、视网膜、肾上腺和胃肠道中表达，提示除葡萄糖稳态外的更广泛的生理作用。因此，最近的研究已报道胰高血糖素对能量管理具有治疗上的积极作用，包括刺激能量消耗和产热，伴随着食物摄取减少和体重减轻。总之，胰高血糖素受体的刺激在肥胖和代谢综合征的治疗中可能是有用的。

胃泌酸调节素是由胰高血糖素和涵盖C-末端延伸的八个氨基酸组成的肽激素。像GLP-1和胰高血糖素一样，它在前原胰高血糖素中被预先形成，并且由小肠的内分泌细胞以组织特异性方式切割和分泌。已知胃泌酸调节素刺激GLP-1和胰高血糖素的受体两者，并因此是双重激动剂的原型(参见Pocai,Molecular Metabolism 2013；3:241-51)。

由于GLP-1和GIP的抗糖尿病作用是已知的，因此GLP-1和胰高血糖素二者对于它们的食物摄取抑制作用是已知的，并且胰高血糖素也是另外的能量消耗的介质，可想到的是，三种激素的活性在一个分子中的组合可产生用于治疗代谢综合征，特别是其组分糖尿病和肥胖的强有力的药物。

因此，本发明的化合物可用于治疗葡萄糖不耐受、胰岛素抵抗、前驱糖尿病、空腹血糖升高(高血糖)、2型糖尿病、高血压、血脂异常、动脉硬化、冠心病、外周动脉疾病、中风或这些个体疾病组分的任何组合。

此外，它们可用于控制食欲、摄食和卡路里摄入、增加能量消耗、防止体重增加、促进体重减轻、减轻过多体重，总体治疗肥胖，包括病态肥胖。

本发明的化合物是对GLP-1、GIP和胰高血糖素的受体的激动剂(例如“三重激动剂”)，并且可提供治疗益处以通过允许同时治疗糖尿病和肥胖来解决靶向代谢综合征的临床需求。

可用本发明的化合物治疗的其它疾病状态和健康状况是肥胖相关的炎症、肥胖性相关的胆囊疾病和肥胖诱导的睡眠呼吸暂停。

尽管所有这些状况都可与肥胖直接或间接相关，但是本发明的化合物的作用可全部或部分经由对体重的作用介导或与其无关。

此外，待治疗的疾病可以是神经变性疾病，如阿尔茨海默氏病或帕金森氏病，或其它如上所述的退行性疾病。

在一个实施方案中，所述化合物在高血糖、2型糖尿病和/或肥胖的治疗或预防中是有用的。

本发明的化合物可具有减少肠道通过、增加胃内容物和/或减少患者的食物摄取的能力。本发明的化合物的这些活性可在本领域技术人员已知的动物模型中评估，并且也在本文方法中描述。

本发明的化合物具有降低患者的血糖水平，和/或降低患者的HbA1c水平的能力。本发明的化合物的这些活性可在本领域技术人员已知的动物模型中评估，并且也在本文方法中和实施例中描述。

本发明的化合物可具有降低患者体重的能力。本发明的化合物的这些活性可在本领域技术人员已知的动物模型中评估，并且也在本文方法中和实施例中描述。

本发明的化合物可用于治疗或预防脂肪肝，优选非酒精性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪肝炎(NASH)。

药物组合物

术语"药物组合物"指示含有当混合时相容的成分且可被施用的混合物。药物组合物可包括一种或多种药物。此外，药物组合物可包括载体、缓冲剂、酸化剂、碱化剂、溶剂、佐剂、张力调节剂、润肤剂、膨胀剂、防腐剂、物理和化学稳定剂，例如表面活性剂、抗氧化剂和其它组分，无论这些被认为是活性成分还是非活性成分。技术人员制备药物组合物的指导可见于，例如，在Remington:The Science和Practice of Pharmacy,(第20版)A.R.GennaroA.R.编,2000,Lippencott Williams&Wilkins和在R.C.Rowe等(编),Handbook ofPharmaceutical Excipients,PhP,2013年5月更新。

本发明的毒蜥外泌肽-4肽衍生物或其盐与作为药物组合物的一部分的可接受的药物载体、稀释剂或赋形剂组合施用。

“药学上可接受的载体”是生理上可接受的(例如生理上可接受的pH)，同时保持与其一起给药的物质的治疗性质的载体。标准的可接受的药物载体和它们的制剂是本领域技术人员已知的并且描述与例如在Remington:The Science和Practice of Pharmacy,(第20版)A.R.Gennaro A.R.编,2000,Lippencott Williams&Wilkins和在R.C.Rowe等(编),Handbook of Pharmaceutical excipients,PhP,2013年5月更新。一个示例性的药学可接受的载体是生理盐水溶液。

在一个实施方案中，载体选自缓冲剂(例如柠檬酸盐/柠檬酸、乙酸盐/乙酸)、酸化剂(如盐酸)、碱化剂(如氢氧化钠)、防腐剂(如苯酚、间甲酚)、共溶剂(例如聚乙二醇400)、张力调节剂(例如甘露醇、甘油)、稳定剂(例如表面活性剂、抗氧化剂、氨基酸)的组。

所使用的浓度在生理上可接受的范围内。

可接受的药物载体或稀释剂包括适于口服、直肠、鼻腔或胃肠外(包括皮下、肌肉内、静脉内、皮内和透皮)施用的制剂中所用的那些。本发明的化合物可典型地胃肠外给药。

术语“药学上可接受的盐”意指安全和有效用于哺乳动物的本发明的化合物的盐。

术语“溶剂合物”是指本发明化合物或其盐与溶剂分子(例如有机溶剂分子和/或水)的复合物。

在药物组合物中，毒蜥外泌肽-4衍生物可以是单体或寡聚体形式。

化合物的术语“治疗有效量”指无毒但足量的化合物以提供所需的效果。实现所需生物效果所必需的式I化合物的量取决于许多因素，例如选择的具体化合物，意欲的用途，施用模式和患者的临床状况。在任何个别情况中适当的“有效”量可由本领域普通技术人员使用常规实验而确定。例如式I化合物的“治疗有效量”为约0.01至50mg/剂，优选为0.02至1mg/剂。

本发明的药物组合物适用于胃肠外(例如皮下、肌内、皮内或静脉内)，直肠，局部和经口(例如舌下)施用，尽管最合适的施用模式取决于每个个别情况中待治疗病况的性质和严重性和每个情况中使用的式I化合物的性质。在一个实施方案中，应用是胃肠外的，例如皮下。

在肠胃外施用的情况中，相应的制剂可为有利的是包括至少一种抗微生物防腐剂以抑制施用之间微生物和细菌的生长。优选的防腐剂是苄醇或苯酚化合物如苯酚或间甲酚。已经描述了这些成分可诱导肽和蛋白质的聚集，导致在制剂中较低的溶解度和稳定性(参见RL Bis等,Int.J.Pharm.472,356-361,2014；T.J.Kamerzell,Adv.Drug Deliv.Rev.,63,1118-1159,2011)。

合适的药物组合物可为分开的单位形式，例如胶囊，片剂和小瓶或安瓿中的粉剂，其每一种均含有限定量的化合物；作为粉末或颗粒；作为在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或作为水包油或油包水乳液。它可以以单剂量或多剂量可注射形式提供，例如以笔的形式。如已经提及的，所述组合物可通过任何合适的药学方法制备，所述药学方法包括使活性成分和载体(其可以由一种或多种另外的成分组成)接触的步骤。

在某些实施方案中，药物组合物可与用于施用的装置一起提供，例如与注射器，注射笔或自动注射器一起。这些装置可与药物组合物分开提供，或用所述药物组合物预填充。

施用单元、包装、笔装置和施用

可制备本发明的化合物用于合适的药物组合物中。合适的药物组合物可为一个或多个施用单位的形式。

组合物可通过任何合适的药学方法制备，所述药学方法包括使本发明的化合物和载体(其可以由一种或多种另外的成分组成)接触的步骤。

施用单位可为例如胶囊、片剂、糖衣丸、颗粒小药囊、滴剂、溶液剂、悬浮剂、冻干剂和粉剂，其各自含有限定量的本发明化合物。

本发明化合物或本发明药物组合物的各上述施用单位(给药单位)可在易于运输和储存的包装中提供。施用单位包装在标准的单剂或多剂包装中，它们的形式、材料和形状取决于制备的单位的类型。

例如，片剂和其它形式的固体施用单位可包装在单个单位中，并且单个包装的单位可包装在多个包装的容器中。

液体制剂可包装成单个单位，例如小瓶、药筒、注射器/预填充注射器、输液袋、可折叠塑料袋、输液瓶、吹-灌密封瓶或输液管，或以单剂量或多剂量可注射的形式，例如以笔装置、泵或注射器的形式，并且单个包装单元可包装在多个包装的容器中。单个包装可仅包括一个或多个施用单位。包装可例如由纸、硬纸板(cardboard)、纸板(paperboard)、塑料、金属、纸、塑料和金属或玻璃中的一种或多种的组合或层叠制成。示例性的实施方式是包含例如片剂或胶囊的泡罩包装，其又可设置在硬纸板箱内，包含例如粉末的铝阻隔叠层小袋，包含例如片剂或溶液的玻璃或塑料瓶，或者小瓶、药筒、注射器、输液袋、输液瓶、输液管或含有溶液或悬浮液的安瓿。

在一些实施方案中，可将施用单位与用于施用的装置一起提供，例如与注射器、注射笔或自动注射器一起提供。这些装置可与药物组合物分开提供，或者用药物组合物预填充。

“笔型注射装置”常常简称为“注射笔”，通常是具有类似于用于书写的钢笔的细长形状的注射装置。尽管这样的笔通常具有管状横截面，但是它们可容易地具有不同的横截面，如三角形、矩形或正方形或围绕这些几何形状的任何变化。通常，笔型注射装置包括三个主要元件：药筒部分，其包括通常容纳在壳体或保持器内的药筒；与药筒部分的一端连接的针组件；以及连接到药筒部分的另一端的剂量部分。药筒常常也称为“安瓿”，通常包括充满药物的贮存器，位于药筒贮存器的一端处的可移动的橡胶类型的塞子或阻塞物，以及位于另一端(常称为颈缩端)处的具有可刺穿的橡胶密封件的顶部。典型地使用卷曲的环形金属带使橡胶密封件就位。虽然药筒壳体可通常由塑料制成，但药筒贮存器历来由玻璃制成。

组合治疗

本发明的化合物，GLP-1、GIP和胰高血糖素受体的三重激动剂，可与其它药理活性化合物如Rote Liste 2016中提及的所有药物广泛地组合，例如与Rote Liste 2016第1章中提到的所有减肥药或食欲抑制剂，Rote Liste 2016第58章中提到的所有降脂药，RoteListe 2016中提到的所有抗高血压药和肾保护药，或Rote Liste 2016第36章中提到的所有利尿剂组合。

活性成分组合可特别用于作用的协同改善。它们可通过将活性成分分开施用于患者或以多种活性成分存在于一种药物制剂中的组合产物的形式应用。当通过分开施用活性成分来施用活性成分时，可以同时或依次进行。

适用于这种组合的其它活性物质尤其包括例如增强一种或多种活性物质相对于所提及的适应症之一的治疗效果和/或允许减少一种或多种活性物质的剂量的那些。

适合于组合的治疗剂包括例如抗糖尿病药，如：

胰岛素和胰岛素衍生物，例如：甘精胰岛素(Glargine)270-330U/mL甘精胰岛素(insulin glargine)(EP 2387989 A)、300U/mL甘精胰岛素(EP 2387989 A)、赖谷胰岛素(Glulisin)/地特胰岛素(Detemir)/赖脯胰岛素(Lispro)/德谷胰岛素(Degludec)/德谷胰岛素Plus(DegludecPlus)、门冬胰岛素(Aspart)、基础胰岛素和类似物(例如LY-2605541、LY2963016、NN1436)、聚乙二醇化的胰岛素赖脯胰岛素、Linjeta、NN1045、胰岛素加Symlin(Insulin plus Symlin)、PE0139、速效和短效胰岛素(例如Linjeta、PH20、NN1218、HinsBet)、(APC-002)水凝胶、口服、吸入、经皮和舌下胰岛素(例如 Afrezza、Tregopil、TPM 02、Capsulin、口服胰岛素、ORMD-0801、NN1953、NN1954、NN1956、VIAtab、Oshadi口服胰岛素)。其它还包括与白蛋白或另一蛋白质通过双功能接头键合的那些胰岛素衍生物。

GLP-1、GLP-1类似物和GLP-1受体激动剂，例如：利西拉来(Lixisenatide)/AVE0010/ZP10/Lyxumia、艾塞那肽(Exenatide)/毒蜥外泌肽-4/Byetta/Bydureon/ITCA650/AC-2993、利拉鲁肽/Victoza、索马鲁肽(Semaglutide)、他司鲁肽(Taspoglutide)、Syncria/阿必鲁肽(Albiglutide)、度拉糖肽(Dulaglutide)、rExendin-4、CJC-1134-PC、PB-1023、TTP-054、Efpeglenatide/HM-11260C、CM-3、GLP-1 Eligen、ORMD-0901、NN-9924、NN-9926、NN-9927、Nodexen、Viador-GLP-1、CVX-096、ZYOG-1、ZYD-1、GSK-2374697、DA-3091、MAR-701、MAR709、ZP-2929、ZP-3022、ZP-DI-70、TT-401、MK-8521、MEDI0382、BHM-034、HM12525A、MOD-6030、CAM-2036、DA-15864、ARI-2651、ARI-2255、LY3298176、NN1177、艾塞那肽-XTEN和胰高血糖素-XTEN、NN9030。

DPP4抑制剂，例如：阿格列汀(Alogliptin)/Nesina、Trajenta/利拉利汀(Linagliptin)/BI-1356/Ondero/Trajenta/Tradjenta/Trayenta/Tradzenta、沙格列汀(Saxagliptin)/Onglyza、西他列汀(Sitagliptin)/捷诺维(Januvia)/Xelevia/Tesave/Janumet/Velmetia、Galvus/维格列汀(Vildagliptin)、阿拉格列汀(Anagliptin)、吉格列汀(Gemigliptin)、特力利汀(Teneligliptin)、美格列汀(Melogliptin)、曲格列汀(Trelagliptin)、DA-1229、奥格列汀(Omarigliptin)/MK-3102、KM-223、艾格列汀(Evogliptin)、ARI-2243、PBL-1427、哌诺沙星(Pinoxacin)。

SGLT2抑制剂，例如：Invokana/卡格列净(Canaglifozin)、Forxiga/达格列净(Dapagliflozin)、瑞格列净(Remoglifozin)、舍格列净(Sergliflozin)、依帕列净(Empagliflozin)、伊格列净(Ipragliflozin)、托格列净(Tofogliflozin)、鲁格列净(Luseogliflozin)、索格列净(Sotagliflozin)(LX-4211)、Ertuglifozin/PF-04971729、RO-4998452、贝格列净(Bexagliflozin)(EGT-0001442)、KGA-3235/DSP-3235、LIK066、SBM-TFC-039、恒格列净(Henagliflozin)(SHR3824)、加格列净(Janagliflozin)、泰格列净(Tianagliflozin)、AST1935、JRP493、HEC-44616

双胍类(例如美福明(Metformin)、丁福明(Buformin)、苯乙福明(Phenformin))、噻唑烷二酮类(例如吡格列酮(Pioglitazone)、利格列酮(Rivoglitazone)、罗格列酮(Rosiglitazone)、曲格列酮(Troglitazone))、双重PPAR激动剂(例如阿格列扎(Aleglitazar)、莫格列扎(Muraglitazar)、替格列扎(Tesaglitazar))、磺酰脲类(例如甲苯磺丁脲(Tolbutamide)、格列苯脲(Glibenclamide)、格列美脲(Glimepiride)/亚莫利(Amaryl)、格列吡嗪(Glipizide))、美格列奈类(例如那格列奈(Nateglinide)、瑞格列奈(Repaglinide)、米格列奈(Mitiglinide))、α-葡糖苷酶抑制剂(例如阿卡波糖(Acarbose)、米格列醇(Miglitol)、伏格列波糖(Voglibose))，胰淀素(Amylin)及胰淀素类似物(例如普兰林肽(Pramlintide)、Symlin)。

GPR119激动剂(例如GSK-263A、PSN-821、MBX-2982、APD-597、ZYG-19、DS-8500)，GPR40激动剂(例如呋格列泛(Fasiglifam)/TAK-875、TUG-424、P-1736、JTT-851、GW9508)。

其它适合的组合伴侣是塞克洛瑟(Cycloset)、11-β-HSD的抑制剂(例如LY2523199、BMS770767、RG-4929、BMS816336、AZD-8329、HSD-016、BI-135585)、葡糖激酶的活化剂(例如TTP-399、AMG-151、TAK-329、GKM-001)、DGAT的抑制剂(例如LCQ-908)、蛋白质酪氨酸磷酸酶1的抑制剂(例如曲度奎明(Trodusquemine))、葡萄糖-6-磷酸酶的抑制剂、果糖-1,6-二磷酸酶的抑制剂、糖原磷酸化酶的抑制剂、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的抑制剂、糖原合酶激酶的抑制剂、丙酮酸脱氢激酶(pyruvate dehydrokinase)的抑制剂、α2-拮抗剂、CCR-2拮抗剂、SGLT-1抑制剂(例如LX-2761)。

一种或多种脂质降低剂也适于作为组合伴侣，如例如：HMG-CoA-还原酶抑制剂(例如辛伐他汀(Simvastatin)、阿托伐他汀(Atorvastatin))、贝特类(例如苯扎贝特(Bezafibrate)、非诺贝特(Fenofibrate))、烟酸及其衍生物(例如Niacin)、PPAR-(α、γ或α/γ)激动剂或调节剂(例如阿格列扎)、PPAR-δ激动剂、ACAT抑制剂(例如阿伐麦布(Avasimibe))、胆固醇吸收抑制剂(例如依折麦布(Ezetimibe))、胆汁酸结合物质(例如消胆胺/考来烯胺(Cholestyramine))、回肠胆汁酸转运抑制剂、MTP抑制剂或PCSK9调节剂。

HDL-升高化合物，如：CETP抑制剂(例如托彻普(Torcetrapib)、安塞曲匹(Anacetrapid)、达塞曲匹(Dalcetrapid)、依塞曲匹(Evacetrapid)、JTT-302、DRL-17822、TA-8995)或ABC1调节剂。

其它适合的组合伴侣是一种或多种用于治疗肥胖的活性物质，如例如：西布曲明(Sibutramine)、特索芬辛(Tesofensine)、奥利司他(Orlistat)、大麻素-1受体的拮抗剂、MCH-1受体拮抗剂、MC4受体激动剂、NPY5或NPY2拮抗剂(例如韦利贝特(Velneperit))、β-3-激动剂、瘦素或瘦素模拟物、5HT2c受体的激动剂(例如氯卡色林(Lorcaserin))，或布普品(bupropione)/那曲酮(naltrexone)、布普品/唑尼沙胺(zonisamide)、布普品/芬特明(phentermine)或普兰林肽/美曲普汀(metreleptin)的组合。

其它合适的组合伴侣是：

进一步的胃肠肽如肽YY 3-36(PYY3-36)或其类似物、胰多肽(PP)或其类似物。

胰高血糖素受体激动剂或拮抗剂、GIP受体激动剂或拮抗剂、葛瑞林(ghrelin)拮抗剂或反向激动剂、类爪蟾肽(Xenin)及其类似物。

而且，具有影响高血压、慢性心力衰竭或动脉粥样硬化的药物的组合是合适的，如例如：血管紧张素II受体拮抗剂(例如替米沙坦(telmisartan)、坎地沙坦(candesartan)、缬沙坦(valsartan)、氯沙坦(losartan)、依普罗沙坦(eprosartan)、厄贝沙坦(irbesartan)、奥美沙坦(olmesartan)、他索沙坦(tasosartan)、阿齐沙坦(azilsartan))、ACE抑制剂、ECE抑制剂、利尿剂、β-阻断剂、钙拮抗剂、中枢作用高血压药(centrally-acting hypertensives)、α-2-肾上腺素能受体的拮抗剂、中性肽链内切酶的抑制剂、凝血细胞聚集抑制剂等或其组合。

在另一个方面，本发明涉及根据本发明的化合物或其生理学上可接受的盐与至少一种上述作为组合伴侣的活性物质进行组合用于制备适用于治疗或预防疾病或病况的药物的用途，所述疾病或病况能受到对GLP-1和胰高血糖素受体的结合和对它们活性的调节的影响。优选地，这是代谢综合征背景下的疾病，特别是上述列出的疾病或病况中的一种，最特别是糖尿病或肥胖或其并发症。

根据本发明的化合物或其生理学上可接受的盐与一种或多种活性物质的组合使用可以同时、分开或序贯地进行。

根据本发明的化合物或其生理学上可接受的盐与另一种活性物质的组合使用可同时或在错开的时间进行，但特别是在短时间间隔内进行。如果将它们同时施用，则将两种活性物质一起给予患者；如果将它们在错开的时间使用，则将两种活性物质在少于或等于12小时，但特别是少于或等于6小时的时期内给予患者。

因而，在另一个方面，本发明涉及一种药物，其包含根据本发明的化合物或所述化合物的生理学上可接受的盐和作为组合伴侣的上述活性物质中的至少一种，任选地连同一种或多种惰性载体和/或稀释剂。

根据本发明的化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂合物以及要与之组合的额外的活性物质，可一起都存在于一种配制物，例如片剂或胶囊中，或是分别在两种相同或不同的配制物中，例如作为所谓的套装试剂盒(kit-of-parts)。

附图说明

图1:显示可逆自缔合(吸引性相互作用)和排斥性维里(Virial)相互作用的肽制剂的动态德拜(Debye)图的比较

图2.SEQ ID NO:6,在饲喂DIO小鼠中第一次治疗后的血糖概貌

图3.SEQ ID NO:6,DIO小鼠中的身体质量

图4.SEQ ID NO:6,DIO小鼠中的身体质量变化

图5.SEQ ID NO:6,DIO小鼠中的全身脂肪质量变化

图6.SEQ ID NO:6,DIO小鼠中的饲料消耗估计

图7.SEQ ID NO:6,DIO小鼠中的终末肝脏质量

图8.SEQ ID NO:6,饲喂DIO小鼠中的终末血浆甘油三酯

图9.SEQ ID NO:6,饲喂DIO小鼠中的血浆LDL

图10.SEQ ID NO:11,在饲喂DIO小鼠中第一次治疗后的血糖概貌

图11.SEQ ID NO:11,DIO小鼠中的身体质量

图12.SEQ ID NO:11,DIO小鼠中的全身质量变化

图13.SEQ ID NO:11,DIO小鼠中的全身脂肪质量变化

图14.SEQ ID NO:11,DIO小鼠中的饲料消耗估计

图15.SEQ ID NO:11,DIO小鼠中的终末肝脏质量

图16.SEQ ID NO:11,饲喂DIO小鼠中的终末血浆甘油三酯

图17.SEQ ID NO:11,饲喂DIO小鼠中的血浆LDL

图18.SEQ ID NO:11,饲喂DIO小鼠中的终末血浆胰岛素

图19.SEQ ID NO:11,饲喂DIO小鼠中的终末血浆葡萄糖

图20.SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,饲喂db/db小鼠中的血糖概貌

图21.SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,饲喂db/db小鼠中在曲线下的血糖面积

图22.SEQ ID NO:7,饲喂db/db小鼠中的血糖概貌

图23.SEQ ID NO:7,饲喂db/db小鼠中在曲线下的血糖面积

图24.SEQ ID NO:11,饲喂db/db小鼠中的血糖概貌

图25.SEQ ID NO:11,饲喂db/db小鼠中在曲线下的血糖面积

图26.SEQ ID NO:11,饲喂db/db小鼠中的终末血清甘油三酯浓度

图27.SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:26,饲喂db/db小鼠中的血糖概貌

图28.SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:26,饲喂db/db小鼠中在曲线下的血糖面积

图29.食物摄取和体重监测数据(SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:6,利拉鲁肽)

图30.主动脉斑块面积数据(SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:6,利拉鲁肽)

图31.血清总胆固醇和LDL-胆固醇数据(SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:6,利拉鲁肽)

方法

采用的缩写如下：

AA 氨基酸

AEEAc (2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酰基

Aib α-氨基-异丁酸

cAMP 环单磷酸腺苷

Boc 叔丁氧羰基

BOP (苯并三唑-1-基氧基)三(二甲氨基)六氟磷酸鏻

BSA 牛血清白蛋白

tBu 叔丁基

dAla D-丙氨酸

DCM 二氯甲烷

Dde 1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)-乙基

ivDde 1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)3-甲基-丁基

DIC N,N'-二异丙基碳二亚胺

DIPEA N,N-二异丙基乙胺

DMEM 杜贝可氏修饰伊格氏培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)

DMF 二甲基甲酰胺

DMS 二甲基硫醚(dimethylsulfide)

EDT 乙二硫醇(ethanedithiol)

FA 甲酸

FBS 胎牛血清

Fmoc 芴基甲基氧基羰基(fluorenylmethyloxycarbonyl)

gAAA γ-氨基己二酸

gGlu γ-谷氨酸(γE)

HATU O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐

HBSS Hanks’平衡盐溶液

HBTU 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基-脲鎓六氟磷酸盐

HEPES 2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸

HOBt 1-羟基苯并三唑

HOSu N-羟基琥珀酰亚胺

HPLC 高效液相色谱

HTRF 均相时间分辨荧光

IBMX 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤

LC/MS 液相色谱/质谱法

Mmt 单甲氧基-三苯甲基

Palm 棕榈酰基

PBS 磷酸盐缓冲盐水

PEG 聚乙二醇

PK 药代动力学

RP-HPLC 反相高效液相色谱

Stea 硬脂酰基

TFA 三氟乙酸

Trt 三苯甲基

UV 紫外

肽化合物的一般合成

材料

不同的Rink-酰胺树脂(4-(2’,4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基乙酰胺基-正亮氨酰基氨基甲基树脂，Merck Biosciences；4-[(2,4-二甲氧基苯基)(Fmoc-氨基)甲基]苯氧基乙酰胺基甲基树脂，Agilent Technologies)用于肽酰胺的合成，其负载在0.2-0.7mmol/g范围内。

经Fmoc保护的天然氨基酸购自Protein Technologies Inc.、Senn Chemicals、Merck Biosciences、Novabiochem、Iris Biotech、Bachem、Chem-Impex International或MATRIX Innovation。遍及合成过程中使用了下列标准氨基酸：Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Met-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-L-Val-OH。

此外，如下特殊氨基酸购自与上述相同的供应商：Fmoc-L-Lys(ivDde)-OH、Fmoc-L-Lys(Mmt)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-D-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Boc-L-His(Boc)-OH(可作为甲苯溶剂合物获得)和Boc-L-His(Trt)-OH。

此外，可应用构造块(2S)-6-[[(4S)-5-叔丁氧基-4-[[(4S)-5-叔丁氧基-4-(十六酰基氨基)-5-氧代-戊酰基]氨基]-5-氧代-戊酰基]氨基]-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)己酸和Boc-L-His(Trt)-Aib-OH。两个构造块分开合成。

在例如Prelude肽合成仪(Protein Technologies Inc)或类似的自动化合成仪上用标准Fmoc化学法和HBTU/DIPEA激活进行固相肽合成。将DMF用作溶剂。脱保护：20％哌啶/DMF，进行2x2.5分钟。洗涤：7x DMF。偶联2:5:10 200mM AA/500mM HBTU/2M DIPEA在DMF中进行2x20分钟。洗涤：5x DMF。

在Lys侧链经修饰的情况中，将Fmoc-L-Lys(ivDde)-OH或Fmoc-L-Lys(Mmt)-OH用于相应的位置中。合成完成后，根据改良的文献步骤(S.R.Chhabra等,TetrahedronLett.39,(1998),1603)，用DMF中的4％水合肼将ivDde基团除去。通过用AcOH/TFE/DCM(1/2/7)在室温重复处理15分钟将Mmt基团除去，然后将树脂用DCM、DCM中的5％DIPEA和DCM/DMF中的5％DIPEA重复洗涤。

通过用所需酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯处理树脂或是通过使用偶联试剂如HBTU/DIPEA或HOBt/DIC，以进行如下的酰化。

用King’s切割混合剂将所有已合成的肽从树脂切下，所述混合剂由82.5％TFA、5％苯酚、5％水、5％茴香硫醚、2.5％EDT组成。然后将粗制的肽在二乙醚或二异丙醚中沉淀，离心并冻干。通过分析型HPLC来分析所述肽，并通过ESI质谱法进行检查。通过常规的制备型RP-HPLC纯化步骤来纯化粗制的肽。

或者，通过手动合成步骤来合成肽：

将0.3g经干燥Rink酰胺MBHA树脂(0.66mmol/g)放入装有聚丙烯过滤膜的聚乙烯容器中。在DCM(15ml)中使树脂膨胀1小时并在DMF(15ml)中膨胀1小时。通过以20％(v/v)哌啶/DMF溶液处理两次历时5分钟及15分钟而将树脂上的Fmoc基团脱保护。用DMF/DCM/DMF(各6:6:6次)洗涤树脂。使用Kaiser测试(定量法)确认Fmoc从固体支持物的移除。将干燥DMF中的C-端Fmoc-氨基酸(对应于树脂负载为5当量过量)添加至去除保护的树脂并用DMF中5当量过量的DIC与HOBT来开始下一个Fmoc-氨基酸的偶联。反应混合物中各个反应物的浓度为约0.4M。在转子上于室温旋转混合物2小时。过滤树脂并且以DMF/DCM/DMF(各6:6:6次)洗涤。肽树脂等分试样在偶联完成时进行的Kaiser测试为阴性(树脂上无色)。在第一个氨基酸附接之后，使用乙酸酐/吡啶/DCM(1:8:8)将树脂中的未反应氨基基团(若有的话)封端/加帽(capped)20分钟，以避免任何的序列删除。在封端/加帽之后，用DCM/DMF/DCM/DMF(各6/6/6/6次)洗涤树脂。通过用20％(v/v)哌啶/DMF溶液处理两次历时5分钟与15分钟，将附接有C-端氨基酸的肽基树脂上的Fmoc基团脱保护。用DMF/DCM/DMF(各6:6:6次)洗涤树脂。对肽树脂等分试样在Fmoc-脱除保护完成时进行的Kaiser测试为阳性。

使用Fmoc AA/DIC/HOBt方法利用对应于DMF中的树脂负载的5当量过量，将Rink酰胺MBHA树脂上的靶序列中的其余氨基酸进行顺序偶联。反应混合物中各反应物的浓度为约0.4M。在转子上于室温旋转混合物2小时。将树脂过滤并用DMF/DCM/DMF(各6:6:6次)洗涤。在每一偶联步骤和Fmoc脱保护步骤之后，进行Kaiser测试以确认反应完成。

在线性序列完成之后，通过使用DMF中的2.5％水合肼将用作分支点或修饰点的赖氨酸的ε-氨基基团脱保护15分钟2次，并用DMF/DCM/DMF(各6:6:6次)洗涤。在DMF中，使用Fmoc-Glu(OH)-OtBu用DIC/HOBt方法(相对于树脂负载的5当量过量)将谷氨酸的γ-羧基端附接至Lys的ε-氨基基团。在转子上于室温旋转混合物2小时。将树脂过滤并用DMF/DCM/DMF(各6x30ml)洗涤。通过以20％(v/v)哌啶/DMF溶液处理两次历时5及15分钟(各25ml)而将谷氨酸上的Fmoc基团脱保护。用DMF/DCM/DMF(各6:6:6次)洗涤树脂。在Fmoc-脱除保护完成时对肽树脂等分试样进行的Kaiser测试为阳性。

若侧链分支还另含有一个γ-谷氨酸，于DMF中用DIC/HOBt方法(相对于树脂负载的5当量过量)将第二个Fmoc-Glu(OH)-OtBu用于附接至γ-谷氨酸的游离氨基基团。在转子上于室温旋转混合物2小时。将树脂过滤并用DMF/DCM/DMF(各6x30ml)洗涤。通过用20％(v/v)哌啶/DMF溶液处理两次历时5及15分钟(25mL)而将γ-谷氨酸上的Fmoc基团脱保护。用DMF/DCM/DMF(各6:6:6次)洗涤树脂。在Fmoc-脱保护完成时对肽树脂等分试样进行的Kaiser测试为阳性。

棕榈酸和硬脂酸附接至谷氨酸的侧链：

向γ-谷氨酸的游离氨基基团添加溶解于DMF中的棕榈酸或硬脂酸(5当量)，并通过添加DMF中的DIC(5当量)及HOBt(5当量)来起始偶联。用DMF/DCM/DMF(各6:6:6次)洗涤树脂。

从树脂最终切割肽：

用DMC(6x10ml)、MeOH(6x10ml)及醚(6x10ml)来洗涤通过手动合成所合成的肽基树脂，并在真空烘干箱中干燥过夜。通过用试剂混合物(80.0％TFA/5％硫代苯甲醚/5％苯酚/2.5％EDT，2.5％DMS和5％DCM)在室温处理肽-树脂3小时，而实现肽从固体支持物的切割。通过过滤收集切割混合物并用TFA(2ml)与DCM(2x5ml)洗涤树脂。在氮气下将过量TFA及DCM浓缩至小体积并将少量DCM(5-10ml)添加至残余物中且在氮气下蒸发。重复过程3-4次以去除大部分的挥发性杂质。将残余物冷却至0℃并添加无水醚以将肽沉淀。将沉淀的肽离心并去除上清液醚且添加新鲜的醚至肽中并再次离心。粗制样品经制备型HPLC纯化并冷冻干燥。通过LCMS确认肽的身分。

此外，使用不同的路径用于引入赖氨酸侧链，其应用预官能化的构建块，其中所述侧链已经附接于所述赖氨酸(例如(2S)-6-[[(4S)-5-叔丁氧基-4-[[(4S)-5-叔丁氧基-4-(十六酰基氨基)-5-氧代-戊酰基]氨基]-5-氧代-戊酰基]氨基]-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)己酸)作为肽合成中的偶联伴侣。用20ml的二甲基甲酰胺洗涤携带氨基基团的0.67mmol的肽树脂。将2.93g的(2S)-6-[[(4S)-5-叔丁氧基-4-[[(4S)-5-叔丁氧基-4-(十六酰基氨基)-5-氧代-戊酰基]氨基]-5-氧代-戊酰基]氨基]-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)己酸溶解于20ml的二甲基甲酰胺连同310mg的羟基苯并三唑水合物和0.32ml的二异丙基碳二亚胺。在搅拌5分钟后，将溶液添加至树脂。将树脂搅动20小时然后用20ml的二甲基甲酰胺各洗涤3次。取小的树脂样品并进行Kaiser测试和Chloranil测试(E.Kaiser,R.L.Colescott,C.D.Bossinger,P.I.Cook,Anal.Biochem.1970,34,595-598；Chloranil-Test:T.Vojkovsky,Peptide Research1995,8,236-237)。此步骤避免对选择性脱保护步骤以及侧链构建块在非常先进的合成中间体上的选择性附接的需要。

分析型HPLC/UPLC

方法A：在210-225nm处检测

柱：Waters ACQUITYCSH^TMC18 1.7μm(150x2.1mm)于50℃

溶剂：H₂O+0.5％TFA:ACN+0.35％TFA(流速0.5ml/分钟)

梯度：80:20(0分钟)至80:20(3分钟)至25:75(23分钟)至2:98(23.5分钟)至2:98(30.5分钟)至80:20(31分钟)至80:20(37分钟)

任选地用质量分析仪：LCT Premier，电喷雾阳离子模式

方法B：在214nm处检测

柱：Waters ACQUITYCSH^TMC18 1.7μm(150x2.1mm)于50℃

溶剂：H₂O+0.05％TFA:ACN+0.035％TFA(流速0.5ml/分钟)

梯度：80:20(0分钟)至80:20(3分钟)至25:75(23分钟)至2:98(23.5分钟)至2:98(30.5分钟)至80:20(31分钟)至80:20(37分钟)

任选地用质量分析仪：Agilent 6230 Accurate-Mass TOF,Dual Agilent JetStream ESI

方法C：在214nm处检测

柱：Waters ACQUITYCSH^TMC18 1.7μm(150x2.1mm)于50℃

溶剂：H₂O+0.1％TFA:ACN+0.1％TFA(流速0.5ml/分钟)

梯度：80:20(0分钟)至80:20(3分钟)至25:75(23分钟)至2:98(23.5分钟)至2:98(30.5分钟)至80:20(31分钟)至80:20(38分钟)

任选地用质量分析仪：Agilent 6230 Accurate-Mass TOF,Dual Agilent JetStream ESI

方法D：在220nm处检测

柱：Waters ACQUITY BEH C18(2.1x100mm x1.7μm),温度:40℃

Aries肽XB C18(4.6x250mm x3.6μm),温度:40℃

溶剂：H₂O+0.1％甲酸(缓冲液A):ACN+0.1％甲酸(流速1ml/分钟)(缓冲液B)

梯度：用2％缓冲液B平衡柱并通过2％至70％缓冲液B的梯度在15分钟过程中进行洗脱

方法E:在215nm处检测

柱：Waters ACQUITYCSH^TMC18 1.7μm(150x2.1mm)于50℃

溶剂：H₂O+0.05％TFA:ACN+0.035％TFA(流速0.5ml/分钟)

梯度：80:20(0分钟)至80:20(3分钟)至25:75(23分钟)至5:95(23.5分钟)至5:95(25.5分钟)至80:20(26分钟)至80:20(30分钟)

一般制备型HPLC纯化步骤

将粗制的肽或者在纯化系统、Jasco半制备型HPLC系统、或Agilent1100HPLC系统上进行纯化。根据要纯化的粗制肽的量，使用不同大小和不同流速的制备型RP-C18-HPLC柱。采用乙腈+0.1％TFA(B)和水+0.1％TFA(A)作为洗脱液。收集含有产物的级分并冻干，以获得纯化的产物，通常是作为TFA盐。

毒蜥外泌肽-4衍生物的溶解度评估

在一批肽的溶解度测量之前，先通过HPLC-UV确定其纯度。

对于溶解度测试，靶浓度为10mg纯化合物/mL。因此，在缓冲系统中，基于之前确定的％纯度以10mg/mL化合物的浓度从固体样品制备溶液：

溶解度缓冲系统A)乙酸盐缓冲液pH 4.5,100mM乙酸钠三水合物,2.7mg/ml间甲酚

溶解度缓冲系统B)磷酸盐缓冲液pH 7.4,100mM磷酸氢钠,2.7mg/ml间甲酚

溶解度缓冲系统C)柠檬酸盐缓冲液pH 6.0,柠檬酸100mM,2.7mg/mL间甲酚

在温和搅拌1小时后从上清进行UPLC-UV，所述上清是以2500RCF(相对离心加速度)离心15分钟后获得的。

然后通过将1:10稀释的缓冲的样品的2μL-注射物的UV峰面积与具有已知浓度的参考肽的标准曲线的比较来确定溶解度，样品和参考肽的不同的UV消光系数基于不同的氨基酸序列计算并在浓度计算中考虑。

毒蜥外泌肽-4衍生物的化学稳定性评估

在一批肽的化学稳定性测量之前，通过UPLC/MS确定其纯度。对于稳定性测试，目标浓度为1mg纯化合物/ml。因此，在缓冲系统中，基于先前确定的％纯度以1mg/mL化合物的浓度从固体样品制备溶液：

化学稳定性缓冲系统A)25mM乙酸盐缓冲液pH4.5,3mg/mL L-甲硫氨酸,2.7mg/mL间甲酚,18mg/mL甘油85％

化学稳定性缓冲系统B)25mM磷酸盐缓冲液pH6.0,3mg/mL L-甲硫氨酸,2.7mg/mL间甲酚,18mg/mL甘油85％

将肽溶液通过0.22μM孔径过滤，并在无菌条件下填充入等分试样中。在开始点，通过注射2μl未稀释的样品进行UPLC-UV。

对于化学稳定性测试，将等分试样在5和40℃储存28天。在此时间过程之后，将样品在2500RCF离心15分钟。然后用UPLC-UV分析2μl未稀释的上清液。

化学稳定性通过由如下方程计算的纯度相对损失来评定：

[(在开始点的纯度)-(在X℃在28天后的纯度)]/(在开始点的纯度)]*100％

X＝5或40℃

将纯度计算为

[(峰面积肽)/(总峰面积)]*100％

用于评估物理稳定性的动态光散射(DLS)

单色和相干光束(激光)用于照亮液体样品。动态光散射(DLS)测量由经过布朗运动的颗粒(1nm≤半径≤1μm)散射的光。这种运动是由颗粒和溶剂分子之间的碰撞引起的，这些颗粒和溶剂分子本身因热能而移动。颗粒的扩散运动导致散射光的时间波动[Pecora,R.Dynamic Light Scattering:Applications of Photon Correlation Spectroscopy,Plenum Press,1985]。

记录散射光强度波动并转换成自相关函数。通过将自相关曲线拟合为指数函数，可得到溶液中的颗粒的扩散系数D。然后使用扩散系数通过假定球形颗粒的斯托克斯-爱因斯坦公式来计算流体动力学半径R_h(或表观斯托克斯半径)。此计算在ISO 13321和ISO22412[国际标准ISO 13321确定粒度分布的方法第8部分：光子相关光谱术，国际标准化组织(ISO)1996；国际标准ISO22412粒度分析-动态光散射，国际标准化组织(ISO)2008]中定义。

在多分散样品的情况下，自相关函数是对应于各物种的指数衰减的总和。然后可使用散射光的时间波动来确定颗粒级分或家族的大小分布概貌。一阶结果是散射光的强度分布作为粒度的函数。强度分布根据每个颗粒级分或家族的散射强度自然加权。对于生物材料或聚合物，颗粒散射强度与分子量的平方成比例。因此，少量的聚集体/团聚体或存在或较大的粒子种类可支配强度分布。然而，此分布可用作样品中存在较大物质的灵敏检测器。在一定假设下，强度分布可使用Mie理论转换成粒度的体积或质量分布。与强度分布相对，质量分布最好用于比较目的，绝不应该被认为是绝对的(由于潜在的假设)。

DLS技术产生具有固有峰展宽的分布。多分散性指数％Pd为粒度分布的宽度的量度，并且通过ISO13321和ISO22412[国际标准ISO 13321确定粒度分布的方法第8部分：光子相关光谱术，国际标准化组织(ISO)1996；国际标准ISO22412粒度分析-动态光散射，国际标准化组织(ISO)2008]中所述的标准方法计算。

DLS相互作用参数(k_D)

DLS相互作用参数(k_D)为描述颗粒间相互作用的量度，其中所述颗粒为折叠的蛋白或肽[Sandeep Yadav等(2009)J Pharm Sc,Vol 99(3),pp 1152-1168；BrianD.Connolly等(2012)Biophysical Journal Volume 103,pp 69-78]。

所述参数k_D由扩散系数D的浓度依赖性得到，其由浓度c的按幂展开给出：

D(c)＝D₀(1+k_Dc+k_iDc²+k_jDc³+…)

忽略高阶项，即k_iD＝k_jD＝…＝0，数据可以线性拟合，k_D由曲线D＝D₀(1+k_D c)的斜率和D₀得到。D₀是零浓度时的扩散系数。参数k_D可用于描述蛋白质或肽分子或低聚物与其自身和它们在溶液中的环境相互作用，并且在理论上与维里系数B₂₂相关，如例如由Harding和Johnson所述，其中M是摩尔质量k_s为沉降速度的一阶浓度系数和υ为偏微比容[HardingSE,Johnson P.(1985)Biochem J,231,pp543-547]。

k_D＝2B₂₂M-k_s-υ

正的B₂₂值指示有利于自我关联的拯救的样本，而负的B₂₂值指示喜欢自我关联的样本。从实用的角度来看，k_D与其对于B₂₂的含义类似，并给出了关于分子之间的净力的信息。高值指示强的净排斥相互作用，低值指示净吸引力。因此，k_D可用于相对的定性比较(参见图1)。

对于每种肽溶液，确定流体力学半径R_h和扩散常数D(经由斯托克斯-爱因斯坦方程相关)作为一式三份的平均。在相同的缓冲系统中，以不同的肽浓度(例如,R_h1和D₁:1mg/ml和R_h5和D₅:5mg/ml)测定两个参数。低和高肽浓度之间这些参数的差异为DLS相互作用参数k_D的代表。R_h5<R_h1或D₅>D₁对应于k_D>0，因此对应于排斥性粒子间相互作用，其导致改善的物理(或胶体)稳定性。

DLS缓冲系统A)25mM乙酸盐缓冲液pH4.5,3mg/mL L-甲硫氨酸,2.7mg/mL间甲酚,18mg/mL甘油85％

DLS缓冲系统B)25mM磷酸盐缓冲液pH6.0,3mg/mL L-甲硫氨酸,2.7mg/mL间甲酚,18mg/mL甘油85％

DLS方法A：在W130i仪器(Avid Nano Ltd,High Wycombe,UK)上并使用低容量一次性比色杯(UVette,Eppendorf AG,Hamburg,Germany)进行DLS测量。用由Avid Nano提供的i-Size 3.0处理数据。使用DynaLS算法用非负约束最小二乘法(NNLS)确定粒度分布的参数。测量是在25℃用660nm激光光源和90°的角度进行的。

DLS方法B:在Nanosizer ZS(Malvern Instruments,Malvern,UK)上并使用一次性UV比色杯(Brand macro,2.5mL和Brand semi-micro 1.5mL,Brand GmbH+Co KG,Wertheim,Germany)进行DLS测量。用Malvern Zetasizer软件7.10或7.01版处理数据。用非负约束最小二乘法(NNLS)确定粒度分布的参数。测量是在25℃用633nm激光光源NIBS(无创后向散射(Non-Invasive Back-Scatter))模式在90°的角度进行的。

DLS方法C:在DynaPro平板阅读器II(Wyatt Technology,Santa Barbara,CA,US)上并使用如下黑色、低容量及非处理平板之一进行DLS测量：具有透明底部的聚苯乙烯384测定板(Corning,NY,US)，具有透明底部的聚苯乙烯96测定板(Corning,NY,US)，具有透明底部的环烯烃聚合物(COP)384测定板(Aurora,MT,US)，或具有透明底部的聚苯乙烯384测定板(Greiner Bio-One,Germany)。用由Wyatt Technology提供的Dynamics软件处理数据。使用DynaLS算法用非负约束最小二乘法(NNLS)确定粒度分布的参数。测量是在25℃用830nm激光光源以158°的角度进行的。

用于评估物理稳定性的ThT测定法

肽溶液的低物理稳定性可导致淀粉样原纤维(amyloid fibril)形成，其在样品中被观察为有序的，线状的大分子结构，其最终可导致凝胶形成。硫磺素T(ThT)广泛用于可视化和量化错误折叠的蛋白质聚集体的存在[Biancalana等(2010)Biochimica etBiophysica Acta.1804(7):1405-1412]。当它与原纤维(如淀粉样聚集体中的那些)结合时，染料显示出独特的荧光特征[Naiki等(1989)Anal.Biochem.177,244-249；LeVine(1999)Methods.Enzymol.309,274-284]。原纤维形成的时间过程通常遵循S形曲线的特征形状，并且可分成三个区域：迟滞期、快速生长期和平台期。

典型的原纤维形成过程从迟滞期开始，其中部分折叠的肽转化为原纤维的量不足以被检测到。迟滞时间对应于核的临界质量被建立的时间。之后，跟随急剧的延伸阶段，原纤维浓度迅速增加。

在Fluoroskan Ascent FL内通过在37℃振荡来进行研究以确定在应激条件下的原纤化倾向。

对于Fluoroskan Ascent FL中的测试，将200μL样品放入96孔微滴定板PS(平底Greiner Fluotrac No.655076)中。用Scotch Tape(Quiagen)密封板。样品通过在37℃以960rpm振荡10秒和50秒静息期的连续循环进行应激。通过每20分钟测量荧光强度来监测动力学。

将肽在缓冲系统中稀释至终浓度为3mg/ml。将20μL的10.1mM ThT的水溶液加入到2mL的肽溶液中以接受100μM ThT的终浓度。对于每个样品，测试了8个重复。

Tht缓冲系统A)100mM乙酸盐pH 4.5，其包括间甲酚(100mM乙酸钠三水合物(Natriumacetat trihydrat),使用2N CH3COOH调节pH,2.7mg/mL间甲酚)

Tht缓冲系统B)100mM柠檬酸盐缓冲液pH 6.0

用于GLP-1、胰高血糖素和GIP受体功效的体外细胞测定法

通过测量稳定表达人GLP-1、GIP或胰高血糖素受体的HEK-293细胞系的cAMP响应的功能测定法来确定化合物对受体的激动作用。

基于HTRF(均相时间分辨荧光)，使用来自Cisbio Corp.的试剂盒(目录号62AM4PEJ)确定细胞的cAMP含量。为了制备，将细胞分入T175培养瓶并在培养基(DMEM/10％FBS)中培养过夜至接近汇合。然后除去培养基，用缺乏钙和镁的PBS洗涤细胞，然后用Accutase(Sigma-Aldrich目录号A6964)进行蛋白酶处理。将分离的细胞洗涤并重悬于测定缓冲液(1x HBSS；20mM HEPES,0.1％BSA,2mM IBMX)中并确定细胞密度。然后将它们稀释至400000个细胞/ml，并将25μl等分试样分配到96孔板的孔中。为了测量，将25μl的测定缓冲液中的测试化合物添加至孔中，然后在室温温育30分钟。加入在裂解缓冲液(试剂盒组分)中稀释的HTRF试剂后，将平板温育1小时，然后测量在665/616nm处的荧光比率。激动剂的体外效力通过确定引起最大响应的50％活化的浓度(EC50)来定量。

用于定量小鼠和猪中的毒蜥外泌肽-4衍生物的生物分析筛选方法

对小鼠皮下(s.c.)给药1mg/kg。在施用后0.25、0.5、1、2、4、8、16和24小时后将小鼠处死并收集血样。在经由液相色谱质谱(LC/MS)进行蛋白质沉淀之后分析血浆样品。使用WinonLin5.2.1版(非隔室模型)计算PK参数和半衰期。

雌性小型猪皮下(s.c.)给药0.05mg/kg、0.075mg/kg或0.1mg/kg。在施用后0.25、0.5、1、2、4、8、24、32、48、56和72小时后收集血液样品。在经由液相色谱质谱术(LC/MS)进行蛋白质沉淀之后分析血浆样品。使用WinonLin Version 5.2.1版(非隔室模型)计算PK参数和半衰期。

在雌性饮食诱导的肥胖(DIO)C57BL/6小鼠中皮下治疗后对血糖、身体质量、全身脂肪含量、饲料消耗的急性和慢性作用

雌性C57BL/6NHsd小鼠从Envigo RMS Inc.以群组饲养的形式定购、以群组饲养的形式运送并与运送的笼中同伴以群组饲养的形式保持于带有木屑垫料的鞋盒中，直到给药前阶段的第38天。在研究开始时，小鼠为25-26周龄。

将小鼠饲养在包括12小时光照/黑暗周期(光照阶段04:00AM至4:00PM)，室温23-26℃和相对湿度30-70％的动物饲养条件下。在药理干预(给药阶段)之前，所有动物都可自由取用水和高脂饮食(TD97366)16周。饲料每周用新鲜饲料代替，直到在给药前阶段的第38天的最后一次。在随后的给药阶段期间，移除剩余饲料的大约50％，用新鲜饲料替换，并将丸粒每周均匀混合一次。

在给药前第38天，将肥胖的DIO小鼠分配到治疗组(n＝8)以匹配所有DIO组之间的平均身体质量。将可随意获得啮齿动物维持性饮食(Teklad Global Diets Rodent 2014,pelleted)的一个年龄匹配的组包括在本研究中，作为瘦的对照组。在给药前阶段中从第32天至第38天，每天一次(皮下大约0.2mL/小鼠)用媒介物(磷酸盐缓冲盐水,PBS,Gibco,不含CaCl₂和MgCl₂)处理所有研究动物。

在给药前阶段的第37天，用PBS将测试物稀释至100μg/mL的浓度，并将该储备溶液的等分试样储存在约≤-60℃。将储备物等分试样解冻用于每周使用，然后储存在处于约4℃的冰箱中。在每个给药当天通过用PBS稀释储备溶液以达到所需浓度而一次新鲜制备注射的测试物溶液。

小鼠每天用皮下注射PBS-媒介物或测试物治疗两次进行28天。早晨给药在06:00至07:30AM之间开始和完成，下午给药在2:00至3:30PM之间。在给药阶段的第28天仅施用早晨剂量。施加的体积是5ml/kg，并将剂量调整至每个个体最近的身体质量记录。

1)非空腹、雌性DIO小鼠中对血糖概貌的急性作用：

动物在实验过程中无限制地取用水和饲料。在给药阶段的第1天，在第一次皮下给药PBS-媒介物或测试物之前的0小时和在非麻醉动物中给药后1、2、3、4、6和24小时通过尾夹收集大约5μL的血液。在第2天给药之前进行24小时血液采集。在6和24小时血液样品之间施用下午剂量。葡萄糖测量在全血中进行，并使用Aviva血糖仪一式两份或三份进行。

2)非空腹、雌性DIO小鼠中对身体质量的慢性作用：

从给药前阶段的第32天到第38天以及遍及给药阶段的28天，每天大约在06:00至07:30AM之间测量身体质量。在给药阶段期间，每天两次用皮下注射PBS-媒介物或测试物处理小鼠。

3)非空腹、雌性DIO小鼠中对全身脂肪质量的慢性作用：

为了确定全身脂肪质量，在给药前第37天和给药阶段的第26天进行定量核磁共振(QNMR)测量。在给药期间，每天两次用皮下注射PBS-媒介物或测试物处理小鼠。

4)雌性DIO小鼠中对饲料消耗的作用：

饲料消耗是基于06：00至07：30AM之间每笼的饲养物重量的每天评估。在遍及给药阶段的28天计算每笼饲养的四只小鼠和饲料消耗。在给药阶段期间，每天两次用皮下注射PBS-媒介物或测试物处理小鼠。

5)非空腹、雌性DIO小鼠中的终末血浆参数：

在第28天，在任何其它生命活动之前收集血液用于确定血浆胰岛素浓度。然后施用早晨剂量，并在给药后4小时进行尸体剖检。为此目的，将动物用异氟烷麻醉，通过眼眶出血收集血液。

5)非空腹、雌性DIO小鼠中的终末肝脏质量：

在第28天和早晨给药后4小时，如上所述在异氟烷麻醉下从小鼠收集血液。然后将小鼠杀死，收集肝脏并称重。

6)肝脏脂质的定量：

将肝等分试样与二氯甲烷:甲醇(2:1)一起温育。通过加入dH₂O并随后离心分离亲脂和疏脂相。收集底部亲脂相，并用剩余的疏脂层和肝脏组织重复该程序。接着将亲脂相合并，并蒸发溶剂。然后在60℃和连续振荡下，将样品与2-丙醇温育。用商业试剂盒根据制造商的说明酶法定量总胆固醇、甘油三酯和磷脂浓度。

7)统计分析：

用Sigmaplot12.5进行统计分析。双尾T检验用于比较DIO-媒介物小鼠(一般n＝8)与DIO-测试物处理小鼠(一般n＝8)的组。当两组均值差异大于0.05时，认为它们统计上具有显著差异。瘦-媒介物组数据在图中描绘，但被用作非肥胖状态的参考数据集。

非空腹、雌性、糖尿病db/db小鼠中皮下处理后对于血糖浓度的急性作用

将雌性健康、瘦BKS.Cg-(瘦)/OlaHsd和糖尿病-易患、肥胖BKS.Cg-+Lepr^db/+Lepr^db/OlaHsd小鼠从Envigo RMS Inc.以群组饲养的形式定购、以群组饲养的形式运送并以群组饲养的形式保持于带有木屑垫料的鞋盒笼中，直到给药前阶段的第15天。在研究开始时，小鼠为约12周龄。

将小鼠饲养在包括12小时光照/黑暗周期(光照阶段04:00AM至4:00PM)，室温23-26℃和相对湿度30-70％的动物饲养条件下。所有动物都可自由取用水和Purina Fomulab饮食5008。

在给药前第9天，进行血糖和身体质量(大约在08:00至10:00AM之间)以及HbA1c测量。在给药前阶段的第15天，将动物分配入处理组(n＝8)和新笼中以匹配所有db/db组之间的均值HbA1c和身体质量。年龄匹配的瘦组被包括在本研究中作为健康的、瘦的参考。

在给药阶段的第1天之前，将测试物用磷酸盐缓冲盐水(PBS,Gibco,无CaCl₂和MgCl₂)稀释至1mg/mL的浓度，并且将此储备溶液的等分试样储存在约≤-60℃。在给药阶段的第1天，将储备物等分试样解冻，并通过用PBS稀释以达到所需的浓度而新鲜制备注射的测试物溶液。

在给药阶段的第1天，将db/db小鼠用皮下注射PBS-媒介物或30μg/kg测试物处理一次。瘦的参考组用皮下注射PBS-媒介物处理一次。给药在08:00和10:00AM之间开始并完成。施加的体积为5ml/kg，并将剂量调整至每个个体的最近的身体质量记录。

1)非空腹动物中对血糖概貌的急性作用

动物在实验过程中无限制地取用水和饲料。在给药阶段的第1天，在任何其它生命活动之前的-30和0分钟通过尾夹收集约5μL血液。在第0分钟，小鼠接受PBS-媒介物或30μg/kg测试物的皮下给药。在给药后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8和24小时收获另外的血液样品。使用AlphaTRAK血糖仪在全血中进行葡萄糖测量。如果两次测量的葡萄糖浓度相差超过20mg/dL，则记录第三个值。血糖的曲线下面积(AUC)通过梯形方法计算并在给药后24小时的持续时间计算。

2)统计分析:

在图中，数据被描绘为均值±SEM。用Sigmaplot12.5进行统计分析。进行单因素方差分析和多重比较(Dunnett方法)，比较糖尿病、肥胖db/db媒介物小鼠(n＝8)的组与各糖尿病、肥胖db/db测试物处理的小鼠(n＝8)。当两组均值差异大于0.05时，认为它们统计上具有显著差异。图中描绘了非糖尿病、瘦的-媒介物组数据，其用作非肥胖、非糖尿病状态的参考数据集。

实施例

通过以下实施例进一步说明本发明。

实施例1：

SEQ ID NO:6的合成

如方法中所述，在Novabiochem Rink-酰胺树脂(4-(2’,4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基乙酰胺基-正亮氨酰氨基甲基树脂),100-200筛目,加载量0.43mmol/g上进行固相合成。以HBTU/DIPEA-活化来实施Fmoc-合成策略。在位置14使用Fmoc-Lys(Mmt)-OH并在位置1使用Boc-His(Trt)-OH用于固相合成方案。如方法中所述，将Mmt-基团从树脂上的肽切下。此后，将Palm-gGlu-gGlu-OSu与采用DIPEA作为碱的释放的氨基基团偶联。用金氏混合物(D.S.King,C.G.Fields,G.B.Fields,Int.J.Peptide Protein Res.1990,36,255-266)将肽从树脂切下。使用乙腈/水梯度(均为具有0.1％TFA的缓冲液)通过在Waters柱(RP18 XSelectCSH-5μm50x150mm)上的制备型HPLC纯化粗产物。通过LCMS(方法B)分析纯化的肽。

在峰下发现的保留时间8.737分钟的质量信号的解卷积揭示肽质量为4932.68，其与预期值4932.67相符。

实施例2：

SEQ ID NO:11的合成

如方法中所述，在Novabiochem Rink-酰胺树脂(4-(2’,4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基乙酰胺基-正亮氨酰氨基甲基树脂),100-200筛目,加载量0.43mmol/g上进行固相合成。以HBTU/DIPEA-活化来实施Fmoc-合成策略。在位置14使用Fmoc-Lys(Mmt)-OH并在位置1使用Boc-His(Trt)-OH用于固相合成方案。如方法中所述，将Mmt-基团从树脂上的肽切下。此后，将Palm-gGlu-gGlu-OSu与采用DIPEA作为碱的释放的氨基基团偶联。用金氏混合物(D.S.King,C.G.Fields,G.B.Fields,Int.J.Peptide Protein Res.1990,36,255-266)将肽从树脂切下。使用乙腈/水梯度(均为具有0.1％TFA的缓冲液)通过在Waters柱(Sunfire Prep C18 ODB 5μm30x250mm)上的制备型HPLC纯化粗产物。通过LCMS(方法B)分析纯化的肽。

在峰下发现的保留时间9.995分钟的质量信号的解卷积揭示肽质量为4863.67，其与预期值4863.63相符。

实施例3：

SEQ ID NO:20的合成

如方法中所述，在Novabiochem Rink-酰胺树脂(4-(2’,4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基乙酰胺基-正亮氨酰氨基甲基树脂),100-200筛目,加载量0.43mmol/g上进行固相合成。以HBTU/DIPEA-活化来实施Fmoc-合成策略。在位置14使用Fmoc-Lys(Mmt)-OH并在位置1使用Boc-His(Trt)-OH用于固相合成方案。如方法中所述，将Mmt-基团从树脂上的肽切下。此后，将Palm-gGlu(OSu)-OtBu(CAS 204521-63-1)与采用DIPEA作为碱的释放的氨基基团偶联。用金氏混合物(D.S.King,C.G.Fields,G.B.Fields,Int.J.PeptideProtein Res.1990,36,255-266)将肽从树脂切下。使用乙腈/水梯度(均为具有0.1％TFA的缓冲液)通过在Waters柱(Sunfire Prep C18 ODB 5μm30x250mm)上的制备型HPLC纯化粗产物。通过LCMS(方法B)分析纯化的肽。

在峰下发现的保留时间8.837分钟的质量信号的解卷积揭示肽质量为4763.670，其与预期值4763.617相符。

以类似的方式，合成并表征表3中列出的其它肽。

表3：合成肽的列表及计算分子量与测定分子量的比较

实施例4：稳定性

肽样品在化学稳定性缓冲系统A中制备，并如方法中所述评估稳定性。结果在表4中给出。

表4：稳定性

实施例5：溶解度

肽样品在溶解度缓冲系统A中制备，并如方法中所述评估溶解度。结果在表5中给出。

表5：溶解度

SEQ ID NO	于pH4.5的溶解度[mg/ml]
		6	>9.7
8	9.5
		9	>9.3
10	>9.8
		11	>9.8
12	>9,1
		13	>9,3
14	>9,4
		15	>9,5

实施例6：如通过DLS相互作用参数评估的稳定性

在DLS缓冲系统A中使用如方法中所述的DLS方法C在不同的肽浓度(1mg/ml和5mg/ml)确定肽样品的流体力学半径R_h作为DLS相互作用参数k_D的代表。结果在表6中给出。

表6：肽浓度为1mg/ml和5mg/ml时的流体力学半径R_h。在更高肽浓度的R_h的降低指示由于排斥性颗粒间相互作用所致的更高的物理稳定性。

实施例7：ThT测定法中评估的稳定性

肽样品的硫黄素T(ThT)测定法中以小时表示的迟滞时间在ThT缓冲系统A中如方法中所述的确定。结果在表7中给出。

表7：硫黄素T(ThT)测定法中以小时表示的迟滞时间

实施例8：关于GLP-1、胰高血糖素和GIP受体的体外数据

如方法部分所述，通过将表达人胰高血糖素受体(h胰高血糖素R)、人GIP受体(hGIP-R)或人GLP-1受体(hGLP-1 R)的细胞暴露于浓度增加的列出的化合物并测量形成的cAMP，确定了肽化合物在GLP-1、胰高血糖素和GIP受体处的效力。

结果示于表8中：

表8.毒蜥外泌肽-4衍生物对人GLP-1、胰高血糖素及GIP受体的EC50值(以pM表示)

实施例9：比较测试

已测试了(除其它外)在位置1携带His，在位置13携带Leu，在位置15携带Glu，在位置19携带Gln，在位置34携带Aib氨基酸，在位置32携带Pro且在位置35和39携带Lys的选择毒蜥外泌肽-4衍生物对比在这些位置处具有天然毒蜥外泌肽-4或其它氨基酸序列的氨基酸残基的对应化合物。参考对化合物和在人GLP-1、胰高血糖素和GIP受体处的相应的EC50值(以pM表示)示于表9中。如其所示，创造性的毒蜥外泌肽-4衍生物显示出相比于携带与天然毒蜥外泌肽-4的氨基酸或其它氨基酸的相应衍生物改进的对GIP受体的活性，保持它们的GLP-1受体和胰高血糖素受体活性。

表9：在位置1携带His，在位置13携带Leu，在位置15携带Glu，在位置19携带Gln，在位置34携带Aib氨基酸，在位置32携带Pro且在位置35和39携带Lys的毒蜥外泌肽-4衍生物相对于在这些位置包含天然毒蜥外泌肽-4(Lys27,Ser32,Gly34,Ala35,Ser39)的氨基酸残基或其它氨基酸的毒蜥外泌肽-4衍生物的比较。对人GLP-1、胰高血糖素和GIP受体的EC50值以pM指示。

实施例10：在饲喂、雌性饮食诱导肥胖(DIO)的C57BL/6小鼠中皮下治疗后SEQ ID NO:6对血糖、身体质量、全身脂肪含量、饲料消耗、终末肝脏重量和终末血浆参数的急性和 慢性作用

动物，研究设计(给药前阶段，给药阶段)，药理干预：

1)早晨饲喂的动物中的血糖概貌

动物在实验过程中无限制地取用水和饲料。在给药阶段的第一天在第一次皮下注射PBS-媒介物或30μg/kg SEQ ID NO:6之前的0小时然后在给药后1、2、3、4、6和24小时测定血糖浓度。在6和24小时的血液样品之间，施用下午剂量。

SEQ ID NO:6处理的动物证明了血糖浓度在24小时中的显著降低。相反，在DIO对照小鼠中没有观察到血糖浓度的这种变化(图2)。

2)身体质量

与媒介物DIO组相比，DIO动物用30μg/kg SEQ ID NO:6每天两次慢性处理在治疗阶段的28天内诱导了身体质量的持续降低(图3)。与用媒介物处理的DIO动物相比，在给药阶段的28天内用SEQ ID NO:6的慢性、每日两次处理导致统计学上显著更明显的身体质量减少(图4,表10)。

3)全身脂肪质量

在给药前第37天和给药阶段的第26天进行全身脂肪质量测量。

与显著的身体质量减少平行，DIO动物用30μg/kg SEQ ID NO:6每天两次慢性处理在给药阶段的28天期间导致与DIO-媒介物动物相比，统计学上显著更明显的全身脂肪质量减少(图5,表10)。

4)饲料消耗

遍及给药阶段的28天，估计每笼饲养的四只小鼠和饲料消耗。

给药开始后，用30μg/kg SEQ ID NO:6每天两次慢性处理抑制了饲料摄入，然而小鼠在大约十天内习惯了药理作用。此后，估计的饲料消耗在SEQ ID NO:6和DIO-媒介物组之间是可比的(图6)。

5)终末肝脏质量

在第28天，将小鼠在早晨给药后4小时实施安乐死，并收集肝脏。

与用媒介物处理的DIO动物相比，DIO动物用30μg/kg SEQ ID NO:6每天两次慢性处理在给药阶段的第28天导致肝脏质量的统计上显著的减少(图7,表10)。

6)终末血浆甘油三酯和LDL

在第28天和早晨给药后4小时，通过眼眶出血从麻醉的、非空腹小鼠收集血液。与用媒介物处理的DIO动物相比，DIO动物用30μg/kg SEQ ID NO:6每天两次慢性处理导致非空腹血浆甘油三酯(图8,表10)和血浆LDL浓度(图9,表10)的统计上显著的减少。

7)统计分析

在图中，数据被描绘为均值±SEM。用Sigmaplot 12.5进行统计分析。使用双尾T-检验以比较DIO-媒介物小鼠(n＝8)的组与DIO-测试物处理的小鼠(n＝8)的组。当两组均值差异大于0.05时，认为它们统计上具有显著差异。图中描绘了瘦的-媒介物组数据，其用作非肥胖状态的参考数据集。

表10.在饲喂、雌性饮食诱导的肥胖(DIO)C57BL/6小鼠中用SEQ ID NO:6的28天皮下处理得到的效果。数据为均值±SEM。n＝8/组。

实施例11：在饲喂、雌性饮食诱导肥胖(DIO)的C57BL/6小鼠中皮下治疗后SEQ ID NO:11对血糖、身体质量、全身脂肪含量、饲料消耗、终末肝脏重量和终末血浆参数的急性和 慢性作用

动物，研究设计(给药前阶段，给药阶段)，药理干预：

小鼠每天两次以皮下注射PBS-媒介物或30μg/kg SEQ ID NO:11处理，进行28天，除了在第1天和第28天，此时小鼠接受单次给药。早晨给药在06:00和07:30AM之间开始和完成，下午给药在2:00和3:30PM之间。在给药阶段的第1天和第28天仅施用早晨剂量。施加的体积是5ml/kg，并将剂量调整至每个个体最近的身体质量记录。

1)早晨饲喂的动物中的血糖概貌

动物在实验过程中无限制地取用水和饲料。在给药阶段的第一天在第一次皮下给药PBS-媒介物或30μg/kg SEQ ID NO:11之前的0小时然后在给药后1、2、3、4、6和24小时在非麻醉动物中通过尾夹收集约5μL的血液。在第2天在给药前进行24小时血液收集。葡萄糖测量在全血中进行，并使用Aviva血糖仪以一式两份或一式三份进行。

SEQ ID NO:11处理的动物证明了血糖浓度在24小时中持续的显著降低。相反，在DIO对照小鼠中没有观察到血糖浓度的这种变化(图10)。

2)身体质量

从给药前阶段的第32天到第38天以及遍及给药阶段的28天，每天大约在06:00至07:30AM之间测量身体质量。在给药阶段期间(除了在第1天和第28天)，每天两次用皮下注射PBS-媒介物或30μg/kg SEQ ID NO:11处理动物。与媒介物DIO组相比，DIO动物用30μg/kgSEQ ID NO:11的慢性处理在治疗阶段的28天内诱导了身体质量的持续降低(图11)。与用媒介物处理的DIO动物相比，在给药阶段的28天内用SEQ ID NO:11的慢性、每日两次处理导致统计学上显著更明显的身体质量减少(T-检验,双尾P<0.001,图12,表11)。

3)全身脂肪质量

为确定全身脂肪质量，在给药前第37天和给药阶段的第26天进行定量核磁共振(QNMR)测量。在给药阶段过程中，将小鼠用皮下注射PBS-媒介物或30μg/kg SEQ ID NO:11每天处理两次。

与显著的身体质量减少平行，与用媒介物处理的DIO动物相比，DIO动物用30μg/kgSEQ ID NO:11每天两次慢性处理在给药阶段的28天期间导致统计上显著更明显的全身脂肪质量减少(T-检验,双尾P<0.001,图13,表11)。

4)饲料消耗

基于在06:00至07:30AM之间饲喂者重量的每天评估来估计饲料消耗。遍及给药阶段的28天确定每笼饲养的4只小鼠和饲料消耗。在给药阶段过程中，将小鼠用皮下注射PBS-媒介物或30μg/kg SEQ ID NO:11每天处理两次。

给药开始后，用30μg/kg SEQ ID NO:11的处理抑制了饲料摄入，然而小鼠在大约15天内习惯了药理作用。在给药阶段中的第15天后，估计的饲料消耗在SEQ ID NO:11和媒介物处理的DIO小鼠之间是相似的(图14)。

5)终末肝脏质量

在第28天收集血液。然后给药早晨剂量并在给药后4小时进行尸体剖检。为此目的，将动物用异氟烷麻醉实施安乐死，通过眼眶出血收集血液，然后是颈脱位法，断头术，双侧开胸，放血或重要器官摘除以确保上次血液收集后死亡。然后收集肝脏并记录肝脏质量。

与用媒介物处理的DIO动物相比，DIO动物用30μg/kg SEQ ID NO:11每天两次慢性处理导致在给药阶段的第28天导致肝脏质量的统计上显著的减少(T-检验,双尾P<0.001,图15,表11)。

6)终末血浆甘油三酯、LDL、胰岛素和葡萄糖

在第28天收集血液。然后给药早晨剂量并在给药后4小时进行尸体剖检。为此目的，将非空腹动物用异氟烷麻醉实施安乐死，并通过眼眶出血收集血液用于测量血浆参数。

在给药阶段的第28天在最近一次给药后4小时，与用媒介物处理的DIO动物相比，DIO动物用30μg/kg SEQ ID NO:11的慢性处理导致非空腹血浆甘油三酯(T-检验,双尾P<0.05,图16,表11)、LDL浓度(T-检验,双尾P<0.0001,图17,表11)、胰岛素(T-检验,双尾P＝0.001,图18,表11)和葡萄糖浓度(T-检验,双尾P<0.00001,图19,表11)的统计上显著的减少。

7)统计分析

在图中，数据被描绘为均值±SEM。用Sigmaplot12.5进行统计分析。使用双尾T-检验以比较DIO-媒介物小鼠(n＝8)的组与DIO-化合物处理的小鼠(n＝8)的组。当两组均值差异大于0.05时，认为它们统计上具有显著差异。图中描绘了瘦的-媒介物组数据，但其用作非肥胖状态的参考数据集。

表11.在饲喂、雌性饮食诱导的肥胖(DIO)C57BL/6小鼠中用SEQ ID NO:11的单次给药得到的效果。数据为均值±SEM。n＝8/组。

实施例12:饲喂、雌性糖尿病db/db小鼠中SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 9在皮下处理后对于血糖的急性作用

动物，研究设计(给药前阶段，给药阶段)，药理干预：

将雌性健康、瘦BKS.Cg-(瘦)/OlaHsd和糖尿病-易患、肥胖BKS.Cg-+Lepr^db/+Lepr^db/OlaHsd小鼠从Envigo RMS Inc.以群组饲养的形式定购、以群组饲养的形式运送并以群组饲养的形式保持于带有木屑垫料的鞋盒笼中，直到给药前阶段的第15天。在研究开始时，小鼠为约12周龄。

将小鼠饲养在包括12小时光照/黑暗周期(光照阶段04:00AM至4:00PM)，室温23-26℃和相对湿度30-70％的动物饲养条件下。所有动物都可自由取用水和Purina Fomulab饮食5008。

在给药前第9天，进行血糖和身体质量(大约在08:00至10:00AM之间)以及HbA1c测量。在给药前阶段的第15天，将动物分配入处理组(n＝8)和新笼中以匹配所有db/db组之间的均值HbA1c和身体质量。年龄匹配的瘦组被包括在本研究中作为健康的、瘦的参考。

在给药阶段的第1天之前，将测试物用磷酸盐缓冲盐水(PBS,Gibco,无CaCl₂和MgCl₂)稀释至1mg/mL的浓度，并且将此储备溶液的等分试样储存在约≤-60℃。在给药阶段的第1天，将储备物等分试样解冻，并通过用PBS稀释以达到所需的浓度而新鲜制备注射的测试物溶液。

在给药阶段的第1天，将db/db小鼠用皮下注射PBS-媒介物或30μg/kg测试物处理一次。瘦的参考组用皮下注射PBS-媒介物处理一次。给药在08:00和10:00AM之间开始并完成。施加的体积为5ml/kg，并将剂量调整至每个个体的最近的身体质量记录。

1)早晨饲喂的动物中的血糖概貌

动物在实验过程中无限制地取用水和饲料。在给药阶段的第一天在任何其它生命活动之前的-30和0分钟通过尾夹收集约5μL的血液。在第0分钟小鼠接受皮下给药PBS-媒介物或30μg/kg SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9。在给药后0.25,0.5,1,1.5,2,3,4,6,8和24小时收获另外的血液样品。使用AlphaTRAK血糖仪在全血中进行葡萄糖测量。如果两次测量的葡萄糖浓度相差超过20mg/dL，则记录第三个值。血糖的曲线下面积(AUC)通过梯形方法计算并且在给药后24小时的持续时间计算。

用30μg/kg SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9单次处理糖尿病、非空腹db/db小鼠在6小时内将高血糖标准化至在非肥胖、瘦的参考小鼠中观察到的非空腹血糖浓度。给药后24小时，所有治疗动物的均值血糖浓度处于或接近基线(图20)。与糖尿病-媒介物组相比，用30μg/kg SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9单次处理糖尿病db/db小鼠导致血糖AUC的统计上显著的降低(单因素ANOVA,Dunnet’s方法,P<0.001所有处理组相对于糖尿病-媒介物组,图21,表12)。

2)统计分析

在图中，数据被描绘为均值±SEM。用Sigmaplot12.5进行统计分析。进行单因素方差分析和多重比较(Dunnett方法)，比较糖尿病、肥胖db/db媒介物小鼠(n＝8)的组与各糖尿病、肥胖db/db化合物处理的小鼠(n＝8)。当两组均值差异大于0.05时，认为它们统计上具有显著差异。图中描绘了非糖尿病、瘦的-媒介物组数据，其用作非肥胖、非糖尿病状态的参考数据集。

表12.在饲喂、雌性糖尿病db/db小鼠中用SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9的皮下处理得到的效果。数据为均值±SEM。n＝8/组。

实施例13：饲喂、雌性糖尿病db/db小鼠中SEQ ID NO:7在皮下处理后对于血糖的 急性作用

动物，研究设计(给药前阶段，给药阶段)，药理干预：

将雌性健康、瘦BKS.Cg-(瘦)/OlaHsd和糖尿病-易患、肥胖BKS.Cg-+Lepr^db/+Lepr^db/OlaHsd小鼠从Envigo RMS Inc.以群组饲养的形式定购、以群组饲养的形式运送并以群组饲养的形式保持于带有木屑垫料的一次性鞋盒笼中，直到给药前阶段的第15天。在研究开始时，小鼠为约12周龄。

将小鼠饲养在包括12小时光照/黑暗周期(光照阶段04:00AM至4:00PM)，室温23-26℃和相对湿度30-70％的动物饲养条件下。所有动物都可自由取用水和Purina Fomulab饮食5008。

在给药前第9天，进行血糖和身体质量(大约在08:00至10:00AM之间)以及HbA1c测量。在给药前阶段的第15天，将动物分配入处理组(n＝8)和新笼中以匹配所有db/db组之间的均值HbA1c和身体质量。年龄匹配的瘦组被包括在本研究中作为健康的、瘦的参考。

在给药阶段的第1天之前，将测试物用磷酸盐缓冲盐水(PBS,Gibco,无CaCl₂和MgCl₂)稀释至1mg/mL的浓度，并且将此储备溶液的等分试样储存在约≤-60℃。在给药阶段的第1天，将储备物等分试样解冻，并通过用PBS稀释以达到所需的浓度而新鲜制备注射的测试物溶液。

在给药阶段的第1天，将db/db小鼠用皮下注射PBS-媒介物或30μg/kg测试物处理一次。瘦的参考组用皮下注射PBS-媒介物处理一次。给药在08:00和10:00AM之间开始并完成。施加的体积为5ml/kg，并将剂量调整至每个个体的最近的身体质量记录。

1)早晨饲喂的动物中的血糖概貌

动物在实验过程中无限制地取用水和饲料。在给药阶段的第一天在任何其它生命活动之前的-30和0分钟通过尾夹收集约5μL的血液。在第0分钟小鼠接受皮下给药PBS-媒介物或30μg/kg SEQ ID NO:7。在给药后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8和24小时收获另外的血液样品。使用AlphaTRAK血糖仪在全血中进行葡萄糖测量。如果两次测量的葡萄糖浓度相差超过20mg/dL，则记录第三个值。血糖的曲线下面积(AUC)通过梯形方法计算并且在给药后24小时的持续时间计算。

用30μg/kg SEQ ID NO:7单次处理糖尿病、非空腹db/db小鼠在6小时内将高血糖标准化至在非肥胖、瘦的参考小鼠中观察到的非空腹血糖浓度。给药后24小时，SEQ ID NO:7处理的动物的均值血糖浓度处于基线(图22)。与糖尿病-媒介物组相比，用30μg/kg SEQID NO:7单次处理糖尿病db/db小鼠导致血糖AUC的统计上显著的降低(单因素ANOVA,Dunnet’s方法,P<0.001 SEQ ID NO:7相对于糖尿病-媒介物组,图23,表13)。

2)统计分析

在图中，数据被描绘为均值±SEM。用Sigmaplot12.5进行统计分析。进行单因素方差分析和多重比较(Dunnett方法)，比较糖尿病、肥胖db/db媒介物小鼠(n＝8)的组与各糖尿病、肥胖db/db化合物处理的小鼠(n＝8)。当两组均值差异大于0.05时，认为它们统计上具有显著差异。图中描绘了非糖尿病、瘦的-媒介物组数据，其用作非肥胖、非糖尿病状态的参考数据集。

表13.在饲喂、雌性糖尿病db/db小鼠中用SEQ ID NO:7的皮下处理得到的效果。数据为均值±SEM。n＝8/组。

实施例14：饲喂、雌性糖尿病db/db小鼠中SEQ ID NO:11在皮下处理后对于血糖的 急性作用

动物，研究设计(给药前阶段，给药阶段)，药理干预：

将雌性健康、瘦BKS.Cg-(瘦)/OlaHsd和糖尿病-易患、肥胖BKS.Cg-+Lepr^db/+Lepr^db/OlaHsd小鼠从Envigo RMS Inc.以群组饲养的形式定购、以群组饲养的形式运送并以群组饲养的形式保持于带有木屑垫料的一次性鞋盒笼中，直到给药前阶段的第15天。在研究开始时，小鼠为约12周龄。

在给药前阶段的第15天，将动物分配入处理组(n＝8)和新笼中以匹配所有db/db组之间的均值HbA1c和身体质量。年龄匹配的瘦组被包括在本研究中作为健康的、瘦的参考。

在给药阶段的第1天之前，将测试物用磷酸盐缓冲盐水(PBS,Gibco,无CaCl₂和MgCl₂)稀释至1mg/mL的浓度，并且将此储备溶液的等分试样储存在约≤-60℃。在给药阶段的第1天，将储备物等分试样解冻，并通过用PBS稀释以达到所需的浓度而新鲜制备注射的测试物溶液。

在给药阶段的第1天，将db/db小鼠用皮下注射PBS-媒介物或30μg/kg测试物处理一次。瘦的参考组用皮下注射PBS-媒介物处理一次。给药在08:00至10:00AM之间开始并完成。施加的体积为5ml/kg，并将剂量调整至每个个体的最近的身体质量记录。

1)早晨饲喂的动物中的血糖概貌

动物在实验过程中无限制地取用水和饲料。在给药阶段的第一天在任何其它生命活动之前的-30和0分钟通过尾夹收集约5μL的血液。在第0分钟小鼠接受皮下给药PBS-媒介物或30μg/kg SEQ ID NO:11。在给药后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8和24小时收获另外的血液样品。使用AlphaTRAK血糖仪在全血中进行葡萄糖测量。如果两次测量的葡萄糖浓度相差超过20mg/dL，则记录第三个值。血糖的曲线下面积(AUC)通过梯形方法计算并且在给药后24小时的持续时间计算。

用30μg/kg SEQ ID NO:11单次处理糖尿病、非空腹db/db小鼠在6小时内将高血糖标准化至在非肥胖、瘦的参考小鼠中观察到的非空腹血糖浓度。给药后24小时，SEQ ID NO:11-处理的动物的均值血糖浓度仍然低于基线浓度(图24)。与糖尿病-媒介物组相比，用30μg/kg SEQ ID NO:11单次处理糖尿病db/db小鼠导致血糖AUC的统计上显著的降低(单因素ANOVA,Dunnet’s方法,P<0.001 SEQ ID NO:11相对于糖尿病-媒介物组,图25,表14)。

2)早晨饲喂的动物中的终末血清甘油三酯浓度

动物在实验过程中无限制地取用水和饲料。在终末研究端点，将动物用异氟烷深度麻醉，收获眼眶血液样品，并准备血清用于甘油三酯测定。给药后24小时，SEQ ID NO：11处理的动物的均值血清三酰甘油浓度在统计学上显著低于由糖尿病媒介物组的动物显示的那些浓度(单因素ANOVA,Dunnet’s方法,P＝0.007 SEQ ID NO:11相对于糖尿病-媒介物组,图26,表14)。

3)统计分析

在图中，数据被描绘为均值±SEM。用Sigmaplot12.5进行统计分析。进行单因素方差分析和多重比较(Dunnett方法)，比较糖尿病、肥胖db/db媒介物小鼠(n＝8,除了对于甘油三酯分析n＝7)的组与糖尿病、肥胖db/db化合物处理的小鼠的组(n＝8)。当两组均值差异大于0.05时，认为它们统计上具有显著差异。图中描绘了非糖尿病、瘦的-媒介物组数据，其用作非肥胖、非糖尿病状态的参考数据集。

表14.在饲喂、雌性糖尿病db/db小鼠中用SEQ ID NO:11的皮下处理得到的效果。数据为均值±SEM。n＝7-8/组。

实施例15：：饲喂、雌性糖尿病db/db小鼠中SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:26在皮下处理后对于血糖的急性作用

动物，研究设计(给药前阶段，给药阶段)，药理干预：

将雌性健康、瘦BKS.Cg-(瘦)/OlaHsd和糖尿病-易患、肥胖BKS.Cg-+Lepr^db/+Lepr^db/OlaHsd小鼠从Envigo RMS Inc.以群组饲养的形式定购、以群组饲养的形式运送并以群组饲养的形式保持于带有木屑垫料的一次性鞋盒笼中，直到给药前阶段的第15天。在研究开始时，小鼠为约12周龄。

将小鼠饲养在包括12小时光照/黑暗周期(光照阶段04:00AM至4:00PM)，室温23-26℃和相对湿度30-70％的动物饲养条件下。所有动物都可自由取用水和Purina Fomulab饮食5008。

在给药前第9天，进行血糖和身体质量(大约在08:00至10:00AM之间)以及HbA1c测量。在给药前阶段的第15天，将动物分配入处理组(n＝8)和新笼中以匹配所有db/db组之间的均值HbA1c和身体质量。年龄匹配的瘦组被包括在本研究中作为健康的、瘦的参考。

在给药阶段的第1天之前，将测试物用磷酸盐缓冲盐水(PBS,Gibco,无CaCl₂和MgCl₂)稀释至1mg/mL的浓度，并且将此储备溶液的等分试样储存在约≤-60℃。在给药阶段的第1天，将储备物等分试样解冻，并通过用PBS稀释以达到所需的浓度而新鲜制备注射的测试物溶液。

在给药阶段的第1天，将db/db小鼠用皮下注射PBS-媒介物或30μg/kg测试物处理一次。瘦的参考组用皮下注射PBS-媒介物处理一次。给药在08:00至10:00AM之间开始并完成。施加的体积为5ml/kg，并将剂量调整至每个个体的最近的身体质量记录。

1)早晨饲喂的动物中的血糖概貌

动物在实验过程中无限制地取用水和饲料。在给药阶段的第一天在任何其它生命活动之前的-30和0分钟通过尾夹收集约5μL的血液。在第0分钟小鼠接受皮下给药PBS-媒介物或30μg/kg SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:26。在给药后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8和24小时收获另外的血液样品。使用AlphaTRAK血糖仪在全血中进行葡萄糖测量。如果两次测量的葡萄糖浓度相差超过20mg/dL，则记录第三个值。血糖的曲线下面积(AUC)通过梯形方法计算并且在给药后24小时的持续时间计算。

用30μg/kg SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16或SEQ IDNO:26单次处理糖尿病、非空腹db/db小鼠在6小时内将高血糖标准化至在非肥胖、瘦的参考小鼠中观察到的非空腹血糖浓度。给药后24小时，所有处理的动物的均值血糖浓度仍然处于或接近基线浓度(图27)。与糖尿病-媒介物组相比，用30μg/kg SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:26单次处理糖尿病db/db小鼠导致血糖AUC的统计上显著的降低(单因素ANOVA,Dunnet’s方法,P<0.001所有处理组相对于糖尿病-媒介物组,图28,表15)。

2)统计分析

在图中，数据被描绘为均值±SEM。用Everst@t6.0.12进行统计分析。进行单因素方差分析和多重比较(Dunnett方法)，比较糖尿病、肥胖db/db媒介物小鼠(n＝8)的组与各糖尿病、肥胖db/db化合物处理的小鼠的组(n＝8)。当两组均值差异大于0.05时，认为它们统计上具有显著差异。图中描绘了非糖尿病、瘦的-媒介物组数据，其用作非肥胖、非糖尿病状态的参考数据集。

表15.在饲喂、雌性糖尿病db/db小鼠中用SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:26的皮下处理得到的效果。数据为均值±SEM。n＝8/组。

实施例16

ApoE KO小鼠中三重GLP-1R/GCGR/GIPR激动剂的抗动脉粥样硬化活性

载脂蛋白E(ApoE)敲除(KO)小鼠模型广泛用于研究动脉粥样硬化。这些小鼠自发地出现动脉粥样硬化病变，其在形态学上类似于在人中观察到的那些(Meir&Leitersdorf2004,Arterioscler Thromb Vasc Biol 24:1006-1014,Rosenfeld et al.2000,Arterioscler Thromb Vasc Biol20:2587-2592)。

动物

将雄性ApoE KO小鼠(B.129P2-apoetm1Unc/J)随机分配至对照组或治疗组(N＝15/组)；野生型小鼠(C57BL6/J)接受媒介物治疗并作为第二健康对照。

研究过程

ApoE KO和野生型小鼠使用填充有媒介物(无菌乙酸盐缓冲液,pH 4.5)、肽SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.11(150μg/kg/天)或填充有利拉鲁肽(600μg/kg/天)的皮下渗透微泵(ALZET^TM)接受恒定的16周输注。在整个研究中每周监测体重和食物摄入量。

血脂参数

在治疗前及第7周和第16周抽取用于血脂分析的血液样品以分析总胆固醇、低密度脂蛋白(LDL)胆固醇和高密度脂蛋白(HDL)胆固醇(未示出)。

动脉粥样硬化斑块形成的定量

解剖主动脉并使用定量和自动图像分析以绝对和相对斑块面积(总主动脉表面积的油红染色面积％)测量主动脉粥样硬化斑块形成。

结果如图所示：

图29：食物摄入量和体重监测数据

图30：主动脉斑块面积数据

图31：血清总胆固醇和LDL-胆固醇数据

在用肽SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.11以150μg/kg/天的剂量长期处理4个月的雄性ApoE KO小鼠中，与媒介物对照相比，导致动脉粥样硬化斑块显著减少63％和73％。抗动脉粥样硬化功效伴随着LDL-胆固醇的显著减少。

相反，4倍高剂量的纯GLP-1受体激动剂利拉鲁肽显著减少主动脉斑块形成，但仅减少37％，其中LDL-胆固醇降低远不那么明显。

表8.序列

序列表

<110> 赛诺菲(SANOFI)

<120> 作为肽类三重GLP1/胰高血糖素/GIP受体激动剂的新化合物

<130> DE2016/076WOPCT

<160> 29

<170> PatentIn 版本3.5

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> 人

<220>

<221> MOD_RES

<222> (30)..(30)

<223> 酰胺化

<400> 1

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

<210> 2

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 利拉鲁肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> Lys在N6与(S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基-进行衍生化

<400> 2

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 3

<211> 29

<212> PRT

<213> 人

<400> 3

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr

20 25

<210> 4

<211> 39

<212> PRT

<213> 钝尾毒蜥

<220>

<221> MOD_RES

<222> (39)..(39)

<223> 酰胺化

<400> 4

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

<210> 5

<211> 42

<212> PRT

<213> 人

<400> 5

Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys

1 5 10 15

Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys

20 25 30

Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln

35 40

<210> 6

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 毒蜥外泌肽4衍生物

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = Aib

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> Lys在N6与(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基)-丁酰基-进行衍生化

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(34)

<223> Xaa = Aib

<220>

<221> MOD_RES

<222> (39)..(39)

<223> 酰胺化

<400> 6

His Xaa His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Leu Lys Glu Glu

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Gln Arg Gln Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly His Pro

20 25 30

Ser Xaa Lys Pro Pro Pro Lys

35

<210> 7

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 毒蜥外泌肽4衍生物

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = Aib

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> Lys在N6与(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基)-丁酰基-进行衍生化

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(29)

<223> Xaa = dAla

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(34)

<223> Xaa = Aib

<220>

<221> MOD_RES

<222> (39)..(39)

<223> 酰胺化

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1 5 10 15

Gln Arg Gln Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Xaa Gly His Pro

20 25 30

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35

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 毒蜥外泌肽4衍生物

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = Aib

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> Lys在N6与(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基)-丁酰基-进行衍生化

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(34)

<223> Xaa = Aib

<220>

<221> MOD_RES

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<220>

<223> 毒蜥外泌肽4衍生物

<220>

<221> misc_feature

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<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> Lys在N6与(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基)-丁酰基-进行衍生化

<220>

<221> misc_feature

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<220>

<221> misc_feature

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<220>

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<220>

<223> 毒蜥外泌肽4衍生物

<220>

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<220>

<221> misc_feature

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<222> (34)..(34)

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<220>

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<220>

<223> 毒蜥外泌肽4衍生物

<220>

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<222> (2)..(2)

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<220>

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<223> Lys在N6与(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基)-丁酰基-进行衍生化

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

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<220>

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<220>

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<220>

<221> misc_feature

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<220>

<221> misc_feature

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<223> 毒蜥外泌肽4衍生物

<220>

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<220>

<221> misc_feature

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<221> misc_feature

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<220>

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<223> 毒蜥外泌肽4衍生物

<220>

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<220>

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<223> 毒蜥外泌肽4衍生物

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<223> 毒蜥外泌肽4衍生物

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<220>

<221> misc_feature

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<223> 毒蜥外泌肽4衍生物

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<223> 毒蜥外泌肽4衍生物

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

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<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> Lys在N6与(4S)-羧基- [2-(2-{2-[(4R)-5-羧基-4-十六酰基氨基-戊酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基氨基]-丁酰基进行衍生化

<220>

<221> misc_feature

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<221> MOD_RES

<222> (39)..(39)

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His Xaa His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Leu Lys Glu Glu

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Gln Arg Gln Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Xaa Gly His Pro

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 毒蜥外泌肽4衍生物

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = Aib

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

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<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

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<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(29)

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<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(34)

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<221> MOD_RES

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<212> PRT

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<220>

<223> 毒蜥外泌肽4衍生物

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

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<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> Lys在N6与(4S)-羧基- [2-(2-{2-[(4R)-5-羧基-4-十六酰基氨基-戊酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基氨基]-丁酰基进行衍生化

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> Xaa = Aib

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(29)

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<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(34)

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<220>

<221> MOD_RES

<222> (39)..(39)

<223> 酰胺化

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35

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 毒蜥外泌肽4衍生物

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = Aib

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> Lys在N6与[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-(十六酰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]丁酰基氨基]-丁酰基-进行衍生化

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> Xaa = Aib

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(34)

<223> Xaa = Aib

<220>

<221> MOD_RES

<222> (39)..(39)

<223> 酰胺化

<400> 26

His Xaa His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Leu Lys Glu Glu

1 5 10 15

Gln Arg Gln Xaa Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly Pro Pro

20 25 30

Ser Xaa Lys Pro Pro Pro Lys

35

<210> 27

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 毒蜥外泌肽4衍生物

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = Aib

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> Lys在N6与(4S)-羧基-[2-(2-{2-[(4R)-5-羧基-4-十六酰基氨基-戊酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基氨基]-丁酰基进行衍生化

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> Xaa = Aib

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(34)

<223> Xaa = Aib

<220>

<221> MOD_RES

<222> (39)..(39)

<223> 酰胺化

<400> 27

His Xaa His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Leu Lys Glu Glu

1 5 10 15

Gln Arg Gln Xaa Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly Pro Pro

20 25 30

Ser Xaa Lys Pro Pro Pro Lys

35

<210> 28

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 毒蜥外泌肽4衍生物

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = Aib

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> Lys在N6与(S)-4-羧基-4-十八酰基氨基-丁酰基-进行衍生化

<220>

<221> MOD_RES

<222> (39)..(39)

<223> 酰胺化

<400> 28

His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Asp Glu

1 5 10 15

Gln Arg Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

<210> 29

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 毒蜥外泌肽4衍生物

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = Aib

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> Lys在N6与(S)-4-羧基-4-十八酰基氨基-丁酰基-进行衍生化

<220>

<221> MOD_RES

<222> (39)..(39)

<223> 酰胺化

<400> 29

Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Asp Glu

1 5 10 15

Gln Arg Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ser Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

Claims (41)

1.式I化合物或其盐或溶剂合物：

H₂N-His-Aib-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Leu-X14-Glu-Glu-Gln-Arg-Gln-X20-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Ala-X29-Gly-X31-Pro-Ser-Aib-Lys-Pro-Pro-Pro-Lys-R¹ I

其中

X14表示具有官能化的-NH₂侧链基团的氨基酸残基，选自下组：Lys、Orn、Dab或Dap，其中所述-NH₂侧链基团通过-Z-C(O)-R⁵官能化，其中

Z表示所有立体异构形式的接头，和

R⁵为包含多至50碳原子和选自N和O的杂原子的模块，

X20表示选自Aib和Lys的氨基酸残基，

X29表示选自D-Ala和Gly的氨基酸残基，

X31表示选自His和Pro的氨基酸残基，

R¹为NH₂或OH。

2.权利要求1的化合物或其盐或溶剂合物，

其中R¹为NH₂。

3.权利要求1-2中任一项的化合物，

其中所述肽化合物对胰高血糖素受体与天然胰高血糖素相比具有至少5％的相对活性。

4.权利要求1-3中任一项的化合物，其中所述肽化合物对GLP-1受体与GLP-1(7-36)-酰胺相比显示至少7％的相对活性。

5.权利要求1-4中任一项的化合物，其中所述肽化合物对GIP受体与GIP相比显示至少4％的相对活性。

6.权利要求1-5中任一项的化合物，其中

X14表示Lys，其中所述-NH₂侧链基团用基团-Z-C(O)R⁵官能化，其中

Z表示选自gGlu、gGlu-gGlu、gGlu-AEEAc-gAAA-、gGlu-gGlu-AEEAc、AEEAc-AEEAc-gGlu和AEEAc-AEEAc-AEEAc的基团；和

R⁵表示选自十五烷基或十七烷基的基团。

7.权利要求1-5中任一项的化合物，其中

X14表示Lys，其中所述-NH₂侧链基团用基团-Z-C(O)R⁵官能化，其中

Z表示选自gGlu、gGlu-gGlu、gGlu-AEEAc-gAAA-和gGlu-gGlu-AEEAc的基团；和

R⁵表示选自十五烷基或十七烷基的基团。

8.权利要求1-5中任一项的化合物或其盐或溶剂合物，其中

X14表示Lys，其中所述-NH₂侧链基团通过如下官能化：(S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基-、(S)-4-羧基-4-十八酰基氨基-丁酰基-、(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基)-丁酰基-、(2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基、(2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-羧基-4-十八酰基氨基-丁酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基、[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-十八酰基氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基氨基}-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基氨基}-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基-，

R¹表示NH₂。

9.权利要求1-5中任一项的化合物或其盐或溶剂合物，其中

X14表示Lys，其中所述-NH₂侧链基团通过如下官能化：(S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基-、(S)-4-羧基-4-十八酰基氨基-丁酰基-、(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基)-丁酰基-、(2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基、(2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-羧基-4-十八酰基氨基-丁酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基氨基]-乙氧基}-乙氧基)-乙酰基，

R¹表示NH₂。

10.权利要求1-8中任一项的化合物或其盐或溶剂合物，其中

X14表示Lys，其中所述-NH₂侧链基团通过如下官能化：(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基)-丁酰基-，

X20表示Lys或Aib，

X29表示选自D-Ala和Gly的氨基酸残基，

X31表示选自His和Pro的氨基酸残基，

R¹表示NH₂。

11.权利要求1-8中任一项的化合物或其盐或溶剂合物，其中

X14表示Lys，其中所述-NH₂侧链基团通过如下官能化：(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基)-丁酰基-、(S)-4-羧基-4-十八酰基氨基-丁酰基-，

X20表示Lys，

X29表示选自D-Ala和Gly的氨基酸残基，

X31表示选自His和Pro的氨基酸残基，

R¹表示NH₂。

12.权利要求1-8中任一项的化合物或其盐或溶剂合物，其中

X14表示Lys，其中所述-NH₂侧链基团通过如下官能化：(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基)-丁酰基-、(S)-4-羧基-4-十八酰基氨基-丁酰基-，

X20表示Lys，

X29表示选自D-Ala和Gly的氨基酸残基，

X31表示His，

R¹表示NH₂。

13.权利要求1-8中任一项的化合物或其盐或溶剂合物，其中

X14表示Lys，其中所述-NH₂侧链基团通过如下官能化：(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基)-丁酰基-、(S)-4-羧基-4-十八酰基氨基-丁酰基-，

X20表示Lys，

X29表示Gly，

X31表示选自His和Pro的氨基酸残基，

R¹表示NH₂。

14.权利要求1-8中任一项的化合物或其盐或溶剂合物，其中

X14表示Lys，其中所述-NH₂侧链基团通过如下官能化：(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基)-丁酰基-、(S)-4-羧基-4-十八酰基氨基-丁酰基-，

X20表示Aib，

X29表示选自D-Ala和Gly的氨基酸残基，

X31表示选自His和Pro的氨基酸残基，

R¹表示NH₂。

15.权利要求1-8中任一项的化合物或其盐或溶剂合物，其中

X14表示Lys，其中所述-NH₂侧链基团通过如下官能化：(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基)-丁酰基-、(S)-4-羧基-4-十八酰基氨基-丁酰基-，

X20表示Aib，

X29表示选自D-Ala和Gly的氨基酸残基，

X31表示Pro，

R¹表示NH₂。

16.权利要求1-8中任一项的化合物或其盐或溶剂合物，其中

X14表示Lys，其中所述-NH₂侧链基团通过如下官能化：(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-十六酰基氨基-丁酰基氨基)-丁酰基-，

X20表示Aib，

X29表示D-Ala，

X31表示选自His和Pro的氨基酸残基，

R¹表示NH₂。

17.权利要求1-16中任一项的化合物以及其盐或溶剂合物，所述化合物选自SEQ IDNO:6-27的化合物。

18.权利要求1的化合物或其盐或溶剂合物，其中所述化合物由SEQ ID NO.:6表示。

19.权利要求1的化合物或其盐或溶剂合物，其中所述化合物由SEQ ID NO.:9表示。

20.权利要求1的化合物或其盐或溶剂合物，其中所述化合物由SEQ ID NO.:11表示。

21.权利要求1-20中任一项的化合物，其用于人类医学。

22.权利要求1-20中任一项的化合物，其用作医药。

23.权利要求21-22中任一项的用于所述用途的化合物，其作为活性剂连同至少一种药学上可接受的载体存在于药物组合物中。

24.权利要求21-23中任一项的用于所述用途的化合物，其连同至少一种额外的治疗活性剂。

25.权利要求24的用于所述用途的化合物，其中所述至少一种额外的治疗活性剂选自下组：胰岛素和胰岛素衍生物；GLP-1，GLP-1类似物和GLP-1受体激动剂；DPP-4抑制剂；SGLT2抑制剂；双重SGLT2/SGLT1抑制剂；双胍类，噻唑烷二酮类，双重PPAR激动剂，磺酰脲类，美格列奈类，α-葡糖苷酶抑制剂，胰淀素和胰淀素类似物；GPR119激动剂，GPR40激动剂，GPR120激动剂，GPR142激动剂，全身或低吸收性TGR5激动剂；甲磺酸溴隐亭，11-β-HSD的抑制剂，葡糖激酶活化剂，DGAT的抑制剂，蛋白酪氨酸磷酸酶1的抑制剂，葡萄糖-6-磷酸酶的抑制剂，果糖-1,6-二磷酸酶的抑制剂，糖原磷酸化酶的抑制剂，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的抑制剂，糖原合酶激酶的抑制剂，丙酮酸脱氢激酶的抑制剂，α2拮抗剂，CCR-2拮抗剂，SGLT-1抑制剂，葡萄糖转运蛋白-4的调节剂，生长抑素受体3激动剂；降脂剂；用于治疗肥胖症的活性物质；胃肠肽；脂肪酶抑制剂，血管生成抑制剂，H3拮抗剂，AgRP抑制剂，三重单胺摄取抑制剂，MetAP2抑制剂，钙通道阻断剂地尔硫的鼻制剂，针对成纤维细胞生长因子受体4产生的反义分子，靶向肽-1的抑制素；和用于影响高血压、慢性心力衰竭或动脉粥样硬化的药物。

26.权利要求21-25中任一项的用于所述用途的化合物，其用于治疗葡萄糖耐受不良、胰岛素抵抗、前驱糖尿病、空腹血糖升高、高血糖症、2型糖尿病、高血压、血脂异常、动脉硬化、冠心病、外周动脉疾病、中风或这些个体疾病组分的任何组合。

27.权利要求21-25中任一项的用于所述用途的化合物，其用于控制食欲、摄食和卡路里摄入，增加能量消耗，预防体重增加，促进体重减轻，减轻体重过重和总体治疗肥胖，包括病态肥胖。

28.权利要求21-25中任一项的用于所述用途的化合物，其用于治疗或预防脂肪肝。

29.权利要求21-25中任一项的用于所述用途的化合物，其用于治疗或预防高血糖、2型糖尿病和/或肥胖。

30.权利要求21-25中任一项的用于所述用途的化合物，其用于同时治疗2型糖尿病和肥胖。

31.权利要求21-25中任一项的用于所述用途的化合物，其用于治疗糖尿病。

32.权利要求21-25中任一项的用于所述用途的化合物，其用于治疗肥胖。

33.权利要求21-25中任一项的用于所述用途的化合物，其用于治疗动脉粥样硬化。

34.权利要求21-25中任一项的用于所述用途的化合物，其用于减少患者的肠道通过，增加患者的胃内容物和/或减少患者的食物摄取。

35.权利要求21-25中任一项的用于所述用途的化合物，其用于降低患者的血糖水平和/或降低患者的HbA1c水平。

36.权利要求21-25中任一项的用于所述用途的化合物，其用于降低患者的体重。

37.药物组合物，其包含至少一种权利要求1-20中任一项的化合物或它们中任何的生理学上可接受的盐或溶剂合物，所述药物组合物用作医药。

38.药物组合物，其包含至少一种权利要求1-20中任一项的化合物或它们中任何的生理学上可接受的盐或溶剂合物和至少一种额外的药学活性成分。

39.用于在患者中治疗高血糖、2型糖尿病或肥胖的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的至少一种权利要求1-20中任一项的式I化合物和有效量的至少一种用于治疗糖尿病、肥胖、血脂异常或高血压的其它化合物。

40.权利要求39的方法，其中将所述有效量的至少一种式I化合物和所述额外的活性成分同时施用于所述患者。

41.权利要求39的方法，其中将所述有效量的至少一种式I化合物和所述额外的活性成分顺序施用于所述患者。