CN110006975A - 一种基于afp的生物传感器及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于AFP的生物传感器及其制备方法，基于石墨烯场效应管FET的肝肿瘤甲胎蛋白AFP传感器为研究对象，通过对石墨烯表面结构/缺陷的有效调控，目的是提高石墨烯与敏感层的结合强度，提高石墨烯对AFP的选择性及传感器的稳定性，研制低成本、高灵敏、高选择性和高稳定性的石墨烯AFP传感器原型器件。本发明还可以推广至其他生物蛋白的石墨烯传感器研究之中。

Description

一种基于AFP的生物传感器及其制备方法
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于AFP的生物传感器及其制备方法。
背景技术
目前，基于石墨烯的肝癌标记物甲胎蛋白(AFP)的传感器的研究已取得一定进展。这些石墨烯AFP传感器主要利用石墨烯电化学传感原理。
例如，Huang等采用氨基功能化的石墨烯与纳米金复合物修饰碳离子液体电极，构建了检测AFP的电流型免疫传感器，其检出限为0.1ng·mL-1。类似的，Su等在石墨烯以及功能化的金纳米仿生界面上通过固定HRP与AFP的抗体(HRP-anti-AFP)的方法检测AFP，该传感器的检测范围为1.0-10ng·mL-1，检出限为0.7ng·mL-1。Wei等通过在半还原的氧化石墨烯片上修饰玻碳电极上固定AFP抗体而用于AFP的检测，它的检测范围为0.05-2.00ng·mL-1，检出限为5.77pg·mL-1。Li等制备的基于CVD石墨烯FET的肺癌标记物传感器检出限达到了0.1pg·mL-1，检测范围也达到了1pg·mL-1-1μg·mL-1，展示了更为优异的性能。蔡等利用共振光散射同时检测AFP和miRNA-122的生物传感器，其双功能免标记探针传感器对AFP和miRNA-122的检出限分别为0.94μg·L-1和98pM，尽管该方法对两种目标同时探测，提高了检测的准确性，但也限制了此方法的普适使用性。
目前的石墨烯AFP传感器、包括基于CVD石墨烯FET的AFP传感器的研究仍处于非常初级的阶段。传感器的灵敏度、稳定性、选择性等远未达到实际应用要求。基于石墨烯的AFP传感器的研究目前更多还集中在结构更简单的石墨烯电化学AFP传感器研究；另外，基于石墨烯场效应管(FET)的AFP传感器尚存以下技术难题。
CVD石墨烯难与抗体敏感层稳定结合。通常，CVD石墨烯表面不存在弱键或者不稳定的键、悬挂键、高度局域的轨道或电荷等常发生化学反应的高活性位点，石墨烯表面电子均匀分布且高度离域，这使得石墨烯表面通常呈现出化学惰性；石墨烯的化学惰性导致石墨烯难与敏感层形成稳固的结合，使得石墨烯传感器难以捕获待测生物分子或基团，从而降低其探测灵敏度。
石墨烯传感器的选择性有待提高。石墨烯的单原子层结构意味着其对外界条件的变化非常敏感，这是石墨烯传感器具有高灵敏性的主要原因。然而，一般待测样品(如血液)是包括目标蛋白在内的多种生物大分子的混合液，本征石墨烯生物传感器会同时对它们都产生不同程度的响应，即对待测分子或基团(如AFP蛋白)缺乏选择性。通常，通过对石墨烯表面进行特定官能团枝接或功能化改性，会提高石墨烯传感器对待测分子或基团的选择性。然而，这些枝接或改性通常会对石墨烯晶格结构造成破坏，极大地降低其导电性能，使传感器灵敏度降低。
石墨烯传感器的稳定性有待提高。由于石墨烯只有一个原子层，石墨烯表面特性(如表面缺陷、掺杂、官能团等表面特性)对石墨烯传感器的性能有很大影响，并且也会影响后续生物分子的功能化；石墨烯的界面特性(如石墨烯与衬底、石墨烯与金属电极、石墨烯与栅介质的界面特性)，也会影响石墨烯的电学特性，极大降低其器件的稳定性；环境介质(如空气、水分等)对石墨烯的电子结构和电学特性也会产生很大的影响。这些因素，会显著影响石墨烯传感器的工作稳定性。
因此，现有技术石墨烯材料多采用石墨烯纳米片及还原氧化石墨烯材料，虽然对AFP具有较高的响应，但其在宽线性范围、高灵敏度、高选择性、高稳定性、大面积制备和检测方法的普适迁移性上仍然存在诸多不足，CVD石墨烯难与抗体敏感层稳定结合，石墨烯传感器的选择性有待提高，石墨烯传感器的稳定性有待提高。
发明内容
本发明的目的在于：针对现有技术在宽线性范围、高灵敏度、高选择性、高稳定性、大面积制备和检测方法的普适迁移性上存在诸多不足，CVD石墨烯难与抗体敏感层稳定结合，石墨烯传感器的选择性有待提高，石墨烯传感器的稳定性有待提高的问题，本发明提供一种基于AFP的生物传感器及其制备方法。
本发明采用的技术方案如下：
一种基于AFP的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
S1.将CVD石墨烯通过湿法转移技术转移至目标基底上；
S2.通过紫外光刻技术和氧离子体刻蚀技术对石墨烯表面进行刻蚀；
S3.将S2步骤得到的石墨烯再次通过紫外光刻技术和氧离子体刻蚀技术处理，将石墨烯处理为部分的石墨烯用光刻胶保护的非缺陷区以及另一部分石墨烯未被光刻胶覆盖的图形化后暴露的缺陷区；
S4.通过电子束蒸发技术在S3步骤得到的石墨烯的两端蒸镀一层Ti/Au电极；
S5.对石墨烯的缺陷区进行功能化处理，以提高AFP抗体的接枝效率；
S6.将S5步骤功能化后的石墨烯在AFP抗体溶液中浸泡8-16h，取出吹干溶液后即得。
本发明首先采用光刻方法将转移到目标基底上的大面积连续的石墨烯进行图形化，然后利用等离子体干刻蚀方法对石墨烯表面进行刻蚀，再除去一部分光刻胶，即可得到两部分图形化后的区域。其中一部分是图形化后暴露的未被光刻胶覆盖的区域，可以对此部分进行后期处理；另一部分是被光刻胶覆盖的区域，此区域主要来用于“导电通道”。通过上述方法，可很容易地在石墨烯表面进行各种不同的图形化分区：包括不同的图形化结构、图形尺寸及图形间隔周期。用光刻胶将掩膜版的分区结构精确地复印到石墨烯表面后，石墨烯薄膜表面被分区为两部分：未被光刻胶覆盖的区域用作表面修饰的缺陷区，被光刻胶覆盖的区域用作保持石墨烯完整结构的非缺陷区。随后可制造缺陷，进一步在石墨烯图形上进行改性或修饰。最终，在石墨烯表面形成AFP抗体接枝区域和未接枝区域，接枝区域负责检测AFP抗原，未接枝区域则保留石墨烯完整的结构，从而保持良好的导电性能。
本发明将CVD石墨烯进行区域化处理，一部分用于载流子的导电通道，另一部分用于功能化后对抗原的检测，这样既保证了石墨烯的高电学性能，又保证了对抗原的检测。因此可以大幅提高抗原检测水平。
进一步地，S2步骤的具体处理方法为：先旋涂一层光刻胶，在掩膜版图形的保护下将光刻胶进行图形化，再利用氧等离子体刻蚀法刻蚀掉未被掩膜版图形保护的石墨烯，在显影液中显影后即可得到图形化的石墨烯区域。
进一步地，S3步骤的具体处理方法为：先旋涂一层光刻胶，在掩膜版图形的保护下将光刻胶进行图形化，再利用氧等离子体刻蚀法刻蚀掉未被掩膜版图形保护的石墨烯，从而在图形化的石墨烯区域表面得到部分暴露的石墨烯区域。
进一步地，S4步骤中Ti的厚度为4-6nm，Au的厚度为40-50nm。
进一步地，S4步骤中Ti的厚度为5nm，Au的厚度为45nm。
进一步地，S5步骤中功能化处理具体为，氨基功能化处理或羟基功能化处理或羧基功能化处理或氮掺杂功能化处理。
进一步地，S6步骤中将功能化后的石墨烯在环境温度为2-6℃下在1-2μg/ml的AFP抗体溶液中浸泡8-16h。
进一步地，S6步骤中将功能化后的石墨烯在环境温度为4℃下在1μg/ml的AFP抗体溶液中浸泡12h。
采用上述的方法制备得到的基于AFP的生物传感器。
进一步地，基于AFP的生物传感器的应用方法为，包括：通过在所述生物传感器表面滴加AFP抗原，测试两端电极之间的电阻变化，完成对AFP抗原的检测。
本发明后续可改变石墨烯图形化的不同结构来达到一种最优的AFP抗原检测效果。也可改变图形化石墨烯和光刻胶保护石墨烯的比例来优化检测结果。但此方法不限于对AFP抗原的检测。可以通过不同的功能化处理来固定不同的抗体类型来达到对不同的抗原进行检测。
本发明的传感器使用后可以在真空腔室中高温退火，将接枝抗体部分的石墨烯表面退火，得到洁净的表面，然后再重新接枝抗体进行检测，循环使用，大大提高了传感器的寿命。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明中，将石墨烯表面进行分区处理，将石墨烯表面图形化后分为未被光刻胶覆盖的区域和被光刻胶覆盖的区域，并在未被覆盖的区域进行修饰，一部分区域用于石墨烯的功能化，用来接枝抗体，检测抗原；另一部分区域利用石墨烯优异的电学传输特性来作为载流子通道，从而达到更优异的检测效果，因而提高了传感器的稳定性和抗干扰性；
2、本发明通过对石墨烯表面掺杂等后处理工艺，获得石墨烯表面结构及缺陷的调控方法，从而大幅度提高AFP抗体接枝效率；
3、本发明制作的生物传感器可以多次循环使用，传感器使用后可以在真空腔室中高温退火，将接枝抗体部分的石墨烯表面退火，得到洁净的表面，然后再重新接枝抗体进行检测，大大提高了传感器的寿命；
4、本发明所制作的AFP生物传感器的检测效率很高，相比于现有的AFP数小时甚至1天以上的检测时间而言，本发明的生物传感器仅需10-50min即可获得检测结果；
5、本发明由于石墨烯与敏感层的结合强度高，显著提高了石墨烯对AFP的选择性及传感器的稳定性，因而所制作的AFP生物传感器的响应速度很快，可以达到器件级的(ms、ns)响应速度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1制作的生物传感器示意图；
图2为实施例2制作的生物传感器示意图；
图3为本发明的工艺流程图；
图中标记：1-金电极，2-光刻胶，3-285nm-SiO2/n+-Si,4-石墨烯。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本发明较佳实施例提供的一种基于AFP的生物传感器，其制备步骤如下：
将石墨烯用PMMA辅助法转移到285nm-SiO2/n+-Si的目标基底上。首先用光刻刻出电极沟道，显影后再利用电子束蒸发生长50nm的金电极。然后再旋涂一层AZ5214光刻胶(旋涂速度：3000r/min，旋涂时间：30s)，在掩膜版图形的保护下将未被电极覆盖的石墨烯进行图形化，再利用氧等离子体刻蚀法(氧气流量：20sccm，刻蚀时间：20s)刻蚀掉未被掩膜版图形保护的石墨烯。最后再旋涂一层光刻胶，将石墨烯区域部分覆盖，作为导电部分。另一部分是图形化后暴露的未被光刻胶覆盖的区域，对此部分进行功能化、接枝抗体等处理，最后得到石墨烯的传感器，如图1所示。
实施例2
本发明较佳实施例提供的一种基于AFP的生物传感器，其制备步骤如下：
将石墨烯用PMMA辅助法转移到285nm-SiO2/n+-Si的目标基底上。首先用光刻刻出电极沟道，显影后再利用电子束蒸发生长50nm的金电极。然后再旋涂一层AZ5214光刻胶(旋涂速度：3000r/min，旋涂时间：30s)，在掩膜版图形的保护下将未被电极覆盖的石墨烯进行图形化，再利用氧等离子体刻蚀法(氧气流量：20sccm，刻蚀时间：20s)刻蚀掉未被掩膜版图形保护的石墨烯。最后再旋涂一层光刻胶，将石墨烯区域部分覆盖，作为导电部分。另一部分是图形化后暴露的未被光刻胶覆盖的区域，对此部分进行功能化、接枝抗体等处理，最后得到石墨烯的传感器，如图2所示。
实验例
通过在实施例1制作的生物传感器表面滴加AFP抗原，测试两端电极之间的电阻变化，完成对AFP抗原的检测。经过10组检测结果显示，测试到电阻变化，需要10-50分钟，其中7组在25-35分钟内获得检测结果，因而可知获得检测结果的速度较快，现对于现有技术需要数小时甚至1天左右的检测时间，本发明的检测效率高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于AFP的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将CVD石墨烯通过湿法转移技术转移至目标基底上；
S2.通过紫外光刻技术和氧离子体刻蚀技术对石墨烯表面进行刻蚀；
S3.将S2步骤得到的石墨烯再次通过紫外光刻技术和氧离子体刻蚀技术处理，将石墨烯处理为用光刻胶保护的非缺陷区以及未被光刻胶覆盖的图形化后暴露的缺陷区；
S4.通过电子束蒸发技术在S3步骤得到的石墨烯的两端蒸镀一层Ti/Au电极；
S5.对石墨烯的缺陷区进行功能化处理，以提高AFP抗体的接枝效率；
S6.将S5步骤功能化后的石墨烯在AFP抗体溶液中浸泡8-16h，取出吹干溶液后即得。
2.根据权利要求1所述的基于AFP的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述S2步骤的具体处理方法为：先旋涂一层光刻胶，在掩膜版图形的保护下将光刻胶进行图形化，再利用氧等离子体刻蚀法刻蚀掉未被掩膜版图形保护的石墨烯，在显影液中显影后即可得到图形化的石墨烯区域。
3.根据权利要求1所述的基于AFP的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述S3步骤的具体处理方法为：先旋涂一层光刻胶，在掩膜版图形的保护下将光刻胶进行图形化，再利用氧等离子体刻蚀法刻蚀掉未被掩膜版图形保护的石墨烯，从而在图形化的石墨烯区域表面得到部分暴露的石墨烯区域。
4.根据权利要求1所述的基于AFP的生物传感器的制备方法，其特征在于：所述S4步骤中Ti的厚度为4-6nm，Au的厚度为40-50nm。
5.根据权利要求4所述的基于AFP的生物传感器的制备方法，其特征在于：所述S4步骤中Ti的厚度为5nm，Au的厚度为45nm。
6.根据权利要求1所述的基于AFP的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述S5步骤中功能化处理具体为：氨基功能化处理或羟基功能化处理或羧基功能化处理或氮掺杂功能化处理。
7.根据权利要求1所述的基于AFP的生物传感器的制备方法，其特征在于：所述S6步骤中将功能化后的石墨烯在环境温度为2-6℃下在1-2μg/ml的AFP抗体溶液中浸泡8-16h。
8.根据权利要求5所述的基于AFP的生物传感器的制备方法，其特征在于：所述S6步骤中将功能化后的石墨烯在环境温度为4℃下在1μg/ml的AFP抗体溶液中浸泡12h。
9.采用权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的基于AFP的生物传感器。
10.根据权利要求9所述的基于AFP的生物传感器的应用方法，其特征在于，包括：通过在所述生物传感器表面滴加AFP抗原，测试两端电极之间的电阻变化，完成对AFP抗原的检测。
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