CN110016429A - 一种含细胞的双重液滴及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备含细胞的双重液滴的方法。本发明还公开利用前述方法制备得到的含细胞的双重液滴。本发明提供的含细胞的双重液滴制备方法，在液滴形成之前，鞘液可以有效的包裹细胞液，避免剪切包裹液时剪切力过大对细胞活性造成损伤；当鞘液和细胞液混合后，能在紫外光传感器检测到双重乳液中的荧光信号，从而判定细胞的活性程度，并及时调节细胞液、鞘液及包裹液的流速，避免产生的细胞活性太低。本发明方法制备得到的含细胞的双重乳液具有较好的同心度和双分散性，乳液中的细胞损伤小，活性高。

Description

一种含细胞的双重液滴及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物材料领域，具体涉及一种含细胞的双重液滴及其制备方法。

背景技术

细胞包裹技术是在凝胶(如海藻酸铀)液滴的内部注入细胞，再将凝胶液滴固化为一个微模块，这样的壳/核(凝胶/细胞)结构避免了内部的活性细胞受到外部环境的影响，大大提高了细胞的活性和稳定性。随着生物技术的发展，细胞包裹技术是生物技术相关领域中非常重要的部分。细胞包裹被用于多种领域，例如：细胞的三维培养、3D生物打印、三维构建体、药物筛选、体内或体外测定、组织工程或用于组织再生等，具有广泛的应用价值。

微流控芯片(Microfluidic chip)又被称为芯片实验室(Lab-on-a-chip)，是指在一块几平方厘米的芯片上集成生物、化学实验中样品的制备、反应、检测、分离等多个功能，堪称一个微型的实验室。液滴微流控是微流控平台的一个重要分支，是利用两相不相容的原理形成单个微液滴。其原理为：两种不相容物质所处的角色不同而分别称之为连续相和分散相，分散性就是被分散成液滴的物质，连续相是充当液滴载体的物质。可以据此，利用液滴微流控技术将细胞包裹进液滴来隔离细胞，实现细胞包裹。

目前基于液滴微流控系统的细胞包裹技术多为单层乳化，根据液滴发生过程中单层乳化根据分散相属于水相或油相的不同分为O/W、W/O型液滴。然而，单纯乳化液滴普遍存在易融合、易碎、易变形等特点，从而对其包裹的细胞损害较大，大大地增大了实验的操作难度，限制了液滴的使用范围。

专利申请号201511009230.5，一种壳核功能材料的制备装置公开了一种采用微流控方法制备双重乳液的装置，该装置制备的双重乳液是一种分散相外液滴包裹着更小内液滴的嵌套结构多相体系，该体系相对于单纯乳化体系可以有效地隔离内液滴与连续相间的接触，而增加液滴的稳定性。然而该技术在制备包含细胞的双重乳液时，会产生较大的剪切力无法保证细胞的活性，且无法检测制得的液滴中细胞的活性情况。

因此，需提供一种基于液滴微流控系统的细胞包裹技术，该技术制备的液滴具有良好的稳定性，并且包裹的细胞具有较好的活性。

发明内容

本发明提供了一种含细胞的双重液滴及其制备方法。

本发明提供了一种制备含细胞的双重液滴的方法，它是利用制备双重乳液的装置制备而得的；

所述的制备双重乳液的装置包括微流控集成芯片，所述微流控集成芯片包括外相输入通道(1)、中间相输入通道(2)、内相输入通道(3)、双重乳液生成微结构(4)和仿生分裂阵列(5)，内相输入通道(3)与中间相输入通道(2)同轴设置，内相输入通道(3)位于中间相输入通道(2)内围，内相输入通道(3)和中间相输入通道(2)汇合后与外相输入通道(1)垂直连接，双重乳液生成微结构(4)的入口与外相输入通道(1)垂直连接，双重乳液生成微结构(4)的出口与仿生分裂阵列(5)相连，双重乳液生成微结构(4)与内相输入通道(3)同轴；

其中，所述的制备含细胞的双重液滴的方法包括以下步骤：

A：将细胞溶液通入内相输入通道(3)；将包裹液1通入中间相输入通道 (2)；将包裹液2通入外相输入通道(1)；

B：细胞溶液与包裹液1在内相输入通道(3)和中间相输入通道(2)的交叉口汇合后，包裹液1将细胞溶液包裹，形成液柱；液柱与包裹液2在双重乳液生成微结构(4)和外相输入通道(1)的交叉口汇合后，再通过双重乳液生成微结构(4)，在双重乳液生成微结构(4)的出口处，形成含细胞的双重乳液；

C：将含细胞的双重乳液再通过仿生分裂阵列(5)，即得到含细胞的双重液滴。

其中，所述内相输入通道(3)和中间相输入通道(2)的出口端均为锥形结构；中间相输入通道(2)的出口位于内相输入通道(3)出口的前方。

其中，所述微流控集成芯片含有一个十字四通槽结构，十字四通槽的两条水平槽作为外相输入通道(1)，十字四通槽的一条竖直槽作为双重乳液生成微结构(4)，十字四通槽的另一条竖直槽与中间相输入通道(2)密封连接；竖直槽与内相输入通道(3)同轴；其中，竖直槽和水平槽的宽度为 0.1mm-10mm，竖直槽和水平槽的深度为0.1mm-0.5mm。

其中，所述的制备双重乳液的装置还包括鞘液通道(6)，所述鞘液通道 (6)与内相输入通道(3)同轴设置，鞘液通道(6)位于内相输入通道(3) 与中间相输入通道(2)之间；所述鞘液通道(6)的出口端为锥形结构；鞘液通道(6)的出口位于内相输入通道(3)出口的前方，中间相输入通道(2) 的出口位于鞘液通道(6)出口的前方。

其中，所述双重乳液生成微结构(4)外设置有紫外光传感器(7)。

其中，所述仿生分裂阵列包括主通道(23)、至少两级层级分裂通道(24) 和汇合通道(25)；优选地，所述层级分裂通道(24)为仿生结构微通道，所述的汇合通道(25)为漏斗状结构。

其中，每级层级分裂通道(24)的分裂数为2，每个分裂通道包括斜通道和连接在斜通道后端的平行通道，所述平行通道与主通道(23)平行，两个斜通道之间的夹角为60度。

其中，步骤A中，所述的细胞溶液为单细胞溶液或多细胞溶液。

其中，所述的细胞溶液包括含细胞的凝胶、细胞悬浮液、细胞浓缩物或多种细胞的聚集体；所述的细胞浓缩物是指将细胞悬浮液离心后，弃去液体，得到的细胞；所述的多种细胞的聚集体包括纤维细胞、干细胞或内皮细胞的聚合体。

其中，步骤A中所述的包裹液1或包裹液2选自胶原、纤维蛋白、壳聚糖、海藻酸盐、淀粉、透明质酸、层粘连蛋白、弹性蛋白、明胶、聚氨基酸、琼脂糖、葡聚糖、甲基纤维素、聚乙烯醇、聚丙烯酸及其衍生物的一种或两种以上的组合。

其中，将鞘液通入鞘液通道(6)。

所述的鞘液是无荧光本底的平衡电解质溶液，主要成份为氯化钠、氯化钾、乙二胺四乙酸二钠和抑菌剂，它作为库尔特流式细胞仪对细胞等生物粒子的理化及生物学特性进行分析时的鞘液使用。大部分高端血液分析仪为了提高检测的精度，都应用了鞘流原理，主要应用的试剂就是鞘液。鞘流形式有单鞘流和多鞘流，目的都是使细胞呈一条直线经过检测部。

其中，所述的紫外光传感器(7)采用检测双重乳液中荧光信号，判定细胞活性程度；根据细胞活性程度，调节细胞液、鞘液和包裹液流速降低剪切力。

其中，所述的制备方法得到的每个含细胞的双重液滴粒径大小为 200～1000um，含有单个或多个细胞。

本发明最后提供了一种根据前述的制备方法制备得到的含细胞的双重液滴。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明将中间相输入通道和内相输入通道设计为同轴结构，增加包裹液对细胞溶液的包裹能力；

2、利用鞘液通道可在细胞溶液的外层通入鞘液，使得鞘液和细胞液均匀混合；同时由于细胞液包裹了鞘液，在包裹液剪流时能够避免对细胞活性的损伤；

3、在完成双重包裹后，紫外光传感器能够检测制得的双重乳液中细胞的活性信息，便于及时调节流体速度以调节剪切力，防止对细胞活性损伤，避免产生的双重乳液活性太低而失去作用。

4、通过仿生分裂阵列可得到均匀性、分散性好的含细胞的双重液滴。

本发明方法制备得到的含细胞的双重液滴具有较好的同心度和双分散性，乳液中的细胞损伤小，活性高。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：本发明双重乳液的制备装置的部分结构示意图；

图2：本发明双重乳液的装置中仿生分裂阵列的示意图；

图中：1-外相输入通道、2-中间相输入通道、3-内相输入通道、4-双重乳液生成微结构、5-仿生分裂阵列、6-鞘液通道、7-紫外光传感器、8-紫外光发射装置、23-主通道、24-层级分裂通道、25-汇合通道。

具体实施方式

实施例1利用本发明双重乳液的装置制备含细胞的双重液滴的方法

1、实验装置

如图1所示，本发明公开的制备高质量含细胞的双重乳液的装置，包括微流控集成芯片，微流控集成芯片包括外相输入通道1、中间相输入通道 2、内相输入通道3、双重乳液生成微结构4和仿生分裂阵列5，内相输入通道3和中间相输入通道2汇合后与外相输入通道1垂直连接，双重乳液生成微结构4的入口与外相输入通道1垂直连接，双重乳液生成微结构4的出口与仿生分裂阵列5相连，双重乳液生成微结构4与内相输入通道3同轴，内相输入通道3与中间相输入通道2同轴设置，内相输入通道3位于中间相输入通道2内围。

如图1所示，十字四通槽的两条水平槽作为外相输入通道1，十字四通槽的一条竖直槽作为双重乳液生成微结构4，十字四通槽的另一条竖直槽与中间相输入通道2密封连接。竖直槽与内相输入通道3同轴。其中，竖直槽和水平槽的宽度为0.1mm-10mm，竖直槽和水平槽的深度为0.1mm-0.5mm，可生成的双重乳液粒径大小为200um-1000um，生成的双重乳液可以包含单个或多个细胞，优选地50-20000个细胞。使用中，竖直槽和水平槽的尺寸可根据细胞浓度调节。

制备高质量含细胞的双重乳液的装置还包括鞘液通道6，鞘液通道6与内相输入通道3同轴设置，鞘液通道6位于内相输入通道3与中间相输入通道2 之间，鞘液通道6、内相输入通道3和中间相输入通道2汇合与外相输入通道 1垂直连接。

内相输入通道3、中间相输入通道2和鞘液通道6的出口端均为锥形结构。鞘液通道6的出口位于内相输入通道3出口的前方，中间相输入通道2的出口位于鞘液通道6出口的前方。

双重乳液生成微结构4外设置有紫外光传感器7，紫外光传感器能够检测制得的双重乳液中细胞的活性信息。紫外光传感器7接收紫外光发射装置8 的光信号。紫外光传感器7与紫外光发射装置8分别设于双重乳液生成微结构4相对的外侧壁上，双重乳液生成微结构4为透明材质。

如图2所示，仿生分裂阵列包括主通道23、至少两级层级分裂通道24和汇合通道25。进一步的，层级分裂通道24为仿生结构微通道，汇合通道25 为漏斗状结构。其中，每级层级分裂通道24的分裂数为2，每个分裂通道包括斜通道和连接在斜通道后端的平行通道，平行通道与主通道23平行，两个斜通道之间的夹角为60度。双乳液在主通道中生成后流入层级分裂通道，被均匀的依次分裂成二、四、八、十六……个均匀的双重乳液，最后在汇合通道中汇合。这样就获得了均匀的、单分散性好的双重乳液。

2、实验方法

A：将细胞溶液通入内相输入通道(3)；将包裹液1通入中间相输入通道 (2)；将鞘液通入鞘液通道(6)；将包裹液2通入外相输入通道(1)；

B：细胞溶液与鞘液在内相输入通道(3)与鞘液通道(6)的交叉口汇合，形成细胞溶液与鞘液的混合溶液；

C：上述E步骤的混合液体与包裹液1在鞘液通道(6)和中间相输入通道(2)的交叉口汇合后，包裹液1将细胞溶液与鞘液的混合溶液包裹，形成液柱；液柱与包裹液2在双重乳液生成微结构(4)和外相输入通道(1)的交叉口汇合后，再通过双重乳液生成微结构(4)，在双重乳液生成微结构(4) 的出口处，形成含细胞的双重乳液；另外，紫外光传感器(7)能检测双重乳液中荧光信号，判定细胞活性程度，通过调节细胞液、鞘液和包裹液流速降低剪切力，提高细胞活性。

D：将含细胞的双重乳液再通过仿生分裂阵列(5)，即得到含细胞的双重液滴。

以下通过具体实验证明本发明的有益效果：

试验例1本发明双重液滴具有良好的物理性质的验证

1实验材料

细胞溶液为：人脐静脉内皮细胞溶液、包裹液1为纤维蛋白、包裹液2 为壳聚糖、鞘液为希森美康Sysmex XE2100血细胞分析用鞘液。

2实验方法

实验组采用本发明实施例1的实验方法制备含细胞的双重液滴；

对照组采用专利申请号201511009230.5公开的制备双重乳液的装置制备含细胞的双重液滴。

3实验结果

3.1该实验方法制得的双重乳液好的同心度是由于采用微流控芯片同轴结构，即包裹液1与细胞液在同轴方向；好的分散性是由下部的均分结构带来的，保证了液滴的均一分散性。实验生成的双重液滴的粒径大小为200um，大小均一，具有较好的同心度和双分散性。

3.2该实验方法通过细胞液与鞘液混合，在液滴部位形成液流的时候鞘液包裹细胞溶液，形成一层保护层，降低对细胞的剪切力，一般细胞能够承受的剪切力在200Pa以下，可以通过检测部检验获得微球荧光情况来测量细胞活性。

采用本发明实施例1的实验方法制备含细胞的双重液滴，细胞活性为 90-95％；采用专利申请号201511009230.5公开的制备双重乳液的装置制备含细胞的双重液滴，细胞活性为60％以下。由此可知：本发明方法制备得到的含细胞的双重乳液，乳液中的细胞损伤小，活性高。

综上，本发明提供的含细胞的双重液滴制备方法，在液滴形成之前，鞘液可以有效的包裹细胞液，避免剪切包裹液时剪切力过大对细胞活性造成损伤；当鞘液和细胞液混合后，能在紫外光传感器检测到双重乳液中的荧光信号，从而判定细胞的活性程度，并及时调节细胞液、鞘液及包裹液的流速，避免产生的细胞活性太低。本发明方法制备得到的含细胞的双重乳液具有较好的同心度和双分散性，乳液中的细胞损伤小，活性高。

Claims (15)

1.一种制备含细胞的双重液滴的方法，其特征在于：它是利用制备双重乳液的装置制备而得的；

所述的制备双重乳液的装置包括微流控集成芯片，所述微流控集成芯片包括外相输入通道(1)、中间相输入通道(2)、内相输入通道(3)、双重乳液生成微结构(4)和仿生分裂阵列(5)，内相输入通道(3)与中间相输入通道(2)同轴设置，内相输入通道(3)位于中间相输入通道(2)内围，内相输入通道(3)和中间相输入通道(2)汇合后与外相输入通道(1)垂直连接，双重乳液生成微结构(4)的入口与外相输入通道(1)垂直连接，双重乳液生成微结构(4)的出口与仿生分裂阵列(5)相连，双重乳液生成微结构(4)与内相输入通道(3)同轴。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的制备含细胞的双重液滴的方法包括以下步骤：

A：将细胞溶液通入内相输入通道(3)；将包裹液1通入中间相输入通道(2)；将包裹液2通入外相输入通道(1)；

B：细胞溶液与包裹液1在内相输入通道(3)和中间相输入通道(2)的交叉口汇合后，包裹液1将细胞溶液包裹，形成液柱；液柱与包裹液2在双重乳液生成微结构(4)和外相输入通道(1)的交叉口汇合后，再通过双重乳液生成微结构(4)，在双重乳液生成微结构(4)的出口处，形成含细胞的双重乳液；

C：将含细胞的双重乳液再通过仿生分裂阵列(5)，即得到含细胞的双重液滴。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述内相输入通道(3)和中间相输入通道(2)的出口端均为锥形结构；中间相输入通道(2)的出口位于内相输入通道(3)出口的前方。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述微流控集成芯片含有一个十字四通槽结构，十字四通槽的两条水平槽作为外相输入通道(1)，十字四通槽的一条竖直槽作为双重乳液生成微结构(4)，十字四通槽的另一条竖直槽与中间相输入通道(2)密封连接；竖直槽与内相输入通道(3)同轴；其中，竖直槽和水平槽的宽度为0.1mm-10mm，竖直槽和水平槽的深度为0.1mm-0.5mm。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的制备双重乳液的装置还包括鞘液通道(6)，所述鞘液通道(6)与内相输入通道(3)同轴设置，鞘液通道(6)位于内相输入通道(3)与中间相输入通道(2)之间；所述鞘液通道(6)的出口端为锥形结构；鞘液通道(6)的出口位于内相输入通道(3)出口的前方，中间相输入通道(2)的出口位于鞘液通道(6)出口的前方。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述双重乳液生成微结构(4)外设置有紫外光传感器(7)。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述仿生分裂阵列包括主通道(23)、至少两级层级分裂通道(24)和汇合通道(25)；优选地，所述层级分裂通道(24)为仿生结构微通道，所述的汇合通道(25)为漏斗状结构。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：每级层级分裂通道(24)的分裂数为2，每个分裂通道包括斜通道和连接在斜通道后端的平行通道，所述平行通道与主通道(23)平行，两个斜通道之间的夹角为60度。

9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤A中，所述的细胞溶液为单细胞溶液或多细胞溶液。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述的细胞溶液包括含细胞的凝胶、细胞悬浮液、细胞浓缩物或多种细胞的聚集体。

11.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤A中所述的包裹液1或包裹液2选自胶原、纤维蛋白、壳聚糖、海藻酸盐、淀粉、透明质酸、层粘连蛋白、弹性蛋白、明胶、聚氨基酸、琼脂糖、葡聚糖、甲基纤维素、聚乙烯醇、聚丙烯酸及其衍生物的一种或两种以上的组合。

12.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：将鞘液通入鞘液通道(6)。

13.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述的紫外光传感器(7)采用检测双重乳液中荧光信号，判定细胞活性程度；根据细胞活性程度，调节细胞液、鞘液和包裹液流速降低剪切力。

14.根据权利要求1-13任意一项所述的制备方法，其特征在于：所述的制备方法得到的每个含细胞的双重液滴粒径大小为200～1000um，含有单个或多个细胞。

15.一种根据权利要求1-14任意一项所述的制备方法制备得到的含细胞的双重液滴。