CN109942708A - 一种抗bcma的单域抗体及其应用 - Google Patents
一种抗bcma的单域抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及本发明涉及一种抗BCMA的单域抗体，其包含CDR1、CDR2、CDR3以及框架区序列；其中，所述CDR1序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示；所述CDR2序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5所示；所述CDR3序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.6所示。本发明还涉及上述抗BCMA的单域抗体的相关应用及其制备方法。本发明所述的抗BCMA单域抗体B1和B65与抗原具有优异的亲和能力，且仅能与BCMA结合，与其它抗原(CD38，CD138等)均不能结合，其对BCMA具有良好的特异性，其单域抗体B1、B65能够有效结合BCMA阳性靶细胞，对于治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症的药物提供了理论基础，尤其是适用于多发性骨髓瘤的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及胞免疫治疗技术领域，尤其涉及一种抗BCMA的单域抗体及其应用。
背景技术
多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种无法治愈的恶性肿瘤，其特点是患者骨髓中浆细胞恶性增生。当前主要使用蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂等来缓解多发性骨髓瘤的症状，但是均不能清除肿瘤。当前一些研究通过靶向CD138、CD38、CS-1、BCMA的疗法来治疗MM。有研究验证了通过靶向CD38分子可以有效杀伤骨髓瘤细胞；靶向CD38的抗体Daratumumab已被FDA批准用于多发骨髓瘤的治疗。但是由于其导致白细胞减少等比较严重的不良反应限制了其应用。
B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen，BCMA)是一种表达在浆细胞，浆母细胞和骨髓浆细胞的抗原，其不在B细胞或者造血干细胞上表达。这种有限的表达细胞类型，使得BCMA可能作为治疗MM的靶点，以开发单抗、抗体偶联药物、双特异性抗体、CAR-T等疗法。当前还没有靶向BCMA的药物上市，但是有少数通过抗体偶联药物，CAR-T疗法等来通过靶向BCMA以治疗多发性骨髓瘤的疗法在进行临床试验，其临床疗效尚为未知数。
重链抗体主要存在于骆驼或者羊驼等动物体内，其抗体结构简单，仅包含重链可变区，不包含轻链。进一步的，其重链可变区被称为单域抗体或者是纳米抗体。相较于普通的抗体结构，单域抗体具有分子小，结构更简单，稳定性高，易表达等特点。并且其与人源抗体VH3的序列高度同源，其同源性远超过鼠源单克隆抗体。基于以上优点，近年来对于纳米抗体的研究以及在疾病诊断和治疗中的应用取得长足的发展。尤其是2019年2月FDA批准了用于治疗成人获得性血栓性血小板减少性紫癜(aTTP)的单域抗体药物Caplacizumab上市，是全球首个上市的单域抗体药物。因此，开发新的靶向BCMA的单域抗体对于多发性骨髓瘤的治疗具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种能够特异性靶向BCMA的单域抗体。本发明使用纯化的BCMA-FC抗原免疫羊驼，得到BCMA的多克隆抗体，并筛选出特异性VHH片段，构建羊驼噬菌体展示文库；采用靶分子BCMA对噬菌体文库进行陶选，并对陶选后的文库进行扩增及噬菌粒救援，对筛选出的BCMA单域抗体进行序列比对和进化树分析，从而获得能够特异性靶向BCMA的单域抗体。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个目的是一种抗BCMA的单域抗体，所述单域抗体序列包含CDR1、CDR2、CDR3以及框架区序列；其中，所述CDR1序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示；所述CDR2序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5所示；所述CDR3序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.6所示。
进一步地，所述单域抗体为B1抗体或B65抗体，所述B1抗体的序列如SEQ ID NO.7所示，所述B65抗体的序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明的第二个目的是提供一种用于编码上述抗BCMA的单域抗体的核酸。
进一步地，编码B1抗体的核酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码B65抗体的序列如SEQID NO.10所示。
本发明的第三个目的是提供一种包含上述核酸的载体。
进一步地，所述载体包括当不限于：DNA载体，RNA载体，质粒，慢病毒载体，腺病毒载体和逆转录病毒载体。
本发明的第四个目的是提供一种包含上述载体的细胞。
本发明的第五个目的是提供一种包含上述抗BCMA的单域抗体的嵌合抗原受体。
进一步地，所述嵌合抗原受体包括胞外识别区、跨膜区和胞内信号区；其中，胞外识别区为抗BCMA的单域抗体。
进一步地，所述跨膜区包括CD8跨膜区、CD28跨膜区等，所述胞内信号区包括CD28、4-1BB、CD3等，也可为本领域任一合适的跨膜区或胞内信号区。本发明的第六个目的是提供一种包含上述嵌合抗原受体的免疫效应细胞。
进一步地，免疫效应细胞选自T淋巴细胞和NK细胞。
本发明的第七个目的是提供一种包含上述抗BCMA的单域抗体的重链抗体；进一步地，所述单域抗体与人源IgG1Fc融合构建为重链抗体。
本发明的第八个目的提供上述核酸、上述载体、上述细胞、上述嵌合抗原受体、上述免疫效应细胞、上述重链抗体在制备用于治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症的药物中的应用。
进一步地，所述药物还含有药学上可接受的辅料。
进一步地，所述与BCMA的表达相关的疾病或病症选自下组：B细胞急性淋巴性白血病，T细胞急性淋巴性白血病，急性淋巴性白血病，慢性髓性白血病，慢性淋巴细胞白血病，B细胞幼淋巴细胞白血病，母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤，伯基特淋巴瘤，弥散性大B细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤，恶性淋巴增殖状况，MALT淋巴瘤，外套细胞淋巴瘤，边缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤，脊髓发育不良和骨髓增生异常综合征，非霍奇金淋巴瘤，浆母细胞淋巴瘤，浆细胞样树突细胞瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，前列腺癌，胰腺癌，肺癌，骨髓瘤，MGUS，浆细胞瘤，系统性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性和POEMS综合征。
本发明的第九个目的是提供一种抗BCMA的单域抗体的制备方法，其包括如下步骤：采用将如SEQ ID NO.9所示或SEQ ID NO.10所示的核酸序列亚克隆到原核表达载体，转化感受态细胞，诱导蛋白表达，分别获得如SEQ ID NO.7所示序列的B1抗体和如SEQ IDNO.8所示序列的B65抗体。
进一步地，所述原核表达载体为pET-28a上，所述感受态细胞为BL21，诱导蛋白采用IPTG。
上述各核苷酸和氨基酸的序列如下表所示：
与现有技术相比，本发明所述的融合蛋白具有以下有益效果：
本发明所述的抗BCMA单域抗体B1和B65与抗原具有优异的亲和能力，且仅能与BCMA结合，与其它抗原(CD38，CD138等)均不能结合，其对BCMA具有良好的特异性，其单域抗体B1、B65能够有效结合BCMA阳性靶细胞，对于治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症的药物提供了理论基础，尤其是适用于多发性骨髓瘤的治疗。
附图说明
图1为本发明一实施例中BCMA抗原VHH氨基酸序列的示意图；
图2为本发明一实施例中BCMA抗原VHH进化树的示意图；
图3为本发明一实施例中BCMA抗原VHH结合BCMA特异性的示意图；
图4为本发明一实施例中BCMA抗原VHH结合MM细胞的示意图；
图5为本发明一实施例中BCMA重链抗体杀伤MM细胞的示意图；
图6为本发明一实施例中BCMA重链抗体延长MM小鼠生存期的示意图。
具体实施方式
本发明涉及一种抗BCMA的单域抗体，其包含CDR1、CDR2、CDR3以及框架区序列；其中，所述CDR1序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示；所述CDR2序列如SEQ ID NO.2或SEQID NO.5所示；所述CDR3序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.6所示。本发明还涉及上述抗BCMA的单域抗体的相关应用及其制备方法。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例为BCMA单域抗体的淘选和序列分析，其具体包括如下步骤：
一、羊驼免疫和血清BCMA抗体效价检测
使用纯化的BCMA-FC抗原免疫羊驼(由成都阿帕克公司完成)，具体免疫程序如表1所示：
表1 羊驼免疫和检测程序
免疫后，按照上表时间点采血，并使用ELISA检测羊驼血清中BCMA抗体的滴度。检测步骤如下：
A、将抗原用0.05M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释至2μg/mL，按100μL/well，4℃包被过夜；
B、弃包被液，PBST洗涤3次，每孔加入300μL 3％脱脂牛奶，37℃封闭1h；
C、PBST洗涤3次，加入100μL/孔的血清稀释液，37℃，孵育45min；
D、PBST洗涤5次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗Alpaca二抗(用PBS按1:1W稀释)，100μL/孔，37℃孵育45min；
E、PBST洗板5次。加入TMB显色液显色，100μL/孔，37℃，5min，加入终止液终止反应，50μL/孔，于450nm下测光密度。
结果如表2所示。经过五次免疫，BCMA抗体浓度达到128K以上，经评估，符合构建抗体噬菌体展示文库的要求，初步得到BCMA的多克隆抗体。
表2 血清效价检测
二、羊驼噬菌体展示文库的构建
采集免疫后的羊驼50mL外周血，按照淋巴细胞分离液使用说明分离PBMC。用TRIzol试剂提取PBMC总RNA。取1μg RNA电泳，检测RNA纯度，结果表明RNA纯度良好。使用III First-Strand Synthesis System for RT-PCR试剂盒进行转录，共转录8μg RNA。之后通过两轮巢式得到特异性VHH片段。
将载体与VHH片段分别用SfiI进行酶切，50℃过夜酶切，然后割胶回收目的片段。连接摩尔比例为Vector：VHH＝1:3。共进行了10次电转化，电转化后立即加入1mL 2YT培养基复苏，共计100ml复苏产物，37℃，180rpm复苏45min，取100μL测定库容量，其余离心，加入5mL 2YT重悬，涂布于200mm的平板上共8块。第二天10-4培养板上共有1000个克隆，因此库容量为1.0×109cfu/mL(1000*100*104)。库容以足以进行抗体的筛选。随机从滴度平板上挑取48个克隆进行鉴定，结果表明插入率均为97.9％。将这48个克隆送测序，进行多样性和进化分析，显示文库多样性良好。
三、BCMA单域抗体的淘选和序列分析
(1)亲和淘选：
1)将靶分子BCMA用PH值为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为5μg/mL，按100μL/孔加入酶标孔中，每个靶分子包被8孔(第二轮和第三轮筛选包被2孔)，4℃包被过夜；
2)弃包被液，PBS洗涤3次，每孔加入300μL 3％BSA-PBS封闭液，37℃封闭1h；
3)PBS洗涤3次，加入100μL噬菌体文库，37℃孵育1h；
5)吸出未结合的噬菌体，用PBST洗涤6次，PBS洗涤2次；
6)加入100μL Gly-HCl洗脱液，37℃孵育8min，洗脱特异性结合的噬菌体；将该洗脱液转移至1.5mL无菌离心管中，迅速用15μL Tris-HCl中和缓冲液中和；
7)取10μL进行梯度稀释，测定滴度，计算淘选回收率，其余洗脱物混合后进行扩增和纯化，用于下一轮亲和淘选，改变淘选条件，每一轮淘选条件如表1。
表3 亲和淘选条件
筛选过程中富集度如下表：
表4 以BCMA抗原为靶分子的酸洗脱三轮筛选回收量
表中：回收率＝回收量/文库投入量；
富集度＝后一轮回收率/上一轮回收率。
(2)淘选后文库的扩增：
1)将淘选洗脱物与处于对数生长前期的E.coli TG1培养物20mL混匀，37℃，静置30min。加入1mL 20％葡萄糖，37℃，180r/min振荡培养30min；
2)按cell：phage＝1：20的比例加入M13K07噬菌体和4μL Amp+，37℃，静置30min后，补加20mL 2×YT，37℃，180r/min振荡培养30min；
3)将培养物分装于离心管中，25℃，5000r/min，10min，细胞沉淀以50mL2×YT-AK液体培养基重悬，30℃，230r/min振荡培养过夜；
4)将过夜培养物4℃，10000r/min离心20min，将上清转移至新离心管，加入1/5体积的PEG/NaCl，混匀后置于4℃2h；
5)4℃，10000r/min，20min，去除上清，将沉淀重悬于1mL PBS中，加入1/5体积的PEG/NaCl，混匀后置于4℃1h；
6)4℃，12000r/min，2min，去除上清，将沉淀悬浮于200μL PBS中，即为扩增产物，测定滴度，用于下一轮淘选或者分析。
(3)噬菌粒的救援：
1)从三轮淘选洗脱物滴度的平板上，用灭菌牙签随机挑取96个单克隆接种于1mL2×YT-A中，37℃，220r/min振荡培养8h。
2)取200μL上述培养物，按cell：phage＝1：20的比例加入M13K07噬菌体，37℃，静置15min，220r/min振荡培养45min。
3)补加800μL体积的2×YT-AK，30℃，剧烈振荡培养过夜。
4)第二天12000rpm离心2min，取上清，用于单克隆ELISA鉴定。
(4)阳性噬菌体克隆的鉴定：
1)将靶分子BCMA用PH值为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为2μg/mL，按100μL/孔加入酶标孔中，4℃包被过夜；
2)弃包被液，PBST洗涤3次，每孔加入300μL 5％脱脂牛奶，37℃封闭1h；
3)PBST洗涤3次，每孔加入50μL噬菌体培养菌液上清和50μL 5％脱脂牛奶，37℃，孵育1h；
4)PBST洗涤6次，加入辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体(用PBS按1:5000稀释)，100μL/孔，37℃作用1h；
5)PBST洗板6次。加入TMB显色液显色，100μL/孔，37℃，7min，加入终止液终止反应，50μL/孔，于450nm下测光密度。
以BCMA抗原为靶分子，采用Gly-HCl酸洗脱方法，洗脱特异噬菌体。经三轮筛选，从第一轮和第二轮滴度测定平板随机挑选96个克隆，(第一轮克隆编号49-96，第二轮编号1-24，第三轮编号25-48)采用间接ELISA筛选阳性克隆，450nm下光密度见下表。
表5 BCMA-FC抗原phage ELISA鉴定
| NO. | OD450 | NO. | OD450 | NO. | OD450 | NO. | OD450 | NO. | OD450 | NO. | OD450 | NO. | OD450 |
| 1 | 2.959 | 9 | 3.060 | 17 | 3.099 | 25 | 3.079 | 33 | 3.041 | 41 | 3.006 | M13K07 | 0.332 |
| 2 | 3.172 | 10 | 3.223 | 18 | 3.223 | 26 | 3.282 | 34 | 2.307 | 42 | 2.450 | M13K07 | 0.518 |
| 3 | 2.959 | 11 | 2.907 | 19 | 2.907 | 27 | 2.974 | 35 | 2.959 | 43 | 2.988 | Blank | 0.065 |
| 4 | 3.151 | 12 | 3.177 | 20 | 3.267 | 28 | 3.177 | 36 | 3.177 | 44 | 3.235 | Blank | 0.074 |
| 5 | 3.083 | 13 | 3.299 | 21 | 3.083 | 29 | 3.241 | 37 | 3.214 | 45 | 3.214 | Blank | 0.062 |
| 6 | 3.050 | 14 | 3.050 | 22 | 3.152 | 30 | 3.108 | 38 | 2.706 | 46 | 2.567 | Blank | 0.063 |
| 7 | 3.114 | 15 | 3.158 | 23 | 3.114 | 31 | 3.181 | 39 | 3.114 | 47 | 3.136 | Blank | 0.060 |
| 8 | 3.194 | 16 | 3.194 | 24 | 3.284 | 32 | 3.037 | 40 | 3.222 | 48 | 3.222 | Blank | 0.078 |
表6 BCMA-his抗原phage ELISA鉴定
| NO. | OD450 | NO. | OD450 | NO. | OD450 | NO. | OD450 | NO. | OD450 | NO. | OD450 | NO. | OD450 |
| 1 | 2.334 | 9 | 2.280 | 17 | 1.618 | 25 | 1.417 | 33 | 1.203 | 41 | 1.476 | M13K07 | 0.850 |
| 2 | 1.644 | 10 | 1.537 | 18 | 1.774 | 26 | 1.398 | 34 | 0.390 | 42 | 0.380 | M13K07 | 0.631 |
| 3 | 2.426 | 11 | 2.753 | 19 | 2.300 | 27 | 1.785 | 35 | 1.338 | 43 | 2.212 | Blank | 0.103 |
| 4 | 2.574 | 12 | 2.75 | 20 | 2.26 | 28 | 2.002 | 36 | 2.006 | 44 | 2.090 | Blank | 0.110 |
| 5 | 2.300 | 13 | 2.396 | 21 | 2.459 | 29 | 2.604 | 37 | 1.680 | 45 | 2.068 | Blank | 0.075 |
| 6 | 2.233 | 14 | 2.005 | 22 | 2.099 | 30 | 2.355 | 38 | 0.602 | 46 | 0.719 | Blank | 0.083 |
| 7 | 1.307 | 15 | 1.267 | 23 | 1.707 | 31 | 1.518 | 39 | 1.098 | 47 | 1.046 | Blank | 0.082 |
| 8 | 2.092 | 16 | 2.354 | 24 | 1.466 | 32 | 0.903 | 40 | 1.965 | 48 | 1.296 | Blank | 0.086 |
表7 BCMA-FC抗原phage ELISA鉴定
表8 BCMA-his抗原phage ELISA鉴定
| NO. | OD450 | NO. | OD450 | NO. | OD450 | NO. | OD450 | NO. | OD450 | NO. | OD450 | NO. | OD450 |
| 49 | 0.069 | 57 | 2.848 | 65 | 2.763 | 73 | 1.416 | 81 | 1.110 | 89 | 0.068 | M13K07 | 2.363 |
| 50 | 1.069 | 58 | 2.414 | 66 | 2.867 | 74 | 0.971 | 82 | 1.714 | 90 | 2.52 | M13K07 | 2.377 |
| 51 | 1.795 | 59 | 2.793 | 67 | 2.468 | 75 | 2.070 | 83 | 0.071 | 91 | 0.070 | Blank | 0.078 |
| 52 | 3.098 | 60 | 2.797 | 68 | 0.084 | 76 | 2.550 | 84 | 2.224 | 92 | 3.054 | Blank | 0.079 |
| 53 | 2.608 | 61 | 2.922 | 69 | 2.627 | 77 | 2.692 | 85 | 3.042 | 93 | 1.511 | Blank | 0.064 |
| 54 | 0.069 | 62 | 2.783 | 70 | 1.939 | 78 | 1.949 | 86 | 0.074 | 94 | 2.627 | Blank | 0.076 |
| 55 | 1.848 | 63 | 0.065 | 71 | 1.848 | 79 | 2.318 | 87 | 2.147 | 95 | 2.067 | Blank | 0.067 |
| 56 | 2.491 | 64 | 3.093 | 72 | 0.237 | 80 | 1.963 | 88 | 0.074 | 96 | 2.623 | Blank | 0.078 |
四、BCMA单域抗体的序列分析
根据目前的测序结果，对序列进行序列比对和进化树分析，BCMA抗原VHH氨基酸序列如图1所示，BCMA抗原VHH进化树如图2所示。结果说明BCMA淘选得到的单域抗体序列差异较小，同源性较高。选取其中的1号(B1)和65号(B65)进行下一步实验，通过IMGT分析其序列结构。B1的CDR1区序列为GSILSIYA，CDR2区的序列为INISSNT，CDR3区的序列为NVAPWGDYDVKTDFGG，其序列如SEQ ID NO.7所示；B65的CDR1区序列为GSISGIYA，CDR2区的序列为ITSGGDT，CDR3区的序列为NVAPWGDYDVRADFGS，其序列如SEQ ID NO.8所示。
实施例2
本实施例为BCMA单域抗体B1和B65的制备。
将所得到SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的核酸序列亚克隆到原核表达载体pET-28a上，转化感受态细胞BL21，经过培养和IPTG诱导蛋白表达，分别获得BCMA单域抗体B1和B6。
使用超声破碎裂解细菌，获得上清后通过镍柱纯化蛋白。将所得到蛋白通过SDS-PAGE检测蛋白纯度，结果显示蛋白纯度均达到90％以上，且蛋白可溶性良好。此实施例说明可成功制备抗BCMA的单域抗体。
实施例3
本实施例对BCMA单域抗体对BCMA抗原的亲和力、特异性及结合靶细胞的能力进行了验证。
一、BCMA单域抗体亲和力
通过Biacore T2000测定BCMA单域抗体B1和B65与抗原的亲和能力。测定流程：
BCMA的固定在25℃下完成，以HBS-EP为缓冲溶液。首先使用新鲜制备的50mM NHS和200mM EDC以10μL/min的速度激活传感器芯片表面。然后，使用10mM NaAC(pH 5.0)溶解BCMA抗原，将其注射进流动室2和4以结合87和1727反应单元，流动室1作为空白对照。在氨基耦合反应之后，通过注射乙醇胺盐酸盐封闭剩余的耦合位点。以HBS-EP为缓冲液进行实验，实验温度为25℃。稀释的BCMA单域抗体B1和B65注射进入芯片表面作为结合相，随后注射HBS-EP作为分离相。运行参数如下：
实验数据由Biacore T2000软件(版本3.1)进行处理，具体结果如下表所示。结果显示，B1和B65均能高亲和力的结合BCMA抗原，亲和力分别为2.14nM和0.32nM。
表9 BCMA与抗BCMA变体的亲和力排名
二、BCMA抗体结合特异性
为了检测所得到单域抗体与BCMA结合的特异性，我们通过ELISA验证了其与BCMA，CD38，CD138等抗原的结合能力，其中CD38和CD138均为多发性骨髓瘤的特异性靶点作为BCMA非特异结合参照。首先以10ug/mL浓度将上述各抗原在PBS缓冲液中包被在酶标版，4℃过夜；使用5％BSA封闭多余位点；各孔中加入B1，B65或者阴性对照羊驼血清；37℃孵育1小时后，使用PBST洗去未结合抗体；加入兔抗羊驼二抗，37℃孵育40分钟，之后使用PBST洗去未结合抗体；加入TMB显色，10分钟后加入浓硫酸终止液终止反应，使用酶标仪测定OD450。其结果如图3所示，结果显示所述单域抗体B1和B65仅能与BCMA结合，与其它抗原均不能结合。因此说明B1和B65与BCMA的结合有良好的特异性。
三、BCMA单域抗体结合靶细胞
为了检测所得抗体B1，B65是否能够结合相关靶细胞。首先构建了BCMA阳性表达的细胞系A549-BCMA，其次鉴定了细胞系A549-BCMA高表达BCMA，但是A549不表达BCMA；同时我们还鉴定了骨髓瘤细胞系U266高表达BCMA，而白血病细胞系K562不表达BCMA。为了方便检测，将BCMA单域抗体标记FITC荧光。将其与靶细胞A549-BCMA或者U266共同孵育，以及与BCMA阴性细胞A549或K562共同孵育，通过流式细胞术检测各细胞染色情况，其结果如图4所示，结果显示B1和B65都能有效结合BCMA阳性靶细胞A549-BCMA和U266，但是不结合A549和K562细胞系，说明单域抗体B1，B65能够有效结合BCMA阳性靶细胞。
实施例4
本实施例验证了BCMA单域抗体对多发性骨髓瘤的治疗效果。
为了检测以上BCMA抗体是否能够有效的靶向和杀伤MM细胞，将上述抗体与人源IgG1Fc融合构建为重链抗体B1-Fc，B65-Fc，将二者分别与靶细胞U266或K562共孵育，并加入人PBMC，以检测其是否可以通过ADCC作用杀伤靶细胞。首先将U266和K562细胞制备为细胞悬液，加入终浓度为2uM CFSE室温染色30min，之后通过FBS终止染色，将细胞重悬于RPMI1640含10％FBS中。之后各加入0.1ug/ml抗体B1-Fc，B65-Fc或者同型IgG，以及3×106PBMC以作为ADCC作用中NK细胞的来源。共孵育4小时之后，将细胞通过annexin-V/PI染色，检测其细胞凋亡的比例，从而得到不同抗体杀伤靶细胞的能力。其结果如图5所示，结果显示，B1-Fc，B65-Fc不能够杀伤K562细胞系，但是可以有效的杀伤BCMA阳性的MM细胞U266。因此说明B1-Fc，B65-Fc可以有效在体外杀伤MM细胞。
为了检测其是否能够在体内清除MM细胞，使用U266细胞系构建了NOD-Scid小鼠MM移植瘤模型。在U266接种后的第7天开始，连续5天每天给小鼠腹腔分别注射B1-Fc，B65-Fc，20ug/只，或者同型人IgG作为对照。小鼠生存期如图6所示，IgG组小鼠在U266接种后第25-30天之间相继发病死亡，但是B1和B65组小鼠生存期大大延长，均超过了60天。因此说明B1-Fc，B65-Fc可以有效在小鼠体外杀伤MM细胞。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何根据本发明原理进行修改和替代也可以达到同样效果。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海科棋药业科技有限公司
<120> 一种抗BCMA的单域抗体及其应用
<130> IPI190694
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> CDR1(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Ser Ile Ser Gly Ile Tyr Ala
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> CDR2(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Thr Ser Gly Gly Asp Thr
1 5
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> CDR3(Artificial Sequence)
<400> 3
Asn Val Ala Pro Trp Gly Asp Tyr Asp Val Arg Ala Asp Phe Gly Ser
1 5 10 15
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> CDR1(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Ser Ile Leu Ser Ile Tyr Ala
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> CDR2(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Ser Ile Leu Ser Ile Tyr Ala
1 5
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> CDR3(Artificial Sequence)
<400> 6
Asn Val Ala Pro Trp Gly Asp Tyr Asp Val Lys Thr Asp Phe Gly Gly
1 5 10 15
<210> 7
<211> 122
<212> PRT
<213> B1(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ser Ile Leu Ser Ile Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ile Ser Ser Asn Thr Phe Tyr Arg Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Val Ala Pro Trp Gly Asp Tyr Asp Val Lys Thr Asp Phe Gly Gly Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 122
<212> PRT
<213> B65(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ser Gly Ile Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Arg Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Asp Thr Phe His Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Val Ala Pro Trp Gly Asp Tyr Asp Val Arg Ala Asp Phe Gly Ser Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 366
<212> DNA
<213> 编码B1的核酸(Artificial Sequence)
<400> 9
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ccggggggtc actgagactc 60
tcctgtacag cctctggaag catcctcagt atctatgcca tgggctggta ccgccaggct 120
ccggggaagc agcgcgagtt ggtcgctgct attaatatca gtagtaacac attctaccga 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccgagaacac ggtgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtctatt actgtaatgt ggcgccttgg 300
ggcgactatg acgtgaaaac tgactttggt ggctggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360
tcctcg 366
<210> 10
<211> 366
<212> DNA
<213> 编码B65的核酸(Artificial Sequence)
<400> 10
cagttgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactt 60
tcctgtgcag cctctggaag catcagcggt atctatgcca tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgccggtt ggtcgcagct attactagtg gtggtgacac gttccatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac aatgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccgtctatt actgtaatgt ggcgccttgg 300
ggcgactatg acgtgagggc tgactttggt tcctggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360
tcctcg 366
Claims (10)
1.一种抗BCMA的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体序列包含CDR1、CDR2、CDR3以及框架区序列；
其中，所述CDR1序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示；所述CDR2序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5所示；所述CDR3序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的一种抗BCMA的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体为B1抗体或B65抗体，所述B1抗体的序列如SEQ ID NO.7所示，所述B65抗体的序列如SEQ ID NO.8所示。
3.一种用于编码权利要求1或2所述的抗BCMA的单域抗体的核酸。
4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，编码B1抗体的核酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码B65抗体的序列如SEQ ID NO.10所示。
5.一种包含权利要求3所述的核酸的载体，其特征在于，所述载体包括DNA载体，RNA载体，质粒，慢病毒载体，腺病毒载体和逆转录病毒载体。
6.一种包含权利要求5所述的载体的细胞。
7.一种包含权利要求1或2所述的抗BCMA的单域抗体的嵌合抗原受体或重链抗体。
8.一种包含权利要求7所述的嵌合抗原受体的免疫效应细胞。
9.如权利要求3所述的核酸、如权利要求5所述的载体、如权利要求6所述的细胞、如权利要求7所述的嵌合抗原受体或重链抗体、如权利要求8所述的免疫效应细胞在制备用于治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症的药物中的应用。
10.一种抗BCMA的单域抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：采用将如SEQ ID NO.9所示或SEQ ID NO.10所示的核酸序列亚克隆到原核表达载体，转化感受态细胞，诱导蛋白表达，分别获得如SEQ ID NO.7所示序列的B1抗体和如SEQ ID NO.8所示序列的B65抗体。
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