CN109996539A - N-甲基-d-天冬氨酸受体别构调节剂及其使用方法 - Google Patents

N-甲基-d-天冬氨酸受体别构调节剂及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及治疗化合物和组合物，以及其在预防或治疗神经病症中的使用方法。特别地，本发明涉及N‑甲基‑D‑天冬氨酸受体(NMDAR)别构调节剂及其在预防或治疗由NMDAR功能障碍引起或与NMDAR功能障碍有关的病症或病况中的使用方法。本发明还涉及用于鉴定NMDAR别构调节剂的方法。

Description

N-甲基-D-天冬氨酸受体别构调节剂及其使用方法
技术领域
本发明涉及治疗化合物和组合物，以及其在预防或治疗神经病症中的使用方法。特别地，本发明涉及N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)别构调节剂及其在预防或治疗由NMDAR功能障碍引起或与NMDAR功能障碍有关的病症或病况中的使用方法。本发明还涉及用于鉴定NMDAR别构调节剂的方法。
发明背景
N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)是大脑中离子型谷氨酸受体的亚家族，在介导诸如学习和记忆的大脑功能中(Tang,Y.P.等人Nature(1999)401(6748):63-69)，和在诸如阿尔茨海默病(Paoletti,P.等人Nat Rev Neurosci(2013)14(6):383-400)、亨廷顿病(Fan,M.&Raymond,L.Prog Neurobiol(2007)81(5-):272-293)和帕金森病(Schmidt,B.J.Ann NYAcad Sci(1998)860:189-202)的慢性大脑退行性疾病以及包括脑外伤(Shohami,E.&Biegon,A.CNS Neurol Disord Drug Targets(2014)13(4):567-573)和诸如脑卒中的急性脑损伤(Liu,Y.等人J Neurosci(2007)27(11):2846-2857)的病症的发病机制中具有关键作用。
脑卒中是严重长期残疾的主要原因(Mozaffarian,D.等人Circulation(2015)131(4):e29-322)。此外，所有脑卒中的87％是缺血性的，并且是由阻断血液流向大脑的血管内形成的血块引起的(Haast等人,J Cereb Blood Flow Metab(2012)32(12):2100-2107；Mozaffarian,D.等人Circulation(2015)131(4):e29-322；Zhang,Y.等人Circulation(2008)118(15):1577-1584)。这种阻断最终导致大脑功能迅速丧失，以及由细胞缺氧、程序性细胞死亡、自由基形成和不受控细胞死亡(坏死)导致的缓慢细胞死亡，这些都会对大脑产生有害影响(Northington,F.J.等人Ann Neurol(2011)69(5):743-758)。
NMDAR亚基形成异四聚体跨膜通道，其由必需的GluN1亚基(先前称为NR1)与GluN2A-D(先前称为NR2A-D)和/或GluN3(A&B)亚基的组合组成(Collingridge,G.L.等人Neuropharmacology(2009)56(1):2-5)。不同的GluN2亚基(GluN2A-D)赋予受体复合物不同的电生理学和药理学性质，并将它们与不同的信号传导机制偶联(Bliss,T.&Schoepfer,R.Science(2004)304(5673):973-974；Seeburg,P.H.Trends Neurosci(1993)16(9):359-365；Seeburg,P.H.Trends Pharmacol Sci(1993)14(8):297-303)。最近的证据表明，NMDAR在介导突触可塑性和细胞存活方面发挥着不同的功能，其取决于GluN2亚基的存在。通常，含有GluN2B的NMDAR激活细胞死亡信号传导，从而介导兴奋毒性神经元损伤，而含有GluN2A的NMDAR促进对学习、记忆和神经元存活重要的长时程增强的诱导，从而保护神经元免受兴奋毒性损伤。
NMDAR在神经元存活和死亡中的双重功能可能至少部分归因于在最近的临床试验中NMDAR调节剂缺乏成功。常规的NMDAR拮抗剂靶向表面受体，基本上阻断神经元存活-信号传导通路和神经元死亡-信号传导通路，以及受体的正常工作，引起不期望的副作用。相反，增强含有GluN2A的NMDAR可以通过特异性促进神经元存活机制保护神经元免受缺血性损伤，从而具有更少的副作用和更宽的治疗窗。
目前用于缺血性脑卒中的治疗选择已被限定在通过基于血管的治疗在脑卒中发作后通过再灌注恢复血流，或通过神经保护策略阻断导致缺血性细胞死亡的信号传导通路(Woodruff T.M.等人Mol Neurodegener(2011)6(1):11)。迄今为止，在使用受体通道的正向调节策略的NMDAR功能的药理学增强方面没有进展。
发明概述
本发明涉及调节NMDAR活性的化合物。具体地，本文鉴定的化合物显示对NMDARGluN1/GluN2A和/或GluN1/GluN2B亚型的正向调节。
在本发明的一方面，提供式1的化合物或其药学上可接受的盐，其用于在有此需要的个体中预防或治疗由NMDAR功能障碍引起或与NMDAR功能障碍有关的病症或病况，
其中
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地是H、OH、卤素、CN、NO2、NRR’、COOR、CONRR’、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C2-C6烯氧基或C2-C6炔氧基；
R15是H或C1-C6烷基；
R11是H或C1-C6烷基；
G是直接键、O、NR、S、OCR’R”、SCR’R”、NRCR’R”、NRC(O)、NRC(O)NR’、NRC(O)CR’R”或NRC(O)CR’R”O，且G以任一方向与羰基和A连接；
A是A-1
X是CR7或N；
Y是CR8或N；
R6、R7、R8、R9和R10各自独立地是H、OH、卤素、CN、NO2、NRR’、NRC(O)R14、COOR、CONRR’、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C2-C6烯氧基或C2-C6炔氧基；或R7和R8一起或者R8和R9一起可形成5-或6-元饱和的、部分不饱和的或芳香性的单环，其任选地含有1至3个选自O、N和S的杂原子；
R14是H、C1-C6烷基或任选地被一个或多个C1-C6烷基取代的C5-C10芳基；
R、R’和R”每次出现独立地是H或C1-C6烷基；且
所述烷基、烯基、炔基、烷氧基、烯氧基和炔氧基各自任选地被一个或多个选自OH和卤素的基团取代。
在本发明的另一方面，提供用于在个体中预防或治疗由NMDAR功能障碍引起或与NMDAR功能障碍有关的病症或病况的方法，其包括向个体给药预防或治疗有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐。
在本发明的再一方面，提供本发明的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于在有此需要的个体中预防或治疗由NMDAR功能障碍引起或与NMDAR功能障碍有关的病症或病况的药物中的用途。
在本发明的又一方面，提供药物组合物，其包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或辅剂。药物组合物可用于调节NMDAR活性，从而用于在有此需要的个体中预防或治疗由NMDAR功能障碍引起或与NMDAR功能障碍有关的病症或病况。
在本发明的又一方面，提供化合物，其特异性结合至N-末端结构域(NTD)中的GluN1和GluN2A亚基之间界面处的靶位点，其中所述靶位点至少由GluN1的氨基酸残基135和GluN2A的氨基酸残基79、111、115、177和178的一个或多个定义。在一些实施方案中，所述化合物特异性增强含有GluN1/GluN2A的NMDAR。
在本发明的又一方面，提供鉴定特异性增强含有GluN1/GluN2A的NMDAR的化合物的计算机辅助方法，所述方法包括以下步骤：
i)将候选化合物的结构与NTD中NMDAR受体的GluN1和GluN2A界面之间的结合口袋对接，其中所述结合口袋至少由GluN1亚基的氨基酸残基135和GluN2A亚基的氨基酸残基79、111、115、177和178的一个或多个定义，和
ii)鉴定可特异性增强含有GluN1/GluN2A的NMDAR的候选化合物。
所述方法还可包括合成或获得鉴定的候选化合物并确定化合物是否特异性增强含有GluN1/GluN2A的NMDAR。
附图简述
图1使用全细胞电压钳记录的初始筛选“命中”的化合物的增强和抑制效果。
图2在表达GluN1/GluN2A和GluN1/GluN2B NMDAR的HEK293细胞中Npam02的不同类似物的调节效果。
图3在转染GluN1/GluN2A亚基的HEK293细胞中Npam02通过直接结合增强GluN1/GluN2A介导的NMDAR电流，并且不改变GluN1/GluN2B介导的NMDAR电流。
图4在培养的海马神经元中Npam02增强神经元NMDAR功能，并且该增强效果由GluN2A拮抗剂阻断。
图5在GluN2B亚基基因缺失的皮质培养神经元中应用Npam02增强GluN2A NMDAR介导的电流。
图6在神经元培养物中Npam02不影响由AMPA和GABA诱导的电流反应。
图7Npam02的2D化学结构。
图8GluN2A F177和Q111形成NTD中NMDAR受体的GluN1和GluN2A界面之间的Npam02结合口袋。
图9在表达GluN1/GluN2A和GluN1/GluN2B NMDAR的HEK293细胞中Npam43的调节效果及其在两种表达系统中的剂量依赖性曲线。
图10降低Npam43的增强效果的N-末端结构域中GluN1/GluN2A界面处的关键氨基酸残基。
图11在表达野生型GluN1/GluN2A、突变型GluN1(L135Q)和突变型GluN1(L135Q)/GluN2A(F115S)的HEK293细胞中谷氨酸的剂量反应。
图12在培养的海马神经元中Npam43特异性靶向含有GluN2A的NMDAR。
图13在培养的海马神经元中Npam43剂量依赖性地增强NMDAR介导的电流并调节NMDA拮抗剂结合。
图14Npam43通过含有GluN1/GluN2A的NMDAR增加细胞内Ca2+。
图15在皮质神经元中Npam43增强CREB磷酸化(pCREB)，其是细胞存活信号传导激活的充分表征的指标。
图16在皮质神经元中Npam43保护免受NMDA诱导的兴奋毒性。
图17在皮质神经元中，通过增加含有GluN2A的NMDAR的激活，Npam43还保护免受非NMDA依赖的、H2O2诱导的氧化细胞毒性。
图18在海马切片中Npam43增强突触传递的GluN2A组分。
图19在海马切片中Npam43促进长时程增强(LTP)。
图20在野生型而非GluN2A敲除小鼠的海马切片的CA1神经元中Npam43增强NMDA诱导的电流。
图21在从成熟大鼠急性制备的海马切片中Npam43增加pCREB水平。
图22在成熟大鼠中IV注射后Npam43穿过血脑屏障。
图23在成熟大鼠中IV注射后的海马组织和皮质组织中Npam43增加pCREB水平。
图24Npam43体内减少小鼠缺血性脑的埂死体积。
图25Npam43减少使用长时程评估点的脑卒中后埂死体积。
图26脑卒中发生后28天体内用Npam43进行脑卒中后治疗改善行为表现。
发明详述
GluN1/GluN2A NMDAR上的新的调节结合位点
NMDAR的结构体系可以表征为具有细胞外N-末端结构域(NTD)、具有形成孔通道的反折环(M2)的三个跨膜结构域(M1、M3、M4)、由NTD之后的远端部分形成的双叶配体结合结构域(称为S1结构域)和连接M3和M4的大细胞外环(称为S2结构域)加上细胞内C-末端结构域(CTD)(Paoletti等人,2013)。
通过3D结构分析和定点突变实验，本发明人在NTD的GluN1和GluN2A亚基之间的界面处鉴定了新的别构调节结合位点。具体地，结合口袋在NMDAR受体的GluN1和GluN2A NTD之间的界面中由氨基酸残基形成，包括(但不限于)GluN1(Leu135)和GluN2A(Phe177、Pro79、Phe115、Gln111和Pro178)。适合于该口袋并与GluN1的Leu135和GluN2A的Phe177、Pro79、Phe115、Gln111或Pro178相互作用的调节剂可能能够增强NMDAR，例如，特异性增强含有GluN2A的GluN2A。
因此，在本发明的一方面，提供化合物，其特异性结合至N-末端结构域(NTD)中的GluN1和GluN2A亚基之间界面处的靶位点。
在一些实施方案中，GluN1亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO:1(UniProtKB/Swiss-Prot:P35439)中所示。在一些实施方案中，GluN2A亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO:2(UniProtKB/Swiss-Prot:Q00959)中所示。
在一些实施方案中，所述靶位点至少由GluN1的氨基酸残基135和GluN2A的氨基酸残基79、111、115、177和178的一个或多个定义。在一些优选实施方案中，所述靶位点至少由GluN1的L135和GluN2A的P79、Q111、F115、F177和P178的一个或多个定义。在一些优选实施方案中，所述靶位点至少由GluN1的L135和GluN2A的P79、Q111、F115、F177和P178定义。在一些实施方案中，所述化合物与GluN1的氨基酸残基135和GluN2A的氨基酸残基79、111、115、177和178的一个或多个相互作用。在一些实施方案中，所述化合物与GluN2A的氨基酸残基Q111和F177相互作用。在一些实施方案中，所述化合物与GluN1的氨基酸残基L135和GluN2A的氨基酸残基P79、Q111、F115、F177和P178相互作用。
在一些实施方案中，所述化合物是含有GluN1/GluN2A的N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)的别构调节剂。在一些实施方案中，所述调节剂特异性增强含有GluN1/GluN2A的NMDAR。
在本发明的另一方面，提供鉴定特异性增强含有GluN1/GluN2A的NMDAR的化合物的计算机辅助方法，所述方法包括以下步骤：
i)将候选化合物的结构与NTD中NMDAR受体的GluN1和GluN2A界面之间的结合口袋对接，其中所述结合口袋至少由GluN1亚基的氨基酸残基135和GluN2A亚基的氨基酸残基79、111、115、177和178的一个或多个定义，和
ii)鉴定可特异性增强含有GluN1/GluN2A的NMDAR的候选化合物。
在一些优选实施方案中，所述结合口袋至少由GluN1的L135和GluN2A的P79、Q111、F115、F177和P178的一个或多个定义。在一些优选实施方案中，所述结合口袋至少由GluN1的L135和GluN2A的P79、Q111、F115、F177和P178定义。
本领域已知可以通过使用计算机建模使用诸如GRAM、DOCK或AUTODOCK对接程序来鉴定底物、辅因子、拮抗剂或激动剂或别构调节剂(Dunbrack等人.1997)。计算机程序也可用于评估候选化合物对受体的吸引、排斥和位阻。
在一些实施方案中，所述方法还包括合成或获得鉴定的候选化合物并确定所述化合物是否特异性增强含有GluN1/GluN2A的NMDAR。
为了确定候选物是否特异性增强含有GluN1/GluN2A的NMDAR，可以使用本申请的工作实施例中描述的方法。
化合物
本发明还提供式1的化合物或其药学上可接受的盐，其用于在有此需要的个体中预防或治疗由NMDAR功能障碍引起或与NMDAR功能障碍有关的病症或病况，
其中
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地是H、OH、卤素、CN、NO2、NRR’、COOR、CONRR’、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C2-C6烯氧基或C2-C6炔氧基；
R15是H或C1-C6烷基；
R11是H或C1-C6烷基；
G是直接键、O、NR、S、OCR’R”、SCR’R”、NRCR’R”、NRC(O)、NRC(O)NR’、NRC(O)CR’R”或NRC(O)CR’R”O，且G以任一方向与羰基和A连接；
A是A-1
X是CR7或N；
Y是CR8或N；
R6、R7、R8、R9和R10各自独立地是H、OH、卤素、CN、NO2、NRR’、NRC(O)R14、COOR、CONRR’、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C2-C6烯氧基或C2-C6炔氧基；或R7和R8一起或者R8和R9一起可形成5-或6-元饱和的、部分不饱和的或芳香性的单环，其任选地含有1至3个选自O、N和S的杂原子；
R14是H、C1-C6烷基或任选地被一个或多个C1-C6烷基取代的C5-C10芳基；
R、R’和R”每次出现独立地是H或C1-C6烷基；且
所述烷基、烯基、炔基、烷氧基、烯氧基和炔氧基各自任选地被一个或多个选自OH和卤素的基团取代。
在优选实施方案中，G是直接键、NMeC(O)、NHC(O)CH2、NHCH2、NHC(O)CH2O或CH2C(O)NH。
在优选实施方案中，X和Y不同时是N。
在优选实施方案中，R11和R15都是H；R4是H、卤素、NO2或C2-C4烯基；R5是H或卤素；R6是H或C1-C4烷基；且R10是H、OH、卤素、NH2、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基。
在优选实施方案中，R1是H、OH、C1-C4烷氧基或C2-C4炔氧基；R2是H、OH、C1-C4烷氧基或卤素；且R3是H或OH；并且卤素代表F、Cl、Br或I，优选Cl或Br。
在优选实施方案中，R7是H、OH、卤素或C1-C4烷基；R8是H、OH、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基或NHC(O)R14，其中R14是被C1-C4烷基取代的苯基；R9是H、OH、卤素、NO2或C1-C4烷基；或R7和R8一起形成苯基；或R8和R9一起形成1,4-二氧杂环己基；并且卤素代表F、Cl、Br或I。
在一些实施方案中，本发明的化合物具有式I的结构，
其中
R1＝H、OH、OMe、OC2H2、OEt、NH2、NEt2、NHEt、NHMe、COOH、CH2OH、NMe2、NO2、CONH2；
R2＝H、OH、OMe、OEt、OtBu、OPr、Pr、Me、Et、NHMe、NHEt、NEt2、NMe2、COOH、NO2、I、tBu、CF3、OIsoPr、IsoPr、CH2OH、CN、CBr3、CCl3；
R3＝H、OH、NH2、Me、OMe、OEt、F、Cl、Br、NHMe、NHEt、Et、NEt2、NMe2、COOH、NO2、I、tBu、CF3、CH2OH、CN、CBr3、CCl3；
R4＝H、OH、NH2、OMe、OEt、F、Cl、Br、Me、CH2C2H4、NHMe、NHEt、Et、NEt2、NMe2、COOH、NO2、I、tBu、CF3、OtBu、OisoPr、IsoPr、CN、CH2OH、CBr3、CCl3；
R5＝H、OH、NH2、OMe、F、Cl、Br、Me、Et、NHMe、NHEt、NEt2、NMe2、COOH、NO2、I、tBu、CF3、CN、CH2OH、CBr3、CCl3；
R6＝H、OH、NH2、F、Cl、Br、Me、OMe、Et、OEt、NHMe、NHEt、NEt2、NMe2、COOH、NO2、I、tBu、CF3、CN、CH2OH、CBr3、CCl3；
R7＝H、OH、NH2、F、Cl、Br、Me、OMe、Et、OEt、NHMe、NHEt、NEt2、NMe2、COOH、NO2、I、tBu、CF3、CN、CH2OH、CBr3、CCl3；
R8＝H、OH、NH2、OMe、F、Cl、Br、Me、Et、OEt、NHMe、NHEt、NEt2、NMe2、COOH、NO2、I、tBu、CF3、CN、CH2OH、CBr3、CCl3；
R9＝H、OH、NH2、F、Cl、Br、Me、OMe、Et、OEt、NHMe、NHEt、NEt2、NMe2、COOH、NO2、I、tBu、CF3、CN、CH2OH、CBr3、CCl3；
R10＝H、OH、NH2、F、Cl、Br、Me、OMe、Et、OEt、NHMe、NHEt、NEt2、NMe2、COOH、NO2、I、tBu、CF3、CN、CH2OH、CCl3、CBr3；
R11＝H、Me；
R12＝(＝O)；
R15＝H、Me、Et、叔-Bu。
在一些实施方案中，本发明的化合物具有式II的结构，
其中
R1＝H、OH、OMe、OC2H2、OEt、NH2、NEt2、NHEt、NHMe、COOH、CH2OH、NMe2、NO2、CONH2；
R2＝H、OH、OMe、OEt、OtBu、OPr、Pr、Me、Et、NHMe、NHEt、NEt2、NMe2、COOH、NO2、I、tBu、CF3、OIsoPr、IsoPr、CH2OH、CN、CBr3、CCl3；
R3＝H、OH、NH2、Me、OMe、OEt、F、Cl、Br、NHMe、NHEt、Et、NEt2、NMe2、COOH、NO2、I、tBu、CF3、CH2OH、CN、CBr3、CCl3；
R4＝H、OH、NH2、OMe、OEt、F、Cl、Br、Me、CH2C2H4、NHMe、NHEt、Et、NEt2、NMe2、COOH、NO2、I、tBu、CF3、OtBu、OisoPr、IsoPr、CN、CH2OH、CBr3、CCl3；
R5＝H、OH、NH2、OMe、F、Cl、Br、Me、Et、NHMe、NHEt、NEt2、NMe2、COOH、NO2、I、tBu、CF3、CN、CH2OH、CBr3、CCl3；
R11＝H、Me；
R12＝(＝O)；
R15＝H、Me、Et、叔-Bu；
R6＝H、OH、NH2、F、Cl、Br、Me、OMe、Et、OEt、NHMe、NHEt、NEt2、NMe2、COOH、NO2、I、tBu、CF3、CN、CH2OH、CBr3、CCl3；
R7＝H、OH、NH2、F、Cl、Br、Me、OMe、Et、OEt、NHMe、NHEt、NEt2、NMe2、COOH、NO2、I、tBu、CF3、CN、CH2OH、CBr3、CCl3；
R8＝H、OH、NH2、OMe、F、Cl、Br、Me、Et、OEt、NHMe、NHEt、NEt2、NMe2、COOH、NO2、I、tBu、CF3、CN、CH2OH、CBr3、CCl3；
R9＝H、OH、NH2、F、Cl、Br、Me、OMe、Et、OEt、NHMe、NHEt、NEt2、NMe2、COOH、NO2、I、tBu、CF3、CN、CH2OH、CBr3、CCl3；
R10＝H、OH、NH2、F、Cl、Br、Me、OMe、Et、OEt、NHMe、NHEt、NEt2、NMe2、COOH、NO2、I、tBu、CF3、CN、CH2OH、CCl3、CBr3；
R15＝H、Me、Et、叔-Bu；
G9＝O、N、S。
在一些实施方案中，本发明的化合物是表A或表B中所示的化合物中的一个或多个：
表A.
表B.
本发明的化合物是NMDAR别构调节剂，并且优选是选择性含有GluN2A的NMDAR正向调节剂和/或选择性含有GluN2B的NMDAR正向调节剂。
如本文所用，以下定义是适用的。
术语“烷基”指具有指定碳原子数的支链和直链饱和脂肪烃基。除非另有说明，“烷基”指C1-C6烷基。例如，“C1-C6烷基”定义为包括具有1、2、3、4、5或6个碳以直链或支链排列的基团。例如，“C1-C6烷基”包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基和己基。
术语“烯基”指具有指定碳原子数和至少一个碳-碳双键的支链和直链烃基。在一些实施方案中，存在一个碳-碳双键，和可存在多达三个碳-碳双键。因此，“C2-C6烯基”指具有2、3、4、5或6个碳原子和1、2或3个碳-碳双键的烯基。例如，“C2-C6烯基”包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基和2-甲基丁烯基。
术语“炔基”指具有指定碳原子数和至少一个碳-碳三键的支链和直链烃基。在一些实施方案中，存在一个碳-碳三键，和可存在多达三个碳-碳三键。因此，“C2-C6炔基”指具有2、3、4、5或6个碳原子和1、2或3个碳-碳三键的炔基。例如，“C2-C6炔基”包括但不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基和3-甲基丁炔基。
术语“烷氧基”、“烯氧基”和“炔氧基”分别指上文定义的烷基、烯基和炔基但在任何可用碳原子上通过氧桥连接。因此，例如，“C1-C6烷氧基”指具有1、2、3、4、5或6个碳原子并且通过氧桥连接的烷基，包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、异丁氧基、戊氧基和己氧基。
本领域技术人员会理解，本发明的化合物中的COOH和NRR’可以分别以相应离子的形式存在，例如羧酸离子和铵离子。或者，在显示离子的情况下，本领域技术人员会理解也可存在反荷离子。
本领域技术人员会理解，基团与本文所述化合物共价连接的点可以，例如且不限于，在特定条件下断裂。特定条件可包括且不限于，例如，体内酶促或非酶促方式。基团的断裂可以，例如且不限于，自发地发生，或通过另一种剂或者物理参数或环境参数的改变而催化、诱导，例如，酶、光、酸、温度或pH。基团可以是，例如且不限于，用于掩蔽官能团的保护基团、用作一种或多种主动或被动转运机制的底物的基团或用于赋予或增强化合物的性质(例如，溶解度、生物利用度或定位)的基团。
如本文所述的化合物可以是游离形式或其盐形式。在一些实施方案中，如本文所述的化合物可以是药学上可接受的盐的形式，其是本领域已知的(Berge S.M.等人,JPharm Sci(1977)66(1):1-19)。
本文所用的药学上可接受的盐包括，例如，具有母体化合物的期望药理学活性的盐(保留母体化合物的生物有效性和/或性质且不是在生物学上和/或其他方面不期望的盐)。例如，具有一个或多个能够形成盐的官能团的本文所述化合物可以形成药学上可接受的盐。
含有一个或多个碱性官能团的化合物可能与例如药学上可接受的有机酸或无机酸形成药学上可接受的盐。药学上可接受的盐可以来自，例如且不限于，乙酸、己二酸、海藻酸、天冬氨酸、抗坏血酸、苯甲酸、苯磺酸、丁酸、肉桂酸、柠檬酸、樟脑酸、樟脑磺酸、环戊基丙酸、二乙基乙酸、二葡萄糖酸、十二烷基磺酸、乙磺酸、甲酸、富马酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、甘油磷酸、乙醇酸、半磺酸(hemisulfonic acid)、庚酸、己酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、2-羟基乙磺酸、异烟酸、乳酸、苹果酸、马来酸、丙二酸、苦杏仁酸、甲磺酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、对甲苯磺酸、烟酸、硝酸、草酸、双羟萘酸、果胶酯酸、3-苯基丙酸、磷酸、苦味酸、庚二酸、特戊酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、琥珀酸、硫酸、氨基磺酸、酒石酸、硫氰酸或十一烷酸。
含有一个或多个酸性官能团的化合物可能与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐，药学上可接受的碱例如且不限于，基于碱金属或碱土金属的无机碱，或有机碱诸如伯胺化合物、仲胺化合物、叔胺化合物、季胺化合物、取代的胺、天然存在的取代的胺、环胺或碱性离子交换树脂。药学上可接受的盐可以来自，例如且不限于，药学上可接受的金属阳离子(诸如铵、钠、钾、锂、钙、镁、铁、锌、铜、锰或铝)的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐，氨、苄星青霉素、葡甲胺、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、异丙胺、三丙胺、三丁胺、乙醇胺、二乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡碱、海巴明、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡萄糖胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、普鲁卡因、N-乙基哌啶、可可碱、四甲基铵化合物、四乙基胺化合物、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、吗啉、N-甲基吗啉、N-乙基吗啉、二环己胺、二苄胺、N,N-二苄基苯乙胺、1-二苯羟甲胺、N,N’-二苄基乙二胺或聚胺树脂。
在一些实施方案中，如本文所述的化合物可含有酸性和碱性基团，并且可以是内盐或两性离子的形式，例如且不限于，甜菜碱。
如本文所述的盐可通过本领域技术人员已知的常规方法制备，例如且不限于，通过使游离形式与有机酸或无机酸或碱反应，或通过从其它盐阴离子交换或阳离子交换。本领域技术人员会理解，盐的制备可以在化合物的分离和纯化中原位发生或者盐的制备可以通过单独反应分离和纯化的化合物发生。
在一些实施方案中，化合物及其所有不同形式(例如，游离形式、盐、多晶型物、异构形式)可以是溶剂加成形式，例如，溶剂合物。溶剂合物含有与化合物或其盐物理结合的化学计量或非化学计量的溶剂。溶剂可以是，例如且不限于，药学上可接受的溶剂。例如，当溶剂是水时形成水合物，或当溶剂是醇时形成醇化物。
在一些实施方案中，如本文所述的化合物及其所有不同形式(例如，游离形式、盐、溶剂合物、异构形式)可包括结晶形式和无定形形式，例如，多晶型物、伪多晶体、构象多晶型物、无定形形式或其组合。多晶型物包括化合物的相同元素组成的不同晶体堆积排列。多晶型物通常具有不同的X射线衍射图、红外光谱、熔点、密度、硬度、晶体形状、光学和电学性质、稳定性和/或溶解度。本领域技术人员会理解，包括重结晶溶剂、结晶速率和储存温度的各种因素可能导致单晶形式占优势。
在一些实施方案中，如本文所述的化合物及其所有不同形式(例如，游离形式、盐、溶剂合物、多晶型物)包括异构体，诸如几何异构体、基于不对称碳的光学异构体、立体异构体、互变异构体、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、外消旋体、非对映异构体混合物及其组合，并且不限于为方便起见示出的式的描述。
药物组合物和制剂
本发明提供药物组合物，其包含本文所述的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或赋形剂。药物组合物用于调节NMDAR活性，例如，特异性增强NMDAR，诸如含有GluN2A的NMDAR。
本发明的药物组合物可以以商业包装的形式提供，其包含用于使用组合物调节NMDAR活性的说明书。
药物制剂通常会包含制剂给药方式可接受的一种或多种载体、赋形剂或稀释剂，其通过注射、吸入、局部给药、灌洗或适于所选治疗的其它方式。合适的载体、赋形剂或稀释剂(本文可互换使用)是本领域已知用于这样的给药方式的那些。
合适的药物组合物可通过本领域已知的方法配制，并且由本领域技术人员确定它们的给药方式和剂量。对于肠胃外给药，可将化合物溶于无菌水或盐水或用于非水溶性化合物给药的药学上可接受的载体，诸如用于维生素K的那些。对于肠内给药，化合物可以以片剂、胶囊剂或溶于液体形式给药。片剂或胶囊剂可以是肠溶包衣的，或者是用于缓释的制剂。许多合适的制剂是已知的，包括，封装待释放的化合物的聚合物或蛋白质微粒、软膏剂、糊剂、凝胶剂、水凝胶剂或可用于外用(topically)或局部(locally)给药化合物的溶液。可以使用缓释贴剂或植入剂以提供经延长的时间段释放。本领域技术人员已知的许多技术描述于Remington:the Science&Practice of Pharmacy by Alfonso Gennaro,第20版,Lippencott Williams&Wilkins,(2000)。用于肠胃外给药的制剂可含有，例如，赋形剂、聚亚烷基二醇(诸如聚乙二醇)、植物油或氢化萘。生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物可用于控制化合物的释放。用于调节化合物的其它潜在有用的肠胃外递送系统包括乙烯乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的输注系统和脂质体。用于吸入的制剂可含有赋形剂，例如乳糖，或可以是含有例如聚氧乙烯-9-月桂醚、甘氨胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或可以是以滴鼻剂形式给药的含油溶液，或为凝胶。
如本文所述或如本文所述使用的化合物或药物组合物可以用医疗装置或器械(诸如植入物、移植物、假体、支架等)的方式给药。此外，可设计植入物旨在含有和释放这样的化合物或组合物。实例是由聚合物材料制作的植入物适用于经一段时间释放化合物。
如本文所述的药物组合物的“有效量”包括治疗有效量。“治疗有效量”指以必要剂量和时间段有效实现期望的治疗结果(诸如减少埂死大小、减少神经元损伤、改善行为表现、增加寿命或增加预期的寿命)的量。化合物的治疗有效量可根据因素诸如脑损伤或个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及化合物在个体中引发期望反应的能力而变化。
可以调整剂量方案以提供最佳治疗反应。治疗有效量也是其中治疗有益效果超过化合物的任何毒性或有害作用的量。“预防有效量”指以必要剂量和时间段有效实现期望的预防结果(减少梗死大小、减少神经元损伤、改善行为表现、增加寿命或增加预期的寿命)的量。通常，预防剂量在疾病之前或疾病早期阶段用于个体，使得预防有效量可小于治疗有效量。
应注意，剂量值可随待缓解的病况的严重程度而变化。对于任何特定个体，可以根据个体需要和给药或管理给药组合物的人的专业判断随时间调整特定剂量方案。本文所述的剂量范围仅是示例性的，并不限制可由医师选择的剂量范围。组合物中活性化合物的量可以根据因素诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重而变化。可以调整剂量方案以提供最佳治疗反应。例如，可以单次推注给药，可以随时间给药几个分开的剂量或可以根据治疗情况的紧急情况按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物以便于给药和剂量的均匀性可能是有利的。
在一些实施方案中，如本文所述的化合物及其所有不同形式，可例如且不限于，与用于选自以下的至少一种适应症的其它治疗方法组合使用：阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、脑外伤和诸如脑卒中的急性脑损伤。例如，本文所述的化合物及其所有不同形式可用作组织纤溶酶原激活剂(TPA)或其它疗法的新辅助(之前)、辅助(期间)和/或辅剂(之后)治疗。
医疗用途
本发明提供调节NMDAR活性的方法，例如，特异性增强NMDAR，诸如含有GluN2A的NMDAR，所述方法包括向哺乳动物细胞给药本文所述的化合物或其药学上可接受的盐，或本文所述的药物组合物。
或者，本发明提供调节NMDAR活性的方法，例如，特异性增强NMDAR，诸如含有GluN2A的NMDAR，所述方法包括向有此需要的个体给药本文所述的化合物或其药学上可接受的盐，或本文所述的药物组合物。
通过调节NMDAR活性，本发明的化合物和组合物可用于预防或治疗由NMDAR功能障碍引起或与NMDAR功能障碍有关的病症或病况。特别地，病症或病况可以是选自以下的至少一种：学习和记忆障碍、偏头痛、癫痫、阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、脑外伤、诸如脑卒中的急性脑损伤、精神分裂症、神经性疼痛、抑郁症和药物成瘾。例如，病症或病况是脑卒中，尤其是缺血性脑卒中。本发明的化合物和组合物还可用于改善学习、认知或记忆。
哺乳动物细胞可以是人类细胞。该细胞可以是神经元。
个体可能被怀疑患有或有患有神经病理性病况或神经退行性疾病的风险。神经病理性病况可能是急性脑损伤，包括脑卒中或创伤性脑损伤。神经退行性疾病可能是阿尔茨海默病、帕金森病或亨廷顿病或精神疾病(诸如精神分裂症、焦虑和抑郁症)。
通常，应使用本文所述的化合物而不引起实质毒性。本文所述的化合物的毒性可使用标准技术确定，例如，通过在细胞培养物或实验动物中测试并确定治疗指数，即LD50(对50％群体致死的剂量)和LD100(对100％群体致死的剂量)的比率。然而在某些情况下，诸如在严重的疾病状况下，给药实质过量的组合物可能是合适的。本文所述的一些化合物在某些浓度下可能是有毒的。滴定研究可用于确定毒性和无毒性浓度。可以通过检测跨细胞系特定化合物或组合物的特异性来评估毒性。动物研究可用于提供化合物是否对其它组织有任何作用的指示。
本文所述的化合物可向个体给药。如本文所用，“个体”可以是人类、非人灵长类、大鼠、小鼠、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫等。个体可能被怀疑患有或有患有神经退行性疾病(诸如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病或精神疾病)或神经病理性病况(诸如创伤性脑损伤或诸如脑卒中的急性脑损伤)的风险。各种神经病理性和神经退行性病况诸如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、精神疾病、创伤性脑损伤或诸如脑卒中的急性脑损伤的诊断方法是本领域普通技术人员已知的。
本文描述了本发明的各种替代实施方案和实施例。这些实施方案和实施例是说明性的，并且不应解释为限制本发明的范围。
实施例
一般方法和材料
1.计算机模拟途径(In silico pipeline)
1.1从ZINC文库中选择化合物
基于各种分子描述符从ZINC文库中筛选先导样化合物子集。然后用里宾斯基三规则(Lupinski’s rule of three)进一步筛选该先导样子集用于开发CNS化合物(Pajouhesh&Lenz,2005)，加上其它化学性质，其包括，没有羧基、没有肽键样结构、60-80A2的极性表面积并拥有至少1个氮、1个氧和1个芳香环。基于它们是否包含化学基序或已知的毒性基团筛选所有候选化合物。通过添加氢并去除次要组分(盐)、去质子化强酸和质子化强碱来最终确定所得数据库。最后，将筛选的数据库能量最小化以获得化合物在其最低能态下的三维结构。然后，最终确定的优化结构准备与GluN1/GluN2A异二聚体N-末端结构域(NTD)的间隙界面对接。
1.2同源模型
基于GluN1/GluN2B的晶体结构建立同源模型。使用类似的GluN1/GluN2B N-末端结构域(PDB代码：3QEK)的X-射线结构构建NR1/NR2A受体的大鼠NMDAR N-末端细胞外结构域的同源模型。尽管GluN1/GluN2A受体是四聚体受体，但是同源模型是在由1个GluN1亚基和1个GluN2A亚基组成的一个二聚体上进行。GluN2A和GluN2B的NTD在序列比对中显示72％的序列一致性和82％的同源性。
1.3用于含有GluN1/GluN2A的NMDAR的选择性调节剂的虚拟筛选(对接)
使用先前描述的基于一致性的计算机模拟方法(Axerio-Cilies等人,2011；Lack等人,2011)，本发明人对从先导样ZINC化学库(Irwin&Shoichet,2005)中预筛选的200,000种可购买的化学物质进行虚拟筛选(Axerio-Cilies等人,2009；Pajouhesh&Lenz,2005)以鉴定可能能够对含有GluN1/GluN2A的NMDAR进行正向别构调节(PAM)的特异性结合物。编辑该多参数方法的各阶段的结果，并使用一致性评分程序对化合物进行分级。对～10,000个排名最高的化合物进行构想，并选出预测对GluN1/GluN2A界面具有高结合潜力的200个初始候选物用于实证测试。
1.4类似物搜索
进行类似物搜索以获得大量化学物质，从中产生构效关系(SAR)。使用活性化合物(Npam02)作为模板/查询使用基于分子指纹的相似性搜索来搜索化学物质数据库。如果分子中存在特征，则该位(bit)设置为“1”，如果特征不存在，则该位设置为“0”，从而为每个化学结构形成独特且唯一的指纹特征。通过比较分子的位串并量化为Tanimoto系数(Tc)来鉴定两个分子之间的相似性(Bajusz,Racz,&Heberger,2015)。在搜索中产生的化合物与在计算机模拟中设计的化学合成的化合物组合产生化合物列表，可以通过皮质神经元中的全细胞电压钳记录来测试以产生SAR。
1.5 Npam化合物的化学合成
通过使适当的取代的苯甲醛与适当的取代的酰肼反应，或通过使适当的取代的苯甲醛与肼反应，然后使产物与适当的酰卤反应来进行Npam化合物的化学合成。进行质子核磁共振1H-NMR和电喷雾质谱(ESI-MS)以验证各化合物的结构和纯度。
5.1 Npam 43的合成
步骤I：2,3-二氯-5-乙氧基-6-羟基-苯甲醛(Int-1)
将2-羟基-3-乙氧基苯甲醛(1.0g,5.2mmol)溶解在乙酸(20mL)中并将N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)(1.4g,11mmol)一次全部加入。将反应混合物在80℃下搅拌过夜，然后冷却至室温。然后加入水和CH2Cl2，分离各相，水相进一步用CH2Cl2萃取，经MgSO4干燥并真空蒸发。通过快速色谱(CH2Cl2/己烷)纯化粗产物，得到纯产物(1.2g,89％)，为黄色固体。
步骤II：(E)-2-溴-N’-(2,3-二氯-5-乙氧基-6-羟基亚苄基)苯甲酰肼(Npam43)
将等摩尔量的2-溴苯甲酰肼(0.30mmol)和Int-1(0.30mmol)溶解在THF(0.5M溶液)中。加入2当量的MgSO4并加热回流1小时。产物可能沉淀。如果没有沉淀，则通过TLC或NMR检查反应以确定Int-1的消耗。如果产物沉淀，则通过过滤回收并用水(2×2ml)洗涤以除去残留的MgSO4。如果产物没有沉淀，则将反应混合物用水稀释直至产物沉淀。用稀释的HCl将混合物酸化至pH 3以除去残留的肼并过滤，如果需要，将其重结晶。该化合物是高熔点固体(熔点210-212℃)。避免了提取。如果没有观察到沉淀，则将溶剂真空蒸发，并通过快速柱色谱法纯化化合物。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝12.59(s,1H),10.41(s,1H),8.89(s,1H),7.61-7.34(m,4H),7.08(s,1H),4.11(q,J＝6.9Hz,2H),1.41(t,J＝7.0Hz,3H)。
MS(EI):(C16H13BrCl2N2O3+H)+计算值为433.0，测量值为433.0；(C16H13BrCl2N2O3+Na)计算值455.0，测量值为455.0。
5.2其它Npam化合物的合成
以下化合物以类似的方式合成。
2.化合物的体外鉴定
2.1 HEK293细胞培养和质粒转染
用pcDNA3-CMV表达载体的组合转染细胞，每种载体表达一种大鼠重组体(GluN2AWT,GluN1WT,GluN2BWT)亚基。通过自动DNA测序确认所有质粒的序列。将人胚肾293(HEK293细胞)在补充有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(Invitrogen)中培养。当HEK293细胞达到90％汇合时，根据制造商的说明书使用Lipofectamine 2000(Invitrogen,11668019)将GluN1&GluN2A或GluN1&GluN2B其一的质粒共转染到细胞中。然后将HEK293细胞在具有95％O2和5％CO2的37℃培养箱中维持48小时，之后用于实验。NMDAR亚基组合的转染比率均为1:1(GluN1/GluN2A或GluN1/GluN2B)。
2.2皮质神经元的原代培养
如前所述从18日龄的Sprague Dawley大鼠胚胎制备大鼠皮质神经元的解离培养物。为了获得富含神经元的混合皮质培养物，在体外第三天(DIV)将尿苷(10μM)和5-氟-2'-脱氧尿苷(10μM)加入培养基中，在培养返回正常培养基之前维持48小时以抑制非神经元细胞增殖。使用成熟的神经元(11-14 DIV)进行实验。使用来自杂合子GluN2A+/-或GluN2B+/-交配的胎仔(litter)的交配后18天的胚胎制备小鼠皮质培养物。为了获得纯合和野生型(WT)同窝胎仔对照神经元培养物，将来自单个胚胎的皮质细胞分别铺板。如前所述使用从各胚胎收集的尾部样品进行基因型分型。为了诱导神经元的凋亡，用NMDA(50μM)和甘氨酸(10μM)刺激皮质培养物20分钟，或在含有以下(以mM计)的无Mg2+细胞外溶液(ECS)中用STS(100nM)刺激1小时：25HEPES酸、140NaCl、33葡萄糖、5.4KCl和1.3 CaCl2，pH 7.35，渗量320-330mOsm。通过在无Mg2+ECS中在荷包牡丹碱存在下用(+)-5-甲基-10,11-二氢-5H-二苯并[a,d]环庚烯-5,10-亚胺马来酸盐(MK-801)(10μM)处理10-15分钟，然后用含有1mMMgCl2(正常ECS)的ECS彻底洗涤以除去任何痕量的MK-801来实现突触NMDA受体的特异性阻断。将GluN2A-特异的拮抗剂NVP-AAM077(0.4μM；来自YP Auberson,Novartis Pharma AG,Basel,Switzerland的馈赠)或GluN2B-特异的拮抗剂Ro 25-6981(0.5μM)在处理之前10分钟和整个处理中加入到灌流(bath)培养基中。
2.3体外电生理学
使用Axopatch 200B或1D膜片钳放大器(Molecular Devices)在电压钳模式下进行全细胞膜片钳记录。除非另外指明，否则以-60mV的保持的电压记录全细胞电流，并且在2kHz过滤信号，在10kHz数字化(Digidata 1322A)。用含有以下(mM)的细胞内溶液填充记录移液管(3-5MΩ)：CsCl 140、HEPES 10、Mg-ATP 4、QX-314 5、pH 7.20；渗量，290-295mOsm。在细胞内溶液中加入BAPTA(10mM)(除非另有说明)。用含有以下(mM)的细胞外溶液连续灌流盖玻片：NaCl 140、KCl 5.4、HEPES 10、CaCl2 1.3、葡萄糖20、pH 7.4；渗量，305-315mOsm。由NMDA通过灌注快速步骤实施NMDA诱导的电流(Warner Instruments)。通过灌注快速步骤系统，通过使用双方形桶玻璃管实现NMDA应用，并根据培养的神经元的年龄，向细胞外溶液中添加CNQX(10μM)、TTX(0.5μM)或BIC(10μM)以分别最小化离子型谷氨酸受体和电压门控钠通道的激活。所有实验均在室温下进行。对所有活性化合物进行来自至少六个HEK293细胞/神经元的记录。将HEK293细胞或原代神经元的数据汇集，并通过以下方程拟合复合的剂量-反应数据：反应百分比＝100×相对效力/[1+(EC50/浓度)nH]，其中EC50是产生半数最大反应的激动剂浓度，相对效力是相对于谷氨酸的最大反应的在最大有效浓度下的反应，nH是Hill斜率。
2.4离体电生理学
使用Axopatch 200B或1D膜片钳放大器(Molecular Devices)在电压钳模式下进行全细胞膜片钳记录。除非另外指明，以-60mV的保持的电压记录全细胞电流，并且在2kHz过滤信号，在10kHz数字化(Digidata 1322A)。用含有以下(mM)的细胞内溶液填充记录移液管(3-5MΩ)：CsCl 140、HEPES 10、Mg-ATP 4、QX-314 5、pH 7.20；渗量，290-295mOsm。在细胞内溶液中加入BAPTA(10mM)(除非另有说明)。用含有以下(mM)的细胞外溶液连续灌流盖玻片：NaCl 140、KCl 5.4、HEPES 10、CaCl21.3、葡萄糖20、pH 7.4；渗量，305-315mOsm。由NMDA、GABA、AMPA其一通过灌注快速步骤实施NMDA、GABA或AMPA诱导的电流(WarnerInstruments)。通过灌注快速步骤系统，通过使用双方形桶玻璃管实现NMDA、GABA、AMPA应用，并根据培养的神经元的年龄，向细胞外溶液中添加CNQX(10μM)和TTX(0.5μM)以分别最小化离子型谷氨酸受体和电压门控钠通道的激活。所有实验均在室温下进行。对所有活性化合物进行来自至少六个HEK293细胞/神经元的记录。将HEK293细胞或原代神经元的数据汇集，并通过以下方程拟合复合的剂量-反应数据：反应百分比＝100×相对效力/[1+(EC50/浓度)nH]，其中EC50是产生半数最大反应的激动剂浓度，相对效力是相对于谷氨酸的最大反应的在最大有效浓度下的反应，nH是Hill斜率。
2.5切片记录
6-8周龄的C57/B16小鼠或大鼠经历颈椎脱位然后断头。将脑立即转移到冰冷的基于NMDG的由以下组成的切削液中：(以mM计)：120 NMDG、2.5 KCl、1.2 NaH2PO4、25 NaHCO3、1.0 CaCl2、7.0 MgCl2、2.4丙酮酸钠、1.3抗坏血酸钠、20 D-葡萄糖，并用HCl酸将pH调节至7.35(除非说明，否则所有化学物质和药物均购自Sigma或BioShop，加拿大)。解剖出海马体，并使用手动组织切片机(Stoelting,Wood Dale,IL,美国)获得横向海马切片(400μm)。切片在含有由以下组成(以mM计)的ACSF的加热(30℃)的培养室中恢复1小时：124 NaCl、3KCl、1.25 NaH2PO4、1 MgSO47H2O、2 CaCl2、26 NaHCO3和15 D-葡萄糖，其用卡波金(95％O2/5％CO2)连续鼓泡(pH至7.3)。室温下再过30分钟后，将切片转移到浸没的记录室中，并用卡波金化的ACSF连续灌注(2-3ml/min)。使用具有MutiClamp 700B放大器的“盲”方法进行CA1锥体神经元的全细胞记录。通过刺激SC通路引发EPSC(兴奋性突触后电流)。为了分离NMDAR电流，细胞在+40mV被电压钳。用含有以下(以mM计)的溶液填充记录移液管：122.5甲磺酸铯、17.5 CsCl、2 MgCl2、10 EGTA、10 HEPES、4 ATP(K)和5 OX-314，并通过CsOH调节pH至7.2。用甲碘荷包牡丹碱(10μM；Abcam)阻断GABA受体介导的抑制性突触电流和用CNQX(10μM；Abcam)阻断AMPAR介导的电流以进一步分离NMDAR电流。为了特异性分离NMDAR电流的NR2A和NR2B组分，加入NVP或艾芬地尔以分别抑制这些受体。通过到实验结束应用APV确认由NMDAR进行的残余突触电流的确认。使用WinLTP记录和分析EPSC。使用GraphPad InStat完成统计分析。进行比较对各种药物鸡尾酒疗法(cocktail)的反应的NMDAR电流的ANOVA和图基事后检验法以确定治疗之间的差异。统计显著性设定为p<0.05，n＝细胞数。数据表示为平均值±SEM。对于细胞外记录(fEPSP)切片条件与全细胞制备相似。将刺激电极置于SC通路中，记录电极置于CA1中的辐射层。使用WinLTP获取并分析记录。测量fEPSP的初始斜率以量化突触强度(Johnston和Wu,1995)。使用学生t-检验进行组间平均fEPSP斜率的统计学比较。所有数值显示为平均值±SEM，n＝切片数。
2.6离体电生理学(GluN2A-敲除小鼠)
使用异氟烷麻醉20-25日龄的雄性和雌性野生型或GluN2A KO小鼠并快速断头。取出脑并在冷(2-4℃)的含有以下的切削液中浸没30秒：92mM NMDG、2.5mM KCl、1.25mMNaH2PO4、30mM NaHCO3、20mM HEPES、4.5mM D-葡萄糖、5mM抗坏血酸钠、3mM丙酮酸钠、0.5mMCaCl2和10mM MgCl2。将脑在融化的3％琼脂-A(CAS#9002-18-0,Bio Basic Canada Inc.)中封闭，然后胶合到切片平台上并用含有冷(2-4℃)气泡(95％O2/5％CO2)切削液的振动切片机(Leica VT 1000S)以320μm厚度冠状切片。将包括前额皮质的切片转移到连续卡波金化预热(32-34℃)的切削液中12分钟时间以进行初始恢复。然后在记录前将切片转移到室温卡波金化的含有以下的保持溶液中至少恢复30分钟：119mM NaCl、2.5mM KCl、1.2mMNaH2PO4、24mM NaHCO3、12.5mM D-葡萄糖、5mM抗坏血酸钠、3mM丙酮酸钠、2mM CaCl2和2mMMgCl2。
2.7 GluN2A-敲除的小鼠
具有C57BL/6J背景的野生型(WT)和GluN2A敲除(GluN2A-/-)小鼠(Sakimura等人,1995；Townsend等人,2003)以群体饲养在标准笼中(每笼2-3只小鼠，最小富集)，维持在21℃。将动物维持在12小时光照/黑暗循环中，随意获取食物和水。各样品(2μL DNA)在由以下组成的PCR主混合物中孵育：14.85μL无核酸酶H2O、2.5μL 10％PE反应缓冲液、1.4μL(50mM)MgCl2、2.0μL(2.5mM)dNTP、0.5μL NR2A1引物、1.0μL NR2A3引物、0.5μL Neo2A引物和0.25μL(5U/μL)Taq DNA聚合酶(Invitrogen Canada；Burlington,Ontario,Canada)。使用的循环参数如下：第一循环在94℃下4分钟，然后以94℃下30秒、60℃下40秒和72℃下60秒进行29个循环。将样品置于72℃下7分钟，然后在4℃下储存直至使用。使用的引物是NR2A1(5'-TCTGGG GCC TGG TCT TCA ACA ATT CTG TGC-3')，NR2A3(5'-CCC GTT AGC CCG TTG AGT CACCCC T-3')和Neo2A(5'-GCC TGC TTG CCG AAT ATC ATG GTG GAA AAT-3')(InvitrogenCanada；Burlington,Ontario,Canada)。PCR产物在具有SYBR-安全的1.5％琼脂糖凝胶上运行，并使用透射照明器显现。
2.8脑切片制备(GluN2A-敲除小鼠)
使用异氟烷麻醉20-25日龄的雄性和雌性野生型或GluN2A KO小鼠并快速断头。取出脑并在冷(2-4℃)的含有以下的切削液中浸没30秒：92mM NMDG、2.5mM KCl、1.25mMNaH2PO4、30mM NaHCO3、20mM HEPES、4.5mM D-葡萄糖、5mM抗坏血酸钠、3mM丙酮酸钠、0.5mMCaCl2和10mM MgCl2。将脑在融化的3％琼脂-A(CAS#9002-18-0,Bio Basic Canada Inc.)中封闭，然后胶合到切片平台上并用含有冷(2-4℃)气泡(95％O2/5％CO2)切削液的振动切片机(Leica VT 1000S)以320μm厚度冠状切片。将包括前额皮质的切片转移到连续卡波金化预热(32-34℃)的切削液中12分钟时间以进行初始恢复。然后在记录前将切片转移到室温卡波金化的含有以下的保持溶液中至少恢复30分钟：119mM NaCl、2.5mM KCl、1.2mMNaH2PO4、24mM NaHCO3、12.5mM D-葡萄糖、5mM抗坏血酸钠、3mM丙酮酸钠、2mM CaCl2和2mMMgCl2。
2.9用pCREB制备用于免疫印迹的海马切片
将4-8周龄(125-200gm)的雄性Sprague Dawley大鼠断头，将其脑迅速解剖并置于冰冷的切削盐水中[含有(以mM计)：110蔗糖、60NaCl、3KCl、1.25NaH2PO4、28NaHCO3、5D-葡萄糖、0.5CaCl2、7MgCl2和0.6抗坏血酸盐，用95％O2/5％CO2饱和]。然后用Vibratome Series1000(Pelco,Ted Pella,Redding,CA)制备400μm横向切片。将切片立即转移到1:1的切削盐水和正常ACSF[含有(以mM)计：125 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、25 NaHCO3、10 D-葡萄糖、2 CaCl2和1 MgCl2，用95％O2/5％CO2饱和]的混合液中，并在室温下维持至少90分钟。然后在药理学刺激之前将切片转移至在浸没室中在32℃下的ACSF 45-60分钟。
2.10电生理学方法(GluN2A-敲除小鼠)
将脑切片转移到立式Nikon FN1显微镜上的记录室中，并将该室用含有以下的32℃的卡波金化aCSF记录溶液连续灌注：121.85mM NaCl、2.5mM KCl、1.2mM NaH2PO4、24mMNaHCO3、12.5mM D-葡萄糖、5mM抗坏血酸钠、3mM丙酮酸钠、2mM CaCl2、0.1mM MgCl2。通过使用CFI APO 40X W NIR物镜(0.80数值孔径，3.5mm工作距离)的视频监测红外差分干涉对比照明显微镜在前额皮质的层V中鉴定椎体神经元。使用具有5-8MΩ电阻的膜片移液管进行全细胞膜片钳记录。记录移液管由硼硅酸盐玻璃毛细管(1B150F-4,WPI,USA)制备，并填充含有以下的移液管溶液(280-290mosM,pH 7.4)：135mM CsMeSO4、0.6mM EGTA、10mM HEPES、2.5mM MgCl2、5mM磷酸盐Tris、3mM Mg-ATP、0.2mM GTP Tris和5mM QX314氯化物。电流信号的电压钳记录用MultiClamp 700B放大器(Molecular Devices)放大，在4kHz低通过滤，用Digidata 1440A数据采集系统(Molecular Devices)在10kHz采样，并使用pCLAMP 10.2采集软件记录(Molecular Devices)。将细胞用液体接界电位校正保持在-65mV，并将串联电阻校正40％。
2.11定点突变
通过使用QuikChange方法(Stratagene)进行GluN1或GluN2A亚基定点突变。通过DNA测序确认所有突变克隆。在HEK293细胞中转染野生型或突变体亚基并进行电生理学检测。用pcDNA3-CMV表达载体的组合转染细胞，每种载体表达大鼠重组体(GluN2AWT，GluN1WT，GluN2BWT)亚基之一。共转染增强的绿色荧光蛋白(GFP)pcDNA3-GFP以促进显微镜观察。使用PFU DNA聚合酶通过GluN1WT和GluN2AWT的定点突变构建GluN2AA108G、GluN2AP79A、GluN2AP178G、GluN2AQ111A、GluN2AF115Y、GluN2AF115S、GluN2AF177S、GluN2AI176Y、GluN2AM112I、GluN1R115E、GluN1L135Q质粒。通过自动DNA测序确认所有质粒的序列。
2.12使用Ca2+敏感染料测量大鼠皮质培养物中的Ca2+
将从整个皮质分离的大鼠神经元接种到聚-d-赖氨酸覆盖的96孔板上。培养12-14天后，根据制造商的指南(Thermo Fisher Scientific)，使用Fluo-4No Wash钙测定试剂盒测定细胞内钙的水平。简而言之，去除神经元培养基并用含有1×HBSS、20mM HEPES、2.5mM丙磺舒和Fluo4-NW染料混合物(pH 7.4；Thermo Fisher Scientific)的钙测定缓冲液(CAB)代替。然后将细胞在37℃孵育45分钟以加载染料，然后在25℃下孵育15分钟。为了分离由NMDAR介导的钙信号，使用NMDA作为激动剂(10μM)，并添加2μM甘氨酸。用拮抗剂NVP-AAM007阻断GluN1/GluN2A NMDAR。用FLEXStation II台式扫描荧光计(MolecularDevices)记录60秒后，在25℃下进行钙荧光测量；然后，在180秒加入NMDAR激动剂NMDA(10μM)/甘氨酸(2μM)。使用485nM的激发、538nM的发射和530nM的截止连续荧光板读数总共30分钟。用SoftMax Pro软件(Molecular Devices)记录数据。
2.13乳酸脱氢酶测定
乳酸脱氢酶(LDH)是细胞质酶，可将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)转化为NADH(还原形式)。当质膜完整性受损时，LDH从细胞释放到培养基中。因此，释放的LDH的量代表细胞死亡程度。在该研究中，使用获自Sigma-Aldrich(no.TOX-7)的体外毒理学测定试剂盒测量细胞外LDH水平。该LDH测定的基础如下：(1)LDH将NAD还原为NADH，(2)然后将所得NADH用于四氮唑染料的化学计量转化，和(3)通过分光光度微板读数器在490nm波长处测量所得的有色化合物。细胞死亡率表示为处理组的吸光度与对照组的吸光度之间的比率(％)。
2.14免疫印迹
将脑组织或培养的细胞在裂解缓冲液中在冰上裂解，然后将溶液在4℃下以14,000rpm离心10分钟。接着，收集上清液并用BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Scientific,23227)测定蛋白质浓度。将等量的蛋白质样品与4倍样品缓冲液混合，在100℃煮沸5分钟，并在10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分离。然后将蛋白质转移至Immobilon-PTM聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad,162-0177)。将膜用含有0.1％Tween-20(TBST)的5％脱脂乳的Tris缓冲盐水在室温下封闭1小时，然后在4℃下用一抗孵育过夜。在TBST中洗涤3×5分钟后，使用ECL Western印迹底物(Pierce,32016)在Bio-Rad成像仪中观察蛋白质。为了检测磷酸化-CREB，使用同一天制备的样品。将聚偏二氟乙烯膜(Millipore,Bedford,MA,USA)与抗磷酸化-CREB(Ser133)的一抗(Cell Signaling Technology,Beverly,MA)一起孵育。为了检测总CREB，剥离相同的聚偏二氟乙烯膜并用抗总CREB的一抗(Cell Signaling Technology)重新探测。通过Bio-Rad Quantity One软件定量各蛋白质的条带密度，并分析相对于在相同膜上上样的总CREB的相对光密度。
2.15兴奋毒性测定
用Npam43处理皮质培养物，并通过测量乳酸脱氢酶(LDH)释放评估在20-24小时后NMDA诱导的兴奋毒性。简而言之，用75μM NMDA处理细胞1.5小时，之后，用新鲜神经基础培养基洗涤神经元一次，并用条件培养基更换培养基。使用获自Sigma-Aldrich(no.TOX-7)的体外毒理学测定试剂盒测量LDH释放。细胞死亡率表示为处理组的吸光度与对照组的吸光度之间的比率(％)。
2.16 H2O2细胞毒性测定
将培养的皮质神经元暴露于600μM H2O2中1小时以诱导神经元细胞死亡。为了显示Npam43对GluN1/GluN2A NMDAR的选择性，用GluN1/GluN2B选择性拮抗剂艾芬地尔(3μM)或者GluN1/GluN2B选择性拮抗剂NVP-AAM077(0.2μM)和TCN-201(10μM)处理神经元。
2.17试剂。用NaH2PO4.2H2O和Na2HPO4.12H2O制备磷酸盐缓冲溶液，通过改变NaH2PO4.2H2O与Na2HPO4.12H2O的摩尔比来调节其pH。其它使用的化学物质具有分析级或更好的质量，并且在整个实验中使用Milli-Q超纯水(>18MU cm)。
2.18仪表和色谱条件。使用高效液相色谱法从CSF和血清基质分离Npam43，并通过电化学检测进行定量。该系统由ESA 582泵(Bedford,MA)、脉冲阻尼器(ScientificSystems Inc.,State College,PA)、Rheodyne Inert手动进样器(型号9125i,20μL进样环；Rohnert Park,CA)、Tosoh Bioscience Super ODS TSK柱(2μm颗粒，2mm×10mm；Montgomeryville，PA)和带有VT-03流通池和Ag/AgCl参比电极的Antec Leyden IntroElectrochemical检测器(V施加＝+800mV；Leyden,The Netherlands)组成。流动相是20mM磷酸盐缓冲液-乙腈(80:20,v/v)混合物，pH 7.0，以0.1mL/min流过该系统。在整个分析中将柱维持在40℃，进样体积为8μL。在使用之前，将流动相通过0.22mm膜过滤和使用真空泵脱气并在实验测试期间保持在氦气吹扫下。使用EZChrome Elite软件(ScientificSoftware,Pleasanton,CA)获取并分析色谱数据。
2.19样品制备
通过将样本与乙腈的等分试样(50:50)混合制备样品。将样品混合，在环境温度下静置10分钟并以5000g离心5分钟。进样8微升上清液。
2.20 CSF和血清提取以及HPLC-ECD分析
将体内研究产生的CSF和血清样品解冻，并将8μl转移到单独的Eppendorf管中。然后加入2μl的0.5μg/ml的Npam50内标(IS)，接着加入22μl的乙腈，其后将样品涡旋5-10秒并在20,000×g下离心5分钟以将沉淀的蛋白质沉积。将澄清的上清液转移至HPLC小瓶中进行分析。使用空白大鼠csf和血清以类似方式制备标准品。使用最优级(Fisher Scientific)溶剂和18MΩ水(Millipore)进行样品制备和随后的HPLC-ECD分析。校准标准品为0.1-50μM(6个点，csf相等水平)，R2>0.99。检测限为>0.8μM的Npam43。加标前和加标后血清与纯标准品比较表明约10％的抑制和95％的提取效率。将校准范围外的任何样品稀释10倍用于重新分析。
3.化合物的体内分析
3.1脑缺血
将体重约200g的成年雄性Sprague Dawley大鼠麻醉，通过在颧骨和鳞骨的前交界尖向1mm处进行开颅窗口(直径2mm)暴露大脑中动脉(MCA)。我们使用缝线结扎方法实现三血管阻塞。使用10-0尼龙缝线将暴露的MCA用方结结扎。接下来，用非创伤性动脉夹夹住双侧颈总动脉(CCA)。通过激光多普勒血流仪(PF-5010,Periflux system；Perimed AB)监测的局部脑血流量显著下降证实了手术的成功。在缺血90分钟后，移除缝线和夹子以允许立即再灌注。将实验大鼠细分组以通过股静脉注射接受不同剂量的Npam43或盐水/载体(如指定的)。使用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)评估染色脑切片中的埂死大小。在脑卒中发作后3.5小时施用Npam43和盐水/载体的推注。为了达到最佳结果，分别在第二天和第三天施用另外两剂Npam43。然后允许大鼠恢复不同的时间直至另外的实验。
3.2磁共振成像
将大鼠麻醉，在成像期间用加热垫将体温维持在37.0±0.5℃。通过3.0T通用电子成像系统(R4,GE)进行T2加权自旋回波成像序列(T2WI)，具有以下参数：重复时间，4000ms；回波时间，105ms；6-8个连续冠状切片，每个厚2mm。在脑卒中发展的这个阶段(缺血后7天)，脑梗死在磁共振成像(MRI)图像上表现为高信号(亮白色)。从切片到切片手动绘制非梗死区域，并用Voxtool分析软件(General Electric)测量体积。通过从对侧半球的总体积中减去缺血半球的非埂死体积来定量埂死大小。
3.3神经行为测试
为了评估由缺血性损伤损坏的神经回路的功能恢复，测试了三种运动活动(感觉运动)缺陷模式：1)垂直活动(在垂直传感器中发生的光束中断的总数)；2)垂直运动的数量(动物后腿直立的数量)；3)使用VersaMax动物活动监测仪(Accuscan Instruments)的垂直运动时间(动物后腿直立的时间量，以秒计)。在昼/夜循环的“黑暗”阶段期间将缺血性大鼠置于记录室中，并通过计算机经2小时自动记录垂直运动时间(秒)。垂直运动的总长度表示由缺血性脑卒中损伤的运动回路的恢复。
实施例1正向别构调节剂的鉴定
GluN1/GluN2A NMDAR亚型是正向别构调节剂的有吸引力的靶标。本发明人采用计算机模拟药物发现方法对来自ZINC数据库(Irwin,J.等人Abstr Pap Am Chem Soc(2005)230:U1009)和一些合成化合物的可购买的先导样化合物进行虚拟筛选以鉴定潜在的GluN1/GluN2A-NMDAR调节剂。计算机模拟方法包括针对GluN1/GluN2A异二聚体的间隙界面的大规模对接，以及对选择用于实证测试的化合物的一致性评分。通过使用在人胚肾(HEK293)细胞中瞬时转染的GluN1/GluN2A进一步筛选候选化合物，并通过全细胞膜片钳记录测试。
表1显示被鉴定为对GluN1/GluN2A NMDAR具有正向调节效果的合成的和ZINC数据库的化合物。
表1.合成的(syn)化合物和来自ZINC数据库的化合物的增强效果
实施例2选择性增强含有GluN1/GluN2A的NMDAR的调节剂的鉴定
本发明人使用瞬时转染的表达GluN1/GluN2A或GluN1/GluN2B的NMDAR的HEK293细胞，并通过全细胞电压膜片钳记录测试以观察所选化合物是否控制药物的亚型选择性特征。
表2示出了显示对GluN1/GluN2A NMDAR的正向调节和/或对GluN1/GluN2B NMDAR的抑制效果的一些鉴定的化合物。图1使用全细胞膜片电生理学记录的数据显示几种Npam化合物对NMDAR介导的电流的各种调节效果。图1证明Npam化合物可对重组GluN1/GluN2ANMDAR具有正向增强效果和/或对GluN1/GluN2B NMDAR具有抑制效果，和/或对GluN1/GluN2B NMDAR几乎没有至没有效果。
表2.在第一筛选中鉴定的命中化合物显示对GluN1/GluN2A NMDAR的正向调节和/或对GluN1/GluN2B NMDAR的抑制。
*:50μM
**:25μM
图2证明在所选的Npam化合物存在下含有GluN1/GluN2A的NMDAR的选择性增强。图2证明，Npam02、Npam58、Npam72和Npam43与Npam01、Npam04、Npam59相比对GluN1/GluN2ANMDAR是选择性的。
将选择性增强含有GluN1/GluN2A的NMDAR的两种化合物Npam02和Npam43进行进一步研究。Npam43是通过基于Npam02的构效关系(SAR)研究获得的。
实施例3 Npam02的特征
3.1评估Npam02在用GluN1/GluN2A或GluN1/GluN2B转染的HEK293细胞中的增强效果
进行全细胞膜片钳记录以在-60mV的保持电压下用基于氯化物的移液管溶液测量谷氨酸引起的电流。
为了排除Npam02本身可能在表达GluN1/GluN2A或GluN1/GluN2B的HEK293细胞中诱导任何电流的可能性，单独施用Npam02(100μM)，向内或向外电流没有变化(图3a,d)。与单独施用谷氨酸相比(图3a,d)，共同施用Npam02(100μM)和协同激动剂适度增强表达GluN1/GluN2A受体的HEK293细胞中NMDA介导的电流(100μM；n＝6；38.85±3.70％；P<0.001；和200μM；n＝6；71.69±5.03％；P<0.001)(图3b,d)。在两种协同激动剂存在下，通过共同施用选择性GluN1/GluN2A拮抗剂NVP-AAM007(0.2μM)可完全阻断增加的NMDAR电流，证实在HEK293细胞中没有归因于内源蛋白质的继发效应(图3a,d)。相反，在Npam02(100μM)存在下表达GluN1/GluN2B组合的HEK293细胞没有展现出NMDAR电流增强(图3c,e)。类似的，Npam02本身不诱导电流，归因于GluN1/GluN2B受体的NMDAR电流被GluN2B特异性拮抗剂艾芬地尔(IF；3μM)成功阻断(图3c,e)。
3.2使用全细胞电压钳记录评估Npam02在成熟皮质野生型和GluN2B-缺失神经元中的增强效果
为了测试化合物是否可以在GluN2A受体高表达时的成熟的14-18日龄皮质神经元中增强NMDAR，本发明人使用NVP-AAM007(较低浓度下的选择性GluN1/GluN2A拮抗剂)来阻断含有GluN1/GluN2A的受体。如图4a中所示，在海马神经元中协同激动剂NMDA(5uM)和甘氨酸(2μM)存在下，灌流应用Npam02(100μM)适度调节NMDAR电流(n＝6,43.04±6.55％；P<0.001)；与NMDA对照组相比。
与HEK293细胞数据一致，Npam02本身不能诱导向内或向外的电流(图4a)。此外，APV(50μM)的应用阻断所有电流表明增强是通过NMDAR介导的并且不是通过归因于其它内源蛋白质的继发效应。另一方面，Npam02的增强效果能够被NVP的存在阻断(0.2μM；n＝6,0.06±1.36％；P>0.05)，表明增强效果来自含有GluN2A的NMDAR(图4b)。
同样以类似的方式测试Npam01和Npam04，但与Npam02不同，NMDAR-电流没有可观察到的增强或抑制效果(图4c)。这表明在表达GluN1和2A NMDAR的HEK293细胞中先前观察到的Npam01和Npam04的增强效果可能被神经元中对含有GluN1/GluN2B的NMDAR的抑制效果所掩盖，导致NMDAR电流的零净变化。
为了进一步评估Npam02的增强效果是否对含有GluN1/GluN2A的NMDAR是选择性的，在缺失GluN2B亚基的神经元中测试了Npam02。在条件性GluN2B-敲除神经元中共同施用NVP-AAM007(0.2μM)和NMDA(20μM)，几乎完全阻断NMDAR电流，(n＝4；90.73±1.11％；P<0.001)(图5a,b)，表明仍有一小部分残余电流来自GluN2B。与NMDA对照组相比，在来自GluN2B-缺失小鼠的神经元中在协同激动剂NMDA(20μM)和甘氨酸(2μM)存在下，灌流应用Npam02(100μM)对NMDAR电流具有正向调节效果(n＝4；44.72±4.29％；P<0.001)(图5a,b)。这与表达GluN1/GluN2A-NMDAR的HEK293细胞中的观察结果以及野生型神经元中观察到的增强效果一致。
此外，为了进一步分离纯的GluN2A-组分，与NMDA对照组相比，共同施用GluN2B拮抗剂艾芬地尔(IF)与Npam02导致类似于先前观察到的增强效果(n＝4；42.22±4.03％；P<0.001)(图5a,b)。
最后，使用GluN2B-敲除的皮质神经元来确定Npam02是否对含有GluN1/GluN2A的NMDAR是选择性的。使用选择性GluN2A拮抗剂阻断GluN2A介导的电流，并确认该化合物是否区分两种亚型。与NMDA对照相比，灌流施用两种协同激动剂与GluN2A-NMDAR拮抗剂NVP-AAM007(0.2μM)和Npam02，阻止了Npam02对NMDAR电流的增强(100μM；n＝4；88.87±3.45％P>0.001)(Figure 5a,b)。这表明残留的GluN2B-NMDAR电流没有增强。
3.3在成熟皮层神经元中Npam02对AMPAR和GABAR介导的电流没有可见的调节效果
接下来，本发明人评估了Npam02对中枢神经系统(CNS)的另外两个关键离子型受体的选择性特征：α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体AMPAR，其已知为谷氨酸的非NMDA型离子型跨膜受体，在中枢神经系统(CNS)中介导快速突触传递，和GABA受体，其是主要的抑制性配体门控离子通道受体。在培养的海马神经元中进行全细胞膜片钳记录。测试显示Npam02对AMPAR(图6a,c)或GABAR(图6b,c)介导的电流没有可观察到的效果。
3.4 GluN1/GluN2A界面位点中的Npam02结合位置
在结构分析中，观察到GluN1/GluN2A二聚体界面主要被疏水残基围绕，诸如(GluN2AF115、GluN2AM112、GluN2AP79、GluN1F113、GluN1Y109、GluN1L135、GluN2AF177、GluN2AP178)，其遍布口袋和Npam02配体周围。事实上，Npam02配体位于由GluN2AF115、GluN2AP79、GluN1F113和GluN1Y109描述的疏水笼中。该笼的特征在于由其侧链中环结构组成的残基。该特征是特别令人感兴趣的，因为理想地来自该笼内配体的环可能通过由两个Π系统(芳基-芳基)介导的强疏水相互作用将其自身锚定在该区域内。Npam02似乎符合这种可能性，因为其芳环(图7中位置1-6)位于该区域内并且与围绕Npam02的芳环(图7中位置1-6)的所有上述残基疏水连接。更具体地，对于来自GluN2AF115和Npam02芳环(图7中位置1-6)的两个Π系统(芳基-芳基)之间的相互作用，T形边-到-面的构象强烈地相互作用，并且似乎是能量上有吸引力的和有利的。在配体的相反侧观察到类似的效果，其中另一个芳环(图7中位置11-16)与GluN1L135、GluN2AF177和GluN2AP178强烈相互作用。GluN1L135似乎其可以通过边-到-面相互作用与Npam02的第二芳环直接相互作用，而GluN2A的其它残基也可以疏水相互作用但极有可能程度较小，因为它们距离配体更远。相反，GluN2AQ111显示出极性氢键，其接受与Npam02的羟基质子(图7中的位置18)的相互作用。
3.5 N-末端结构域(NTD)中预测结合位点的定点突变
为了验证药物是否与GluN1和GluN2A之间的二聚体界面结合，进行了N-末端结构域(NTD)口袋的定点突变。选择两个被认为与药物直接相互作用至关重要的残基。大量的诱导适合对接表明Npam02可占据和利用NTD的上叶(R1)之间的空间(图8a)。因此本发明人测试了Npam02对含有GluN1/GluN2A的NMDAR的增强是否通过在口袋界面周围的残基的突变而改变，其通过选择阻断化合物相互作用但不干扰整个蛋白质结构的侧链来取代。在预测的调节位点中Npam02的对接模型显示，两个残基GluN2A(Gln111)和GluN2A(F177)(图8b)与Npam02直接相互作用，其中GluN2A(Gln111)与羟基(图7中位置18)形成氢键，GluN2A(F177)可能引起对芳香环(图7中位置11-16)的疏水相互作用。实际上，与对野生型GluN1/GluN2A受体观察到的调节效果相比，通过两个突变实现了调节程度的显著降低。在野生型神经元中(n＝7,41.75±2.62％)(图8c)，当GluN2A从Gln111Ala突变时，Npam02(100μM)的调节效果显著降低(n＝7,30.69±1.60％,P>0.05)(图8c)，并且Phe177Ser突变时进一步降低(n＝7,22.86±1.12％,P>0.01)(Figure 8c)。这两个突变的并入以及随后的Npam02调节效果的降低表明Npam02可以结合该间隙界面位点。
实施例4 Npam43的特征
4.1在转染的HEK293细胞中Npam43选择性增强含有GluN1/GluN2A的NMDAR介导的电流
如图9中所示，与单独施用谷氨酸相比，在表达GluN1/GluN2A受体的HEK细胞中，共同施用Npam43(10μM)与协同激动剂显著增强NMDA介导的电流，表明Npam43可以作为Npam。相反，表达GluN1/GluN2B亚型的HEK细胞在Npam43(10μM)存在下没有表现出NDMAR电流的增强(图9)。类似地，Npam43本身没有引起电流。如图9中所示，HEK细胞中增强的GluN1/GluN2ANMDAR介导的电流显示在Npam43存在下的剂量依赖关系，其相对于单独的协同激动剂基线在～350％达到饱和，EC50是-0.614±0.05μM的pEC50(0.24±0.05μM)。从含有GluN2B的NMDAR记录中未观察到Npam43的电流的剂量依赖性增强。
4.2降低增强效果的N-末端结构域中GluN1/GluN2A界面处的关键氨基酸残基
本发明人测试了Npam43对含有GluN1/GluN2A的NMDAR的增强是否通过在口袋界面周围的残基的突变而改变，其通过选择阻断化合物相互作用但不干扰整个蛋白质结构的侧链来取代。GluN1和GluN2A亚基的一级序列显示在图10a中，粗体残基定义为基于GluN1/GluN2A 3-D模型的位点口袋所需的(图10b)。在预测的调节位点中Npam43的对接模型显示GluN1-(Leu135)(图10b)(其在β链5之前形成弯曲)可能在与配体相互作用中其作用。
实际上，GluN1-(Leu135Gln)实现了调节程度的显著降低，其使正向调节显著降低了70％以上(n＝6；-77.5±2.12％；P<0.001；标准化为野生型GluN1/GluN2A中的Npam43反应)，表明该氨基酸对于与化合物的疏水接触是至关重要的(图10c)。该模型还显示α-螺旋80中的GluN2A-(Gln111)与Npam43形成关键的H-键相互作用(图10b)，因此当Gln111突变为GluN2A-(Gln111Ala)时，也观察到增强的减少(图10d)，与该区在介导配体结合中的作用一致(n＝6；-67.4±11.8％；P<0.001；标准化为野生型GluN1/GluN2A中的Npam43反应)。此外，位于α-螺旋80中的GluN2A-(Phe115Ser)突变使正向调节减少(n＝6；-67.4±11.8％；P<0.001；标准化为野生型GluN1/GluN2A中的Npam43反应)，表明在该位置的疏水性特征是必不可少的(图10d)。图11a显示GluN1-(Leu135Gln)和GluN2A-(Phe115Ser)独立和共同突变都不直接反映总蛋白质结构的变化而是影响配体结合。这也通过与野生型GluN1/GluN2A相比这两个突变中的L-谷氨酸剂量反应没有改变而证实。
表3中总结的和图10d中所示的在定义的口袋中的另外8个突变，也显示增强的显著降低，其范围为(10-62％)，强烈表明配体结合发生在NTD上叶(R1)中的该交界处。也突变了四个阴性对照突变GluN1-(Arg115Glu)、GluN2A-(Met112Ile)、GluN2A-(Ile176Tyr)和GluN2A-(Ala108Gly)，其定义为对配体结合没有贡献的结合口袋内的残基，以进一步证明该模型结合位点的准确性(图10d)。表3中没有单点突变能够消除Npam43的结合，因此是双突变；构建一个来自GluN1(Leu135Gln)和一个来自GluN2A(Phe115Ser)的突变，并测试是否可以进一步减少残余的正向调节。单独地削弱相互作用的NTD的双突变如增强中的加和的减少所反应的进一步降低了Npam43的结合(n＝6；-93.9±10.3％；P<0.001；标准化为野生型GluN1/GluN2A中的Npam43反应)(图10e:图10f突出显示这两个点突变，它们的相对位置以及它们在结合位点中强烈影响相互作用)。为了确定是否这种减少是由于Npam43结合或是由于受体的脱敏性，对野生型的双突变研究了谷氨酸激活的剂量反应关系。图11a显示与GluN1/GluN2A野生型受体相比，双突变的谷氨酸剂量反应没有显著改变，表明该突变不影响蛋白质功能。为了评估用于GluN1/GluN2A NTD的结构模型的准确性，从HEK293细胞中GluN1或GluN2A的突变形式观察到的Npam43的相对增强之间进行了相关性绘图，并由对接分析预测了结合能(图11b)。在观察到的增强和预测的结合能之间存在强烈的相关性R2＝0.93，表明该模型足够准确来模拟化合物在该结合口袋内(图11b)。
表3 Npam43诱导的GluN1或GluN2A突变体的增强
相对增强 相互作用:直接/类型 净差异增强 N
GluN1<sup>WT</sup>/GluN2A<sup>WT</sup> 209±6.7％ 6
GluN1/GluN2A<sup>Q111A</sup> 129±6.7％ 是/H-键 -38.4±0.78％ 4
GluN1/GluN2A<sup>F115Y</sup> 100±4.2％ 是/Hyd-C -52.2±0.52％ 6
GluN1/GluN2A<sup>F177S</sup> 79.9±2.6％ 是/Hyd-C -61.7±0.03％ 5
GluN1/GluN2A<sup>I176Y</sup> 189±3.8％ 否/- -10.1±0.12％ 3
GluN1/GluN2A<sup>M112I</sup> 255±19％ 是/Hyd-C +22.2±0.94％ 3
GluN1/GluN2A<sup>P178G</sup> 95.5±3.8％ 是/Hyd-C -54.3±0.42％ 4
GluN1/GluN2A<sup>P79A</sup> 99.3±2.8％ 是/Hyd-C -52.5±0.20％ 5
GluN1/GluN2A<sup>F115S</sup> 68.1±14.1％ 是/Hyd-C -67.4±11.8％ 6
GluN1/GluN2A<sup>A108G</sup> 210±9.0％ 否/- +0.48±0.01％ 3
GluN1<sup>R115E</sup>/GluN2A 255±3.5％ 否/- +22.0±0.40％ 4
GluN1<sup>L135Q</sup>/GluN2A 47.1±2.8％ 是/Hyd-C -77.5±2.12％ 7
GluN1<sup>L135Q</sup>/GluN2A<sup>F115S</sup> 12.7±1.8％ 是,是/Hyd-C,Hyd-C -93.9±10.3％ 5
4.3在培养的大鼠海马神经元中Npam43对含有GluN1/GluN2A的NMDAR的调节增强NMDAR介导的电流
图12证明在海马神经元中Npam43选择性增强GluN1/GluN2ANMDAR。图12显示在Npam43存在下或通过共同施用Npam43和GluN1/GluN2B特异性拮抗剂艾芬地尔(IF；3μM)的增强的增加。图12进一步显示用GluN1/GluN2A特异性拮抗剂NVP-AAM077和NMDA阻断剂AP5处理分别降低增强和消除电流。剂量反应分析显示Npam43剂量依赖性地增强NMDAR电流，EC50为0.25±0.12μM(图13)，并在10μM达到饱和点(n＝6；高于对照水平基线322±27％)。另外，发现NMDA剂量反应曲线是pEC50＝1.484±0.082μM或30.5±11.7μM，其中在Npam43(5μM)存在下向左移位，由此增强图13中所示的NMDA激动剂的亲和力。
4.4 Npam43通过含有GluN1/GluN2A的NMDAR增加细胞内Ca2+
使用原代培养的大鼠神经元的基于细胞的Ca2+内流测定用于确定Npam43的调节是否有助于细胞内Ca2+的增加以及这种影响是否是通过含有GluN1/GluN2A的NMDAR介导。将NMDA(10μM)和甘氨酸(2μM)加入细胞培养物中以激活NMDAR。将Npam43施用到培养的神经元增加图14中所示的Ca2+内流荧光信号。为了确定Ca2+的内流是否是通过含有GluN1/GluN2A的NMDAR，本发明人共同施用GluN2A拮抗剂NVP-AAM0077并观察到对Npam43的反应的Ca2+内流显著减少，表明GluN2A受体介导增强的钙内流，如图14中所示。
实施例5 Npam43的神经保护效果
5.1 CREB的磷酸化(pCREB)
CREB的磷酸化是细胞存活通路激活的可靠指标。图15a证明，在存在或不存在GluN1/GluN2B拮抗剂艾芬地尔的情况下，用Npam43处理，CREB磷酸化(pCREB)增加。图15a进一步显示与阳性对照荷包牡丹碱(BIC；10μM)相比，GluN1/GluN2A特异性拮抗剂NVP-AAM007减少Npam43诱导的pCREB。图15b证明Npam43对于增加的pCREB的剂量依赖性效果。
5.2 NMDA诱导的兴奋毒性和H2O2诱导的细胞毒性的降低
图16-17显示在不存在GluN1/GluN2A拮抗剂NVP-AAM007的情况下，通过Npam43处理，降低皮质神经元中NMDA诱导的兴奋毒性和H2O2诱导的非NMDAR依赖性细胞毒性。图16进一步显示Npam43对于NMDA诱导的细胞毒性的剂量依赖性效果。图17显示暴露于H2O2增加神经元细胞死亡。图17进一步显示在Npam43存在下H2O2诱导的细胞毒性降低，除了用GluN1/GluN2A拮抗剂(NVP-AAM077,0.2μM和TCN-201,10μM)共同处理。
实施例6切片中Npam43的特征(离体)
6.1突触传递和长时程增强(LTP)的GluN2A组分都增强了
进行电生理学记录以直接测定脑海马切片中Npam43对NMDAR电流的效果，本发明人在GluN2A或GluN2B拮抗剂(NVP-AAM007(NVP),0.2μM或艾芬地尔,(IF)3μM)存在下药理学分离突触传递的GluN2A和GluN2B组分。图18证明在小鼠海马切片中Npam43选择性增强NMDAR电流的GluN2A组分并且对GluN2B NMDAR没有效果。由于GluN2A的激活已被证明可促进突触可塑性，因此还进行了电生理学记录以证明GluN2A的增强可促进长时程增强(LTP)，从而有助于促进突触强度。图19显示在小鼠海马切片中Npam43可促进诱导LTP。
6.2敲除(KO)GluN2A小鼠的皮质切片证明Npam43对GluN2A NMDAR的增强效果
为了直接测试Npam43对突触激活的NMDAR的选择性，在来自GluN2A敲除(KO)小鼠以及野生型(WT)小鼠的切片中进行记录。图20显示在WT小鼠中，当将Npam43施用于脑切片时，观察到NMDAR EPSC的明显增强。在GluN2A KO小鼠中，Npam43的施用对NMDAR EPSC没有效果，表明其增强效果归因于GluN2A NMDAR。
6.3在海马切片中Npam43增加pCREB水平
如图21中所示，在存在和不存在NVP-AAM077(0.2μM)的情况下，用荷包牡丹碱(BiC；10μM；暴露30分钟)或Npam43(10μM；暴露30分钟)处理的海马切片中基线水平丝氨酸133上CREB磷酸化(pCREB)的免疫细胞化学分析。用BiC刺激神经元增加pCREB水平，并且这种效果被b NVP-AAM007(0.2μM)降低。如图21中所示，用Npam43(10μM)处理显著增强pCREB水平，其在NVP-AAM007(0.2μM)存在下被完全阻断。
实施例7 Npam43的药理学特征
成熟大鼠中IV注射后Npam43穿过血脑屏障
使用Sprague Dawley成熟(～300g)大鼠评估Npam43的体内药理学特征。以0.5-5mg/kg不同剂量静脉注射Npam43(i.v)，提取脑脊液(CSF)和血清样品，并用高效液相色谱电化学检测(HPLC-ECD)分析。如图22中所示，静脉给药后对Npam43的药代动力学分析证明其有效穿透血脑屏障(BBB)，并且在CSF和血清中具有适度的代谢稳定性。注射后1小时观察到注射剂量和CSF中的最终浓度之间的线性关系。如图22中所示，在CSF中Npam43的半衰期估计为2.95±0.6h，其与血清中的衰减相似。
实施例8 Npam43的体内功效
8.1 Npam43增强海马组织和皮质组织中的pCREB水平
如图23中所示，在i.v.注射Npam43(1mg/kg)治疗后1小时收获海马和皮质脑切片，通过免疫印迹探测样品的pCTEB和tCREB水平。与体外测定一致，pCTEB水平升高。
8.2缺血性脑损伤后神经元损伤的减少
梗死大小可用作发作后脑损伤的测量。图24-25显示，与用载体/盐水对照处理相比，用Npam43治疗减少了大脑中动脉阻塞(MCAo)的大鼠模型中的梗死体积。图24证明缺血后24小时Npam43对埂死体积的剂量依赖性效果。图25MRI扫描显示Npam43减少使用长时程评估点(7天)的埂死大小。
8.3局灶性缺血性脑损伤后改善的行为表现
进行神经行为测定以评估脑卒中后神经元的功能恢复。图26证明，与脑卒中发作后28天的未治疗对照大鼠相比，Npam43治疗的大鼠显示增强的脑卒中后运动行为。
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Met Ser Thr Met His Leu Leu Thr Phe Ala Leu Leu Phe Ser Cys Ser
1 5 10 15
Phe Ala Arg Ala Ala Cys Asp Pro Lys Ile Val Asn Ile Gly Ala Val
20 25 30
Leu Ser Thr Arg Lys His Glu Gln Met Phe Arg Glu Ala Val Asn Gln
35 40 45
Ala Asn Lys Arg His Gly Ser Trp Lys Ile Gln Leu Asn Ala Thr Ser
50 55 60
Val Thr His Lys Pro Asn Ala Ile Gln Met Ala Leu Ser Val Cys Glu
65 70 75 80
Asp Leu Ile Ser Ser Gln Val Tyr Ala Ile Leu Val Ser His Pro Pro
85 90 95
Thr Pro Asn Asp His Phe Thr Pro Thr Pro Val Ser Tyr Thr Ala Gly
100 105 110
Phe Tyr Arg Ile Pro Val Leu Gly Leu Thr Thr Arg Met Ser Ile Tyr
115 120 125
Ser Asp Lys Ser Ile His Leu Ser Phe Leu Arg Thr Val Pro Pro Tyr
130 135 140
Ser His Gln Ser Ser Val Trp Phe Glu Met Met Arg Val Tyr Asn Trp
145 150 155 160
Asn His Ile Ile Leu Leu Val Ser Asp Asp His Glu Gly Arg Ala Ala
165 170 175
Gln Lys Arg Leu Glu Thr Leu Leu Glu Glu Arg Glu Ser Lys Ala Glu
180 185 190
Lys Val Leu Gln Phe Asp Pro Gly Thr Lys Asn Val Thr Ala Leu Leu
195 200 205
Met Glu Ala Arg Glu Leu Glu Ala Arg Val Ile Ile Leu Ser Ala Ser
210 215 220
Glu Asp Asp Ala Ala Thr Val Tyr Arg Ala Ala Ala Met Leu Asn Met
225 230 235 240
Thr Gly Ser Gly Tyr Val Trp Leu Val Gly Glu Arg Glu Ile Ser Gly
245 250 255
Asn Ala Leu Arg Tyr Ala Pro Asp Gly Ile Ile Gly Leu Gln Leu Ile
260 265 270
Asn Gly Lys Asn Glu Ser Ala His Ile Ser Asp Ala Val Gly Val Val
275 280 285
Ala Gln Ala Val His Glu Leu Leu Glu Lys Glu Asn Ile Thr Asp Pro
290 295 300
Pro Arg Gly Cys Val Gly Asn Thr Asn Ile Trp Lys Thr Gly Pro Leu
305 310 315 320
Phe Lys Arg Val Leu Met Ser Ser Lys Tyr Ala Asp Gly Val Thr Gly
325 330 335
Arg Val Glu Phe Asn Glu Asp Gly Asp Arg Lys Phe Ala Asn Tyr Ser
340 345 350
Ile Met Asn Leu Gln Asn Arg Lys Leu Val Gln Val Gly Ile Tyr Asn
355 360 365
Gly Thr His Val Ile Pro Asn Asp Arg Lys Ile Ile Trp Pro Gly Gly
370 375 380
Glu Thr Glu Lys Pro Arg Gly Tyr Gln Met Ser Thr Arg Leu Lys Ile
385 390 395 400
Val Thr Ile His Gln Glu Pro Phe Val Tyr Val Lys Pro Thr Met Ser
405 410 415
Asp Gly Thr Cys Lys Glu Glu Phe Thr Val Asn Gly Asp Pro Val Lys
420 425 430
Lys Val Ile Cys Thr Gly Pro Asn Asp Thr Ser Pro Gly Ser Pro Arg
435 440 445
His Thr Val Pro Gln Cys Cys Tyr Gly Phe Cys Ile Asp Leu Leu Ile
450 455 460
Lys Leu Ala Arg Thr Met Asn Phe Thr Tyr Glu Val His Leu Val Ala
465 470 475 480
Asp Gly Lys Phe Gly Thr Gln Glu Arg Val Asn Asn Ser Asn Lys Lys
485 490 495
Glu Trp Asn Gly Met Met Gly Glu Leu Leu Ser Gly Gln Ala Asp Met
500 505 510
Ile Val Ala Pro Leu Thr Ile Asn Asn Glu Arg Ala Gln Tyr Ile Glu
515 520 525
Phe Ser Lys Pro Phe Lys Tyr Gln Gly Leu Thr Ile Leu Val Lys Lys
530 535 540
Glu Ile Pro Arg Ser Thr Leu Asp Ser Phe Met Gln Pro Phe Gln Ser
545 550 555 560
Thr Leu Trp Leu Leu Val Gly Leu Ser Val His Val Val Ala Val Met
565 570 575
Leu Tyr Leu Leu Asp Arg Phe Ser Pro Phe Gly Arg Phe Lys Val Asn
580 585 590
Ser Glu Glu Glu Glu Glu Asp Ala Leu Thr Leu Ser Ser Ala Met Trp
595 600 605
Phe Ser Trp Gly Val Leu Leu Asn Ser Gly Ile Gly Glu Gly Ala Pro
610 615 620
Arg Ser Phe Ser Ala Arg Ile Leu Gly Met Val Trp Ala Gly Phe Ala
625 630 635 640
Met Ile Ile Val Ala Ser Tyr Thr Ala Asn Leu Ala Ala Phe Leu Val
645 650 655
Leu Asp Arg Pro Glu Glu Arg Ile Thr Gly Ile Asn Asp Pro Arg Leu
660 665 670
Arg Asn Pro Ser Asp Lys Phe Ile Tyr Ala Thr Val Lys Gln Ser Ser
675 680 685
Val Asp Ile Tyr Phe Arg Arg Gln Val Glu Leu Ser Thr Met Tyr Arg
690 695 700
His Met Glu Lys His Asn Tyr Glu Ser Ala Ala Glu Ala Ile Gln Ala
705 710 715 720
Val Arg Asp Asn Lys Leu His Ala Phe Ile Trp Asp Ser Ala Val Leu
725 730 735
Glu Phe Glu Ala Ser Gln Lys Cys Asp Leu Val Thr Thr Gly Glu Leu
740 745 750
Phe Phe Arg Ser Gly Phe Gly Ile Gly Met Arg Lys Asp Ser Pro Trp
755 760 765
Lys Gln Asn Val Ser Leu Ser Ile Leu Lys Ser His Glu Asn Gly Phe
770 775 780
Met Glu Asp Leu Asp Lys Thr Trp Val Arg Tyr Gln Glu Cys Asp Ser
785 790 795 800
Arg Ser Asn Ala Pro Ala Thr Leu Thr Phe Glu Asn Met Ala Gly Val
805 810 815
Phe Met Leu Val Ala Gly Gly Ile Val Ala Gly Ile Phe Leu Ile Phe
820 825 830
Ile Glu Ile Ala Tyr Lys Arg His Lys Asp Ala Arg Arg Lys Gln Met
835 840 845
Gln Leu Ala Phe Ala Ala Val Asn Val Trp Arg Lys Asn Leu Gln Asp
850 855 860
Arg Lys Ser Gly Arg Ala Glu Pro Asp Pro Lys Lys Lys Ala Thr Phe
865 870 875 880
Arg Ala Ile Thr Ser Thr Leu Ala Ser Ser Phe Lys Arg Arg Arg Ser
885 890 895
Ser Lys Asp Thr Ser Thr Gly Gly Gly Arg Gly Ala Leu Gln Asn Gln
900 905 910
Lys Asp Thr Val Leu Pro Arg Arg Ala Ile Glu Arg Glu Glu Gly Gln
915 920 925
Leu Gln Leu Cys Ser Arg His Arg Glu Ser
930 935
<210> 2
<211> 1464
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 2
Met Gly Arg Leu Gly Tyr Trp Thr Leu Leu Val Leu Pro Ala Leu Leu
1 5 10 15
Val Trp Arg Asp Pro Ala Gln Asn Ala Ala Ala Glu Lys Gly Pro Pro
20 25 30
Ala Leu Asn Ile Ala Val Leu Leu Gly His Ser His Asp Val Thr Glu
35 40 45
Arg Glu Leu Arg Asn Leu Trp Gly Pro Glu Gln Ala Thr Gly Leu Pro
50 55 60
Leu Asp Val Asn Val Val Ala Leu Leu Met Asn Arg Thr Asp Pro Lys
65 70 75 80
Ser Leu Ile Thr His Val Cys Asp Leu Met Ser Gly Ala Arg Ile His
85 90 95
Gly Leu Val Phe Gly Asp Asp Thr Asp Gln Glu Ala Val Ala Gln Met
100 105 110
Leu Asp Phe Ile Ser Ser Gln Thr Phe Ile Pro Ile Leu Gly Ile His
115 120 125
Gly Gly Ala Ser Met Ile Met Ala Asp Lys Asp Pro Thr Ser Thr Phe
130 135 140
Phe Gln Phe Gly Ala Ser Ile Gln Gln Gln Ala Thr Val Met Leu Lys
145 150 155 160
Ile Met Gln Asp Tyr Asp Trp His Val Phe Ser Leu Val Thr Thr Ile
165 170 175
Phe Pro Gly Tyr Arg Asp Phe Ile Ser Phe Ile Lys Thr Thr Val Asp
180 185 190
Asn Ser Phe Val Gly Trp Asp Met Gln Asn Val Ile Thr Leu Asp Thr
195 200 205
Ser Phe Glu Asp Ala Lys Thr Gln Val Gln Leu Lys Lys Ile His Ser
210 215 220
Ser Val Ile Leu Leu Tyr Cys Ser Lys Asp Glu Ala Val Leu Ile Leu
225 230 235 240
Ser Glu Ala Arg Ser Leu Gly Leu Thr Gly Tyr Asp Phe Phe Trp Ile
245 250 255
Val Pro Ser Leu Val Ser Gly Asn Thr Glu Leu Ile Pro Lys Glu Phe
260 265 270
Pro Ser Gly Leu Ile Ser Val Ser Tyr Asp Asp Trp Asp Tyr Ser Leu
275 280 285
Glu Ala Arg Val Arg Asp Gly Leu Gly Ile Leu Thr Thr Ala Ala Ser
290 295 300
Ser Met Leu Glu Lys Phe Ser Tyr Ile Pro Glu Ala Lys Ala Ser Cys
305 310 315 320
Tyr Gly Gln Ala Glu Lys Pro Glu Thr Pro Leu His Thr Leu His Gln
325 330 335
Phe Met Val Asn Val Thr Trp Asp Gly Lys Asp Leu Ser Phe Thr Glu
340 345 350
Glu Gly Tyr Gln Val His Pro Arg Leu Val Val Ile Val Leu Asn Lys
355 360 365
Asp Arg Glu Trp Glu Lys Val Gly Lys Trp Glu Asn Gln Thr Leu Ser
370 375 380
Leu Arg His Ala Val Trp Pro Arg Tyr Lys Ser Phe Ser Asp Cys Glu
385 390 395 400
Pro Asp Asp Asn His Leu Ser Ile Val Thr Leu Glu Glu Ala Pro Phe
405 410 415
Val Ile Val Glu Asp Ile Asp Pro Leu Thr Glu Thr Cys Val Arg Asn
420 425 430
Thr Val Pro Cys Arg Lys Phe Val Lys Ile Asn Asn Ser Thr Asn Glu
435 440 445
Gly Met Asn Val Lys Lys Cys Cys Lys Gly Phe Cys Ile Asp Ile Leu
450 455 460
Lys Lys Leu Ser Arg Thr Val Lys Phe Thr Tyr Asp Leu Tyr Leu Val
465 470 475 480
Thr Asn Gly Lys His Gly Lys Lys Val Asn Asn Val Trp Asn Gly Met
485 490 495
Ile Gly Glu Val Val Tyr Gln Arg Ala Val Met Ala Val Gly Ser Leu
500 505 510
Thr Ile Asn Glu Glu Arg Ser Glu Val Val Asp Phe Ser Val Pro Phe
515 520 525
Val Glu Thr Gly Ile Ser Val Met Val Ser Arg Ser Asn Gly Thr Val
530 535 540
Ser Pro Ser Ala Phe Leu Glu Pro Phe Ser Ala Ser Val Trp Val Met
545 550 555 560
Met Phe Val Met Leu Leu Ile Val Ser Ala Ile Ala Val Phe Val Phe
565 570 575
Glu Tyr Phe Ser Pro Val Gly Tyr Asn Arg Asn Leu Ala Lys Gly Lys
580 585 590
Ala Pro His Gly Pro Ser Phe Thr Ile Gly Lys Ala Ile Trp Leu Leu
595 600 605
Trp Gly Leu Val Phe Asn Asn Ser Val Pro Val Gln Asn Pro Lys Gly
610 615 620
Thr Thr Ser Lys Ile Met Val Ser Val Trp Ala Phe Phe Ala Val Ile
625 630 635 640
Phe Leu Ala Ser Tyr Thr Ala Asn Leu Ala Ala Phe Met Ile Gln Glu
645 650 655
Glu Phe Val Asp Gln Val Thr Gly Leu Ser Asp Lys Lys Phe Gln Arg
660 665 670
Pro His Asp Tyr Ser Pro Pro Phe Arg Phe Gly Thr Val Pro Asn Gly
675 680 685
Ser Thr Glu Arg Asn Ile Arg Asn Asn Tyr Pro Tyr Met His Gln Tyr
690 695 700
Met Thr Arg Phe Asn Gln Arg Gly Val Glu Asp Ala Leu Val Ser Leu
705 710 715 720
Lys Thr Gly Lys Leu Asp Ala Phe Ile Tyr Asp Ala Ala Val Leu Asn
725 730 735
Tyr Lys Ala Gly Arg Asp Glu Gly Cys Lys Leu Val Thr Ile Gly Ser
740 745 750
Gly Tyr Ile Phe Ala Ser Thr Gly Tyr Gly Ile Ala Leu Gln Lys Gly
755 760 765
Ser Pro Trp Lys Arg Gln Ile Asp Leu Ala Leu Leu Gln Phe Val Gly
770 775 780
Asp Gly Glu Met Glu Glu Leu Glu Thr Leu Trp Leu Thr Gly Ile Cys
785 790 795 800
His Asn Glu Lys Asn Glu Val Met Ser Ser Gln Leu Asp Ile Asp Asn
805 810 815
Met Ala Gly Val Phe Tyr Met Leu Ala Ala Ala Met Ala Leu Ser Leu
820 825 830
Ile Thr Phe Ile Trp Glu His Leu Phe Tyr Trp Lys Leu Arg Phe Cys
835 840 845
Phe Thr Gly Val Cys Ser Asp Arg Pro Gly Leu Leu Phe Ser Ile Ser
850 855 860
Arg Gly Ile Tyr Ser Cys Ile His Gly Val His Ile Glu Glu Lys Lys
865 870 875 880
Lys Ser Pro Asp Phe Asn Leu Thr Gly Ser Gln Ser Asn Met Leu Lys
885 890 895
Leu Leu Arg Ser Ala Lys Asn Ile Ser Asn Met Ser Asn Met Asn Ser
900 905 910
Ser Arg Met Asp Ser Pro Lys Arg Ala Thr Asp Phe Ile Gln Arg Gly
915 920 925
Ser Leu Ile Val Asp Met Val Ser Asp Lys Gly Asn Leu Ile Tyr Ser
930 935 940
Asp Asn Arg Ser Phe Gln Gly Lys Asp Ser Ile Phe Gly Asp Asn Met
945 950 955 960
Asn Glu Leu Gln Thr Phe Val Ala Asn Arg His Lys Asp Asn Leu Ser
965 970 975
Asn Tyr Val Phe Gln Gly Gln His Pro Leu Thr Leu Asn Glu Ser Asn
980 985 990
Pro Asn Thr Val Glu Val Ala Val Ser Thr Glu Ser Lys Gly Asn Ser
995 1000 1005
Arg Pro Arg Gln Leu Trp Lys Lys Ser Met Glu Ser Leu Arg Gln
1010 1015 1020
Asp Ser Leu Asn Gln Asn Pro Val Ser Gln Arg Asp Glu Lys Thr
1025 1030 1035
Ala Glu Asn Arg Thr His Ser Leu Lys Ser Pro Arg Tyr Leu Pro
1040 1045 1050
Glu Glu Val Ala His Ser Asp Ile Ser Glu Thr Ser Ser Arg Ala
1055 1060 1065
Thr Cys His Arg Glu Pro Asp Asn Asn Lys Asn His Lys Thr Lys
1070 1075 1080
Asp Asn Phe Lys Arg Ser Met Ala Ser Lys Tyr Pro Lys Asp Cys
1085 1090 1095
Ser Asp Val Asp Arg Thr Tyr Met Lys Thr Lys Ala Ser Ser Pro
1100 1105 1110
Arg Asp Lys Ile Tyr Thr Ile Asp Gly Glu Lys Glu Pro Ser Phe
1115 1120 1125
His Leu Asp Pro Pro Gln Phe Val Glu Asn Ile Thr Leu Pro Glu
1130 1135 1140
Asn Val Gly Phe Pro Asp Thr Tyr Gln Asp His Asn Glu Asn Phe
1145 1150 1155
Arg Lys Gly Asp Ser Thr Leu Pro Met Asn Arg Asn Pro Leu His
1160 1165 1170
Asn Glu Asp Gly Leu Pro Asn Asn Asp Gln Tyr Lys Leu Tyr Ala
1175 1180 1185
Lys His Phe Thr Leu Lys Asp Lys Gly Ser Pro His Ser Glu Gly
1190 1195 1200
Ser Asp Arg Tyr Arg Gln Asn Ser Thr His Cys Arg Ser Cys Leu
1205 1210 1215
Ser Asn Leu Pro Thr Tyr Ser Gly His Phe Thr Met Arg Ser Pro
1220 1225 1230
Phe Lys Cys Asp Ala Cys Leu Arg Met Gly Asn Leu Tyr Asp Ile
1235 1240 1245
Asp Glu Asp Gln Met Leu Gln Glu Thr Gly Asn Pro Ala Thr Arg
1250 1255 1260
Glu Glu Val Tyr Gln Gln Asp Trp Ser Gln Asn Asn Ala Leu Gln
1265 1270 1275
Phe Gln Lys Asn Lys Leu Arg Ile Asn Arg Gln His Ser Tyr Asp
1280 1285 1290
Asn Ile Leu Asp Lys Pro Arg Glu Ile Asp Leu Ser Arg Pro Ser
1295 1300 1305
Arg Ser Ile Ser Leu Lys Asp Arg Glu Arg Leu Leu Glu Gly Asn
1310 1315 1320
Leu Tyr Gly Ser Leu Phe Ser Val Pro Ser Ser Lys Leu Leu Gly
1325 1330 1335
Asn Lys Ser Ser Leu Phe Pro Gln Gly Leu Glu Asp Ser Lys Arg
1340 1345 1350
Ser Lys Ser Leu Leu Pro Asp His Ala Ser Asp Asn Pro Phe Leu
1355 1360 1365
His Thr Tyr Gly Asp Asp Gln Arg Leu Val Ile Gly Arg Cys Pro
1370 1375 1380
Ser Asp Pro Tyr Lys His Ser Leu Pro Ser Gln Ala Val Asn Asp
1385 1390 1395
Ser Tyr Leu Arg Ser Ser Leu Arg Ser Thr Ala Ser Tyr Cys Ser
1400 1405 1410
Arg Asp Ser Arg Gly His Ser Asp Val Tyr Ile Ser Glu His Val
1415 1420 1425
Met Pro Tyr Ala Ala Asn Lys Asn Thr Met Tyr Ser Thr Pro Arg
1430 1435 1440
Val Leu Asn Ser Cys Ser Asn Arg Arg Val Tyr Lys Lys Met Pro
1445 1450 1455
Ser Ile Glu Ser Asp Val
1460

Claims (22)

1.式1的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于在有此需要的个体中预防或治疗由N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)功能障碍引起或与N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)功能障碍有关的病症或病况的药物中的用途，
其中
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地是H、OH、卤素、CN、NO2、NRR’、COOR、CONRR’、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C2-C6烯氧基或C2-C6炔氧基；
R15是H或C1-C6烷基；
R11是H或C1-C6烷基；
G是直接键、O、NR、S、OCR’R”、SCR’R”、NRCR’R”、NRC(O)、NRC(O)NR’、NRC(O)CR’R”或NRC(O)CR’R”O，且G以任一方向与羰基和A连接；
A是A-1
X是CR7或N；
Y是CR8或N；
R6、R7、R8、R9和R10各自独立地是H、OH、卤素、CN、NO2、NRR’、NRC(O)R14、COOR、CONRR’、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C2-C6烯氧基或C2-C6炔氧基；或R7和R8一起或者R8和R9一起可形成5-或6-元饱和的、部分不饱和的或芳香性的单环，其任选地含有1至3个选自O、N和S的杂原子；
R14是H、C1-C6烷基或任选地被一个或多个C1-C6烷基取代的C5-C10芳基；
R、R’和R”每次出现独立地是H或C1-C6烷基；且
所述烷基、烯基、炔基、烷氧基、烯氧基和炔氧基各自任选地被一个或多个选自OH和卤素的基团取代。
2.权利要求1的用途，其中G是直接键、NMeC(O)、NHC(O)CH2、NHCH2、NHC(O)CH2O或CH2C(O)NH。
3.权利要求2的用途，其中X和Y不同时是N。
4.权利要求3的用途，其中
R11和R15都是H；
R4是H、卤素、NO2或C2-C4烯基；
R5是H或卤素；
R6是H或C1-C4烷基；且
R10是H、OH、卤素、NH2、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基。
5.权利要求4的用途，其中
R1是H、OH、C1-C4烷氧基或C2-C4炔氧基；
R2是H、OH、C1-C4烷氧基或卤素；且
R3是H或OH；
并且卤素代表F、Cl、Br或I，优选Cl或Br。
6.权利要求4的用途，其中
R7是H、OH、卤素或C1-C4烷基；
R8是H、OH、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基或NHC(O)R14，其中R14是被C1-C4烷基取代的苯基；
R9是H、OH、卤素、NO2或C1-C4烷基；
或
R7和R8一起形成苯基；
或
R8和R9一起形成1,4-二氧杂环己基；
并且卤素代表F、Cl、Br或I。
7.权利要求4的用途，其中所述化合物选自：
8.权利要求1至7中任一项的用途，其中所述化合物是NMDAR别构调节剂。
9.权利要求8的用途，其中所述化合物是选择性含有GluN2A的NMDAR的正向调节剂。
10.权利要求8的用途，其中所述病症或病况是与兴奋毒性有关的神经病症。
11.权利要求8的用途，其中所述病症或病况选自学习和记忆障碍、偏头痛、癫痫、阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、脑外伤、诸如脑卒中的急性脑损伤、精神分裂症、神经性疼痛、抑郁症和药物成瘾。
12.化合物，其选自：
或其药学上可接受的盐。
13.药物组合物，其包含权利要求12的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或辅剂。
14.化合物，其特异性结合至N-末端结构域(NTD)中的GluN1和GluN2A亚基之间界面处的靶位点，其中所述靶位点至少由GluN1的氨基酸残基135和GluN2A的氨基酸残基79、111、115、177和178的一个或多个定义。
15.权利要求14的化合物，其中所述靶位点至少由GluN1的L135和GluN2A的P79、Q111、F115、F177和P178的一个或多个定义。
16.权利要求14的化合物，其中所述靶位点至少由GluN1的L135和GluN2A的P79、Q111、F115、F177和P178定义。
17.权利要求14的化合物，其中所述化合物在靶位点内与GluN1的氨基酸残基135和GluN2A的氨基酸残基79、111、115、177和178的一个或多个相互作用。
18.权利要求14的化合物，其中所述调节剂特异性增强含有GluN1/GluN2A的NMDAR。
19.鉴定特异性增强含有GluN1/GluN2A的NMDAR的化合物的计算机辅助方法，所述方法包括以下步骤：
i)将候选化合物的结构与NTD中NMDAR受体的GluN1和GluN2A界面之间的结合口袋对接，其中所述结合口袋至少由GluN1亚基的氨基酸残基135和GluN2A亚基的氨基酸残基79、111、115、177和178的一个或多个定义，和
ii)鉴定可特异性增强含有GluN1/GluN2A的NMDAR的候选化合物。
20.权利要求19的方法，其中所述结合口袋至少由GluN1的L135和GluN2A的P79、Q111、F115、F177和P178的一个或多个定义。
21.权利要求19的方法，其中所述结合口袋至少由GluN1的L135和GluN2A的P79、Q111、F115、F177和P178定义。
22.权利要求19-21中任一项的方法，其中所述方法还包括合成或获得鉴定的候选化合物并确定所述化合物是否特异性增强含有GluN1/GluN2A的NMDAR。
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