CN109964963A - 毛头鬼伞和霜霉威在防治葡萄霜霉病中的应用 - Google Patents

毛头鬼伞和霜霉威在防治葡萄霜霉病中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109964963A
CN109964963A CN201910298752.3A CN201910298752A CN109964963A CN 109964963 A CN109964963 A CN 109964963A CN 201910298752 A CN201910298752 A CN 201910298752A CN 109964963 A CN109964963 A CN 109964963A
Authority
CN
China
Prior art keywords
propamocarb
protein extract
shaggy cap
solution
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910298752.3A
Other languages
English (en)
Inventor
杜飞
赵爽
邓维萍
何霞红
朱书生
荣成博
高宜
杨阳
梅馨月
张能
何涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yunnan Agricultural University
Original Assignee
Yunnan Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yunnan Agricultural University filed Critical Yunnan Agricultural University
Priority to CN201910298752.3A priority Critical patent/CN109964963A/zh
Publication of CN109964963A publication Critical patent/CN109964963A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/44—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids
    • A01N37/46—N-acyl derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N47/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid
    • A01N47/08—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having one or more single bonds to nitrogen atoms
    • A01N47/10—Carbamic acid derivatives, i.e. containing the group —O—CO—N<; Thio analogues thereof
    • A01N47/12—Carbamic acid derivatives, i.e. containing the group —O—CO—N<; Thio analogues thereof containing a —O—CO—N< group, or a thio analogue thereof, neither directly attached to a ring nor the nitrogen atom being a member of a heterocyclic ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了毛头鬼伞和霜霉威在防治葡萄霜霉病中的应用。本发明的防治葡萄霜霉病的药剂含有霜霉威和毛头鬼伞蛋白质提取物；毛头鬼伞蛋白质提取物的制备方法包括：将毛头鬼伞子实体粉碎后用水浸提，收集水溶性物质，得到毛头鬼伞水溶性提取物；对该毛头鬼伞水溶性提取物用硫酸铵沉淀蛋白质，收集沉淀，对沉淀用水透析后，得到毛头鬼伞蛋白质提取物。霜霉威和毛头鬼伞蛋白质提取物对葡萄霜霉病菌的EC50分别为0.21和3.24mg/L，霜霉威与毛头鬼伞蛋白质提取物按照21:490的质量比混配产生了协同作用，对葡萄霜霉病菌的EC50为0.13mg/L。本发明在治疗和预防葡萄霜霉病方面有减少化学药剂使用量的优点。

Description

毛头鬼伞和霜霉威在防治葡萄霜霉病中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中葡萄霜霉病的防治，特别涉及毛头鬼伞和霜霉威在防治葡萄霜霉病中的应用。
背景技术
葡萄霜霉病是由卵菌门、卵菌纲、霜霉目Plasmopara viticola(Berk.dt Curtis)Berl.Et de Toni.侵染所致，该菌为专性寄生菌。该菌菌丝体无隔多核，在寄主细胞间生长，以球状吸器深入寄主细胞内吸取养分。病菌主要以卵孢子在落叶中越冬，在暖冬地区，附着在芽上和挂在树上的叶片内的菌丝体也能越冬。
葡萄霜霉病是一种世界性的葡萄病害。葡萄霜霉病主要危害叶片，也能侵染新梢幼果等幼嫩组织。目前葡萄霜霉病的防治方法主要有物理防治法和化学防治法。物理防治法是清除病原和加强果园管理。化学防治法采用氟吗啉、乙磷铝、烯酰吗啉、霜霉威、霜脲氰等内吸性杀菌剂进行霜霉病的防治。葡萄生产中长期高量使用化学农药，引起了一系列问题，如病原菌/病虫的抗药性增加，果农不得不加大农药的使用量，农药成本增加；果实农残超标，环境污染风险增大；非靶标生物受害和慢性毒性等诸多问题，因此葡萄生产急需安全性高，残留量低，无公害的病虫害防控技术。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何降低预防和/或治疗葡萄霜霉病中的化学药剂的使用量。
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种制剂。
本发明所提供的制剂含有霜霉威和毛头鬼伞蛋白质提取物；所述毛头鬼伞蛋白质提取物按照包括如下步骤的方法制备：
1)将毛头鬼伞子实体粉碎后用水浸提，收集水溶性物质，得到毛头鬼伞水溶性提取物；
2)对所述毛头鬼伞水溶性提取物用硫酸铵沉淀蛋白质，收集沉淀，对所述沉淀用水透析后，得到所述毛头鬼伞蛋白质提取物；
所述制剂为葡萄霜霉病菌抑制剂，或为预防和/或治疗葡萄霜霉病的药剂。
上述制剂中，所述用硫酸铵沉淀蛋白质可为用饱和度为80％的硫酸铵沉淀蛋白质。
上述制剂中，所述用水透析可为用去离子水透析。
上述步骤2)中，所述用去离子水透析采用截留分子量为3kDa半透膜进行。
上述制剂中，霜霉威和所述毛头鬼伞蛋白质提取物的质量比可为21：210，所述毛头鬼伞蛋白质提取物的质量以蛋白质的质量计。
霜霉威和毛头鬼伞在制备预防和/或治疗葡萄霜霉病药剂中的应用也属于本发明的保护范围。
霜霉威和所述毛头鬼伞蛋白质提取物在预防和/或治疗葡萄霜霉病中的应用也属于本发明的保护范围。
霜霉威和毛头鬼伞在制备葡萄霜霉病菌抑制剂中的应用也属于本发明的保护范围。
霜霉威和所述毛头鬼伞蛋白质提取物在抑制葡萄霜霉病菌中的应用也属于本发明的保护范围。
所述毛头鬼伞蛋白质提取物的下述任一种用途也属于本发明的保护范围：
Μ1.所述毛头鬼伞蛋白质提取物在制备预防和/或治疗葡萄霜霉病药剂中的应用；
Μ2.所述毛头鬼伞蛋白质提取物在预防和/或治疗葡萄霜霉病中的应用；
Μ3.所述毛头鬼伞蛋白质提取物制备葡萄霜霉病菌抑制剂中的应用；
Μ4.所述毛头鬼伞蛋白质提取物在抑制葡萄霜霉病菌中的应用。
毛头鬼伞的下述任一种用途也属于本发明的保护范围：
N1.毛头鬼伞在制备预防和/或治疗葡萄霜霉病药剂中的应用；
N2.毛头鬼伞在预防和/或治疗葡萄霜霉病中的应用；
N3.毛头鬼伞在制备葡萄霜霉病菌抑制剂中的应用；
N4.毛头鬼伞在抑制葡萄霜霉病菌中的应用。
上文中，所述预防和/或治疗葡萄霜霉病的药剂和所述葡萄霜霉病菌抑制剂的活性成分可为霜霉威和所述毛头鬼伞蛋白质提取物。所述预防和/或治疗葡萄霜霉病的药剂的活性成分还可含有其它组分，所述其它组分本领域技术人员可根据预防和/或治疗葡萄霜霉病的效果确定。所述葡萄霜霉病菌抑制剂的活性成分还可含有其它组分，所述其它组分本领域技术人员可根据对葡萄霜霉病菌的抑制效果确定。
所述预防和/或治疗葡萄霜霉病的药剂和所述葡萄霜霉病菌抑制剂还可包括载体。所述载体可为微粉CaCO3、草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石、硅藻土和水中的至少一种。上述预防和/或治疗葡萄霜霉病的药剂和所述葡萄霜霉病菌抑制剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
上述步骤1)中，所述用水浸提可为在2-6℃用水浸提10-14小时。所述水可为去离子水。
所述毛头鬼伞子实体可为新鲜的子实体也可为干燥的子实体。所述干燥的子实体是将新鲜的毛头鬼伞子实体在常温(如20-25℃)下干燥得到的。
所述新鲜毛头鬼伞子实体和水的体积比可为1：40-60，如1：40。
上述步骤1)中，可采用离心收集所述水溶性物质。离心收集所述水溶性物质的离心力可为6000-15000g(如12000g)，离心时间可为10-20分钟(如15分钟)。上述步骤2)中，也可采用离心收集所述沉淀。离心收集所述沉淀的离心力可为6000-15000g(如12000g)，离心时间可为10-20分钟(如15分钟)。
上述步骤2)中，在4℃对所述毛头鬼伞水溶性提取物进行饱和度为80％的硫酸铵沉淀。
上述制备方法还包括将透析后的半透膜内的液体在3000-9000g(如6000g)，离心10-20分钟(如15分钟)，收集上清液，将该上清液进行冷冻干燥，制备成毛头鬼伞蛋白质提取物干粉的步骤。
实验证明霜霉威对葡萄霜霉病菌的EC50为0.21mg/L，毛头鬼伞蛋白质提取物葡萄霜霉病菌的EC50为3.24mg/L，霜霉威与毛头鬼伞蛋白质提取物混配后，对葡萄霜霉病菌有显著增效作用：霜霉威和蛋白质的质量比为21:490的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂的共毒系数为1520.64。说明霜霉威与毛头鬼伞蛋白质提取物按照霜霉威与毛头鬼伞蛋白质提取物中的蛋白质质量比为21:490的比例混配产生了协同作用。霜霉威和蛋白质的质量比为21:490的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂对葡萄霜霉病菌具有显著的抑制作用，对葡萄霜霉病菌的EC50为0.13mg/L，远小于霜霉威对葡萄霜霉病菌的EC50。本发明在治疗和预防葡萄霜霉病方面有减少化学药剂霜霉威的使用量保证果实安全品质的优点。
附图说明
图1为田间采集的葡萄霜霉病病叶照片。
图2为葡萄霜霉病菌对毛头鬼伞蛋白质提取物、毛头鬼伞蛋白质提取物和霜霉威的敏感性照片。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的毛头鬼伞为毛头鬼伞(Coprinus comatus)已于1992年9月21日收藏于中国普通微生物保藏管理中心(China General MicrobiologicalCultureCollection Center,CGMCC)，保藏号为CGMCC 5.615，自该收藏日起公众可从CGMCC获得该菌株。
下述实施例中的大杯伞为大杯伞(Clitocybe maxima)(又称Clitocybe maxima(P.Gaertn.,G.Mey.&Scherb.)P.Kumm.)已于2013年4月26日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会林业微生物中心(又称中国林业微生物菌种保藏管理中心，China ForestryCulture Collection Center，英文缩写CFCC，简称林业微生物中心)，保藏号为CFCC89534，自该收藏日起公众可从CFCC获得该菌株。
实施例1、毛头鬼伞蛋白质提取物以及霜霉威与毛头鬼伞蛋白质提取物混配对葡萄霜霉病菌的抑制作用
1、食用菌蛋白质提取物的制备
1.1、名称为毛头鬼伞蛋白质提取物的制备
用40倍体积的去离子水浸泡冷冻干燥的毛头鬼伞子实体2小时，利用组织捣碎机将混合物进行组织破碎至糊状，于4℃浸提(即静置)12h后，12000g离心15min，收集上清液，该上清液即为毛头鬼伞水溶性提取物。
在4℃向毛头鬼伞水溶性提取物中加入(NH4)2SO4至(NH4)2SO4的饱和度为80％，于4℃条件下静置4小时，12000g离心15min，收集沉淀，对该沉淀进行透析。其中，透析采用的半透膜的截留分子量为3kDa，沉淀在半透膜中在流动的自来水中透析5h，再在去离子水中透析12h。将透析后的半透膜内的液体在6000g离心15min，收集上清液，将该上清液置于液氮中冷冻，并冷冻干燥36小时，获得蛋白质粉，研磨成粉末状,该粉末即为毛头鬼伞蛋白质提取物。该毛头鬼伞蛋白质提取物的有效成分(活性成分)为蛋白质。用BCA法测定该毛头鬼伞蛋白质提取物的蛋白质含量，结果表明该毛头鬼伞蛋白质提取物的蛋白质含量为78.41％(质量百分含量)。
1.2、名称为大杯伞蛋白质提取物的制备
用40倍体积的去离子水浸泡冷冻干燥的大杯伞子实体2小时，利用组织捣碎机将混合物进行组织破碎至糊状，于4℃浸提(即静置)12h后，12000g离心15min，收集上清液，该上清液即为大杯伞水溶性提取物。
在4℃向大杯伞水溶性提取物中加入(NH4)2SO4至(NH4)2SO4的饱和度为80％，于4℃条件下静置4小时，12000g离心15min，收集沉淀，对该沉淀进行透析。其中，透析采用的半透膜的截留分子量为3kDa，沉淀在半透膜中在流动的自来水中透析5h，再在去离子水中透析12h。将透析后的半透膜内的液体在6000g离心15min，收集上清液，将该上清液置于液氮中冷冻，并冷冻干燥36小时，获得蛋白质粉，研磨成粉末状,该粉末即为大杯伞蛋白质提取物。该大杯伞蛋白质提取物的有效成分(活性成分)为蛋白质。用BCA法测定该大杯伞蛋白质提取物的蛋白质含量，结果表明该大杯伞蛋白质提取物的蛋白质含量为73.17％(质量百分含量)。
2、食用菌蛋白质溶液的配置
2.1、配制蛋白质浓度分别为5、50、500μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液
取1.1的毛头鬼伞蛋白质提取物(蛋白质含量为78.41％)19.13mg于离心管中，每管加入30mL无菌水，震荡几次，置于25℃水浴3min，待蛋白质溶解后取出离心管，得到蛋白质浓度为500μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液(简称500μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液)。
取蛋白质浓度为500μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液3mL加27mL无菌水配成30mL蛋白质浓度为50μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液(简称50μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液)。
取蛋白质浓度为50μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液3mL加27mL无菌水配成30mL蛋白质浓度为5μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液(简称5μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液)。
2.2、配制蛋白质浓度分别为5、50、500μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液
取1.2的大杯伞蛋白质提取物(蛋白质百分含量为73.17％)20.5mg于离心管中，每管加入30mL无菌水，震荡几次，置于25℃水浴3min，待蛋白质溶解后取出离心管，得到蛋白质浓度为500μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液(简称500μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液)。
取蛋白质浓度为500μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液3mL加27mL无菌水配成30mL蛋白质浓度为50μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液(简称50μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液)。
取蛋白质浓度为50μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液3mL加27mL无菌水配成30mL蛋白质浓度为5μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液(简称5μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液)。
3、配制霜霉威浓度为1、5、10μg/mL的霜霉威溶液
(1)母液的配制：取103μL霜霉威原液加上9.897mL的丙酮配制成97％的溶液；该母液中霜霉威的浓度为1×104μg/mL。
(2)稀释液的配制：即取0.5mL的母液加上4.5mL的丙酮，得到5mL的1000μg/mL的霜霉威溶液。
(3)配制霜霉威浓度为1、5、10μg/mL的霜霉威溶液
取1000μg/mL的霜霉威溶液0.4mL加上39.6mL的无菌水配成40mL浓度为10μg/mL的霜霉威溶液；
取10μg/mL的霜霉威溶液20mL加上20mL的无菌水配成40mL浓度为5μg/mL的霜霉威溶液；
取5μg/mL的霜霉威溶液8mL加上32mL的无菌水配成40mL浓度为1μg/mL的霜霉威溶液。
4、宿主与病原
4.1葡萄健康叶片的采集
于云南省昆明市寻甸县农场、寻甸县云南农业大学现代化教育基地的葡萄园内，采集品种为红地球的葡萄健康叶片用于葡萄霜霉病的相关研究。
4.2葡萄霜霉菌的采集和分离
2013年8～9月于云南农业大学现代化教育基地、基地周边葡萄园等地区的葡萄园中采集葡萄霜霉病病叶。田间观察结果可知：叶片染病初呈半透明、边缘不清晰的淡黄绿色油浸状斑点，后扩展成黄色至褐色多角形斑。湿度大时，背面产生白色霉层，即病菌的孢囊梗和孢子囊，病斑最后变褐，叶片干枯(图1)。每个葡萄园采用5点法取样以降低采集到相同菌株的几率。采集的葡萄霜霉病叶用保鲜袋保湿，将其放于温度为21℃，相对湿度为90-100﹪，光照16h/黑暗8h的培养箱中保湿培养，待叶片重新长出新鲜的菌丝后备用。
用4℃的无菌水将培养后新鲜的霜霉菌在显微镜观察配制成浓度为1×104个孢子/ml的霜霉菌孢子悬浮液，可将孢子悬浮液用于后续试验。
5、葡萄霜霉病菌分别对毛头鬼伞蛋白质提取物、大杯伞蛋白质提取物和霜霉威敏感基线的建立
5.1药剂处理
选择3-4叶期叶龄、大小尽量一致的健康葡萄红地球叶片，用无菌水冲洗后，将3-5片叶子重叠，用打孔器制取ф15mm的叶盘，并将所有叶盘随机混匀备用。实验重复三次，每次将叶盘分为四组：毛头鬼伞蛋白质提取物组、大杯伞蛋白质提取物组、霜霉威组和对照组。毛头鬼伞蛋白质提取物组设500μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液处理、50μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液处理和5μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液处理这三个处理，每个处理15个叶盘；大杯伞蛋白质提取物组设500μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液处理、50μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液处理和5μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液处理这三个处理，每个处理15个叶盘；霜霉威组设10μg/mL的霜霉威溶液处理、5μg/mL的霜霉威溶液处理和1μg/mL的霜霉威溶液处理这三个处理，每个处理15个叶盘。
分别向500μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液、50μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液和5μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液中加入吐温20，使吐温20的浓度为0.1μg/mL，得到毛头鬼伞蛋白质提取物组处理液；
分别向500μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液、50μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液和5μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液中加入吐温20，使吐温20的浓度为0.1μg/mL，得到大杯伞提取物组处理液；
分别向10μg/mL的霜霉威溶液、5μg/mL的霜霉威溶液和1μg/mL的霜霉威溶液中加入吐温20，使吐温20的浓度为0.1μg/mL，得到霜霉威组处理液。
对照处理液为用无菌水作为溶剂，吐温20作为溶质配制吐温20的浓度为0.1μg/mL的溶液。
在每个培养皿盖子中放入15个叶盘，按照标记的浓度分别加入10mL对应浓度的药剂对叶片进行浸泡处理20分钟，完成药剂处理。浸泡时正面朝上，保证药剂浸入叶背。
5.2葡萄霜霉病菌的接种和培养
浸泡结束后将经过5.1的药剂处理的叶盘上的药液吸干，叶背朝上置于用相同药剂浓度润湿的吸水纸上，然后用液滴法将4.2的浓度为1×104个孢子/ml的霜霉菌孢子悬浮液接种到健康的离体叶片背面，每个叶盘接种20μL霜霉菌孢子悬浮液(1×104个孢子/mL)，将接种后的叶盘放置于19℃光照培养箱中黑暗培养24h，以确保病原菌的侵入，然后在19℃、12h光暗交替的光照培养箱中保湿培养，直到开始发病。然后连续监测叶盘上的发病面积，计算防治效果和EC50。用该方法测定葡萄霜霉病菌对毛头鬼伞蛋白质提取物、大杯伞蛋白质提取物和霜霉威的敏感性测定，并建立敏感基线。
5.3结果调查及统计分析
5.3.1调查方法
培养发病后采用方格法(每个方格面积为4mm2)测量叶盘上的发病面积，按照以下公式计算毛头鬼伞蛋白质提取物、大杯伞蛋白质提取物和霜霉威对葡萄霜霉病菌的抑制率。
5.3.2数据统计分析
将抑制率转化成机率值(y)，浓度转化成对数值(x)，求出各药剂对葡萄霜霉病菌的毒力回归曲线方程y＝a+bx，以及有效抑制中浓度EC50值和相关系数r。
结果表明葡萄霜霉病菌对霜霉威、毛头鬼伞蛋白质提取物和大杯伞蛋白质提取物具有显著的敏感性，主要表现为发病率显著降低，病情指数显著降低，抗病能力增强(图2)。霜霉威对葡萄霜霉病菌的EC50为0.21mg/L，毛头鬼伞蛋白质提取物对葡萄霜霉病菌的EC50为3.24mg/L，大杯伞蛋白质提取物对葡萄霜霉病菌的EC50为0.05mg/L(表1)。葡萄霜霉病菌对毛头鬼伞蛋白质提取物的敏感性低于霜霉威。葡萄霜霉病菌对大杯伞蛋白质提取物的敏感性高于霜霉威。
表1、葡萄霜霉病菌分别对毛头鬼伞蛋白质提取物、大杯伞蛋白质提取物和霜霉威敏感性测定结果
6.霜霉威分别和毛头鬼伞蛋白质提取物、大杯伞蛋白质提取物混配对葡萄霜霉病菌的室内联合毒力测定
参照Schepers(1984)及Ishii(2001)等的方法，用叶盘法进行葡萄霜霉病菌对霜霉威和毛头鬼伞蛋白质提取物、大杯伞蛋白质提取物的毒力测定。
6.1、配制蛋白质浓度分别为5、50、500μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液
同2.1。
6.2、配制蛋白质浓度分别为5、50、500μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液
同2.2。
6.3、配制霜霉威浓度为1、5、10μg/mL的霜霉威溶液
同3。
6.4、配制霜霉威与毛头鬼伞蛋白质提取物的混配药剂溶液
6.4.1配制霜霉威和蛋白质的质量比为21:490的浓度分别为3.5mg/L、35mg/L和350mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液
将5μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液和1μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为3.5mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为3.5mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:490。
将50μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液和5μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为35mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为35mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:490。
将500μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液和10μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为350mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为350mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:490。
其中，各混配药剂的有效成分(活性成分)均为蛋白质和霜霉威，各混配药剂溶液的浓度为毛头鬼伞蛋白质提取物中所含蛋白质的浓度和霜霉威的浓度之和。
6.4.2配制霜霉威和蛋白质的质量比为21:315的浓度分别为3.0mg/L、30mg/L和300mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液
将5μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液和1μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为3.0mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为3.0mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:315。
将50μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液和5μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为30mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为30mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:315。
将500μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液和10μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为300mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为300mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:315。
其中，各混配药剂的有效成分(活性成分)均为蛋白质和霜霉威，各混配药剂溶液的浓度为毛头鬼伞蛋白质提取物中所含蛋白质的浓度和霜霉威的浓度之和。
6.4.3配制霜霉威和蛋白质的质量比为21:210的浓度分别为2.5mg/L、25mg/L和250mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液
将5μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液和1μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为2.5mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为2.5mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:210。
将50μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液和5μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为25mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为25mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:210。
将500μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液和10μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为250mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为250mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:210。
其中，各混配药剂的有效成分(活性成分)均为蛋白质和霜霉威，各混配药剂溶液的浓度为毛头鬼伞蛋白质提取物中所含蛋白质的浓度和霜霉威的浓度之和。
6.4.4配制霜霉威和蛋白质的质量比为21:140的浓度分别为2.0mg/L、20mg/L和200mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液
将5μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液和1μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为2.0mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为2.0mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:140。
将50μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液和5μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为20mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为20mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:140。
将500μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液和10μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为200mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为200mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:140。
其中，各混配药剂的有效成分(活性成分)均为蛋白质和霜霉威，各混配药剂溶液的浓度为毛头鬼伞蛋白质提取物中所含蛋白质的浓度和霜霉威的浓度之和。
6.4.5配制霜霉威和蛋白质的质量比为21:90的浓度分别为1.5mg/L、15mg/L和150mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液
将5μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液和1μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为1.5mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为1.5mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:90。
将50μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液和5μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为15mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为15mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:90。
将500μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液和10μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为150mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为150mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:90。
其中，各混配药剂的有效成分(活性成分)均为蛋白质和霜霉威，各混配药剂溶液的浓度为毛头鬼伞蛋白质提取物中所含蛋白质的浓度和霜霉威的浓度之和。
6.5、配制霜霉威与大杯伞蛋白质提取物的混配药剂溶液
6.5.1配制霜霉威和蛋白质的质量比为21:490的浓度分别为3.5mg/L、35mg/L和350mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液
将5μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液和1μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为3.5mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为3.5mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:490。
将50μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液和5μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为35mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为35mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:490。
将500μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液和10μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为350mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为350mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:490。
其中，各混配药剂的有效成分(活性成分)均为蛋白质和霜霉威，各混配药剂溶液的浓度为大杯伞蛋白质提取物中所含蛋白质的浓度和霜霉威的浓度之和。
6.5.2配制霜霉威和蛋白质的质量比为21:315的浓度分别为3.0mg/L、30mg/L和300mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液
将5μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液和1μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为3.0mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为3.0mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:315。
将50μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液和5μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为30mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为30mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:315。
将500μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液和10μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为300mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为300mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:315。
其中，各混配药剂的有效成分(活性成分)均为蛋白质和霜霉威，各混配药剂溶液的浓度为大杯伞蛋白质提取物中所含蛋白质的浓度和霜霉威的浓度之和。
6.5.3配制霜霉威和蛋白质的质量比为21:210的浓度分别为2.5mg/L、25mg/L和250mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液
将5μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液和1μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为2.5mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为2.5mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:210。
将50μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液和5μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为25mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为25mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:210。
将500μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液和10μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为250mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为250mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:210。
其中，各混配药剂的有效成分(活性成分)均为蛋白质和霜霉威，各混配药剂溶液的浓度为大杯伞蛋白质提取物中所含蛋白质的浓度和霜霉威的浓度之和。
6.5.4配制霜霉威和蛋白质的质量比为21:140的浓度分别为2.0mg/L、20mg/L和200mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液
将5μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液和1μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为2.0mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为2.0mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:140。
将50μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液和5μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为20mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为20mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:140。
将500μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液和10μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为200mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为200mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:140。
其中，各混配药剂的有效成分(活性成分)均为蛋白质和霜霉威，各混配药剂溶液的浓度为大杯伞蛋白质提取物中所含蛋白质的浓度和霜霉威的浓度之和。
6.5.5配制霜霉威和蛋白质的质量比为21:90的浓度分别为1.5mg/L、15mg/L和150mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液
将5μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液和1μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为1.5mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为1.5mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:90。
将50μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液和5μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为15mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为15mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:90。
将500μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液和10μg/mL的霜霉威溶液混合得到浓度为150mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液，该浓度为150mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液中，霜霉威和蛋白质的质量比为21:90。
其中，各混配药剂的有效成分(活性成分)均为蛋白质和霜霉威，各混配药剂溶液的浓度为大杯伞蛋白质提取物中所含蛋白质的浓度和霜霉威的浓度之和。
6.6药剂处理
选择3-4叶期叶龄、大小尽量一致的健康葡萄红地球叶片，用自来水冲洗后，将3-5片叶子重叠，用打孔器制取ф15mm的叶盘，并将所有叶盘随机混匀备用。实验重复三次，每次将叶盘分为14组：毛头鬼伞蛋白质提取物组、大杯伞蛋白质提取物组、霜霉威组、霜霉威和蛋白质的质量比为21:490的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液组(简称霜：毛＝21:490组)、霜霉威和蛋白质的质量比为21:315的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液组(简称霜：毛＝21:315组)、霜霉威和蛋白质的质量比为21:210的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液组(简称霜：毛＝21:210组)、霜霉威和蛋白质的质量比为21:140的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液组(简称霜：毛＝21:140组)、霜霉威和蛋白质的质量比为21:90的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液组(简称霜：毛＝21:90)组、霜霉威和蛋白质的质量比为21:490的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液组(简称霜：大＝21:490组)、霜霉威和蛋白质的质量比为21:315的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液组(简称霜：大＝21:315组)、霜霉威和蛋白质的质量比为21:210的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液组(简称霜：大＝21:210组)、霜霉威和蛋白质的质量比为21:140的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液组(简称霜：大＝21:140组)、霜霉威和蛋白质的质量比为21:90的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液组(简称霜：大＝21:90组)和对照组。
毛头鬼伞蛋白质提取物组设500μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液处理、50μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液处理和5μg/mL的毛头鬼伞蛋白质提取物溶液处理这三个处理，每个处理15个叶盘；大杯伞蛋白质提取物组设500μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液处理、50μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液处理和5μg/mL的大杯伞蛋白质提取物溶液处理这三个处理，每个处理15个叶盘；霜霉威组设10μg/mL的霜霉威溶液处理、5μg/mL的霜霉威溶液处理和1μg/mL的霜霉威溶液处理这三个处理，每个处理15个叶盘。霜：毛＝21:490组设3.5mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理、35mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理、350mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理这三个处理，每个处理15个叶盘；霜：毛＝21:315组设3.0mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理、30mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理、300mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理这三个处理，每个处理15个叶盘；霜：毛＝21:210组设2.5mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理、25mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理、250mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理这三个处理，每个处理15个叶盘；霜：毛＝21:140组设2.0mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理、20mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理、200mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理这三个处理，每个处理15个叶盘；霜：毛＝21:90组均分别设1.5mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理、15mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理、150mg/L的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理这三个处理，每个处理15个叶盘。霜：大＝21:490组设3.5mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理、35mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理、350mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理这三个处理，每个处理15个叶盘；霜：大＝21:315组设3.0mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理、30mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理、300mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理这三个处理，每个处理15个叶盘；霜：大＝21:210组设2.5mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理、25mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理、250mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理这三个处理，每个处理15个叶盘；霜：大＝21:140组设2.0mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理、20mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理、200mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理这三个处理，每个处理15个叶盘；霜：大＝21:90组均分别设1.5mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理、15mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理、150mg/L的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂溶液处理这三个处理，每个处理15个叶盘。对照处理液为用无菌水作为溶剂，吐温20作为溶质配制吐温20的浓度为0.1μg/mL的溶液。
在每个培养皿盖子中放入15个叶盘，除对照组外其余各组的各种处理，按照标记的浓度分别加入10mL对应浓度的药剂并同时加入吐温20使吐温20的含量为0.1μg/mL，对叶片进行浸泡处理20分钟，完成药剂处理。对照组的培养皿盖子中放入15个叶盘，加入10mL对照处理液，对叶片进行浸泡处理20分钟，完成药剂处理。浸泡时正面朝上，保证药剂浸入叶背。
6.7葡萄霜霉病菌的接种和培养
浸泡结束后将经过6.6的药剂处理的叶盘上的药液吸干，叶背朝上置于用相同药剂润湿的吸水纸上，然后用液滴法将4.2的浓度为1×104个孢子/ml的霜霉菌孢子悬浮液接种到叶片背面，每个叶盘接种20μL霜霉菌孢子悬浮液(1×104个孢子/mL)，将接种后的叶盘放置于19℃光照培养箱中黑暗培养24h，以确保病原菌的侵入，然后在19℃、12h光暗交替的光照培养箱中保湿培养，直到开始发病。培养发病后采用方格法(每个方格面积为4mm2)测量叶盘上的发病面积，按照如下公式计算毛头鬼伞蛋白质提取物、大杯伞蛋白质提取物、霜霉威、霜霉威和蛋白质的质量比为21:490的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂(简称霜：毛＝21:490)、霜霉威和蛋白质的质量比为21:315的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂(简称霜：毛＝21:315)、霜霉威和蛋白质的质量比为21:210的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂(简称霜：毛＝21:210)、霜霉威和蛋白质的质量比为21:140的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂(简称霜：毛＝21:140)、霜霉威和蛋白质的质量比为21:90的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂(简称霜：毛＝21:90)、霜霉威和蛋白质的质量比为21:490的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂(简称霜：大＝21:490)、霜霉威和蛋白质的质量比为21:315的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂(简称霜：大＝21:315)、霜霉威和蛋白质的质量比为21:210的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂(简称霜：大＝21:210)、霜霉威和蛋白质的质量比为21:140的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂(简称霜：大＝21:140)、霜霉威和蛋白质的质量比为21:90的大杯伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂(简称霜：大＝21:90)各种处理对葡萄霜霉病菌的抑制率和有效抑制中浓度EC50。
将抑制率转化成机率值(y)，浓度转化成对数值(x)，求出各药剂对葡萄霜霉病菌的毒力回归曲线方程y＝a+bx，以及有效抑制中浓度EC50值和相关系数r。
混配药剂的联合毒力采用孙云沛的共毒系数方法表示：
毒力指数＝(标准药剂EC50值/供试药剂EC50值)×100
混配药剂实际毒力指数ATI＝(标准药剂EC50值/供试药剂(混配)EC50值)×100
混配药剂理论毒力指数TTI＝∑(某药的毒力指数×在混配药剂中该药有效成分的百分率)。
CTC≧120时为增效作用；CTC≦80时为拮抗作用；80<CTC<120时为加和作用。
结果如表2所示，表明霜霉威与毛头鬼伞蛋白质提取物混配后，对葡萄霜霉病菌有显著增效作用：霜霉威和蛋白质的质量比为21:490的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂的共毒系数为1520.64。说明霜霉威与毛头鬼伞蛋白质提取物按照霜霉威与毛头鬼伞蛋白质提取物中的蛋白质质量比为21:490的比例混配产生了协同作用。霜霉威和蛋白质的质量比为21:490的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂对葡萄霜霉病菌具有显著的抑制作用，对葡萄霜霉病菌的EC50为0.134mg/L，远小于霜霉威对葡萄霜霉病菌的EC50(0.21mg/L)。
霜霉威和蛋白质的质量比为21:315和21:210的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂的共毒系数分别为108.75和83.91，具有加和作用；霜霉威和蛋白质的质量比为21:140和21:90的毛头鬼伞蛋白质提取物与霜霉威的混配药剂的共毒系数分别为61.08和4.31，具有拮抗作用。
表2霜霉威和毛头鬼伞蛋白质提取物混配对葡萄霜霉病菌的室内联合毒力测定结果
药剂 EC50(mg/L) 毒力指数 实际毒力指数 理论毒力指数 共毒系数
霜霉威 0.21 100.00
毛头鬼伞蛋白质提取物 3.24 6.48
霜：毛＝21:490 0.13 156.93 10.32 1520.64
霜：毛＝21:315 1.57 13.40 12.33 108.68
霜：毛＝21:210 1.67 12.57 14.98 83.91
霜：毛＝21:140 1.84 11.41 18.68 61.08
霜：毛＝21:90 20.19 1.04 24.17 4.30
注：表中数据为三次重复实验的平均值。
结果如表3所示，表明霜霉威与大杯伞蛋白质提取物混配后，霜霉威与大杯伞蛋白质提取物对葡萄霜霉病菌均没有显著增效作用，其共毒系数均在120以下。
表3霜霉威和大杯伞蛋白质提取物混配对葡萄霜霉病菌的室内联合毒力测定结果
药剂 EC50(mg/L) 毒力指数 实际毒力指数 理论毒力指数 共毒系数
霜霉威 0.21 100
大杯伞蛋白质提取物 0.05 420
霜：大＝21:490 0.05 420.00 406.85 103.23
霜：大＝21:315 0.05 388.89 370.83 104.87
霜：大＝21:210 0.04 488.37 453.06 107.79
霜：大＝21:140 0.05 396.23 371.10 106.77
霜：大＝21:90 0.06 350.00 352.78 99.21
注：表中数据为三次重复实验的平均值。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.制剂，所述制剂含有霜霉威和毛头鬼伞蛋白质提取物；所述毛头鬼伞蛋白质提取物按照包括如下步骤的方法制备：
1)将毛头鬼伞子实体粉碎后用水浸提，收集水溶性物质，得到毛头鬼伞水溶性提取物；
2)对所述毛头鬼伞水溶性提取物用硫酸铵沉淀蛋白质，收集沉淀，对所述沉淀用水透析后，得到所述毛头鬼伞蛋白质提取物；
所述制剂为葡萄霜霉病菌抑制剂，或为预防和/或治疗葡萄霜霉病的药剂。
2.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于：所述用硫酸铵沉淀蛋白质为用饱和度为80％的硫酸铵沉淀蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的制剂，其特征在于：所述药剂的活性成分为霜霉威和所述毛头鬼伞蛋白质提取物。
4.根据权利要求1、2或3所述的制剂，其特征在于：霜霉威和所述毛头鬼伞蛋白质提取物的质量比为21：490，所述毛头鬼伞蛋白质提取物的质量以蛋白质的质量计。
5.霜霉威和毛头鬼伞在制备预防和/或治疗葡萄霜霉病药剂中的应用。
6.霜霉威和权利要求1-4中任一权利要求中所述毛头鬼伞蛋白质提取物在预防和/或治疗葡萄霜霉病中的应用。
7.霜霉威和毛头鬼伞在制备葡萄霜霉病菌抑制剂中的应用。
8.霜霉威和权利要求1-4中任一权利要求中所述毛头鬼伞蛋白质提取物在抑制葡萄霜霉病菌中的应用。
9.权利要求1-4中任一权利要求中所述毛头鬼伞蛋白质提取物的下述任一种用途：
Μ1.权利要求1-4中任一权利要求中所述毛头鬼伞蛋白质提取物在制备预防和/或治疗葡萄霜霉病药剂中的应用；
Μ2.权利要求1-4中任一权利要求中所述毛头鬼伞蛋白质提取物在预防和/或治疗葡萄霜霉病中的应用；
Μ3.权利要求1-4中任一权利要求中所述毛头鬼伞蛋白质提取物制备葡萄霜霉病菌抑制剂中的应用；
Μ4.权利要求1-4中任一权利要求中所述毛头鬼伞蛋白质提取物在抑制葡萄霜霉病菌中的应用。
10.毛头鬼伞的下述任一种用途：
N1.毛头鬼伞在制备预防和/或治疗葡萄霜霉病药剂中的应用；
N2.毛头鬼伞在预防和/或治疗葡萄霜霉病中的应用；
N3.毛头鬼伞在制备葡萄霜霉病菌抑制剂中的应用；
N4.毛头鬼伞在抑制葡萄霜霉病菌中的应用。
CN201910298752.3A 2019-04-15 2019-04-15 毛头鬼伞和霜霉威在防治葡萄霜霉病中的应用 Pending CN109964963A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910298752.3A CN109964963A (zh) 2019-04-15 2019-04-15 毛头鬼伞和霜霉威在防治葡萄霜霉病中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910298752.3A CN109964963A (zh) 2019-04-15 2019-04-15 毛头鬼伞和霜霉威在防治葡萄霜霉病中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109964963A true CN109964963A (zh) 2019-07-05

Family

ID=67084571

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910298752.3A Pending CN109964963A (zh) 2019-04-15 2019-04-15 毛头鬼伞和霜霉威在防治葡萄霜霉病中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109964963A (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1471806A (zh) * 2003-06-03 2004-02-04 云南大学 毛头鬼伞菌丝的棘状小球结构及其应用
CN101115394A (zh) * 2005-02-08 2008-01-30 国立大学法人静冈大学 植物病害防除剂和植物病害防除方法
CN102246781A (zh) * 2011-08-05 2011-11-23 深圳诺普信农化股份有限公司 一种杀菌组合物
CN102585027A (zh) * 2012-02-23 2012-07-18 上海市农业科学院 一种毛头鬼伞大分子多糖及其制备方法
CN103285043A (zh) * 2013-05-30 2013-09-11 北京市农林科学院 具有抗肿瘤功效的食用真菌蛋白质提取物的制备方法
JP2018177799A (ja) * 2017-04-19 2018-11-15 小山　修 植物の土壌病害防除方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1471806A (zh) * 2003-06-03 2004-02-04 云南大学 毛头鬼伞菌丝的棘状小球结构及其应用
CN101115394A (zh) * 2005-02-08 2008-01-30 国立大学法人静冈大学 植物病害防除剂和植物病害防除方法
CN102246781A (zh) * 2011-08-05 2011-11-23 深圳诺普信农化股份有限公司 一种杀菌组合物
CN102585027A (zh) * 2012-02-23 2012-07-18 上海市农业科学院 一种毛头鬼伞大分子多糖及其制备方法
CN103285043A (zh) * 2013-05-30 2013-09-11 北京市农林科学院 具有抗肿瘤功效的食用真菌蛋白质提取物的制备方法
JP2018177799A (ja) * 2017-04-19 2018-11-15 小山　修 植物の土壌病害防除方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN JINTONG ET,AL: "Antimicrobial activity of edible mushroom culture filtrates on plant pathogens", 《PLANT PATHOLOGY BULLETIN》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104630071B (zh) 一株多孢木霉及其应用
Eslaminejad et al. Morphological characteristics and pathogenicity of fungi associated with Roselle (Hibiscus Sabdariffa) diseases in Penang, Malaysia
Roy Jeersanidhi Memorial Award Lecture-Mycological problems of crude herbal drugs-Overview and challenges-AK. ROY
CN105705629A (zh) 用作生物防治剂的粉红粘帚霉的分离株
CN109843068A (zh) 前沟藻属的一种或多种微藻的细胞提取物用于对植物和培养种子的真菌、卵菌和/或致病细菌的杀真菌和/或杀细菌活性的用途
CN102199558A (zh) 桔黄假单胞菌的培育方法及应用
WO2023000612A1 (zh) 一种芒果蒂腐病菌杀菌剂及其应用
Abdullah et al. Fungi associated with grapevine (Vitis vinifera L) decline in middle of Iraq
CN106119136A (zh) 黑附球菌及其应用
CN109938046A (zh) 葡萄霜霉病生物化学协同控制药剂及其应用
CN108586570A (zh) 一种辣椒抗菌肽的提取纯化方法
Kigigha et al. Assessment of traditional medicinal application of Alchornea cordifolia
CN104450547B (zh) 一种能防治葡萄霜霉病和辣椒疫病的生防菌株、制剂及其应用
CN109022537B (zh) 一种快速评价柑橘溃疡病药剂药效的方法
CN109964963A (zh) 毛头鬼伞和霜霉威在防治葡萄霜霉病中的应用
CN105112315A (zh) 一种烟草普通花叶病毒生防内生菌粪产碱菌菌株
CN109845764A (zh) 鲍鱼菇蛋白质提取物在防治葡萄霜霉病中的应用
CN109593114A (zh) 一种黄蛞蝓抗菌肽、提取方法及其应用
CN105838613A (zh) 一株高产黄柄曲霉素的木豆内生真菌及其应用
Van Anh et al. Morphology, microscopic anatomy and bacterial inhibition of extracts of Ludwigia adscendens (L.) H. Hara plants growing in Lang Sen Wetland Reserve, Long An province, Vietnam
Abdulsalam et al. Isolation and control of fungi associated with neck rot disease of onions (Allium Cepa L.) in Bama, Borno State, Nigeria
CN109964949A (zh) 黄伞多糖提取物和霜霉威在防治葡萄霜霉病中的应用
CN109964962A (zh) 平菇在防治葡萄霜霉病中的应用
Noverita et al. Antibacterial activities of ethanol extracts fruit bodies of Ganoderma lucidum and rigidoporus microphorus against Escherichia coli and staphlyococcus aureus
Kunz Control of post harvest disease (Botryodiplodia sp.) of rambutan and annona species by using a bio-control agent (Trichoderma sp.)

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190705

RJ01 Rejection of invention patent application after publication