CN109957533A - 一株产肌氨酸氧化酶的海洋细菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株产肌氨酸氧化酶的海洋细菌，以及在制备肌氨酸氧化酶的应用。一种海洋细菌LYH18菌株，为芽孢杆菌属Bacillus sp.，该菌株已于2019年3月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其生物保藏号为CGMCC No.17306。筛选的具有肌氨酸氧化酶生产能力的菌株Bacillus sp.LYH18菌株，其在培养84h后，肌氨酸氧化酶的酶活力可以达到0.5‑0.6U/mL，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，尤其是涉及一株产肌氨酸氧化酶的海洋细菌及其应用。
背景技术
肌氨酸氧化酶作为一种重要的诊断酶制剂，被广泛应用于人体血清中肌酐水平的检测，用来判断肾功能的健康程度，尽管目前许多国内外学者对其已有研究，但在实际生产中仍然存在产量低、热稳定性不好的问题，且国内研究较少，因此如何快速筛选出一种酶活高产量高适应工业化生产的肌氨酸氧化酶有重要意义，且现今肌氨酸氧化酶工业生产主要由微生物发酵所得，因此，培养出一种能产出肌氨酸氧化酶的细菌是十分必要的。
发明内容
本发明的第一目的是提供产肌氨酸氧化酶的海洋细菌Bacillus sp.LYH18及其筛选方法。
本发明的第二目的是提供产肌氨酸氧化酶的海洋细菌Bacillus sp.LYH18在制备肌氨酸氧化酶的应用。
本发明的第三目的是在提供肌氨酸氧化酶的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种产肌氨酸氧化酶的海洋细菌LYH18菌株，为芽孢杆菌属Bacillus sp.，该菌株已于2019年3月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其生物保藏号为CGMCCNo.17306。
所述的海洋细菌LYH18菌株为革兰氏阳性、好氧、杆状的海洋细菌，最适生长温度为20℃，最适生长pH为6.5-7.5，最适生长盐度3-5％。
所述的海洋细菌LYH18菌株的具体筛选方法如下：
初筛：将中国大连渤海湾海域采集到的深海海泥富集水样涂布于初筛培养基，在35℃，150rpm摇床培养48h，得到形态各异的单菌落，进行分离纯化后，用30％(v/v)甘油(1:1；甘油：菌液)放于-80℃进行保存；
初筛培养基的制备方法为：肌酸5.0-10.0g，酵母膏0.5-10.0g，磷酸二氢钾1.0-10.0g，磷酸氢二钾0.5-10.0g，硫酸镁0.5-10.0g，淀粉10.0-20.0g，碘化钾1.0-10.0g，琼脂20.0-40.0g，加入海水至1L，pH6.5-7.0，在0.1MPa、100-200℃下高压蒸汽灭菌10-30min。
复筛：将上述保种的细菌进行划线分离纯化后，接入50mL发酵培养基，在35℃，150rpm摇床培养48h，分离能降解肌酸的海洋细菌；
种子培养基的制备方法为：肌酸3.0-5.0g，酵母膏0.5-10.0g，磷酸二氢钾1.0-10.0g，磷酸氢二钾0.5-10.0g，硫酸镁0.5-10.0g，加入海水至1L，pH7.0，在0.1MPa、100-200℃下高压蒸汽灭菌10-30min。
发酵培养基的制备方法为：肌酸5.0-8.0g，酵母膏0.5-10.0g，磷酸二氢钾1.0-10.0g，磷酸氢二钾0.5-10.0g，硫酸镁0.5-10.0g，加入海水至1L，pH7.0，在0.1MPa、100-200℃下高压蒸汽灭菌10-30min；
最终筛选：通过平板透明圈反应筛选，具体为配制0.5％肌酸固体培养基，添加100μL菌液涂布，培养18～24h，取有蓝绿色透明圈的菌落，进行测定是否降解肌酸，如果可以降解肌酸，再测定其是否有肌氨酸氧化酶活性，最终确定菌株。
肌酸固体培养基的制备方法为：肌酸5.0g，酵母膏0.5g，磷酸二氢钾1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，淀粉10.0g，碘化钾1.0g，琼脂20.0g，加入海水至1L，pH7.0，在0.1MPa、100-200℃下高压蒸汽灭菌10-30min。
所述的海洋细菌LYH18菌株可在制备肌氨酸氧化酶中应用。
所述肌氨酸氧化酶的制备方法包括以下步骤：
1)、将菌株保种管涂布于初筛平板上，分离纯化，接入种子培养基中培养至对数生长期，得到种子液；
2)、将种子液转接到发酵培养基中，继续培养，得到发酵液；
3)、将发酵液中的待测菌体细胞用超声波进行破壁，离心后去上清酶液，即为肌氨酸氧化酶液。
本发明筛选的具有肌氨酸氧化酶生产能力的细菌，所产出的肌氨酸氧化酶的最适温度为25℃，温度在15～45℃时，相对酶活基本保持在80％以上，并且在25～40℃条件下处理60min依然可以保持高酶活性，因此，在室温条件下，该酶即可保持较高酶活与稳定性，在工业上具有更好的应用前景。
附图说明
图1为产肌氨酸氧化酶的海洋细菌LYH18菌株在培养基上生长的菌落形态；
图2是产肌氨酸氧化酶的海洋细菌LYH18菌株的电子显微镜形态图；
图3是产肌氨酸氧化酶的海洋细菌LYH18菌株基于16S rDNA序列，利用MEGA 5.1软件进行Bacillus sp.LYH18和其亲缘关系相近菌株之间的系统发育树图；
图4为产肌氨酸氧化酶的海洋细菌LYH18菌株的降解肌酸的曲线图；
图5为肌氨酸氧化酶的生长曲线和酶活曲线；
图6为肌氨酸氧化酶最适温度曲线图；
图7为肌氨酸氧化酶稳定性曲线图。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的详细步骤。
一种产肌氨酸氧化酶的海洋细菌LYH18菌株，为芽孢杆菌属Bacillus sp.，该菌株已于2019年3月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其生物保藏号为CGMCCNo.17306。
1)目标菌的筛选
对来源于中国大连渤海湾海域采集到的深海海泥样品进行微生物富集，初筛复筛、筛选产肌氨酸氧化酶的菌株。具体技术方案如下：
初筛：将中国大连渤海湾海域采集到的深海海泥富集水样涂布于初筛培养基(肌酸5.0g，酵母膏0.5g，磷酸二氢钾1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，淀粉10.0g，碘化钾1.0g，琼脂20.0g，加入海水至1L，pH6.5，在0.1MPa、121℃下高压蒸汽灭菌20min)。在35℃，150rpm摇床培养48h，得到形态各异的单菌落，进行分离纯化后，用30％(v/v)甘油(1:1；甘油：菌液)保存在-80℃。
复筛：将上述保种的细菌纯化接入50mL发酵培养基(肌酸6.0g，酵母膏0.5g，磷酸二氢钾1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，加入海水至1L，pH7.0，在0.1MPa、121℃下高压蒸汽灭菌20min)，在35℃，150rpm摇床培养。分离能降解肌酸的海洋细菌。
海洋细菌LYH18菌株的筛选方法：通过平板透明圈反应筛选，具体为配制0.5％肌酸固体培养基(肌酸5.0g，酵母膏0.5g，磷酸二氢钾1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，淀粉10.0g，碘化钾1.0g，琼脂20.0g，加入海水至1L，pH7.0，在0.1MPa、121℃下高压蒸汽灭菌20min)；添加100μL菌液涂布，培养18～24h，取有蓝绿色透明圈的菌落，进行测定是否降解肌酸，如果可以降解肌酸，再测定其是否有肌氨酸氧化酶活性，肌酸降解测定曲线如图3所示，最终确定菌株；
所述肌酸降解的测定方法为：0.5mL的样品，加入含有l％α-萘酚的1.5mol/L的NaOH 1mL，再加入0.5mL 0.05％的双乙酰显色30min，再加3mL蒸馏水，于530nm测吸光度。
2)形态特征，生长条件以及系统发育树分析研究表明，海洋细菌LYH18菌株具有以下特点：
如图1所示，LYH18菌株在选择培养基上生长时，菌落呈圆形，隆起，表面光滑，湿润，边缘整齐，无色，易挑取，这些特征表明菌株LYH18呈现出典型的细菌特征；革兰氏染色呈阳性；LB培养基上生长3天芽孢形成，乳白色、凸起、表面光滑、直径1～1.5mm的圆形菌落，光学显微镜观察菌体呈杆状，见图2，LYH18菌株的形态学特征总结于表1。
表1 LYH18菌株的形态学特征
生理生化特性：
参照《常见细菌系统鉴定手册》(第8版)对LYH18菌株进行生理生化试验，生理生化特征结果总结于表2。
表2 LYH18菌株的生理生化特征
注：“+”表示该培养条件下能够生长，或者为阳性反应；“-”表示该培养条件下不能够生长，或者为阴性反应。
LYH18菌株生理生化特征如下：在无氧条件下不能生长；过氧化氢酶作用下呈阳性；V-P测定呈阴性；对氯化钠有较强的耐受性，在10％条件下也可生长；不能分解酪酛、明胶及淀粉；不能利用分子态氮，可将硝酸盐分解为亚硝酸盐；能利用多种碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、D-果糖、纤维二糖、松三糖、D-半乳糖、(L+)-鼠李糖，但不能利用D-木糖、棉子糖和D-甘露糖；不能产吲哚。由于LYH18菌株能产芽抱，因此将其归于《常见细菌系统鉴定手册》(第8版)的“产芽孢细菌”部分。手册中记录了16个属的细菌可产芽抱，只有芽孢八叠球菌属的细胞呈球状，另外的15个属细胞均为杆状。根据其相应的生理生化特征初步将其归属为Bacillus(芽孢杆菌属)中。
生长条件为：严格好氧，最适生长温度为20℃，最适生长pH为6.5-7.5，最适生长盐度3～5％。
系统发育树分析：LYH18菌株的16SrDNA测得序列如SEQ ID NO.1所示，上传至NCBI，Genbank号分别为：MK050527；如图3所示，根据16s系统发育进化树分析LYH18菌株与Bacillus firmus的相似性最高，为99％，确定菌株属于芽孢杆菌(Bacillus sp.)。
3)肌氨酸氧化酶的制备
将菌株保种管涂布于选择性筛选平板上，分离纯化，接入种子培养基中培养至对数生长期，得到种子液；
将种子液转接到发酵培养基中，继续培养，得到发酵液；
将发酵液中的待测菌体细胞用超声波进行破壁，离心后去上清酶液，即为肌氨酸氧化酶液
具体操作方法如下：
一、将菌株保种管涂布于初筛平板上，分离纯化，接入种子培养基中培养至对数生长期，得到种子液；
将LYH18菌株从保种管中取100μL涂布于初筛平板上，纯化为2～3次；所述接入种子培养基中培养至对数生长期，可在35℃，150rpm摇床培养24h至对数生长期；
所述初筛培养基的配方为：肌酸5.0g，酵母膏0.5g，磷酸二氢钾1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，淀粉10.0g，碘化钾1.0g，琼脂20.0g，加入海水至1L，pH6.5，在0.1MPa、121℃下高压蒸汽灭菌20min。
所述种子培养基的配方为：肌酸5.0g，酵母膏0.5g，磷酸二氢钾1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，加入海水至1L，pH7.0，在0.1MPa、121℃下高压蒸汽灭菌20min。
二、将种子液转接到发酵培养基中，继续培养，得到发酵液；
种子液的接种量为1-2％；所述发酵培养基的配方为：肌酸6.0g，酵母膏0.5g，磷酸二氢钾1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，加入海水至1L，pH7.0，在0.1MPa、121℃下高压蒸汽灭菌20min；所述培养可在35℃，150rpm摇床培养48h，得到发酵液。
三、将发酵液中的待测菌体细胞用超声波进行破壁，离心后获得上清液，即为肌氨酸氧化酶液，所述超声破碎20min，离心条件为8000rpm X 20min。
四、肌氨酸氧化酶的制备
将上述的发酵菌液经超声破碎和离心后获得上清液，此即为肌氨酸氧化酶酶液。
五、肌氨酸氧化酶活性的测定
肌氨酸氧化酶活单位：37℃每分钟分解1μmol肌氨酸的酶量为一个酶活单位。
酶活测定采用比色法测定。酶反应体系为：0.1mL酶液+0.9mL底物(含肌氨酸的焦磷酸钠缓冲溶液pH8.0)。酶活测定过程：将反应体系混合均匀立即放在37℃反应10min；加入0.25mL醋酸终止反应，并加入1.5mL含有乙酰丙酮的乙酸铵溶液，37℃保温40min后在410nm处测定OD值。以过氧化氢的标准曲线为对照。以胞外酶液即未破碎的酶液作为酶活测定的阴性对照。
结果表明，如图5所示，84h测得的肌氨酸氧化酶酶活力为0.5-0.6U/mL；24h时OD值可达到1.982，30hOD值最大值可达到2.013。
六、对所产肌氨酸氧化酶的生理生化特征进行检验
(1)肌氨酸氧化酶的最适作用温度
按照肌氨酸氧化酶的酶活测定方法，分别在不同温度条件下(5～70℃，梯度为5℃)，测定发酵得到的粗酶液中的肌氨酸氧化酶酶活力，确定酶的最佳反应温度；将同组实验中最高酶活的相对值设为100％。
不同温度下测定肌氨酸氧化酶酶活力，结果见图6，结果表明在10～15℃时，肌氨酸氧化酶的活性随着温度的升高而立刻增大，酶作用的最适温度为25℃；温度在15～45℃时，相对酶活基本保持在80％以上，这说明在室温条件下，该酶即可保持较高酶活，这一特点可节省能源的消耗；当酶作用温度高于45℃时，酶活性急剧下降，当温度高于50℃时，相对酶活在60％以下，综上说明肌氨酸氧化酶适合在低温条件下，此时酶活性相对较高，符合海洋低温酶的特性，这一特性有利于该酶在实际生产中的应用。
(2)肌氨酸氧化酶的热稳定性
将发酵得到的粗酶液分别在不同温度条件下(25℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃)处理60min，测定酶活力，确定酶的热稳定性；将同组实验中最高酶活的相对值设为100％。
将发酵得到的粗酶液在不同温度下分别处理一段时间后，测定酶活力，结果如图7所示，在25～40℃条件下处理60min依然可以保持高酶活性，说明该酶在室温条件下，较稳定；当温度大于40℃以后，酶活性呈逐渐下降的趋势，符合海洋低温酶的特性，该酶在50℃处理处理60min，酶活急速下降，仅保留30％的酶活力；在60℃、70℃处理60min，酶活均低于10％，说明该酶热稳定性较弱。有研究认为低温酶类具有较高的柔韧性，与底物结合可以消耗较低的能量，进而使得酶的热稳定性降低，因此，本申请中所筛选出的LYH18菌株所产的酶在室温条件下具有良好的稳定性，更具有应用价值。
与国内外筛选的其他肌氨酸氧化酶的菌株相比，本申请中所筛选出的LYH18菌株所产的酶，最适温度为25℃，更接近于室温条件，并且室温条件下依然保持高酶活性，更便于保藏，也更加适应于工业化生产。
序列表
<110> 大连大学
<120> 一株产肌氨酸氧化酶的海洋细菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1256
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc atgctgatcc gcgattacta 60
gcgattccgg cttcatgcag gcgagttgca gcctgcaatc cgaactgaga atggttttat 120
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catcctgtcc cccgaagggg aacgccctat ctctagggtt ggcaggagat gtcaagacct 420
ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcaaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc 480
cgtcaattcc tttgagtttc agccttgcgg ccgtactccc caggcggagt gcttaatgcg 540
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ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct acccacgctt tcgcgcctca gcgtcagtta 660
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acggttgagc cgtgggcttt cacatcagac ttaagaaacc gcctgcgcgc gctttacgcc 840
caataattcc ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag 900
ccgtggcttt ctggtcaggt accgtcaagg taccggcagt tactccggta cttgttcttc 960
cctgacaaca gagttttacg atccgaaaac cttcatcact cacgcggcgt tgctccgtca 1020
gactttcgtc cattgcggaa gattccctac tgctgcctcc cgtaggagtc tgggccgtgt 1080
ctcagtccca gtgtggccga tcaccctctc aggtcggcta cgcatcgtcg ccttggtgag 1140
ccgttacctc accaactagc taatgcgccg cgggcccatc tgtaagtgat agccgaaacc 1200
atctttcagc tttccctcat gtgagggaaa gagttatccg gtattagctc cggttt 1256
Claims (10)
1.一种产肌氨酸氧化酶的海洋细菌LYH18菌株，为芽孢杆菌属Bacillus sp.，该菌株已于2019年3月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其生物保藏号为CGMCCNo.17306。
2.如权利要求1所述的海洋细菌，其特征在于，所述LYH18菌株为革兰氏阳性、杆状的细菌。
3.产肌氨酸氧化酶的海洋细菌LYH18菌株在制备肌氨酸氧化酶的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肌氨酸氧化酶的制备方法包括以下步骤：
1)将LYH18菌株保种管涂布于初筛平板上，分离纯化，接入种子培养基中培养至对数生长期，得到种子液；
2)将种子液转接到发酵培养基中，继续培养，得到发酵液；
3)将发酵液中的待测菌体细胞用超声波进行破壁，离心后去上清酶液，即为肌氨酸氧化酶液。
5.如权利要求4所述的肌氨酸氧化酶的制备方法，其特征在于，在步骤1中，将菌株从保种管中取100μL涂布于初筛平板上，所述纯化2～3次。
6.如权利要求4所述的肌氨酸氧化酶的制备方法，其特征在于，在步骤1中，所述接入种子培养基中培养至对数生长期是在10-40℃，100-150rpm摇床培养24h至对数生长期；所述的初筛培养基配方为：肌酸5.0-10.0g，酵母膏0.5-10.0g，磷酸二氢钾1.0-10.0g，磷酸氢二钾0.5-10.0g，硫酸镁0.5-10.0g，淀粉10.0-20.0g，碘化钾1.0-10.0g，琼脂20.0-40.0g，加入海水至1L，pH6.5-7.0，在0.1MPa、100-200℃下高压蒸汽灭菌10-30min。
7.如权利要求4所述的肌氨酸氧化酶的制备方法，其特征在于在步骤1中，所述种子培养基的配方为：肌酸3.0-5.0g，酵母膏0.5-10.0g，磷酸二氢钾1.0-10.0g，磷酸氢二钾0.5-10.0g，硫酸镁0.5-10.0g，加入海水至1L，pH6.5-7.0，在0.1MPa、100-200℃下高压蒸汽灭菌10-30min。
8.如权利要求4所述的肌氨酸氧化酶的制备方法，其特征在于在步骤2中，所述种子液的接种量为1-2％。
9.如权利要求4所述的肌氨酸氧化酶的制备方法，其特征在于在步骤2中，所述发酵培养基的配方为：肌酸5.0-8.0g，酵母膏0.5-10.0g，磷酸二氢钾1.0-10.0g，磷酸氢二钾0.5-10.0g，硫酸镁0.5-10.0g，琼脂20.0-25.0g，加入海水至1L，pH6.5-7.0，在0.1MPa、100-200℃下高压蒸汽灭菌10-30min；所述培养条件为10-40℃，100-150rpm摇床培养48h。
10.如权利要求4所述的肌氨酸氧化酶的制备方法，其特征在于在步骤3中，所述超声破碎20min，离心为8000rpmX20min。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190702 |