CN110018225A - 一种同时分析生物组织中多种胺类代谢物的质谱成像方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种同时分析生物组织多种胺类代谢物的MALDI质谱成像方法，属于质谱检测技术领域。所述多种胺类代谢物为胆碱、甘油磷酸胆碱、肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、组胺、精胺、亚精胺、甜菜碱、丁酰肉碱、戊酰肉碱、C18:0肉碱、乙酰胆碱、肌酸、组氨酸、磷酸胆碱(共计16种)，该方法操作简便、灵敏度高、重复性好，可以用于生物组织中胺类代谢物的可视化表征，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种同时分析生物组织中多种胺类代谢物的质谱成像方法
技术领域
本发明属于质谱检测技术领域，具体涉及一种同时分析生物组织中多种胺类代谢物的质谱成像方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
生物组织具有非常复杂的结构和功能，也是大多数生物学功能发挥、疾病发生发展的靶部位。其中，胺类代谢物作为生物组织的重要组成分子，在细胞生物膜形成、细胞间信号转导及能量代谢中发挥着重要的作用。对生物组织中胺类代谢物进行原位分析，掌握机体生理和病理条件下胺类代谢物的分布和变化特征，能够更深层次地理解胺类代谢物在生命活动及病变过程中的作用和机制。
Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization(MALDI)质谱成像技术是表征生物组织中分子空间分布的一种重要技术手段。MALDI以激光为探针对组织中所含的多种分子按空间位置逐点进行扫描检测，获得其离子强度与位置关系的多维数据阵，然后通过数据处理软件对不同质荷比(m/z)的离子按照其强度和空间位置进行重构和可视化，最终实现多种分子的同时成像分析。尽管MALDI可以在数微米的空间分辨率下实现组织中脂质、多肽、蛋白等的原位分析，但是发明人发现，由于MALDI质谱成像技术的灵敏度不足以及样品准备阶段需要在组织切片上喷涂基质，容易造成低质量区(m/z<700)产生非常强的聚合峰，严重地影响了目标胺类代谢物的质谱成像分析。因此如何提高检测灵敏度，实现生物组织中小分子胺类代谢物的高覆盖原位分析，仍然是MALDI质谱成像分析面临的巨大挑战。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供一种同时分析生物组织多种胺类代谢物的MALDI质谱成像方法，所述多种胺类代谢物为胆碱、甘油磷酸胆碱、肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、组胺、精胺、亚精胺、甜菜碱、丁酰肉碱、戊酰肉碱、C18:0肉碱、乙酰胆碱、肌酸、组氨酸、磷酸胆碱(共计16种)，该方法操作简便、灵敏度高、重复性好，可以用于生物组织中胺类代谢物的可视化表征。
本发明基于以下技术方案实现上述技术目的：
本发明的第一个方面，提供一种同时分析生物组织中多种胺类代谢物的质谱成像方法，所述方法包括：
将新鲜生物组织制冰冻切片转移至导电载玻片上，抽真空后进行冰丙酮处理；
将基质溶液喷涂至冰丙酮处理后的组织切片上，进行MALDI质谱成像分析。
进一步的，冰冻切片的厚度为10～18微米(优选12毫米)；
进一步的，所述导电载玻片为ITO-氧化铟锡导电载玻片；
进一步的，所述冰丙酮处理具体方法为：将冰冻切片置于冰丙酮中震荡处理，震荡转速为40～80次/分钟(优选60次/分钟)，震荡时间为1-15分钟(优选为15分钟)；
进一步的，所述基质溶液中基质为1,5-二氨基萘；溶剂为乙腈和水的混合物，优选为乙腈-水(1:1，v/v)；更进一步的，所述基质溶液配制浓度为1～5mg/mL(优选为2.5mg/mL)；
进一步的，喷涂处理具体条件为：喷涂速率为0.05～0.15mL/分钟，喷涂温度为40～60℃，喷嘴轨道速度为750～850mm/分钟，喷嘴轨道间距为2～5mm，循环次数为6～12次；
更进一步的，喷涂速率为0.075mL/分钟，喷涂温度为55℃，喷嘴轨道速度为800mm/分钟，喷嘴轨道间距为3mm，循环次数为8次。
进一步的，所述同时分析生物组织中多种胺类代谢物的质谱成像方法还包括将多种胺类代谢物进行靶向质谱成像数据提取，获得其离子强度和可视化成像图。
进一步的，所述胺类代谢物包括胆碱、甘油磷酸胆碱、肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、组胺、精胺、亚精胺、甜菜碱、丁酰肉碱、戊酰肉碱、C18:0肉碱、乙酰胆碱、肌酸、组氨酸和磷酸胆碱。
本发明的第二个方面，提供上述方法在对生物组织中小分子胺类代谢物分析中的应用。
本发明的优点和积极效果：
本发明意外发现，通过对组织切片进行冰丙酮浸泡可显著提高生物组织中胺类代谢物的检测灵敏度，从而首次实现了组织中16种胺类代谢物的同时质谱成像分析。其中，所检测的16种代谢物分别为：胆碱、甘油磷酸胆碱、肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、组胺、精胺、亚精胺、甜菜碱、丁酰肉碱、戊酰肉碱、C18:0肉碱、乙酰胆碱、肌酸、组氨酸、磷酸胆碱。
本发明所述方法不仅操作简便、灵敏度高，而且胺类代谢物的检测重现性好，质谱响应的相对偏差(RSD)在3.45％～8.98％之间，同时浸泡后的组织切片的空间分辨率也不受影响，因此本发明具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是实施例1中基质、喷涂基质后的脾脏组织、冰丙酮浸泡后的脾脏组织的MALDI质谱轮廓(m/z 80-1000)图；
图2是实施例1中无处理、冰丙酮浸泡后脾脏组织中胺类代谢物的质谱响应变化趋势图；
图3是实施例1中借助大鼠脑水平切片评价丙酮浸泡前后MALDI质谱成像空间分辨率变化情况图；其中，图3A为大鼠脑水平切片及H&E染色示意图；图3B1为未经丙酮处理的大鼠脑水平切片中C22:0-羟基-硫苷脂的MALDI质谱成像空间分辨率情况图；图3B2为经丙酮处理15min的大鼠脑水平切片中C22:0-羟基-硫苷脂的MALDI质谱成像空间分辨率情况图；图3C1为未经丙酮处理的大鼠脑水平切片中C32:0-磷脂酰胆碱的MALDI质谱成像空间分辨率情况图；图3C2为经丙酮处理15min的大鼠脑水平切片中C32:0-磷脂酰胆碱的MALDI质谱成像空间分辨率情况图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，由于MALDI质谱成像技术的灵敏度不足以及样品准备阶段需要在组织切片上喷涂基质，容易造成低质量区(m/z<700)产生非常强的聚合峰，严重地影响了目标胺类代谢物的质谱成像分析。
有鉴于此，本发明的一个典型实施方式中，提供一种同时分析生物组织中16种胺类代谢物的质谱成像方法，所述方法包括：
(1)取新鲜生物组织，采用病理切片机制作冰冻切片；
(2)将步骤(1)制作的冰冻切片转移到的ITO-氧化铟锡导电载玻片上；
(3)将步骤(2)处理的组织切片置于真空干燥器中抽真空15分钟；
(4)将步骤(3)处理的组织切片置于盛有有机溶剂的染色缸中；
(5)将步骤(4)的染色缸置于摇床上进行震荡；
(6)配置基质溶液；
(7)将步骤(5)处理完的组织切片进行1,5-二氨基萘基质喷涂；
(8)将步骤(7)喷涂完基质的组织切片进行MALDI质谱成像分析；
(9)对组织切片中16种胺类代谢物进行靶向质谱成像数据提取，获得其离子强度和可视化成像图。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤(1)中冰冻切片的厚度为10～18微米(优选12毫米)；切片厚度过薄，则易造成组织皱缩，且电荷效应较低，从而达不到质谱分析的要求；切片过厚，在MALDI过程中容易受到非靶物的干扰，而且影响胺类代谢物的离子化效率。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤(4)中选择的有机溶剂为冰丙酮。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤(5)中在摇床上的震荡转速为60次/分钟，震荡时间为1-15分钟，进一步优选的，震荡时间为15分钟；经试验验证，通过优化控制冰丙酮处理条件，可以在不影响质谱成像的空间分辨率的同时，显著提高胺类代谢物的检测灵敏度，从而可以检测出更多的胺类小分子代谢物。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤(6)中所选择的基质为1,5-二氨基萘。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤(6)中1,5-二氨基萘基质的溶剂为乙腈-水(1:1，v/v)，配制浓度为2.5mg/mL。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤(7)中基质喷涂条件为：喷涂速率为0.075mL/分钟，喷涂温度为55℃，喷嘴轨道速度为800mm/分钟，喷嘴轨道间距为3mm，循环次数为8次；
基质的选择和基质覆盖条件都会影响组织中靶分子的质谱成像质量，本发明通过不断筛选优化，最终确定上述基质和基质喷涂条件，从而进一步提高MALDI质谱成像空间分辨率，提高胺类小分子代谢物的质谱成像质量。
本发明的又一具体实施方式中，所述16种胺类代谢物包括胆碱、甘油磷酸胆碱、肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、组胺、精胺、亚精胺、甜菜碱、丁酰肉碱、戊酰肉碱、C18:0肉碱、乙酰胆碱、肌酸、组氨酸和磷酸胆碱。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述方法在对生物组织中小分子胺类代谢物分析中的应用。
下面结合实施例对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。
实施例1
(1)取新鲜大鼠脾脏组织，采用Thermo CryoStar NX50NOVPD切片机制作12微米厚的冰冻切片，共计制作6片；
(2)将冰冻切片用纤维毛刷转移到25mm*75mm的ITO-氧化铟锡导电载玻片上；
(3)将组织切片置于真空干燥器中，在真空条件下抽干15分钟后，然后将组织切片置于染色缸中备用；
(4)其中1片组织切片不加入任何处理试剂，另外5片均在染色缸中加入适量的冰丙酮，然后将染色缸置于摇床上，设定摇床的震荡转速为60次/分钟，分别在震荡的第1、2、5、10、15分钟从浸有冰丙酮的染色缸中取出组织切片，晾干备用；
(5)精密称量25mg 1,5-二氨基萘置于10mL容量瓶中，加入10mL乙腈-水(1:1，v/v)溶液，涡旋混匀，超声10分钟，备用；
(6)采用HTX TM-SprayerTM基质喷涂仪进行组织切片的基质喷涂，设定喷涂条件为：喷涂速率为0.075mL/分钟，喷涂温度为55℃，喷嘴轨道速度为800mm/分钟，喷嘴轨道间距为3mm，循环次数为8次；
(7)利用布鲁克RapiflexMALDItissuetyperTM-TOF型质谱成像系统对喷涂完1,5-二氨基萘基质的组织切片进行质谱成像采集分析，设定的质谱分析参数如下表1所示；
表1 MALDI-TOF质谱分析参数
(8)通过布鲁克FlexImaging 5.0数据处理软件对组织切片中16种胺类代谢物进行靶向质谱成像数据提取，获得其离子强度和可视化质谱成像图。
图1是1,5-二氨基萘基质、喷涂基质后的脾脏组织、冰丙酮浸泡后的脾脏组织的MALDI质谱轮廓(m/z 80～1000)，可见经过冰丙酮浸泡后，脾脏组织中可被检测到的小分子代谢物数目明显增加，而且其检测灵敏度也有明显的提升。
图2统计的是未经过冰丙酮浸泡和冰丙酮浸泡1、2、5、10、15分钟的组织切片中可被检测到的胺类代谢物，可以观察到冰丙酮浸泡可以显著提高胺类代谢物的检测灵敏度，其中无处理条件下未检测到的丙酰肉碱和组胺，经过冰丙酮浸泡后可实现MALDI质谱检测。冰丙酮浸泡15分钟是组织中胺类代谢物检测的最优条件。
为了分析冰丙酮浸泡是否会对组织切片质谱成像的空间分辨率造成影响，对组织异质性较高的脑组织制作冰冻切片2片，1片不经过任何处理，另1片在冰丙酮中浸泡15分钟，进行MALDI质谱成像分析。通过图3可以观察到：冰丙酮浸泡15分钟不会影响组织切片质谱成像的空间分辨率。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种同时分析生物组织中多种胺类代谢物的质谱成像方法，其特征在于，所述方法包括：
将新鲜生物组织制冰冻切片转移至导电载玻片上，抽真空后进行冰丙酮处理；
将基质溶液喷涂至冰丙酮处理后的组织切片上，进行MALDI质谱成像分析。
2.如权利要求1所述的质谱成像方法，其特征在于，所述冰冻切片的厚度为10～18微米(优选12毫米)。
3.如权利要求1所述的质谱成像方法，其特征在于，所述冰丙酮处理具体方法为：将冰冻切片置于冰丙酮中震荡处理，震荡转速为40～80次/分钟(优选60次/分钟)，震荡时间为1-15分钟(优选为15分钟)。
4.如权利要求1所述的质谱成像方法，其特征在于，所述基质溶液中基质为1,5-二氨基萘。
5.如权利要求1所述的质谱成像方法，其特征在于，所述基质溶液中的溶剂为乙腈和水的混合物，优选为乙腈-水(1:1，v/v)。
6.如权利要求1所述的质谱成像方法，其特征在于，所述基质溶液配制浓度为1～5mg/mL(优选为2.5mg/mL)。
7.如权利要求1所述的质谱成像方法，其特征在于，喷涂处理具体条件为：喷涂速率为0.05～0.15mL/分钟，喷涂温度为40～60℃，喷嘴轨道速度为750～850mm/分钟，喷嘴轨道间距为2～5mm，循环次数为6～12次；
优选的，喷涂速率为0.075mL/分钟，喷涂温度为55℃，喷嘴轨道速度为800mm/分钟，喷嘴轨道间距为3mm，循环次数为8次。
8.如权利要求1所述的质谱成像方法，其特征在于，所述同时分析生物组织中多种胺类代谢物的质谱成像方法还包括将多种胺类代谢物进行靶向质谱成像数据提取，获得其离子强度和可视化成像图。
9.如权利要求1所述的质谱成像方法，其特征在于，所述胺类代谢物包括胆碱、甘油磷酸胆碱、肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、组胺、精胺、亚精胺、甜菜碱、丁酰肉碱、戊酰肉碱、C18:0肉碱、乙酰胆碱、肌酸、组氨酸和磷酸胆碱。
10.权利要求1-9任一项所述方法在对生物组织中小分子胺类代谢物分析中的应用。
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