CN109957544A - 体外活化及/或扩增免疫细胞的方法 - Google Patents

体外活化及/或扩增免疫细胞的方法 Download PDF

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Abstract

所描述为一种体外活化及/或扩增免疫细胞的方法，包括以下步骤：a)提供磁性粒子，磁性粒子的表面为多突状且修饰有至少一种免疫诱发物质，其中磁性粒子由内而外包括共聚物核心、高分子层、磁性物质层以及硅基层；b)提供细胞溶液，细胞溶液中包括至少一种免疫细胞；c)将磁性粒子与细胞溶液进行接触，使磁性粒子的表面上的至少一种免疫诱发物质得以活化及/或扩增细胞溶液中的至少一种免疫细胞。

Description

体外活化及/或扩增免疫细胞的方法
技术领域
本揭露是关于一种调控免疫细胞的方法，特别是关于一种体外活化及/或扩增免疫细胞的方法。
背景技术
癌症免疫疗法包括单株抗体药物、免疫检查点抑制剂、细胞免疫治疗及癌症疫苗，其中细胞免疫治疗的重大进展使其受到相当的瞩目。
当免疫细胞从病人血液中纯化分离出来后，如何能够有效率且安全地活化及扩增免疫细胞是影响其疗效的关键技术。一般来说，人体中是通过抗原呈递细胞(antigenpresenting cells,APC)来活化免疫细胞并引发免疫反应以毒杀外来物质，而其中，树突状细胞(dendritic cells,DC)为最重要的抗原呈递细胞。
细胞免疫治疗技术发展至今是以人造抗原呈递细胞(artificial antigenpresenting cells,aAPC)来达到体外活化及扩增免疫细胞的目的，其中利用基因工程改造的饲养细胞(feeder cells)作为aAPC由于存在操作不便及安全性的问题，因此具磁性且可快速分离同时又修饰有特定抗体以作为免疫诱发物质的磁性粒子已成为市场主流。
目前应用于活化及扩增免疫细胞的市售磁性粒子几乎皆为圆球形，且表面修饰的抗体也大多相同，主要皆应用于活化及扩增αβT细胞，而缺乏可应用于γδT细胞的相关产品。再者，近年来相关研究文献也指出，磁性粒子本身的尺寸、弹性、表面抗体的组成及修饰方式都可能会影响其活化及扩增免疫细胞的效能。
因此，亟需开发一种可高效能活化及扩增免疫细胞的磁性粒子，且于表面刺激物质的提供选择性上可更多元，以利进一步应用于γδT细胞。
发明内容
本揭露提供一种体外活化及/或扩增免疫细胞的方法，其能以高效率活化及/或扩增免疫细胞。
本揭露的体外活化及扩增免疫细胞的方法包括以下步骤：a)提供磁性粒子，磁性粒子的表面为多突状且修饰有至少一种免疫诱发物质，其中磁性粒子由内而外包括共聚物核心、高分子层、磁性物质层以及硅基层；b)提供细胞溶液，细胞溶液中包括至少一种免疫细胞；c)将磁性粒子与细胞溶液进行接触，使磁性粒子的表面上的至少一种免疫诱发物质得以活化及/或扩增细胞溶液中的至少一种免疫细胞。
在本揭露的一实施例中，上述磁性粒子的表面包括多个形状不规则的突起物。
在本揭露的一实施例中，上述多个突起物的平均高度为100nm～5000nm。
在本揭露的一实施例中，上述磁性粒子的平均直径为1μm～50μm。
在本揭露的一实施例中，上述免疫细胞包括T细胞、NK细胞或前述的组合。
在本揭露的一实施例中，上述免疫细胞包括调节T细胞。
在本揭露的一实施例中，上述免疫细胞包括αβT细胞、γδT细胞或前述的组合。
在本揭露的一实施例中，上述免疫细胞包括γδT细胞。
在本揭露的一实施例中，上述至少一种免疫诱发物质可包括抗CD3抗体、抗CD28抗体、抗TCRγ/δ抗体、抗CD83抗体、抗CD137抗体、4-1BBL、抗CD2抗体、抗CD335抗体或前述的组合。
在本揭露的一实施例中，上述至少一种免疫诱发物质修饰至磁性粒子的表面的方式包括非共价键结(non-covalent binding)、共价键结(covalent binding)、生物素-亲和素作用(avidin-biotin interaction)、静电吸附作用(electrostatic adsorption)、疏水性吸附作用(hydrophobic adsorption)或前述的组合。
在本揭露的一实施例中，上述共聚物核心包括由单官能基单体与双官能基单体共聚而成的共聚物。
在本揭露的一实施例中，上述的双官能基单体相对于单官能基单体的体积百分比例为0.4％～2％。
在本揭露的一实施例中，上述共聚物核心包括苯乙烯/二乙烯苯共聚物、甲基丙烯酸甲酯/三乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、甲基丙烯酸甲酯/乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、苯乙烯/三乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、苯乙烯/乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物或甲基丙烯酸甲酯/二乙烯苯共聚物。
在本揭露的一实施例中，上述高分子层包括带有电荷的至少一官能基团。
在本揭露的一实施例中，上述的至少一官能基团包括羧基、氨基或前述的组合。
在本揭露的一实施例中，上述的磁性物质层包括顺磁性材料(paramagnetic)、超顺磁性材料(superpara magnetic)、铁磁性材料(ferromagnetic)、铁氧体磁性材料(ferritemagnetic)或前述的组合。
在本揭露的一实施例中，上述的磁性物质层包括铁离子(Fe2+)、钴离子(Co2+)、镍离子(Ni2+)或前述的组合。
在本揭露的一实施例中，上述硅基层的厚度至少为1nm～50nm。
基于上述，相较于传统的球体磁性粒子，本揭露实施例所提供的磁性粒子因具有多突状表面，在面对外表型态多属不规则形的免疫细胞，甚至是近似神经细胞的具有不规则突起的树突状细胞时，于仿生的概念下，应可增加磁性粒子与免疫细胞接触的表面积，进而提升磁性粒子活化免疫细胞及/或扩增免疫细胞数目的效能。
此外，在本揭露的另一实施例中，磁性粒子可于其表面通过设计并修饰特定的免疫诱发物质种类，使得磁性粒子可应用于γδT细胞的活化及扩增，进而克服目前尚缺乏可应用于γδT细胞的相关产品的问题。如此一来，将有助免疫细胞应用于癌症免疫疗法等技术的研究与发展。
为让本揭露的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，并配合所附图式作详细说明如下。
附图简述
图1为本揭露一实施例的一种体外活化及/或扩增免疫细胞的方法的流程图。
图2为本揭露一实施例的一种用于体外活化及/或扩增免疫细胞的方法的磁性粒子的示意图。
图3A至图3C依次是本揭露实验例1中平均直径分别为2.5μm、4.5μm以及8.5μm的多突状磁性粒子的电子显微镜照片。
图4为本揭露实验例1的多突状磁性粒子的磁滞曲线。
图5A至5D分别显示使用市售磁性粒子(图5A)、平均直径为2.5μm(图5B)、4.5μm(图5C)以及8.5μm(图5D)的多突状磁性粒子进行T细胞活化及/或扩增于不同培养天数的细胞数量，过程中于培养的第5天移除磁性粒子。其中，横轴代表时间(天)，左方纵轴代表细胞数目，而右方纵轴代表细胞的扩增倍率。又，各长条图中分别以斜线及空白代表活细胞数量及死细胞数量。另，以第0天的初始细胞数量作为对照基准，将其余各天的活细胞数量分别除以第0天的初始细胞数量而获得各天的活细胞数量的平均扩增倍率，并以虚线连结各天所计算的活细胞数量的平均扩增倍率，以显示第0～12天培养过程中活细胞数量的扩增趋势。
图6A至6D分别显示使用市售磁性粒子(图6A)、表面修饰有抗体且抗CD3抗体与抗CD28抗体比例分别为1:2(图6B)、1:6(图6C)以及1:10(图6D)的多突状磁性粒子进行T细胞活化及/或扩增于不同培养天数的细胞数量，过程中于培养的第5天移除磁性粒子。其中，横轴代表时间(天)，左方纵轴代表细胞数目，而右方纵轴代表细胞尺寸(μm)。又，各长条图中分别以斜线及空白代表活细胞数量及死细胞数量。另，以第0天的初始细胞数量作为对照基准，将其余各天的活细胞数量分别除以第0天的初始细胞数量而获得各天的活细胞数量的平均扩增倍率，并以虚线连结各天所计算的活细胞数量的平均扩增倍率，以显示第0～12天培养过程中活细胞数量的扩增趋势。此外，更以实线显示第0～12天培养过程中平均细胞尺寸(μm)的增减态势。
图7A至7C分别显示使用流式细胞仪对T细胞进行分析的结果，其中比较组1、比较组2以及实验组依序为经市售商品TransActTMT Cell reagent、Human T-Activator CD3/CD28以及表面修饰有抗体且抗CD3抗体与抗CD28抗体的比例为1:6的前述多突状磁性粒子进行T细胞活化及/或扩增后的T细胞，并以未经处理的第0天的初始细胞作为对照组。其中，横轴代表各组别，左方纵轴代表各种细胞在所有细胞中所占的比例(％)，DN表示双阴性(double negative)T细胞，Naive表示初始T细胞，TCM表示中央记忆T细胞(central memory T cells)，TEM表示效应记忆T细胞(effector memory T cells,TEM)，TEMRA表示效应记忆重新表现CD45RA T细胞(T effector memory re-expressing CD45RA(TEMRA))。
符号说明
100：磁性粒子
102a、102b：免疫诱发物质
110：多突状共聚物核心
112：突起物
120：高分子层
130：磁性物质层
h：平均高度
实施方式
图1为本揭露一实施例的一种体外活化及/或扩增免疫细胞的方法的流程图。图2为本揭露一实施例的一种用于体外活化及/或扩增免疫细胞的方法的磁性粒子的示意图。请同时参照图1与图2，首先，进行步骤S10，提供磁性粒子100，磁性粒子100的表面为多突状且修饰有至少一种免疫诱发物质102a、102b，其中磁性粒子100由内而外包括共聚物核心110、高分子层120、磁性物质层130以及硅基层140。在一实施例中，磁性粒子100具有平均直径D，即磁性粒子100的最短直径(例如D1)及最长直径(例如D2)的平均值，其范围可为1μm～50μm。在一实施例中，磁性粒子100的平均直径可为2μm～40μm。在另一实施例中，磁性粒子100的平均直径可为3μm～30μm。在又一实施例中，磁性粒子100的平均直径可为4μm～20μm。在再一实施例中，磁性粒子100的平均直径可为2μm～10μm。
上述多突状共聚物核心110为球形，其表面具有多个突起物112。突起物112的平均高度h，即各突起物112的顶端至各突起物112的两底部连线的垂直距离(例如高度h1、h2、h3)的平均值，其范围可为100nm～5000nm，例如为100nm～500nm、500nm～1000nm、1000nm～1500nm、1500nm～2000nm、2000nm～2500nm、2500nm～3000nm、3000nm～3500nm、3500nm～4000nm、4000nm～4500nm或4500nm～5000nm。在一实施例中，突起物112的平均高度h可为300nm～4000nm。在另一实施例中，突起物112的平均高度h可为500nm～3000nm。在又一实施例中，突起物112的平均高度h可为800nm～2000nm。在又另一实施例中，突起物112的平均高度h可为1000nm～1800nm。在一实施例中，突起物112可以是均匀地或不均匀地散布在表面上，以整体来看，突起物112实质上为不规则的突起。例如，突起物112可包括，但不限于乳突状或球状。
在一实施例中，上述多突状共聚物核心110的形成方法为可包括，但不限于分散聚合法、悬浮聚合法或乳化聚合法，意即以上述聚合法将至少2种单体聚合成共聚物。在一实施例中，至少2种单体可以是脂溶性单体，例如可包括单官能基单体、双官能基单体或前述的组合。在一实施例中，若为单官能基单体与双官能基单体的组合，则双官能基单体相对于单官能基单体的体积百分比例可为0.4％～2％，例如是0.5％～1.8％或0.6％～1.5％。
此外，单官能基单体可为单乙烯基单体，诸如苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、氯乙烯或其他单官能基单体。双官能基单体可为双乙烯基单体，诸如二乙烯苯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、三乙二醇二甲基丙烯酸酯或其他双官能基单体。在一实施例中，共聚物可包括苯乙烯/二乙烯苯共聚物、甲基丙烯酸甲酯/三乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、甲基丙烯酸甲酯/乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、苯乙烯/三乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、苯乙烯/乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物或甲基丙烯酸甲酯/二乙烯苯共聚物，但不以此为限。
在一实施例中，上述高分子层120可覆盖多突状共聚物核心110，且高分子层120包括至少一官能基团。其中，高分子层120的材料不同于多突状共聚物核心110，且官能基团可带有电荷，使得多突状共聚物核心110的表面带电，以利于后续吸附磁性物质层130的磁性物质前驱物。在一实施例中，上述官能基团可包括，但不限于带负电。此外，官能基团可为羧基、氨基或其组合，但不限于此。特别一提的是，虽然在图2中是将高分子层120与多突状共聚物核心110绘示为可区别的膜层，然而，高分子层120与多突状共聚物核心110实际上并不存在明显的界线。再者，虽然在本揭露中是以高分子层来统称位于多突状共聚物核心表面的具有官能基团的膜层，但实际上，高分子层120可为经官能基团修饰(modification)的多突状共聚物核心的表面，而非具体形成一膜层。
上述磁性物质层130可覆盖高分子层120。在本一实施例中，覆盖有高分子层120的多突状共聚物核心110可吸附磁性物质前驱物，以于高分子层120上形成磁性物质层130。在一实施例中，磁性物质前驱物可包括，但不限于铁离子(Fe2+)、钴离子(Co2+)、镍离子(Ni2+)或其组合。具体而言，磁性物质前驱物可为前述金属离子的盐类，诸如氯化亚铁、氯化亚钴、氯化镍等。在一实施例中，磁性物质层130的表面可具有小突起，意即具有粗糙表面。此外，磁性物质层130可包括，但不限于顺磁性材料、超顺磁性材料、铁磁性材料、铁氧体磁性材料或其组合。在一实施例中，磁性物质层130可以是铁磁性材料。又，在一实施例中，磁性物质层130可具有实质上均一的厚度，且全面性地包覆共聚物核心110。举例来说，磁性物质层130的厚度可为20nm～200nm，且例如是40nm～100nm。
上述硅基层140可覆盖磁性物质层130。在一实施例中，硅基层140的材料可包括，但不限于硅氧烷、硅玻璃、氧化硅、硅酸盐或其组合。具体而言，硅基层140可包括硅酸四甲酯(tetramethoxysilane,TMOS)、四乙氧基硅烷(tetraethoxysilane,TEOS)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-Aminopropyltriethoxysilane,APTES)、3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane,GOPTS)等材料。又，在一实施例中，硅基层140的厚度可为1nm～50nm，且可为5nm～40nm、10nm～35nm、15nm～30nm或10nm～20nm。
在一实施例中，由于依序形成于多突状共聚物核心110上的高分子层120、磁性物质层130以及硅基层140实质上不会改变多突状共聚物核心110的型态，因此所形成的磁性粒子100仍具有多突状的外表。如此一来，仍能大幅增加磁性粒子100可与免疫细胞的表面积，且有利于磁性粒子100的紧密堆积。
在一实施例中，上述免疫诱发物质102a、102b可以是任何可以引起免疫反应的物质，可包括但不限于特定类型的肽、蛋白质或片段。在一实施例中，针对所要扩增及/或活化的免疫细胞种类，可选择特定类型的抗体作为免疫诱发物质102a、102b。举例来说，免疫诱发物质102a、102b可为抗体，诸如抗CD3(anti-CD3)抗体、抗CD28(anti-CD28)抗体、抗TCRγ/δ(anti-TCRγ/δ)抗体、抗CD8(anti-CD8)抗体、抗CD137(anti-CD137)抗体、4-1BBL(4-1BB配体(Ligand)，或CD137配体)、抗CD2(anti-CD2)抗体、抗CD335(anti-CD335)抗体或前述的组合。在一实施例中，为了活化T细胞，于免疫诱发物质102a、102b的选择上可至少包括两种不同抗体，诸如抗CD3抗体以及抗CD28抗体，但不限于此。特别注意的是，虽然在图2中是绘示两种不同免疫诱发物质102a、102b为例，但在其他实施例中，磁性粒子100的最外表面上可以包括同一种免疫诱发物质或者是两种以上不同免疫诱发物质。此外，图2中的免疫诱发物质102a、102b的排列方式仅为例示，并非欲意限制免疫诱发物质的排列方式。
在一实施例中，免疫诱发物质102a、102b可以是均匀地分布于磁性粒子100的最外表面上，以利于与免疫细胞进行接触。在另一实施例中，免疫诱发物质102a、102b亦可以是修饰于硅基层140的表面上。上述将免疫诱发物质102a、102b修饰至磁性粒子100的表面的方式可包括非共价键结、共价键结、生物素-亲和素作用、静电吸附作用、疏水性吸附作用或前述的组合，但不限于其他合适的结合方式。又，在另一实施例中，免疫诱发物质102a、102b可以是通过耦合试剂修饰于硅基层140的表面上。耦合试剂可包括，但不限于3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷((3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane)、3-缩水甘油醚氧基丙基三乙氧基硅烷((3-Glycidyloxypropyl)triethoxysilane)、三乙氧硅烷-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(triethoxysilane-polyethylene-glycol-N-hydroxysuccinimide)或前述的组合。
接着，请继续参照图1与图2，进行步骤S20，提供细胞溶液，且此细胞溶液中包括至少一种免疫细胞。在一实施例中，免疫细胞可包括，但不限于αβT细胞、γδT细胞、调节T细胞、NK细胞或前述的组合。在另一实施例中，免疫细胞例如是γδT细胞。
其后，仍请继续参照图1与图2，进行步骤S30，将磁性粒子100与细胞溶液进行接触，使磁性粒子100的表面上的至少一种免疫诱发物质102a、102b得以活化及扩增细胞溶液中的至少一种免疫细胞。在一实施例中，以免疫细胞是γδT细胞为例，磁性粒子100的表面上的免疫诱发物质102a、102b可为抗TCRγ/δ(anti-TCRγ/δ)抗体及4-1BBL。在一实施例中，上述接触可包括通过将大约相等数量的磁性粒子100与免疫细胞进行混合来达到接触的目的。
上述免疫细胞的活细胞数量的细胞扩增倍率会随着细胞种类、个体间差异与培养环境的不同而有所差异。以培养环境而言，操作者可依实际需求选择所需培养的规模，举例来说，小规模培养环境(例如6孔培养盘)的免疫细胞的活细胞数量的细胞扩增倍率可为20～120倍，例如是30～110倍、40～100倍等，但不限于此。而大规模培养环境(例如生物反应器(bioreactor))的免疫细胞的活细胞数量的细胞扩增倍率可为100～8000倍，例如是500～7000倍、800～6000倍等，但不限于此。在特定实施例中，某些免疫细胞的活细胞数量的细胞扩增倍率甚至可达到上万倍。一般而言，免疫细胞的活细胞数量的平均扩增倍率可为20～1000倍。在一实施例中，免疫细胞的活细胞数量的平均扩增倍率可为30～900倍。在另一实施例中，免疫细胞的活细胞数量的平均扩增倍率可为40～800倍。
此外，在一实施例中，磁性粒子100可具有残磁性，也就是说，当外加磁场去除后，磁性粒子100的磁性不会随着消失，仍保有磁性。如此一来，在一实施例中，将磁性粒子100散布于细胞溶液中时，磁性粒子100可通过残磁性而彼此排列成一排，但不限于仅单一一排，而成排的磁性粒子100会因整体表面积较大而提高与免疫细胞接触的机率。又，在一实施例中，多排的磁性粒子100可与免疫细胞聚集成群，以利于活化及/或扩增免疫细胞。
上述磁性粒子具有多突状表面，相似于人体中效能最强的抗原递呈细胞(antigenpresenting cell,APC)，甚至是相似于树突状细胞(dendritic cell,DC)。因此，在仿生的概念下，可推测此多突状磁性粒子能以较大的表面积与免疫细胞进行接触，进而对于活化及/或扩增免疫细胞的效能有所助益。
以下例举特定实验例以具体说明体外活化及/或扩增免疫细胞的方法。
实验例1：将免疫诱发物质修饰于多突状磁性粒子的表面
(1)多突状磁性粒子的表面官能化
首先，提供三种本揭露的多突状磁性粒子，其平均直径分别2.5μm、4.5μm以及8.5μm，在电子显微镜(10000×)下具有如图3A至图3C所示的型态。并且，以平均直径为4.5μm的多突状磁性粒子为例，其磁滞曲线分析图如图4所示。一般来说，当磁场强度为0时，若磁滞曲线重合且磁化强度为0，则表示为顺磁性，若磁滞曲线无法重合，则表示为铁磁性。由图4可知，这些多突状磁性粒子具有铁磁性。
将1克的多突状磁性粒子、100mL的去离子水、500mL的乙醇、30mL的氨水(NH4OH)及0.1mL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-Aminopropyltriethoxysilane,APTES)置入反应器中，在室温下搅拌反应1小时。反应完成后，以磁铁收集多突状磁性粒子。接着，移去反应溶液并加入去离子水清洗多突状磁性粒子，重复以去离子水清洗三次后，得到表面修饰有氨基的多突状磁性粒子。
(2)免疫诱发物质的修饰方法
首先，以100μL的4-吗啉乙磺酸钠盐(4-Morpholineethanesulfonic acid,MES)缓冲溶液(25mM，pH 5.0)将如上述的约7×107颗表面修饰有氨基的多突状磁性粒子清洗三次。接着，取20mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride,EDC)、20mg的N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt,NHS)及4mg的聚丙烯酸(poly acrylicacid,PAA，15kDa)溶解于400μL的MES缓冲溶液，再与清洗后的多突状磁性粒子混合并于室温下反应30分钟。反应完成后，以磁铁收集多突状磁性粒子。
接着，移去反应溶液并以100μL的MES缓冲溶液清洗多突状磁性粒子三次后，加入包含有10μL抗CD3抗体(厂牌ebioscience)、60μL抗CD28抗体(厂牌ebioscience)、以及130μL MES缓冲溶液的混合溶液，并在4℃下进行隔夜反应。其后，加入200μL人血清白蛋白(human serum albumin,HSA，厂牌Sigma)溶液(10mg/mL，以MES缓冲溶液配制)，并在4℃下再次进行隔夜反应。
待反应完成后，以磁铁收集多突状磁性粒子。接着，移去反应溶液，以包含有0.1％HSA及2mM乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)的PBS缓冲溶液清洗多突状磁性粒子三次，每次至少停留5分钟，再以含0.1％HSA的PBS缓冲溶液清洗多突状磁性粒子三次。最后，将修饰完免疫诱发物质的多突状磁性粒子分散在1.75mL的含0.1％HSA的PBS缓冲溶液中，以得到表面修饰有免疫诱发物质的多突状磁性粒子且浓度为4×107颗/mL。
实验2：以修饰有免疫诱发物质的多突状磁性粒子活化及/或扩增T细胞(1)自血液中分离T细胞
依商品手册建议的比例将10mL血液与0.5mL T细胞分离试剂(名称RosetteSepHuman T Cell enrichment cocktail，厂牌Stemcell)混合并反应20分钟后，以移液管(pipette)加入并混合等体积的含有2％胎牛血清的PBS缓冲溶液，以得到细胞溶液。接着，将细胞溶液加入含有15mL T细胞分离液的梯度密度离心管中，并以转速为1200rcf离心20分钟。其后，将细胞上清液移至新的离心管中，再以转速为300rcf离心10分钟。接着，于去除上清液后，以5mL的含有2％胎牛血清的PBS缓冲溶液回溶细胞，并加入20mL的红血球裂解溶液(名称RBC lysis buffer，厂牌Stemcell)于4℃反应10分钟，再以转速为300rcf离心8分钟。接着，以5mL细胞培养液(含10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS，厂牌BI)的RPMI1640培养液，厂牌Gibco)回溶细胞，并于转速为300rcf离心8分钟后进行一次细胞清洗。最后，使用细胞培养液回溶细胞，以得到高纯度(诸如90-97％)的T细胞溶液。
(2)T细胞的刺激与培养
以0.2mL的细胞培养液清洗由实验例1所得的5×105颗表面修饰有免疫诱发物质的多突状磁性粒子三次，之后将多突状磁性粒子分散于0.15mL细胞培养液中。接着，将上述由实验例2的(1)所获得的5×105颗T细胞与前述分散于培养液中且表面修饰有免疫诱发物质的多突状磁性粒子进行混合，并以细胞培养液将总体积补至0.5mL，以获得T细胞液。同时，以市售圆球形磁性粒子与上述实验例2的(1)所获得的5×105颗T细胞混合为T细胞液以作为比较组。然后，将实验组与比较组的T细胞液分别放置于24孔培养盘中(厂牌Corning)，并在含5％二氧化碳的37℃培养箱中进行T细胞的刺激与培养(此时称为培养的第0天)。
然后，于培养的第2天加入0.5mL细胞培养液，并于培养的第5天使用移液管冲散T细胞与磁性粒子。之后，将T细胞与磁性粒子的混合液移至微量试管中，并将微量试管置放到磁座上，以将磁性粒子吸引到微量试管的管壁，而将已受到免疫诱发物质刺激但不含磁性粒子的悬浮细胞液移至新的6孔培养盘中(厂牌Corning)。接着，量测上述经刺激且不含磁性粒子的悬浮细胞液的总体积及细胞浓度，并于调整此细胞液浓度为0.5～1×106颗/mL后，置放至新的培养盘中并放回含5％二氧化碳的37℃培养箱中继续培养。
此后，于培养的第6～8天，每天重复进行以下步骤，使用移液管将T细胞分散均匀后，量测细胞液的总体积及细胞浓度，并将刺激后的T细胞液浓度调整为0.5～1×106颗/mL后，放回培养箱中继续培养。而于培养的第9～12天，每天重复进行以下步骤，使用移液管将T细胞分散均匀后，量测细胞液的总体积及细胞浓度，并以第0天的细胞浓度作为对照基准，来计算第9～12天的T细胞的平均扩增倍率。
图5A至5D分别显示使用市售磁性粒子、平均直径为2.5μm、4.5μm以及8.5μm的多突状磁性粒子进行T细胞活化及/或扩增于不同培养天数的细胞数量，其中以市售磁性粒子作为比较组。
依据图5A至图5D结果显示，在第9天时，相较于比较组的T细胞的平均扩增倍率为26.64，以平均直径为2.5μm、4.5μm以及8.5μm的多突状磁性粒子处理的实验组的T细胞的平均扩增倍率分别为29.20、31.39以及29.89。此外，在第9天之后，比较组的T细胞的平均扩增倍率逐渐下降或趋于平缓，而实验组的T细胞的平均扩增倍率则是持续增加，其中又以4.5μm的磁性粒子(即图5C所示)所能达到的扩增效能最为显著，可达90以上的扩增倍率。
实验例3：以修饰有不同比例的两种抗体的多突状磁性粒子活化及/或扩增T细胞
实验例3的操作流程与实验例2相同，主要不同处在于实验例3是使用4.5μm的磁性粒子为测试对象，以及在免疫诱发物质的修饰比例上，是将抗CD3抗体与抗CD28抗体以1:2、1:6以及1:10比例配制为抗体混合溶液，并分别用以修饰前述的4.5μm磁性粒子。在本实验例中，同时以市售圆球形磁性粒子作为比较组，但无法确知此市售圆球形磁性粒子上的抗体比例。
图6A至6D分别显示使用市售磁性粒子表面修饰有抗体且抗CD3抗体与抗CD28抗体比例分别为1:2、1:6以及1:10的多突状磁性粒子进行T细胞活化及/或扩增于不同培养天数的细胞数量。依据图6A至图6D可知，相较于比较组(图6A，)，实验组的表面具有不同比例的抗体修饰的磁性粒子(图6B，抗CD3抗体:抗CD28抗体＝1:2；图6C，抗CD3抗体:抗CD28抗体＝1:6；图6C，抗CD3抗体:抗CD28抗体＝1:10)皆可以有效地活化及/或扩增T细胞。
实验例4：经活化及/或扩增的T细胞的特性分析
以流式细胞仪(SONY SA3800)对上述本发明的多突状磁性粒子活化及/或扩增后的T细胞进行特性分析，并以经两种市售商品(包含磁性粒子及修饰抗体，商品中仅揭露其修饰抗体为抗CD3抗体与抗CD28抗体，但未提供所修饰抗体的比例)活化及/或扩增后的T细胞(比较组1及比较组2)同步进行比较。其中，比较组1为以市售商品TransActTMT Cellreagent(Miltenyi Biotec)活化及/或扩增后的T细胞，而比较组2为以市售商品Human T-Activator CD3/CD28(ThermoFisher)活化及/或扩增后的T细胞。实验组则为表面修饰有抗体且抗CD3抗体与抗CD28抗体比例为1:6的前述多突状磁性粒子进行T细胞活化及/或扩增后的T细胞，并以未经处理的第0天的初始细胞作为对照组。结果如图7A至7C所示。
由图7A至7C可知，相较于比较组1(TransActTM)与比较组2实验组的T细胞(即通过本发明的多突状磁性粒子经修饰后所活化及/或扩增的T细胞)具有以下特性：(1)CD4+T细胞与CD8+T细胞的比例最接近1:1(图7A)；(2)中央记忆T细胞(centralmemory T cell,TCM)相对于效应记忆T细胞(effector memory T cells,TEM)占有较高的比例(图7B)；以及(3)带有四种免疫抑制分子(PD-1(programmed cell death-1)、CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4)、TIM-3(T-cell immunoglobulin andmucin-domain containing-3)及LAG-3(lymphocyte-activation gene 3))的T细胞的总数量最少(图7C)。
综上所述，本揭露的磁性粒子具有多突状表面，相似于人体中效能最强的抗原递呈细胞，甚至是树突状细胞。因此，在仿生的概念下，可推测此多突状磁性粒子能以较大的表面积与免疫细胞进行接触，进而对于活化免疫细胞及/或扩增免疫细胞数目的效能有所助益。
此外，本揭露实施例的磁性粒子可于其表面通过设计并修饰特定的免疫诱发物质种类，使得磁性粒子可应用于γδT细胞的活化及扩增，进而克服目前尚缺乏可应用于γδT细胞的相关产品的问题。举例来说，在一实施例中，以全血分离后的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)为来源，使用修饰有免疫诱发物质的多突状磁珠可提升γδT细胞的扩增倍率约1.2-3.5倍。再者，由于磁性粒子具有磁性与特定免疫诱发物质，是以具有可快速分离与诱发免疫反应的优点，如此一来，将有助免疫细胞应用于癌症免疫疗法等技术的研究与发展。
虽然本揭露已以实施例揭露如上，然其并非用以限定本揭露，任何所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本揭露的精神和范围内，当可作些许的更动与润饰，故本揭露的保护范围当视后附的权利要求所界定者为准。

Claims (18)

1.一种体外活化及/或扩增免疫细胞的方法，包括：
a)提供磁性粒子，所述磁性粒子的表面为多突状且修饰有至少一种免疫诱发物质，其中所述磁性粒子由内而外包括共聚物核心、高分子层、磁性物质层以及硅基层；
b)提供细胞溶液，所述细胞溶液中包括至少一种免疫细胞；以及
c)将所述磁性粒子与所述细胞溶液进行接触，使所述磁性粒子的所述表面上的所述至少一种免疫诱发物质得以活化及/或扩增所述细胞溶液中的所述至少一种免疫细胞。
2.如权利要求1所述的体外活化及/或扩增免疫细胞的方法，其中所述共聚物核心的表面包括多个形状不规则的突起物。
3.如权利要求2所述的体外活化及/或扩增免疫细胞的方法，其中所述多个突起物的平均高度为100nm～5000nm。
4.如权利要求1所述的体外活化及/或扩增免疫细胞的方法，其中所述磁性粒子的平均直径为1μm～50μm。
5.如权利要求1所述的体外活化及/或扩增免疫细胞的方法，其中所述免疫细胞包括T细胞、NK细胞或前述的组合。
6.如权利要求5所述的体外活化及/或扩增免疫细胞的方法，其中所述免疫细胞包括调节T细胞。
7.如权利要求6所述的体外活化及/或扩增免疫细胞的方法，其中所述免疫细胞包括αβT细胞、γδT细胞或前述的组合。
8.如权利要求1所述的体外活化及/或扩增免疫细胞的方法，其中所述免疫细胞包括γδT细胞。
9.如权利要求1所述的体外活化及/或扩增免疫细胞的方法，其中所述至少一种免疫诱发物质包括抗CD3抗体、抗CD28抗体、抗TCRγ/δ抗体、抗CD83抗体、抗CD137抗体、4-1BBL、抗CD2抗体、抗CD335抗体或前述的组合。
10.如权利要求1所述的体外活化及/或扩增免疫细胞的方法，其中所述至少一种免疫诱发物质修饰至所述磁性粒子的所述表面的方式包括非共价键结、共价键结、生物素-亲和素作用、静电吸附作用、疏水性吸附作用或前述的组合。
11.如权利要求1所述的体外活化及/或扩增免疫细胞的方法，其中所述共聚物核心包括由单官能基单体与双官能基单体共聚而成的共聚物。
12.如权利要求11所述的体外活化及/或扩增免疫细胞的方法，其中所述双官能基单体相对于所述单官能基单体的体积百分比例为0.4％～2％。
13.如权利要求1所述的体外活化及/或扩增免疫细胞的方法，其中所述共聚物核心包括苯乙烯/二乙烯苯共聚物、甲基丙烯酸甲酯/三乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、甲基丙烯酸甲酯/乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、苯乙烯/三乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、苯乙烯/乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物或甲基丙烯酸甲酯/二乙烯苯共聚物。
14.如权利要求1所述的体外活化及/或扩增免疫细胞的方法，其中所述高分子层包括带有电荷的至少一官能基团。
15.如权利要求14所述的体外活化及/或扩增免疫细胞的方法，其中所述至少一官能基团包括羧基、氨基或前述的组合。
16.如权利要求1所述的体外活化及/或扩增免疫细胞的方法，其中所述磁性物质层包括顺磁性材料、超顺磁性材料、铁磁性材料、铁氧体磁性材料或前述的组合。
17.如权利要求1所述的体外活化及/或扩增免疫细胞的方法，其中所述磁性物质层包括铁离子、钴离子、镍离子或前述的组合。
18.如权利要求1所述的体外活化及/或扩增免疫细胞的方法，其中所述硅基层的厚度至少为1nm～50nm。
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