CN109942582B - 一种靶向原肌球蛋白激酶trk融合蛋白的pet探针及其合成与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种靶向原肌球蛋白激酶TRK融合蛋白的PET探针及其合成与应用。PET探针，其分子结构如下：
与现有技术相比，本发明研发出了新型的TRK PET探针，具有TRK特异性，用于探测TRK融合蛋白在肿瘤组织中的表达，从而为临床检查提供可靠的诊断与分子表型的数据。
Description
技术领域
本发明属于探针合成技术领域，尤其是涉及一种靶向原肌球蛋白激酶TRK融合蛋白的PET探针及其合成与应用。
背景技术
原肌球蛋白受体激酶((tropomyosin receptor kinase，简称Trk)是一类酪氨酸激酶受体，主要由NTRK基因编码。Trk受体分为TrkA(分子量140kD)、TrkB(145kD)和TrkC(145kD)。原肌球蛋白是一类膜蛋白受体，主要包括膜外配体结合区，跨膜区与膜内ATP结合区。TrkA、TrkB、TrkC的膜外接合区展现了高度的相似性。Trk在中枢神经系统与外周神经系统的生理、发育及功能中发挥着重要的作用。正常的Trk受体通过与结合膜外配体结合后，形成二聚体并引起膜内激酶区的磷酸化与活化，从而引发下游信号通路的激活，进而促进细胞的增殖与分化。NTRK基因重排与融合是在多种癌症中常见的现象，广泛存在于多种癌症中(如直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、胶质瘤、星型细胞瘤、婴儿纤维肉瘤、甲状腺癌、胃肠道间质瘤等)，并编码了多种原激球蛋白激酶Trk融合蛋白。这些融合蛋白能够在没有配体的情况下，激活下游的通路并促进肿瘤的形成与细胞增殖。因此，Trk融合蛋白也成为了癌症领域光谱的药物靶点及诊断标志物。目前为止，临床上运用的检测NTRK融合的技术手段主要包括NGS测序，FISH以及IHC。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种靶向原肌球蛋白激酶TRK融合蛋白的PET探针及其合成与应用。
在本发明中，将现有的新型临床药物Larotrectinib进行放射性标记，从而研发出新型的TRK PET探针，以用于临床及临床前的诊断与疗效评估。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种靶向原肌球蛋白激酶TRK融合蛋白的PET探针，其分子结构如下：
一种所述PET探针的小分子前体，其分子结构如下：
所述PET探针的合成方法，包括以下步骤：
将化合物11溶于无水DMSO中，加入K222与碳酸钾，然后加入18F(111GBq)，进行反应，然后加入HCl，反应，反应后进行纯化分离，得到所述PET探针；
所述化合物11分子结构如下：
所述化合物11是通过以下方法合成得到的：
将化合物9加入到CHCl3中，并加入Oxone与TFA，搅拌反应后，进行减压浓缩，将浓缩产物加入到溶有6,10-dioxaspiro[4.5]decane-7,9-dione的EtOH中，室温下发应后，等反应结束后，进行手性拆分得到终化合物11；
所述化合物9分子结构如下：
所述化合物9是通过以下方法合成得到的：
将化合物8、TFA加入到DCM中，在冰浴的条件下加入acetyl chloride，进行反应，反应结束后，进行纯化得到化合物9；
所述化合物8分子结构如下：
所述化合物8是通过以下方法合成得到的：
将化合物7溶于DCM中，加入CDI，加入(S)-pyrrolidin-3-ol，进行反应，反应结束后，分离得到化合物8；
所述化合物7分子结构如下：
所述化合物7是通过以下方法合成得到的：
将化合物6、加入到EtOH中，加入HCl与Fe，并在N2保护的条件下反应，反应结束后，进行分离得到化合物7；
所述化合物6分子结构如下：
所述化合物6是通过以下方法合成得到的：
将化合物4与化合物5混合，随后在N2的保护条件下加入EtOH与THF，再加入TFA，进行反应，反应结束后，进行分离得到化合物6；
所述化合物4分子结构如下：
所述化合物5分子结构如下：
所述化合物4是通过以下方法合成得到的：
将化合物3溶于MeOH中，并加入乙酸、NaBH4，进行反应，反应结束后，进行分离得到化合物4；
所述化合物3分子结构如下：
所述化合物3是通过以下方法合成得到的：
在无水THF中加入NaH、化合物2及1-vinylpyrrolidin-2-one，搅拌反应，然后冷却至室温，然后缓慢加入HCl溶液继续反应，反应结束后，进行分离得到化合物3；
所述化合物2分子结构如下：
所述化合物2是通过以下方法合成得到的：
将化合物1溶于EtOH，然后滴加H2SO4，将混合物搅拌，反应，反应结束后，进行分离得到化合物2；
所述化合物1分子结构如下：
本发明所述PET探针用于制备临床或临床前的诊断和/或疗效评估的药物的应用，可用于放射化学标记，临床前动物影像等方法的研究。
与现有技术相比，本发明研发出了新型的TRK PET探针，具有TRK特异性，用于探测TRK融合蛋白在肿瘤组织中的表达，从而为临床检查提供可靠的诊断与分子表型的数据。
附图说明
图1为靶向于TRK融合蛋白PET探针前体的合成路线图；
图2为PET探针的放射化学制备路线图；
图3为化合物2的TLC层析结果；
图4为化合物3的TLC层析结果；
图5为化合物4的TLC层析结果；
图6为化合物6的TLC层析结果；
图7为化合物7的TLC层析结果；
图8为化合物9合成反应的TLC层析结果。
具体实施方式
本发明在已知的化合物LOXO-101的基础上进行进一步的改造，将其设计并制备成一个拥有18F标记的PET探针。这个过程主要包括两个部分：1.PET探针化合物前体的制备，2.PET探针的放射化学标记。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1、PET探针化合物前体的制备(如图1)：
(1)化合物2合成方法：
将化合物1(20.0g,75.2mmol,1eq)溶于70mL EtOH。然后逐渐滴加H2SO4(7.37g,75.1mmol,4.01mL,1eq).将混合物在100℃下搅拌5h，并用TLC(Dichloromethane/Methanol＝10/1,Rf＝0.87)检测反应的进度。当反应完成后，反应物在减压的情况下被浓缩。浓缩产物经过萃取(EOtOH 200mL,NaHCO3饱和溶液(100.0mL x 2)后，取有机层，并加入无水Na2SO4干燥。经过进一步蒸干得到最终油状产物2(21.0g,71.4mmol,94.9％yield)。
图3为此反应的TLC层析结果。
(2)化合物3合成方法：
在无水THF(131.0mL)中加入NaH(3.71g,92.8mmol,60.0％purity,1.3eq)，化合物2(21.0g,71.4mmol,1eq)及1-vinylpyrrolidin-2-one(8.49g,76.4mmol,8.17mL,1.07eq)。混合物在80℃下搅拌3小时，然后冷却至室温。然后缓慢加入10％的HCl溶液(30mL)并在100℃下搅拌10小时。反应进度经过TLC(Petroleum ether/Ethyl acetate＝4/1,Rf＝0.68)探测。当反应结束后，在冰浴的条件下，逐渐加入1M NaOH溶液，将反应溶液的pH值调整至8.0。并用DCM(50.0mL x 2)进行进一步的萃取，并通过柱层析(SiO2,Petroleum ether/Ethylacetate＝8/1to 5/1)，得到白色化合物3(1.60g,5.53mmol,7.75％yield).图4为此反应的TLC层析结果。
化合物3的核磁共振数据为：
1H NMR:ET20681-25-P1A CDCl3 Varian_S_400MHz8.29(dd,J＝2.2,6.8Hz,1H),7.67(ddd,J＝2.3,4.6,8.7Hz,1H),6.87(dd,J＝8.6,10.8Hz,1H),4.08-3.97(m,2H),2.98(dtd,J＝2.2,5.4,11.0Hz,2H),2.12-1.97(m,2H)
(3)化合物4合成方法：
将化合物3(1.60g,5.53mmol,1eq)溶于10mL MeOH中，并加入乙酸(2.10g,34.9mmol,2.00mL,6.32eq)。在冰浴的条件下向反应物中加入NaBH4(209.4mg,5.53mmol,1eq)。混合物在室温的条件下搅拌5小时，并用TLC(Petroleum ether/Ethyl acetate＝3/1,Rf＝0.06)监测反应进度。当反应完全时，将反应产物进行减压浓缩。对浓缩后的产品用饱和Na2CO3将pH值调节至8，并用EtOAc(20.0mLx 4)进行萃取，并用无水Na2SO4进行干燥，然后进行减压蒸馏，得到无色油状化合物4(1.60g,5.50mmol,99.3％yield)。图5为此反应的TLC层析结果。
(4)化合物6合成方法：
将化合物4(1.15g,5.77mmol,1.05eq)与化合物5(1.60g,5.50mmol,1eq)加入圆底烧瓶中。随后在N2的保护条件下加入12mL EtOH与3mL THF。随后将反应溶液本温度调至40℃，并通过滴液漏斗向圆底烧瓶中加入TFA(1.95g,19.2mmol,2.68mL,3.5eq)。待液体加完后，反应物温度调至50℃并在此温度下搅拌5h。反应通过TLC(Dichloromethane/Methanol＝10/1,Rf＝0.37)进行监测。当反应结束时，对反应溶液进行过滤，并收集过滤物进行烘干，得到白色固体状化合物6(2.10g,4.63mmol,84.3％yield)。图6为此反应的TLC层析结果。
(5)化合物7合成方法：
将反应物6(1.90g,4.19mmol,1eq)加入到30mL EtOH中，随后加入HCl(30.0mL)与Fe(2.34g,41.9mmol,10eq)，并在N2保护的条件下将反应物在60℃条件下加热1小时。用TLCTLC(Ethyl acetate,Rf＝0.30)进行反应的监测，当反应结束后，将反应物倒入200mL水中并用固体Na2CO3将反应体系的pH调节至8.通过进一步用EtOAc(100.0mL x 3)进行萃取，收集有机层并用无水Na2SO4进行干燥。通过进一步的减压蒸馏得到黄色固体状化合物7(1.80g,crude)。图7为此反应的TLC层析结果。
化合物7的核磁共振数据为：
1H NMR:ET21514-5-P1A1 CDCl3 Varian_S_400MHz8.07(d,J＝7.5Hz,1H),7.62(s,1H),7.52(ddd,J＝2.2,4.9,8.4Hz,1H),7.35(dd,J＝2.1,6.9Hz,1H),6.84(dd,J＝8.6,10.1Hz,1H),5.87(br s,1H),5.28(br s,1H),3.98-3.86(m,1H),3.80-3.68(m,1H),2.81(br s,2H),2.52-2.35(m,1H),2.08-2.04(m,1H),2.03-1.96(m,2H)
(6)化合物8合成方法：
将化合物7(1.80g,4.25mmol,1eq)溶于10mL DCM中。随后加入CDI(1.38g,8.51mmol,2eq).在常温下搅拌2小时后，加入(S)-pyrrolidin-3-ol(741.0mg,8.51mmol,686.1uL,2eq)。反应物在常温下搅拌半小时，并用TLC(Dichloromethane/Methanol＝10/1,Rf＝0.32)监测反应进度。当反应结束后，反应物用50.0mL水进行稀释并用EtOAc(50.0mL x3)进行萃取。将萃取所得的有机层用饱和食盐水进行冲洗并进一步用无水Na2SO4进行干燥。通过进一步的浓缩与柱层析(SiO2,Petroleum ether/Ethyl acetate＝50/1to 0/1)得到褐色化合物8(2.00g,3.73mmol,87.7％yield).
化合物8的核磁共振数据为：
1H NMR:ET21476-4-P1A MeOD Varian_S_400MHzδ＝8.29-8.12(m,2H),7.92(s,1H),7.56(br d,J＝7.5Hz,2H),7.37(br d,J＝6.2Hz,1H),7.14-7.05(m,1H),6.93(br t,J＝9.4Hz,1H),4.46(br d,J＝1.8Hz,2H),3.84-3.71(m,2H),3.57(br d,J＝6.8Hz,4H),2.13-2.05(m,4H),1.98(s,2H)
(7)化合物9合成方法：
将化合物8(2.00g,3.73mmol,1eq),TFA(754.6mg,7.46mmol,1.04mL,2.0eq)加入到10.0mL DCM中。随后在冰浴的条件下加入acetyl chloride(439.1mg,5.59mmol,399.1uL,1.5eq)。反应化合物在常温下搅拌5小时.并用TLC(Dichloromethane/Methanol＝10/1,Rf＝0.32)监测反应进度。当反应结束后，对反应物进行减压浓缩，并用柱层析(SiO2,DCM/Methanol＝10/1)进行纯化得到黄色固体状化合物9(0.800g,1.38mmol,37.1％yield)。图8为此反应的TLC层析结果。
化合物9的核磁共振数据为：
1H NMR:ET21476-5-P1A MeOD Bruker_F_400MHzδ＝9.59(br s,1H),9.12(br s,1H),8.85(br s,1H),8.65(br d,J＝6.2Hz,1H),8.19(br t,J＝9.4Hz,1H),6.76-6.49(m,2H),5.32-5.19(m,1H),5.10-4.65(m,5H),3.75(br s,1H),3.53-3.32(m,3H),3.30(s,3H),3.27(br s,1H)
(8)化合物11合成方法：
将化合物9(0.5g,0.62mmol)加入到10mL CHCl3中，并加入1mL Oxone与0.5mLTFA。在室温下搅拌反应4小时后，进行减压浓缩，将浓缩产物加入到溶有6,10-dioxaspiro[4.5]decane-7,9-dione(0.22g,1.24mmol)的10mL EtOH中，室温下发应2h后，用LCMS进行检测，等反应结束后，进行手性拆分得到终产物11(180mg).
实施例2、PET探针的放射化学标记(如图2)：
将前体11(3.0mg)溶于无水1mL DMSO中，加入10mg K222与3mg碳酸钾，然后加入18F(111GBq)，并在130℃条件下反应10分钟，然后加入6M HCl 1mL,并在100℃下反应3分钟。待反应结束后，用HPLC(C18,Dynamax 250·21.4mm；Varian)进行纯化，流速为6.0mL/min，流动相为10mM NaH2PO4 buffer(pH 6.7)and ethanol(47.5:52.5,v/v)，最后将收集到的组分经过C18 Sep-Pak(Waters)进行收集，然后用1mL EtOH进行冲洗并收集到9mL的生理盐水瓶子中，得到相应的放射性PET探针，放射化学产率为20％。
本发明研发出了新型的TRK PET探针，具有TRK特异性，用于探测TRK融合蛋白在肿瘤组织中的表达，从而为临床检查提供可靠的诊断与分子表型的数据。
Trk在中枢神经系统与外周神经系统的生理、发育及功能中发挥着重要的作用。正常的Trk受体通过与结合膜外配体结合后，形成二聚体并引起膜内激酶区的磷酸化与活化，从而引发下游信号通路的激活，进而促进细胞的增殖与分化。NTRK基因重排与融合是在多种癌症中常见的现象，广泛存在于多种癌症中(如直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、胶质瘤、星型细胞瘤、婴儿纤维肉瘤、甲状腺癌、胃肠道间质瘤等)，并编码了多种原激球蛋白激酶Trk融合蛋白。这些融合蛋白能够在没有配体的情况下，激活下游的通路并促进肿瘤的形成与细胞增殖。因此，Trk融合蛋白也成为了癌症领域光谱的药物靶点及诊断标志物。目前为止，临床上运用的检测NTRK融合的技术手段主要包括NGS测序，FISH以及IHC。此发明针对Trk融合蛋白将现有的小分子化合物进行改造，从而进一步形成能够特异性的诊断Trk融合蛋白表达的分子探针，从而为临床上对肿瘤的特征进行分子诊断提供可靠的分子分型数据，并指导相关的Trk融合蛋白的临床用药。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种靶向原肌球蛋白激酶TRK融合蛋白的PET探针的小分子前体，其特征在于，其分子结构如下：
2.一种靶向原肌球蛋白激酶TRK融合蛋白的PET探针的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
将化合物11溶于无水二甲基亚砜中，加入K222与碳酸钾，然后加入18F，放射性活度111GBq，进行反应，然后加入HCl，反应，反应后进行纯化分离，得到所述PET探针；
所述PET探针分子结构如下：
所述化合物11分子结构如下：
所述化合物11的制备方法包括：
将化合物9加入到CHCl3中，并加入过氧单磺酸钾与TFA，搅拌反应后，进行减压浓缩，将浓缩产物加入到溶有6.10-二氧杂螺[4.5]十烷-7,9-二酮的无水乙醇中，室温下发应后，等反应结束后，进行手性拆分得到终化合物11；
所述化合物9分子结构如下：
所述化合物9的制备方法包括：
将化合物8、TFA加入到二氯甲烷中，在冰浴的条件下加入乙酰氯，进行反应，反应结束后，进行纯化得到化合物9；
所述化合物8分子结构如下：
所述化合物8的制备方法包括：
将化合物7溶于二氯甲烷中，加入N,N'-羰基二咪唑，加入(S)-3-吡咯烷醇，进行反应，反应结束后，分离得到化合物8；
所述化合物7分子结构如下：
3.根据权利要求2所述PET探针的合成方法，其特征在于，所述化合物7的制备方法包括：
将化合物6、加入到无水乙醇中，加入HCl与Fe，并在N2保护的条件下反应，反应结束后，进行分离得到化合物7；
所述化合物6分子结构如下：
所述化合物6的制备方法包括：
将化合物4与化合物5混合，随后在N2的保护条件下加入无水乙醇与四氢呋喃，再加入TFA，进行反应，反应结束后，进行分离得到化合物6；
所述化合物4分子结构如下：
所述化合物5分子结构如下：
4.根据权利要求3所述PET探针的合成方法，其特征在于，所述化合物4的制备方法包括：
将化合物3溶于甲醇中，并加入乙酸、NaBH4，进行反应，反应结束后，进行分离得到化合物4；
所述化合物3分子结构如下：
5.根据权利要求4所述PET探针的合成方法，其特征在于，所述化合物3的制备方法包括：
在无水四氢呋喃中加入NaH、化合物2及N-乙烯基吡咯烷酮，搅拌反应，然后冷却至室温，然后缓慢加入HCl溶液继续反应，反应结束后，进行分离得到化合物3；
所述化合物2分子结构如下：
6.根据权利要求5所述PET探针的合成方法，其特征在于，所述化合物2的制备方法包括：
将化合物1溶于无水乙醇，然后滴加H2SO4，将混合物搅拌，反应，反应结束后，进行分离得到化合物2；
所述化合物1分子结构如下：
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