CN109975259A - 一种生物细胞三维成像系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明适用于三维成像技术领域，提供了一种生物细胞三维成像系统，包括光源，转换单元将光束转换为无衍射光束；第一透镜将无衍射光束进行会聚；物镜将无衍射光束投射至待测物，并收集荧光；双色镜透射无衍射光束并反射荧光；荧光成像单元对荧光成像；单螺旋单元将荧光转换为单螺旋光；单螺旋光在探测器中形成多个同圆心不同位置的像点，用于对细胞内的轴向位置进行定位。通过采用无衍射光束，其具有轴向长度较大的特征，可以贯穿整个细胞厚度，可以快速实现细胞厚度范围内的荧光激发，结合单螺旋单元，使得在探测器的接收面上形成多个位于同心圆的不同位置的像点，根据像点的相对位置快速确定深度信息，结合横向定位即可实现快速、精确三维成像。

Description

一种生物细胞三维成像系统及方法

技术领域

本发明属于细胞成像技术领域，特别涉及一种生物细胞三维成像系统及方法。

背景技术

实现在活体细胞的高精度快速三维成像是目前一个极具挑战性的研究课题，对于细胞生物学、分子生物学的研究具有重要的意义。目前，尚难以实现细胞内亚细胞结构的高精度快速三维成像。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物细胞三维成像系统，旨在解决细胞三维成像速度慢、精度低的技术问题。

本发明是这样实现的，

一种生物细胞三维成像系统，包括：

光源；

转换单元，用于将所述光源发出的光束转换为无衍射光束；

第一透镜，用于将所述无衍射光束进行会聚；

物镜，设置于所述第一透镜的输出光路上，用于将所述无衍射光束投射至待测物，在所述待测物的照明空间内形成针状光束，并收集所述待测物在所述针状光束的激发下产生的荧光；

双色镜，设置于所述第一透镜和所述物镜之间，用于透射无衍射光束并反射荧光；

荧光成像单元，设置于所述双色镜的反射光路上，用于对所述荧光成像；

单螺旋单元，设置于所述荧光成像单元的输出光路上，用于将所述荧光转换为单螺旋光；

探测器，设置于所述单螺旋单元的输出光路上，所述单螺旋光在所述探测器中形成多个像点，所述多个像点位于一同心圆的不同位置，所述像点的位置用于对所述细胞内的轴向位置进行定位。

进一步地，所述单螺旋单元包括第二透镜、第三透镜和设置于所述第二透镜和第三透镜之间的相位板，所述荧光成像单元的像面处于所述第二透镜的物方焦点处，所述相位板位于所述第二透镜的像方焦点处和第三透镜的物方焦点处，所述探测器的像面处于所述第三透镜的像方焦点处。

进一步地，所述针状光束的轴向长度大于待测物内的待测细胞的轴向长度。

进一步地，所述转换单元为角锥棱镜，包括同轴设置的柱状部和锥状部，所述柱状部靠近所述光源，所述锥状部的锥形顶点指向光束的传输方向。

进一步地，在所述光源和转换单元之间还设有准直扩束单元以及模式转换装置，所述模式转换装置设置于所述光源和准直扩束单元之间，用于将所述光源发出的线偏振光转换为径向偏振光。

进一步地，所述光源采用激光光源；所述生物细胞三维成像系统还包括载物平台，用于承载所述待测物；

所述生物细胞三维成像系统还包括平移台，与所述载物平台连接以驱动所述载物平台在二位方向上平移。

进一步地，所述生物细胞三维成像系统还包括用于滤除非荧光的荧光滤光片，所述荧光滤光片设置于所述双色镜和荧光成像单元之间。

本发明的另一目的在于提供一种生物细胞三维成像方法，包括：

将光源发出的光束转换为无衍射光束；

将所述无衍射光束聚焦于待测物，在所述待测物的细胞内形成针状光束，使所述待测物产生荧光；

将所述荧光转换为单螺旋光，并基于所述单螺旋光进行成像；

通过设置于所述单螺旋光的成像面处的探测器收集所述单螺旋光，所述单螺旋光在所述探测器中形成多个像点，所述多个像点位于一同心圆的不同位置；

根据多个像点的位置进行轴向定位。

进一步地，所述根据多个像点的位置进行轴向定位的步骤包括：

计算所述像点相对于所述圆周上的参考像点的旋转角度，所述参考像点对应细胞内一已知的轴向参考位置；

根据所述旋转角度以及预先标定的算法进行轴向定位。

进一步地，所述生物细胞三维成像方法还包括：

使所述光源对待测物进行横向扫描，进行横向定位；

根据所述横向定位的信息及所述轴向定位的信息对细胞进行三维成像。

本发明提供的生物细胞三维成像系统及方法具有如下有益效果：通过采用转换单元获得无衍射光束，其具有轴向长度较大的特征，可以贯穿整个细胞厚度，这样采用无衍射光束可以快速实现细胞厚度范围内的荧光激发，而不需逐层扫描，通过在双色镜的反射光路上设置荧光成像单元以及单螺旋单元，将荧光转换为单螺旋光，单螺旋光的固有特征使其在探测器的接收面上会形成多个像点，多个像点对应细胞内轴向不同深度的物点，并且位于一同心圆的不同位置，各像点的相对位置则对应了细胞内不同深度信息。进而，通过无衍射光束照射细胞，结合单螺旋单元产生单螺旋光，可以对细胞内的轴向位置进行快速、精确定位。

附图说明

图1是本发明实施例提供的生物细胞三维成像系统的结构示意图；

图2是本发明实施例提供的生物细胞三维成像系统的无衍射光束的示意图；

图3是本发明实施例提供的生物细胞三维成像系统的像点示意图；

图4是本发明实施例提供的生物细胞三维成像系统的不同轴向位置对应的像点示意图；

图5是本发明实施例提供的生物细胞三维成像系统的标定曲线示意图；

图6是本发明实施例提供的生物细胞三维成像方法的流程图；

图7是本发明另一实施例提供的生物细胞三维成像系统的结构示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

需说明的是，当部件被称为“固定于”或“设置于”另一个部件，它可以直接或者间接位于该另一个部件上。当一个部件被称为“连接于”另一个部件，它可以是直接或者间接连接至该另一个部件上。术语“上”、“下”、“左”、“右”、“前”、“后”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置为基于附图所示的方位或位置，仅是为了便于描述，不能理解为对本技术方案的限制。术语“第一”、“第二”仅用于便于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明技术特征的数量。“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

为了说明本发明所述的技术方案，以下结合具体附图及实施例进行详细说明。

请参阅图1至图3，本发明实施例提供一种生物细胞三维成像系统，沿着照明光路传输方向依次包括光源10、转换单元20、第一透镜30、双色镜40以及物镜50，物镜50将照明光束投射至待测物100，待测物100产生荧光，在荧光的传输路径上依次包括：上述物镜50、上述双色镜40、荧光成像单元60、单螺旋单元70以及探测器80。为了提升检测精度，还可以在双色镜40和荧光成像单元60之间设置荧光滤光片90，其中，双色镜40和荧光滤光片90可以将荧光从激光中分离出来，并且去除其他杂散光。

该系统的工作原理如下：上述光源10通常采用激光光源10，以发射激光光束。转换单元20用于将光源10发出的光束转换为无衍射光束L，无衍射光束L经过光束整形可以在待测区域内产生轴向长度大于10微米的针状光束，可以贯穿整个细胞厚度，参考图2。在本实施例中，无衍射光束指的是束斑直径很小且不随传播距离改变的光束。虽然，由于实际的光学系统中存在光学孔径的限制。本案中的针状光束长度达到细胞厚度，约10微米以上，也可以根据需要随时调整，可长可短，该针状光束的束腰半径为0.3倍波长。第一透镜30用于将无衍射光束进行会聚，传输至双色镜40，双色镜40是一种能够透射无衍射光束，并反射荧光的镜片；物镜50设置于第一透镜30的输出光路并进一步位于双色镜40的透射光路上，用于将无衍射光束投射至待测物100，在待测物100的待测细胞中形成细长的针状光束，该针状光束的长度可供贯穿整个细胞，双色镜40还用于接收待测物100产生的荧光；荧光成像单元60设置于双色镜40的反射光路上，基于该荧光成像在像面61处；单螺旋单元70设置于荧光成像单元60的输出光路上，将荧光转换为单螺旋光，单螺旋光由探测器80收集。

由于无衍射光束L所形成的针状光束可以具有很长的轴向长度，能够在细胞厚度范围内同时激发荧光分子产生荧光，因此被探测的单螺旋光是来源于细胞内的不同深度，单螺旋光的固有特征使其在探测器80中形成多个亮点或像点S，如图4所示，并且这多个像点位于一同心圆C的不同位置。参考图3，可以通过角度α表示不同像点S的相对位置，该相对位置信息可以用于对细胞内的轴向位置进行定位。该角度α为待测像点S相对于参考像点S0的旋转角度，即S0与圆心O的连线和S与圆心O的连线之间的夹角。其中，参考像点S0对应的轴向位置可以定义为轴向零参考点，位于像点S0逆时针方向的角度α和位于像点S0顺时针方向的角度α对应轴向零参考点的上方和下方两个相反方向的位置。进一步参考图5，根据标定实验数据，可以示意轴向位置和角度α的对应关系，图中示意该对应关系为线性关系，在其他实施例中，也可能是非线性关系。在实际采用该系统进行待测物的三维成像时，可以将像点位置带入预先标定的算法，获得轴向位置，再结合横向扫描实现三维成像。横向定位可以采用本领域内常用的方法，在获取横向定位数据和轴向定位数据后，二者的结合方式也可以采用常规的方法。当然，还可以对横向定位方案进行优化，以提升成像精度和效率。

在本实施例中，单螺旋光的获得(即单螺旋点扩展函数的产生)至少可以采用以下两种方案：其一，通过不同Gauss–Laguerre(GL)模式的线性叠加，实现仅随传播方向螺旋旋转并且横向形状保持不变的螺旋光束；其二，在成像光路的入瞳位置放置一个具有螺旋相位变化的菲涅耳波带片来产生的螺旋光束。

该生物细胞三维成像系统具有如下效果：通过采用转换单元20获得无衍射光束，其具有在照明空间内轴向长度较大的特征，可以贯穿整个细胞厚度，这样采用无衍射光束可以快速实现细胞厚度范围内的荧光激发，而不需逐层扫描，通过在双色镜40的反射光路上设置荧光成像单元60以及单螺旋单元70，将荧光转换为单螺旋光，单螺旋光的固有特征使其在探测器80的接收面上会形成多个像点，多个像点对应细胞内轴向不同深度的物点，并且位于一同心圆的不同位置，各像点的相对位置则对应了细胞内不同深度信息。进而，通过无衍射光束照射细胞，结合单螺旋单元70，可以对细胞内的轴向位置进行快速、精确定位，进而实现快速、精确的三维成像。

进一步地，单螺旋单元70是一4F系统，具体包括第二透镜71、第三透镜72和设置于第二透镜71和第三透镜72之间的相位板73，荧光成像单元60的像面61处于第二透镜71的物方焦点处，相位板73位于第二透镜71的像方焦点处，同时也位于第三透镜72的物方焦点处，探测器80的像面61处于第三透镜72的像方焦点处。通过第二透镜71和第三透镜72中间频谱面上的特殊设计的相位板73共同实现单螺旋，获得单螺旋光。

在本实施例中，转换单元20优选为角锥棱镜，该角锥棱镜包括同轴设置的柱状部21和锥状部22，柱状部21靠近光源10侧，其具有垂直于光束传输方向的平整入射面，锥状部22的锥形顶点指向光束的传输方向，通过锥状部22将光束调整为无衍射光束，如图2。

在本实施例中，在光源10和转换单元20之间还设有准直扩束单元11，用于将光源10发出的光束进行拓宽准直，或者横向尺度较大的平行光束，以用于后续的光路调整。准直扩束单元11可以包括第四透镜111和第五透镜112。

在另一个实施例中，参考图7，在光源10和准直扩束单元11之间还设有模式转换装置110，用于将入射的线偏振光转换为径向偏振光，这种径向偏振光通过高数值的物镜50聚焦后，可以有效减小光斑大小，即减小针状光束的直径，从而可以提高横向的空间分辨率。

在本实施例中，为了便于待测物100设置，该生物细胞三维成像系统还包括载物平台(图中未示意)，设置于物镜50的像方，其位置设置使得待测物100处于无衍射光束的聚焦位置。进一步地，该载物平台优选位置可调，以便于XY轴向的扫描。具体地，可以设置一平移台与载物平台连接，通过驱动平移台在XY二维方向上平移，带动待测物100在垂直于细胞深度的方向上平移，进行横向扫描，从而完成整个细胞的三维成像。

参考图6，本发明实施例还提供一种生物细胞三维成像方法，包括下述步骤：

步骤S101：将光源发出的光束转换为无衍射光束；

步骤S102：将所述无衍射光束聚焦于待测物，在所述待测物的细胞内形成针状光束，使所述待测物产生荧光；

步骤S103：将所述荧光转换为单螺旋光，并基于所述单螺旋光进行成像；

步骤S104：通过设置于所述单螺旋光的成像面处的探测器收集所述单螺旋光，所述单螺旋光在所述探测器中形成多个像点，所述多个像点位于一同心圆的不同位置；

步骤S105：根据多个像点的位置进行轴向定位。

具体地，上述方法基于上述系统实现，在步骤S102中，针状光束的长度可以达到10微米以上，根据测量需求，可以通过对系统中的转换单元20、第一透镜30、物镜50中的若干个元件进行调整而得到不同的长度。

在步骤S104中和S105中，单螺旋光在探测器中形成多个像点，这多个像点位于一同心圆的不同位置，该圆心的位置由待测细胞中的横向位置决定，该像点相对于圆心的的具体位置由轴向位置决定。继续参考图3和图4，其中，轴向零参考位置对应像点S0，其他像点S相对于S0的旋转角度各不相同，该角度对应了相对于轴向零参考位置的不同的轴向位置。根据大量实验数据拟合统计，该角度和轴向位置存在一定的变换关系。基于该拟合曲线确定角度和轴向位置的对应关系，形成算法存储于系统中。在一个实施例中，拟合曲线如图4所示，在实际成像或测量中，根据预先确定的算法，将成像后的角度数据代入算法，即可快速获得轴向位置。

进一步地，可以进行步骤S106：使所述光源对待测物进行横向扫描，进行横向定位；

步骤S107：根据所述横向定位的信息及所述轴向定位的信息对细胞进行三维成像。进一步地，在步骤S101中，可以将光源发出的线偏振光束先转换为径向偏振光，再转换为无衍射光束，这样，最终通过物镜输出至待测物的针状光束的直径可以更小，进而提高横向分辨率。

综上，本发明提供的生物细胞三维成像系统及方法，通过针状无衍射光束激发细胞内的荧光分子，基于针状无衍射光束较大的轴向长度，使其可以贯穿整个细胞厚度，快速实现细胞厚度范围内的荧光激发；同时，通过荧光成像单元60以及单螺旋单元70的配合，将荧光转换为单螺旋光，单螺旋光在探测器80的接收面上形成多个位于同心圆上的像点，各像点的相对位置与细胞内的深度有关。进而，该系统通过无衍射光束照射细胞，结合单螺旋单元，可以对细胞内的轴向位置进行快速、精确定位，再结合横向定位可以实现快速、精确的活体细胞三维成像。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种生物细胞三维成像系统，其特征在于，包括：

光源；

转换单元，用于将所述光源发出的光束转换为无衍射光束；

第一透镜，用于将所述无衍射光束进行会聚；

物镜，设置于所述第一透镜的输出光路上，用于将所述无衍射光束投射至待测物，在所述待测物的照明空间内形成针状光束，并收集所述待测物在所述针状光束的激发下产生的荧光；

双色镜，设置于所述第一透镜和所述物镜之间，用于透射无衍射光束并反射荧光；

荧光成像单元，设置于所述双色镜的反射光路上，用于对所述荧光成像；

单螺旋单元，设置于所述荧光成像单元的输出光路上，用于将所述荧光转换为单螺旋光；

探测器，设置于所述单螺旋单元的输出光路上，所述单螺旋光在所述探测器中形成多个像点，所述多个像点位于一同心圆的不同位置，所述像点的位置用于对所述细胞内的轴向位置进行定位。

2.如权利要求1所述的生物细胞三维成像系统，其特征在于，所述单螺旋单元包括第二透镜、第三透镜和设置于所述第二透镜和第三透镜之间的相位板，所述荧光成像单元的像面处于所述第二透镜的物方焦点处，所述相位板位于所述第二透镜的像方焦点处和第三透镜的物方焦点处，所述探测器的像面处于所述第三透镜的像方焦点处。

3.如权利要求1所述的生物细胞三维成像系统，其特征在于，所述针状光束的轴向长度大于待测物内的待测细胞的轴向长度。

4.如权利要求1所述的生物细胞三维成像系统，其特征在于，所述转换单元为角锥棱镜，包括同轴设置的柱状部和锥状部，所述柱状部靠近所述光源，所述锥状部的锥形顶点指向光束的传输方向。

5.如权利要求4所述的生物细胞三维成像系统，其特征在于，在所述光源和转换单元之间还设有准直扩束单元以及模式转换装置，所述模式转换装置设置于所述光源和准直扩束单元之间，用于将所述光源发出的线偏振光转换为径向偏振光。

6.如权利要求1所述的生物细胞三维成像系统，其特征在于，所述光源采用激光光源；所述生物细胞三维成像系统还包括载物平台，用于承载所述待测物；所述生物细胞三维成像系统还包括平移台，与所述载物平台连接以驱动所述载物平台在二位方向上平移。

7.如权利要求6所述的生物细胞三维成像系统，其特征在于，所述生物细胞三维成像系统还包括用于滤除非荧光的荧光滤光片，所述荧光滤光片设置于所述双色镜和荧光成像单元之间。

8.一种生物细胞三维成像方法，其特征在于，包括：

将光源发出的光束转换为无衍射光束；

将所述无衍射光束聚焦于待测物，在所述待测物的细胞内形成针状光束，使所述待测物产生荧光；

将所述荧光转换为单螺旋光，并基于所述单螺旋光进行成像；

通过设置于所述单螺旋光的成像面处的探测器收集所述单螺旋光，所述单螺旋光在所述探测器中形成多个像点，所述多个像点位于一同心圆的不同位置；

根据多个像点的位置进行轴向定位。

9.如权利要求8所述的生物细胞三维成像方法，其特征在于，

所述根据多个像点的位置进行轴向定位的步骤包括：

计算所述像点相对于所述圆周上的参考像点的旋转角度，所述参考像点对应细胞内一已知的轴向参考位置；

根据所述旋转角度以及预先标定的算法进行轴向定位。

10.如权利要求8所述的生物细胞三维成像方法，其特征在于，所述生物细胞三维成像方法还包括：

使所述光源对待测物进行横向扫描，进行横向定位；

根据所述横向定位的信息及所述轴向定位的信息对细胞进行三维成像。